Abstract
Afferente nerver ikke bare formidle informasjon vedrørende normal fysiologi, men også signal forstyrret homeostase og patofysiologiske prosesser i de forskjellige organsystemer fra omkretsen mot det sentrale nervesystemet. Som sådan har den økt aktivitet eller "allergi" av mesenteriets afferente nerver blitt tildelt en viktig rolle i patofysiologien av visceral hypersensitivitet og magesmertesyndromer.
Mesenterisk afferent nerve-aktivitet kan måles in vitro i et isolert tarmsegment som er montert i et spesialbygde organbadet og hvorfra innvoller nerve er isolert, slik at forskere for å vurdere nerveaktivitet i tilknytning til den gastrointestinale segmentet direkte. Aktivitet kan registreres ved baseline i standardiserte forhold, under utspiling av segmentet eller etter tilsetning av farmakologiske forbindelser levert intraluminally eller serosally. Denne teknikken gjørforskeren å enkelt studere effekten av legemidler rettet mot det perifere nervesystemet i kontrollprøver; Dessuten gir det viktig informasjon om hvordan neuronal aktivitet er endret under sykdom. Det bør bemerkes imidlertid at måling afferent nevronal utløsning aktivitet utgjør bare en videresendingsstasjon i det komplekse nevrale signalkaskade, og forskere bør huske på å ikke overse neuronal aktivitet på andre nivåer (f.eks ryggmargen, ryggmarg eller sentralnervesystemet ) for å fullt ut belyse komplekse nevronale fysiologi i helse og sykdom.
Vanlig brukte anvendelser innbefatter studier av neuronal aktivitet som svar på administrering av lipopolysakkarid, og studiet av afferente nerveaktivitet i dyremodeller av irritabel tarm syndrom. I en mer translatorisk tilnærming, kan den isolerte mus tarmsegment bli utsatt for colonic supernatanter fra IBS-pasienter. Videre er en modifikasjonav denne teknikken har nylig blitt vist å være anvendelige i human colonic prøver.
Introduction
Sensorisk signalering og smerteopplevelse er en kompleks prosess som resulterer fra et intrikat samspill mellom afferente nerver, spinal nevroner, stigende og synkende facilitatory og hemmende trasé og flere forskjellige områder av hjernen. Som sådan, kan endringer i en eller flere av disse nivåene resultere i endrede sensorisk signalering og visceral smerte i sykdomstilstander. For å studere alle disse forskjellige aspekter av sensorisk signalering av flere teknikker har blitt utviklet som strekker seg fra enkeltcelleforsøk (f.eks, kalsium avbildning på neuroner) til hele dyremodeller (f.eks atferdsmessige reaksjoner som visceromotor respons). Teknikken som beskrives i dette dokumentet gir forskere til å vurdere spesifikt afferente nerveaktivitet in vitro fra et isolert segment av tynntarmen eller kolon hos gnagere. Kort sagt, er en isolert gastrointestinal segment (vanligvis jejunum eller tykktarm) montert i en spesialbygd opptak kammer dynket med en fysiologisk KRebs løsning. Den innvoller nerve er skåret fri og koblet til en elektrode som tillater registrering av afferente nerveaktivitet i innvoller eller bekken afferente nerver. Nerveaktivitet kan tas opp basalt eller som respons på økende intraluminale trykk og / eller farmakologiske forbindelser som kan anvendes enten direkte inn i opptakskammeret (serosally), eller via intraluminal perfusatet (mukosalt) for å vurdere deres virkning på afferente utladning 1-6 . Av notatet, innvoller nerver også inneholde efferente fibre og viscerofugal afferente i tillegg til de sensoriske afferente. En av de store fordelene ved ex vivo innvoller nerve-opptak er det faktum at forskere kan kvantifisere nerveaktivitet uten modulasjon eller inngang fra sentralnervesystemet, slik at man for å undersøke den direkte effekten av lokalt anvendte forbindelser på nerve-aktivitet. Videre overvåkning av viktige parametere, slik det er nødvendig ved hjelp av in vivo-metode (se nedenfor), er no lenger relevant. In vitro innvoller opptak er endelig mye mindre tidkrevende enn sin in vivo motstykke.
