Abstract
Afferente nerver ikke kun overføre information vedrørende den normale fysiologi, men også signalere forstyrret homeostase og patofysiologiske processer i respektive organsystemer fra periferien mod centralnervesystemet. Som sådan har den øgede aktivitet eller "overfølsomhed" af mesenteriske afferente nerver fået tildelt en vigtig rolle i patofysiologien af visceral hypersensitivitet og mavesmerter syndromer.
Mesenteriske afferent nerve aktivitet kan måles in vitro i et isoleret tarm segment, der er monteret i et specialbygget organbad, og hvorfra splanknisk nerve er isoleret, hvilket tillader forskerne til direkte vurdere nerveaktivitet støder op til den gastrointestinale segment. Aktivitet kan optages ved baseline i standardiserede forhold, under udspiling af segment eller efter tilsætning af farmakologiske forbindelser leveret intraluminalt eller serosally. Denne teknik tilladerforskeren for nemt undersøge effekten af lægemidler rettet mod det perifere nervesystem i kontrol prøver; Desuden er det giver vigtige oplysninger om, hvordan neuronal aktivitet ændres under sygdom. Det skal dog bemærkes, at måling afferent neuronal fyring aktivitet kun udgør én relæstation i den komplekse neuronal signalering kaskade, og forskerne skal huske på ikke at overse neuronal aktivitet på andre niveauer (fx dorsalrodsganglier, rygmarv eller centralnervesystemet ) for fuldt ud at belyse den komplekse neuronale fysiologi i sundhed og sygdom.
Almindeligt anvendte applikationer omfatter studiet af neuronal aktivitet som respons på administrationen af lipopolysaccharid, og studiet af afferent nerve aktivitet i dyremodeller af irritabel tarmsyndrom. I en mere translationel tilgang, kan det isolerede intestinale segment mus udsættes for colon supernatanter fra IBS-patienter. Desuden er en modifikationved denne teknik er for nylig blevet vist at være anvendelig i humane colon prøver.
Introduction
Sensorisk signalering og smerteopfattelse er en kompleks proces, der resulterer fra en indviklet samspil mellem afferente nerver, spinal neuroner, op- og nedstigende facilitatory og hæmmende veje og flere forskellige hjerneområder. Som sådan kan ændringer ved en eller flere af disse niveauer resultere i ændret sensorisk signalering og visceral smerte i sygdomstilstande. For at undersøge alle disse forskellige aspekter af sensorisk signalsystemer flere teknikker er blevet udviklet lige fra encellede eksperimenter (f.eks calcium imaging på neuroner) til hele dyremodeller (f.eks adfærdsmæssige reaktioner såsom visceromotor respons). Den i dette dokument teknik tillader forskerne at foretage en specifik vurdering afferent nerve aktivitet in vitro fra et isoleret segment af tyndtarmen eller tyktarmen hos gnavere. Kort sagt er en isoleret gastrointestinal segment (sædvanligvis jejunum eller colon) monteret i et specialbygget optagelse kammer perfunderet med en fysiologisk KRebs opløsning. Den splanknisk nerve dissekeres fri og forbundet til en elektrode tillader registrering af afferent neuronal aktivitet i splanknisk eller bækken afferente nerver. Nerveaktivitet kan optages basalt eller som reaktion på stigende intraluminale tryk og / eller farmakologiske forbindelser, der kan anvendes enten direkte ind i optagelsen kammeret (serosally), eller via intraluminale perfusat (mucosalt) for at vurdere deres virkning på afferent udledning 1-6 . Af note, splanknisk nerver indeholder også efferente fibre og viscerofugal afferenter foruden de sensoriske afferenter. En af de store fordele ved ex vivo splanknisk nerve optagelse er, at forskerne kan kvantificere nerveaktivitet uden graduering eller input fra centralnervesystemet, tillader en at studere den direkte virkning af lokalt anvendte forbindelser på nerveaktivitet. Endvidere monitorering af vitale parametre, som det er nødvendigt under anvendelse af in vivo fremgangsmåde (se nedenfor), er no længere relevant. In vitro splanknisk optagelse er endelig langt mindre tidskrævende end in vivo modstykke.