Afferent nerve-aktivitet som reaksjon på andre stimuli, slik som mucosal fjærende, prober ved bruk av von Frey hår eller strekking av segmentet, kan studeres i en modifisert forsøksoppsett der tarmvevet er festet ned og åpnet i lengderetningen (noe som er i motsetning til vår oppsett ved hjelp av en intakt segment), som ble beskrevet i en tidligere utgave 7,8. I tillegg bare nylig ble en teknikk beskrevet å studere colonic afferent nerve aktivering i tarmveggen selv via kalsium bildebehandling, igjen ved hjelp av en låst ned, åpnet på langs segment 9.
En alternativ versjon av denne in vivo teknikk består av å måle neuronal aktivering nær afferent inntreden i ryggmargen. Kort sagt, blir bedøvet dyret plassert i liggende stilling, exposing det lumbosakrale ryggmargen til hvilken afferent nerve av interesse prosjekter ved hjelp av laminektomi, konstruere en parafin fylt brønn ved bruk av huden av innsnitt og drapering dorsal rootlet over en platina bipolar elektrode 10,11. Denne teknikken dessuten gjør det mulig for forskere å karakterisere fibre basert på deres ledningshastighet, og skille unmyelinated C-fibre fra tynt myelinerte Aδ-fibre. Videre er rygg rootlets utelukkende inneholder sensoriske afferente fibre, i motsetning til de blandede afferente og efferente nerver innvoller som er nevnt tidligere.
Opptak afferent nerve utslipp in vitro fra isolerte gut segmenter kan også gjøres ved hjelp av menneskelige prøver, som to forskergrupper uavhengig publisert første-i-mann manuskripter opptak colonic afferent nerve aktivitet i menneskelig reseksjon eksemplarer 12,13. Gjennomføringen av denne teknikken kan resultere i en lettere til oversettelserpå av murine data til human staten, og kan tillate forskere å lett identifisere legemidler rettet mot sensibilisert sensoriske nerve. Den kliniske betydningen av å karakterisere afferent nerve aktivitet, samt oppdagelsen av nye terapeutiske reagenser som er rettet mot ublu afferent nerve aktivitet, har blitt kunstferdig diskutert av mange eksperter på området 14-19.
Den forannevnte in vitro-teknikk utfyller mer kjent in vivo-måling av afferent nerve-aktivitet. Under in vivo neuronal aktivitet måling, kan nerveaktivitet måles direkte i den sederte dyr under hvilken segmentet av interesse blir identifisert og deretter intubert og en flytende parafin fylt brønn blir konstruert ved anvendelse av bukveggen og huden av den gnager 20. Den afferent nerve av interesse blir så identifisert, seksjonert og plassert på en bipolar platina elektrode, slik at nerveaktivitet measurement. Denne teknikken gjør det mulig for forskeren å modulere afferente nerveaktivitet i lever riktignok bedøvet dyr; som sådan, kan man studere neuronal aktivitet reagere på forstyrrelser så som luminal utspiling eller intravenøs administrering av en forbindelse.
Translasjonell forskning fokuserer i dag hovedsakelig på anvendelsen av human-avledet supernatanter (f.eks., Fra colonic biopsier, dyrket perifere mononukleære blodceller, osv) på jejunale og / eller colonic mus afferente 21,22. Forskere kan direkte bruke supernatanter enten i organbadet eller i den intraluminal løsning som perfuses tarmen segmentet, slik at ulike effekter av serøse versus slimhinne søknad kan studeres på afferent nerve utslipp. Som sådan, ble det vist at colonic slimhinnebiopsi supernatans fra pasienter med irritabel tarm-syndrom kan forårsake overfølsomhet i mus colonic afferente, marsvin submucous nevroner og mus dorsaleganglion nevroner 21,23,24.
Til slutt, opptak neuronal aktivitet er ikke begrenset til de mesenteriale og / eller bekkennerveceller innervating mage-tarmkanalen. Andre har vist at nerve opptak kan utføres i afferenter forsyne kneleddet 25, mens andre har karakterisert blære afferente nerveaktivitet, så vel 26-28, og viste at bekkenet afferenter fra blæren, samt mage-tarmkanalen løper sammen, hvilket kan føre til neuronal crosstalk 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet nedenfor ble godkjent av komiteen for medisinsk etikk og bruken av forsøksdyr ved Universitetet i Antwerpen (filnummer 2012-42).
1. Tissue Forberedelse av Jejunal og Kolon afferente nerver
- Klargjøring av jejunal afferent nerve
- Utfør gnager dødshjelp av ungdom eller voksen gnager som er godkjent før eksperimentet ved den lokale Etisk Komité (f.eks., Terminal sedering fulgt av hjertestans punktering, halshugging, etc.).
MERK: Vi brukte cervikal dislokasjon å ofre dyrene således resulterer i forsøk uten behov for ytterligere anestesi eller post-kirurgisk behandling som vev behandles videre in vitro.
MERK: Alder har vist seg å dempe mesenteric afferente mechanosensory funksjoner 30, vi anbefaler derfor forskere til å holde seg til en bestemt aldersgruppe for varigheten avet enkelt eksperiment. - Plasser ofret forsøksdyr i liggende stilling og utføre en abdominal midtlinjen snitt gjennom huden og mage muskelen laget ved hjelp av en skalpell, som strekker seg fra xyphoid prosessen til skambeinet.
- Bade bukhulen med kald Krebs-løsning for å hindre at intraabdominale vev fra å tørke ut (Krebs sammensetning: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2PO 4, 15,43 mM NaHCO 3, 1,21 mM MgSO4, 11,52 mM D-glukose og 1,52 mM CaCl2).
- Raskt skjære hele jejunum bruker skarp saks ved excising ca 20 cm av tynntarmen starter umiddelbart distalt av duodenojejunal fleksing, tar seg ikke å skade omkringliggende strukturer og holde tarmen er mesentery, som inneholder jejunale blodkar og afferente nerver, intakt.
MERK: For bare jejunal disseksjon i bukhulen, en trenger ikke å brukeet stereomikroskop, da dette lett kan visualiseres med det blotte øye. - Plasser det utskårede jejunum i iskald Krebs-løsning og holde på is, samtidig som oksygenering av Krebs-oppløsning kontinuerlig med karbogen (95% O2, 5% CO2).
- Skjær jejunum med skarp saks i ca 3 cm lange sløyfer. Observer mesenteric bunt med fartøyene og innvoller nerve et sted nær sentrum av den respektive loop.
- Spyl hvert segment med Krebs-oppløsning ved hjelp av en butt kateter for å fjerne luminale innhold og kymus som disse inneholder fordøyelsesenzymer som vil akselerere forringelse av vevsprøve in vitro.
MERK: Pass på at du ikke skader lumen av loopen ved spyling, som ødeleggelsen av villi vil resultere i frigjøring av mediatorer som kan endre afferent nerve aktivitet. - Identifiser segmentet for å måle den afferente nerveaktivitet (for eksempel, den første jejunal segment distalt av Treitz-senen eller duodenojejunal bøyning), og legg dette i en spesialbygde opptakskammeret belagt med en silikon elastomer lag.
MERK: Begynnelsen av jejunum er anatomisk definert som en del av tynntarmen hvor Treitz-senen krysser tynntarmen, også kalt duodenojejunal flexure.
MERK: Dekk bunnen av opptakskammeret med et tynt lag silikon-elastomer i god tid før starten av forsøket. Utarbeidelsen av denne elastomer lag skal utføres i henhold til produsentens instruksjoner 1. - Perfuse kammeret kontinuerlig med varm, carbogenated Krebs-oppløsning ved en hastighet på 10 ml / min og holder Krebs 'temperaturen i opptakskammeret konstant ved 34 ° C.
- Monter jejunal-segmentet i organbadet, slik at den orale ende er forbundet med sprøytedriveren tilveiebringe luminal strømmen og aboral enden kobles til utstrømning. litt stretch segmentet, men tar seg ikke å utøve overdreven spenning. Fest begge endene fast bruker 4/0 silkeligaturer til inn- og utløpsportene.
- Fest sprøyten driveren til munnende, og perfuse den jejunal segmentet intraluminally med Krebs-løsning (ikke-oksygenert, omgivende temperatur) ved en hastighet på 10 ml / time.
- Pin mesenteriet av montert tarmsegmentet flatt mot silikonelastomer bunnlaget, ved hjelp av insekt nålene. Strekk mesenteriet ut for å optimalisere visualisering av den mesenteriske bunten; ikke utøve press på bunten eller jejunum.