Afferent neuronal aktivitet som respons på andre stimuli, såsom mucosal strøg, sondering hjælp von Frey-hår eller strækning af segmentet, kan studeres i en modificeret forsøgsopstilling, hvor det intestinale væv holdt nede og åbnet på langs (som er i modsætning til vores setup ved hjælp af en intakt segment), som blev beskrevet i en tidligere emne 7,8. Hertil kommer, først for nylig, blev en teknik beskrevet at studere colon afferent nerve aktivering i selve colon væg via calcium imaging, igen ved hjælp af et fastgjort ned, på langs åbnet segment 9.
En alternativ version af denne in vivo teknik består af måling neuronal aktivering nær afferente indtræden i rygmarven. Kort sagt er den sederet dyr anbringes i bugleje, exposing lumbosacral rygmarven, som afferent nerve steder projekter ved hjælp af laminektomi, opføre et paraffin-fyldt brønd under anvendelse af huden af snittet og drapering den dorsale rootlet over en platin bipolær elektrode 10,11. Denne teknik gør det endvidere muligt for forskerne at karakterisere fibre baseret på deres ledningshastighed, og skelne umyelinerede C-fibre fra tyndt myelinerede Aδ-fibre. Endvidere dorsale rodspirer udelukkende indeholder sensoriske afferente fibre, i modsætning til de blandede afferente og efferente splanknisk nerver nævnt tidligere.
Optagelse afferente nerve udledning in vitro fra isolerede gut segmenter kan også gøres ved hjælp af humane prøver, som to forskergrupper uafhængigt offentliggjort første-i-mand manuskripter optagelse colon afferent nerveaktivitet i human resektion prøver 12,13. Gennemførelsen af denne teknik kan resultere i en lettere translatipå af murine data til human tilstand, og kan gøre det muligt for forskerne at nemt at identificere lægemidler rettet mod den sensibiliserede sensoriske nerve. Den kliniske betydning af karakterisere afferent nerveaktivitet, samt opdagelsen af nye terapeutiske reagenser, der er målrettet ublu afferent nerveaktivitet, er blevet kunstfærdigt diskuteret af mange eksperter på området 14-19.
Den førnævnte in vitro teknik supplerer mere almindeligt kendt in vivo måling af afferent nerveaktivitet. Under in vivo neuronal aktivitet måling, kan nerveaktivitet måles direkte i sederet dyr, i hvilken segmentet af interesse identificeres og efterfølgende intuberet, og en flydende paraffin fyldt godt konstrueres ved anvendelse bugvæggen og huden af gnaver 20. Den afferent nerve af interesse identificeres derefter, snittet og placeres på en bipolær platinelektrode, tillader neuronal aktivitet measurement. Denne teknik gør det muligt for forskeren at modulere afferent nerveaktivitet i levende omend bedøvede dyr; som sådan, kan man studere neuronal aktivitet at reagere på interferens såsom luminal udspiling eller intravenøs administration af en forbindelse.
Translationel forskning fokuserer i dag primært på anvendelse af human-afledte supernatanter (f.eks. Fra biopsier fra colon, dyrkede perifere mononukleære blodceller, etc.) på jejunale og / eller colon mus afferenter 21,22. Forskere kan direkte anvende supernatanter enten ind i organet bad eller i den intraluminale løsning, der gennemløber vævet tarmen segmentet, således at forskellige virkninger af serosa versus slimhinde ansøgning kan studeres på afferent nerve udledning. Som sådan blev det vist, at colon mucosa-biopsi supernatanter fra patienter med irritabel tyktarm kan forårsage overfølsomhed i muse colon afferenter, marsvin submukøse neuroner og muse dorsale rodganglieneuroner 21,23,24.