- Utfør en test rampe distensjon (se nedenfor) ved å lukke utgang inntil intraluminal trykket av tarmsegmentet når 60 mmHg, for å bekrefte at ingen intraluminal Krebs løsning lekker fra den monterte segmentet. Observere en jevn økning i intraluminal trykk uten avbrudd.
- Observere små sammentrekninger i segment (peristaltiske wave) under den innledende fase distensjon. Om nødvendig, blokkerer peristaltiske aktivitet ved tilsetning av 1 uM av kalsiumkanalblokkeren nifedipin L-type i Krebs løsning.
MERK: Legge 1fiM av atropin til Krebs løsning i tillegg til nifedipin, vil fullstendig lamme tarmsegmentet. Vi har imidlertid ingen personlig erfaring med bruk og virkning av atropin på afferent nerve opptaket. - Under en stereomikroskop, forsiktig begynne å skrelle av fettvev fra mesentery ved forsiktig lugger det med to små pinsett, tar seg ikke å skade skip og afferent nerve som ligger begravet i fettvev.
- Start med en fjerntliggende avstand fra jejunum, og eksponere begge blodkar i det mesenteriske bunten.
- Observer afferent jejunal nerve i mellom begge fartøyene som en tynn, hvit tråd innkapslet i fettvev. Bare dissekere mer proksimalt mot jejunum ved forsiktig peeling fettvev unna ved hjelp pinsett nårtidlig identifisering av både mesenteriets fartøy og / eller afferent nerve er vanskelig.
- Dissekere jejunal mesenteriske nerve av segmentet fri over en avstand på flere millimeter, ved fjerning av fettvev heftende til nerven.
- Skjære over nerve ved hjelp av skarpe vev saks. Om nødvendig, skrelle av det gjenværende fett og bindevev, så vel som epineuronal slire ved forsiktig å rykke det med liten pinsett.
- Ved hjelp av en mikromanipulator, senke spissen av suge elektroden, som er koblet til en sprøyte med stempelet, inn i organbadet; deretter, ved manipulering av stemplet, forsiktig aspirere noen Krebs-løsning fra organbadet slik at spissen av elektroden er neddykket i Krebs-oppløsning (figur 1). Sørg for at Krebs løsningen dekker ledningen elektrode inne i suge elektroden.
MERK: Klargjør borsilikatglass suge kapillar som inneholder trådelektrode før starten av forsøket ossing en pipette avtrekker. - Posisjonere spissen av suge elektroden umiddelbart ved siden av transektert afferent nerve tråden og trekker den transektert nerve tråden inn i det kapillære over hele sin lengde.
- Manøvrere elektrodespissen mot noen fettvev og suge dette inn i glasset mens kapillar fast aspirering med stempelet, for derved å mekanisk "tetning" nerven i kapillaren fra innholdet i organbadet.
- Verifisere opptak av afferente nerveaktivitet ved å bruke datainnsamlingssystemet, for eksempel ved å utføre en rampe distensjon-indusert økning i afferent avfyring (se nedenfor). Etter isolering av nerve inn i suge elektrode, stabilisere preparatet i 15 minutter for å oppnå en stabil tilstand spontan afferent nerveaktivitet før utfører selve eksperimenter.
- For å utføre rampe oppblåsthet, distend tarmsegment ved å lukke utgang, noe som fører til gradual økning i trykket i tarmsegmentet (opp til 60 mmHg). Bare utføre den ønskede forsøksprotokoll når tre påfølgende rampe distensions (med en 15 min intervall) gi en reproduserbar multi-unit utslippet (figur 2).
- Utfør gnager dødshjelp av ungdom eller voksen gnager som er godkjent før eksperimentet ved den lokale Etisk Komité (f.eks., Terminal sedering fulgt av hjertestans punktering, halshugging, etc.).
- Utarbeidelse av korsryggen innvoller afferent (colonic afferent nerve)
MERK: disseksjon av colonic afferente nerver krever en mer detaljert disseksjon. Avvik fra den tidligere "jejunal 'protokoll er listet nedenfor:- Avlive dyret ved hjelp av en human måte, legg den i liggende stilling, utføre en midtlinjen laparotomi og overdrevent hell iskald Krebs løsning i bukhulen. MERK: Krebs sammensetning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glukose og 2,5 mM CaCl2, 3 uM indometacin.
MERK: Legg merke til endret sammensetning av Krebs løsning; indomethacin tilsettes til såning for å forhindre forandringer av afferente nerveaktivitet av prostaglandiner. - Kast fettvev, blære og indre genitalia, og forsiktig forskyve tynntarmen til den ene side i bukhulen. Utføre en utvidet prelevation av den distale del av tykktarmen med intakte mesenteriske nerver fra magen.
MERK: Viktige landemerker som kan inngå i denne disseksjon for å hjelpe videre utarbeidelse av vev inkluderer abdominal aorta og vena cava, venstre nyre og bekkenbunnsmuskulaturen.
MERK: Under disseksjon, tar seg ikke å utøve trekkraft på forbindelses vev mellom kolon og abdominal aorta, som denne regionen inneholder lumbale innvoller nerver. - Overfør vevet segmentet silikonelastomer foret opptak kammer. Bruk venstre nyrearterien, som stammer fra den abdominale aorta, som et utgangspunkt. Følg abdominal aorta i aboral retning, møter den overlegne mesenteric arterie sammen med cøliaki og overlegen mesenteric ganglion. Til slutt ankommer forbindelsesvevet mellom den distale delen av tykktarmen og i aorta, karakterisert ved at den nerve av interesse er plassert.
- Identifisere arteria mesenterica inferior som stammer fra den abdominale aorta. Den lumbale innvoller afferent nerve kan identifiseres på basis av arteria mesenterica inferior; det går parallelt med arterie (figur 3).
- Etter tran av nerve, forsiktig løsner det omkringliggende bindevev skjede og erte nerven i flere fine tråder. Sørg for å holde en trygg avstand fra tykktarmen.
- Trekke en av disse enkelttråder inn i suge elektrode, 'sel' kapillaren med omkringliggende fettvev som tidligere beskrevet, og utføre den ønskede forsøksprotokoll.
- Forkaste enhver overflødig vev som er tilstede i organbadet (f.eks, nyrer, abdominal fartøy, muskelvev), ens disse kan forstyrre afferent signal.
MERK: Nifedipin (1 uM) kan tilsettes til Krebs-løsningen i tilfelle afferent nerve signal blir forstyrret av spontan intestinal bevegelse på grunn av glattmuskelcelle sammentrekninger.
MERK: Legemidler kan administreres på tre forskjellige steder: 1) serosally ved oppløsning av den ønskede forbindelse inn i Krebs at perfuses opptakskammeret, 2) direkte inn i organbadet mens midlertidig stoppe perfusjon eller 3) intraluminally ved å løse opp forbindelsen av interesse inn i Krebs løsning i sprøyten stasjonen. Desensitivisering av den afferente nerve kan forekomme når kumulative doser av en forbindelse som administreres for raskt etter hverandre.
- Avlive dyret ved hjelp av en human måte, legg den i liggende stilling, utføre en midtlinjen laparotomi og overdrevent hell iskald Krebs løsning i bukhulen. MERK: Krebs sammensetning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glukose og 2,5 mM CaCl2, 3 uM indometacin.
Figur 1: Skjematisk oversikt over formålet-bygget opptak Chamber og suge elektrode Detaljert oversikt over Techni. cal oppsett med suge elektroden og opptakskammeret på plass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative Frembringelse av den in vitro for opptak av Jejunal afferente nerveaktivitet Typisk opptak av jejunal multi-enhet afferente nerveaktivitet (imp.sec -1) (øvre panel) ved start og i respons til 2 rampe distensions opp til 60 mmHg. (nedre panel), og den påfølgende identifikasjon (wavemark analyse) av ulike enkeltheter i nervesignaler (tredje panel). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
Fig. 3: nevroanatomi av kolon A) sensorisk informasjon fra tykktarmen føres gjennom lende colonic nerver (LCN) mot det sentrale nervesystemet, og LCN løper i umiddelbar nærhet til arteria mesenterica inferior (IMA). En del av fibrene fra dette lumbar colonic nerve vil naturligvis langs intermesenteric nerve (IMN) for å danne de lumbale innvoller nerver (LSN). Den dårligere mesenteric ganglion (IMG) ligger på opprinnelsen til IMA fra abdominal aorta. Opptak i avstand fra IMG er obligatorisk bør forskerne ønsker å studere viscerofugal afferent nerve aktivitet. B) En skjematisk oversikt over den eksperimentelle oppsett. Afferent opptak av LCN er utført i et organ som begge ved hjelp av en sugeelektrode koplet til datainnsamlingssystemet. Ramp distensjon kan utføres ved nedleggelse av utløpsåpningen mens du fortsetter tilsig avKrebs løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Data Acquisition
- Spill nerve aktivitet via en suge elektrode koblet til en heads. Forsterke (få 10k) og filtrere signalet (båndpass 500 - 5000 Hz) 20.