Endelig optagelse neuronal aktivitet er ikke begrænset til den mesenteriale og / eller bækken neuroner innerverer mavetarmkanalen. Andre har vist, at nerve optagelser kan udføres i afferente levere knæleddet 25, mens andre har karakteriseret blære afferent nerveaktivitet samt 26-28, og viste, at bækken afferenter fra blæren samt mavetarmkanalen konvergere, hvilket kan resultere i neuronal crosstalk 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet nedenfor blev godkendt af Udvalget for medicinsk etik og brugen af forsøgsdyr ved universitetet i Antwerpen (filnummer 2012-42).
1. Tissue Forberedelse af jejunal og Colon afferente nerver
- Forberedelse af jejunal afferent nerve
- Udfør gnaver aflivning af den unge eller voksne gnaver, der er blevet godkendt inden forsøget af den lokale etiske udvalg (f.eks., Terminal sedation efterfulgt af hjertepunktur, cervikal dislokation, etc.).
BEMÆRK: Vi anvendte cervikal dislokation at ofre dyrene således resulterer i eksperimenter uden behov for yderligere anæstesi eller post-kirurgisk omhu som væv videreforarbejdes in vitro.
BEMÆRK: Alder har vist sig at dæmpe mesenteriske afferente mechanosensory funktioner 30, vi derfor råde forskere til at holde sig til en bestemt aldersgruppe for varigheden afet enkelt forsøg. - Placer aflivet forsøgsdyr i liggende stilling og udfører en abdominal midtlinieincision gennem huden og abdominale muskel lag under anvendelse af en skalpel, der strækker sig fra xyphoid processen indtil skambenet.
- Bade bughulen med kold Krebs-opløsning for at forhindre det intra-abdominale væv mod udtørring (Krebs sammensætning: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCI, 1,57 mM NaH 2 PO4, 15,43 mM NaHCO3, 1,21 mM MgSO4, 11,52 mM D-glucose og 1,52 mM CaCl2).
- Hurtigt udskære hele jejunum hjælp skarp saks ved udskæring ca. 20 cm af tyndtarmen begynder straks distalt for duodenojejunal bøjning, pas på ikke at beskadige omkringliggende strukturer og holde tarmen er mesenterium, som indeholder jejunale blodkar og afferente nerver, intakt.
BEMÆRK: den blotte jejunum dissektion i bughulen, man behøver ikke at brugeet stereomikroskop, som dette kan let visualiseres med det blotte øje. - Placer udskårne jejunum i iskold Krebs-opløsning og holde på is, mens ilte Krebs-opløsning kontinuerligt med carbogen (95% O2, 5% CO2).
- Skær jejunum med skarpe saks i ca. 3 cm lange sløjfer. Overhold mesenteriske bundle indeholder skibe og splanknisk nerve eller andet sted nær centrum af den respektive loop.
- Skyl hvert segment med Krebs-opløsning ved anvendelse af en stump kateter til fjernelse lumen indhold og Chyme da disse indeholder fordøjelsesenzymer, der vil fremskynde forværringen af vævsprøven in vitro.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige lumen af løkken under skylning, som ødelæggelsen af villi vil resultere i frigivelse af mediatorer, der kan ændre afferent nerveaktivitet. - Identificer segmentet at måle afferent nerveaktivitet (f.eks den første jejunal segment distalt for Treitz-ligamentet eller duodenojejunal bøjning), og placere dette i et specialbygget optagelse kammer belagt med en silikoneelastomer lag.
BEMÆRK: Begyndelsen af jejunum er anatomisk defineret som den del af tyndtarmen, hvor Treitz-ligamentet sender tyndtarmen, også kaldet duodenojejunal bøjning.
BEMÆRK: Dæk bunden af optagelsen kammer med et tyndt silikoneelastomer lag i god tid før starten af forsøget. Udarbejdelsen af denne elastomer lag skal udføres i henhold til producentens anvisninger 1. - Perfundere kammeret konstant med varm, carbogenated Krebs-opløsning ved en hastighed på 10 ml / min og holde Krebs 'temperatur i optagelsen kammeret konstant ved 34 ° C.
- Monter jejunal segment i organbadet således, at den orale ende er forbundet til sprøjten driver leverer luminale gennemstrømning og aboral ende forbindes til udstrømningen. Lidt stgylpe segmentet, men passe på ikke at trykke for spændinger. Fastgør begge ender fast med 4/0 silke ligaturer til ind- og udstrømning porte.