MERK: En 50/60 Hz Noise Eliminator bør inkluderes i den eksperimentelle oppsettet for å fjerne 50/60 Hz elektriske forstyrrelser støysignaler. Signalet er automatisk, digitalisert og samplet ved 20 kHz for analyse.
3. Analyse 5,20
- Rapportere afferent nerve tømming som det totale antall impulser / sekund for hele nerve eller bruk spesialisert programvare for å utføre ytterligere analyse, som multi-enhets opptak av generell nerveaktivitet inneholde aksjonspotensialer av forskjellig form, amplitude og bredde, svarende til forskjellige nerve enheteri hvert afferent fiber (figur 2).
- Match individuelle wavemarks til forhåndsdefinerte maler, slik at diskriminering mellom enkeltheter. Før tildeling av en pigg til en viss bølge mark, et forhold signal-til-støy på> 2: 1 skal håndheves.
MERK: Under wavemark analyse, konstruerer vi en ny mal når minst 10 tilsvarende toppene er identifisert ved analyse programvare. Ingen mal er konstruert for figurer sjeldnere enn 1 av 50 pigger. En pigg er avstemt til en templat ved hjelp prinsipp komponentanalyse når minst 80% av sine punkter er identisk med templatet pigg. Mal matching er operatøravhengig, og bør alltid utføres av samme forsker i en blindet måte. - Beregn virkningspotensialet responser ved å subtrahere den spontane aktivitet i utgangspunktet (intraluminal trykk av 0 mmHg) fra responsen under distensjon ved faste tidspunkter (5 mmHg av tilveksten fra 0 til 20 mmHg intraluminale trykk, trinn på 10mmHg fra 20 mmHg og utover). Mål baseline afferent utslippet med en bin størrelse på 10 sek.
- Bruk én enhet analyse for å klassifisere fibre basert på deres utskrivning profil under rampen distensjon (figur 4). I tillegg kan én enhet analyse bli anvendt for å studere kjemosensitiv profilen av forskjellige typer enheter, som ikke alle typer enheter vil vise det samme avfyrings endret aktivitetsnivået til et medikament eller forbindelse.
- Klassifisere fibre som lavterskel fibre ( 'LT', vanligvis utøve økt utslipp på lavere distensjon trykk), høy terskel fibre ( "HT", utøve økt utslipp på høyeste distensjon press), bredt dynamisk område fibre ( 'WDR', demonstrere økt avfyring under hele rampen distensjon) eller mekanisk ufølsomt afferent ( 'MIA', nervefibre som vanligvis ikke responderer på rampen distensions) 5; 20.
- Uttrykk nerve avfyring respons på 20 mmHg som percentage av maksimal avfyring respons under distensjon (LT%) som det gjenspeiler graden av brenning ved lav utspilt trykk.
MERK: Derfor er LT fibre karakterisert ved en LT%> 55%, mens HT er definert ved en verdi på <15%. Verdier for WDR enheter varierer mellom 15 og 55% (20). En MIA viser spontan afferent avfyring som er upåvirket av distensions.
Fig. 4: Skjematisk representasjon av forskjellige afferente fiber enheter basert på deres Mechanosensitive profil Enhetene er klassifisert basert på den prosentvise (LT%) av deres skuddtakt på 20 mmHg distensjon trykk i forhold til den maksimale responsen under avfyring distensjon. Lavterskel fibre (øvre venstre panel) overveiende vise en økt nerve aktivitet ved lave distensjon trykk, noe som resulterer i en LT% på over 55%. Høy terskel enheter (øverst til høyrepanel) tvert imot bare vise en økning i avfyringshastigheten ved skadelige trykk (% LT <15). Bredt dynamisk område fibre (nedre venstre panel) viser en gradvis økning i nerve aktivitet under hele distensjon (% LT varierer mellom 15 og 55), mens mekanisk ufølsomme fibre (høyre panel lavere) ikke svare på økende distensjon trykk. LT%: (afferent skyte på 20 mmHg / maksimal afferent avfyring) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jejunal afferent nerve aktivitet ble målt ved baseline og som svar på rampen oppblåst i ni åtte ukers gammel mannlig AV-1 mus. Dyrene ble huset i grupper i standardiserte betingelser (6 dyr per bur, 20-22 ° C, fuktighet 40 - 50%, 12 timers lys-mørke-syklus) med ubegrenset tilgang på vann fra springen og regelmessig chow. Jejunal segmenter av mus viste uregelmessig spontan afferent nerve utslipp ved start på en intraluminal trykk på 0 mmHg (gjennomsnittlig spontan aktivitet 11,47 ± 3,31 imp / sek).
Den jejunal afferent nerve aktivitet økt ved å utføre rampe distensions opp til 60 mmHg. Vanligvis er økningen i afferente nerveaktivitet som følge av økningen i intraluminale trykk, karakterisert ved en bifasisk respons (figur 5), som består av en innledende rask økning i avfyrings aktivitet opp til den intraluminale trykk når 20 mmHg, hh kan i hovedsak tilskrives økt skuddtakt av lavterskel fibre. Dette blir så fulgt av en platåfase, hvoretter en andre økning i avfyrings aktivitet kan observeres fra 40 mmHg og utover, som representerer aktiveringen av overveiende høye terskel fibre.
Basert på deres bølgeformer, kan enkeltheter bli diskriminert i hver multi-enhet opptak og klassifisert i en av de ovennevnte fire kategorier. I 9 mus, diskrimineres vi 40 forskjellige enheter (4,44 ± 1,01 enheter / jejunal afferente nerve), med LT-enhetene være de mest utbredte seg, etterfulgt av WDR og HT fibre (figur 6). Avfyringen aktiviteten til de forskjellige enheter som respons på rampen distensjon kan observeres i figur 7.
Figur 5:
Figur 6:. Single Unit Fordeling av 40 enheter identifisert i Jejunal afferente nerver fra 9 villtype mus HT: høy terskel fiber, LT: lav terskel fiber, MIA: mekanisk vennlig fiber, WDR: bredt dynamisk område fiber._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7:. Trykk-responskurver for de forskjellige typer underenheter i villtype mus Singelen-enhet afferente nerve utladning (imp.sec -1) fra de fire ulike enheter som kan identifiseres, i villtype mus under rampen distensions. En lav terskel fiber (LT, øverst til venstre figur) er preget av en innledende rask økning i skyting aktivitet under distensions, mens den høye terskelen fiber (HT, nedre venstre figur) viser bare økt tenning under skadelige intraluminale press. Bredt dynamisk område fibre (WDR, øvre høyre figur) viser en jevn økning i skyting aktivitet under hele oppblåsthet, og Mekano-ufølsom afferente fibre (MIA, nederst til høyre figur) ikke svare på økende intraluminale trykk. verdier repmislike middel afferent utslipp ± sem imp.sec -1. impulser per sekund Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen i dette notatet beskriver en reproduserbar laboratorium teknikk for å studere mesenteric afferent nerve aktivitet hos gnagere som brukes av vår gruppe og andre 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritiske trinnene i protokollen inkluderer rask isolering av vev, aspirasjon av nerven strengen inn i suge elektroden og tilstrekkelig "forsegling" av glasskapillær fra organbadet ved å aspirere omgivende fettvev inn i kapillaren. Den åpning av glasskapillære bør være presist bestemt: en åpning som er for liten vil komplisere aspirasjon av nerve strengen inn i elektroden, mens en altfor stor blenderåpning vil hindre den "forsegling" av kapillaren med fettvev, noe som resulterer i overflødig bakgrunnsstøy som vil hemme analyse (lavt signal-til-støy-opptak). For å muliggjøre pålitelig enkelt enhet klassifisering, bør innvoller afferenter deles i forskjellige strenger for å redusereantall enheter i opptaket. Vanligvis ville vi foreslå mål å ha et maksimalt 4 - 5 enheter i hvert opptak. Forskere derfor burde justere blenderåpningen basert på fiber av interesse, og lab dyr som er brukt.
Et annet kritisk punkt omfatter tilstrekkelig jording av eksperimentelle oppsettet. Suge elektrode og opptak av kammeret bør være tilstrekkelig jordet og er dekket av et Faraday-bur for å redusere interfererende elektriske felt som hindrer analyse av neuronal aktivitet, mens alt annet utstyr inkludert registreringsapparater, bør sprøyte driver et cetera installeres utenfor buret .
Ved å ta opp afferente nerveaktivitet i umiddelbar nærhet til jejunum eller tykktarmen, kan man isolere den første delen av den afferente signaltransduksjon kjede og lett å studere bidrag, og endringer som opptrer på den eneste afferent nivå uten innblanding fra den sentrale nervOUS-systemet. En av begrensningene ved denne teknikken er det faktum at in vitro observasjoner ikke alltid kan lett ekstrapoleres til den in vivo miljø, som in vitro oppsettet bare inneholder en reléstasjon i det komplekse nervesignalkaskade. Som sådan, må et bredere bilde gjøres innlemme alle andre stasjoner, for eksempel ryggmargen, sentralnervesystemet (f.eks funksjonell avbildning av hjernen) og synkende (hemmende) efferente baner.
En annen fordel med denne fremgangsmåten utgjør ganske enkel teknisk fremgangsmåte, da man ikke lenger har til å overvåke velvære for laboratoriet dyr som gir de gastrointestinale prøven. På den annen side er den in vitro måling av neuronal aktivitet ikke er egnet til å belyse virkningen av en systemisk administrert medikament på afferente nerve utladning, men forskere kan teoretisk overvinne denne hindring ved systemisk administrering av legemidlet of interesse til dyret, etterfulgt av ex vivo in vitro opptaket av afferent nerve-aktivitet. Imidlertid bør man være oppmerksom på det faktum at noen stoffet til stede i innspillingen kammeret vil bli utvannet på grunn av badekaret perfusjon under disseksjon og påfølgende opptak. Til slutt, utføre in vitro innvoller nerve opptak med genmodifiserte dyr kan tillate forskere å fullt ut klargjøre rollen av ulike kanaler og reseptorer uttrykt på afferente fibre.
Forskere forsøker å implementere denne teknikken må også huske på at identifisering og isolering av mesenteric afferent og bekken afferente åpenbart krever kunnskap om grunnleggende anatomi og teknisk trening, og forskere burde være kjent med de grunnleggende prinsippene for neuronal elektrofysiologi.
In vitro-innstillingen videre tillater forskere å enkelt identifisere mulige farmakologiske tjæreblir, og gir et innblikk i den fysiologiske rollen til neuronal aktivitet samt endret sensorisk signalisering i en rekke sykdomsprosesser.
Ved jejunale afferente målinger, kan flere vev segmenter av et enkelt dyr studeres samtidig, en funksjon som er ganske vanskelig å bruke en in vivo oppsett. Forskere bør imidlertid forsiktig tolke resultatene fra forskjellige segmenter, som regionale forskjeller could skjevhet resultater. Derfor vil vi anbefale å konsekvent måle afferent nerve aktivitet fra samme sted (for eksempel første segmentet distalt fra Treitz-senen eller duodenojejunal flexure).
Typiske nåværende og fremtidige anvendelser av denne teknikken omfatter screening av farmakologiske forbindelser som kan endre sensibilisering av mesenteriets afferente under patologier som er preget av visceral hypersensitivitet og smerte. Som allerede nevnt før, er målet forSE forbindelser kan være oppstått et eller annet sted langs den intrikate nervesystemet som strekker seg fra det enteriske iboende nervesystemet til hjernen; som sådan, karakterisere og modulering av afferente nerveaktivitet bidrar til det større bildet som også omfatter den kalsium-avbildning av den iboende enteriske nerver og dorsale rotganglier, måling av visceromotor responsen som en indikator på visceral hypersensitivitet in vivo, og funksjonell hjerneavbildning, blant andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