- Fastgør sprøjten driveren til den mundtlige ende, og perfundere den jejunal segment intraluminalt med Krebs-opløsning (ikke-iltet, omgivelsestemperatur) med en hastighed på 10 ml / time.
- Pin mesenterium fra den monterede intestinal segment fladt mod silikoneelastomeren nederste lag, ved hjælp af insekt ben. Stræk mesenterium ud for at optimere visualisering af mesenteriske bundt; ikke lægge pres på bundtet eller jejunum.
- Udfør en test rampe distension (se nedenfor) ved at lukke output port indtil intraluminale tryk af den intestinale segment når 60 mmHg, for at kontrollere, at ingen intraluminale Krebs-opløsning lækker fra den monterede segment. Overhold en jævn stigning i intraluminale tryk uden afbrydelser.
- Overhold små sammentrækninger af segment (peristaltisk waves) i den indledende distension fase. Hvis det er nødvendigt, blokerer peristaltiske aktivitet ved tilsætning af 1 uM af L-typen calciumkanalblokker nifedipin til Krebs-opløsning.
BEMÆRK: Tilføjelse 1 uM atropin til Krebs-opløsning udover nifedipin, vil fuldstændig lamme intestinale segment. Vi har dog ingen personlig erfaring med anvendelse og effekt af atropin på afferent nerve optagelse. - Under et stereomikroskop, forsigtigt begynde at skrælle fedtvævet fra mesenteriet ved forsigtigt trækker den med to små pincet, pas på ikke at beskadige skibe og afferente nerve, der ligger begravet i fedtvæv.
- Start med en fjern afstand fra jejunum, og udsætte begge blodkar i mesenteriske bundt.
- Overhold afferente jejunum nerve i mellem begge fartøjer som en tynd, hvid tråd indkapslet i fedtvæv. Kun dissekere mere proximalt mod jejunum ved forsigtigt skrælle fedtvævet væk med en pincet, når deindledende identifikation af både mesenteriske fartøjer og / eller afferent nerve er vanskelig.
- Dissekere jejunum mesenteriale nerve af segmentet fri over en afstand på adskillige millimeter, ved at fjerne fedtvæv klæbende til nerven.
- Transekt nerven hjælp skarp væv saks. Hvis det er nødvendigt, skrælle den resterende fedt og bindevæv, samt epineuronal skede ved forsigtigt tugging det med de små pincet.
- Ved hjælp af en mikromanipulator, sænke spidsen af suge elektrode, forbundet til en sprøjte med stempel, til organbadet; derefter, ved at manipulere stemplet forsigtigt aspireres nogle Krebs-opløsning fra organbadet så spidsen af elektroden er neddykket i Krebs-opløsning (figur 1). Sikre, at Krebs-opløsning dækker trådelektrode inde i suge elektrode.
BEMÆRK: Forbered borsilikatglas sugning kapillar, der indeholder tråden elektrode før starten af eksperimentet osing en pipette aftrækker. - Placer spidsen af suge elektrode umiddelbart ved siden af overskårne afferent nerve streng og trække den overskårne nerve-strengen i kapillarrøret over hele sin længde.
- Manøvrere spidsen af elektroden hen imod nogle fedtvæv og aspirere dette i glasset kapillar mens fast opsugning med stemplet, hvorved mekanisk 'befæstelse' nerven i kapillarrøret fra indholdet i organbadet.
- Kontroller registrering af afferent nerveaktivitet ved hjælp af data erhvervelse systemet, fx ved at udføre en rampe udspiling-inducerede stigning i afferent fyring (se nedenfor). Efter isolering af nerven i suge elektrode, stabilisere præparatet i 15 minutter for at opnå en stabil tilstand spontan afferent nerveaktivitet, før det aktuelle forsøg.
- For at udføre rampe udspiling, udspile den intestinale segment ved at lukke output port, der fører til gradual trykstigning i den intestinale segment (op til 60 mmHg). Kun udføre den ønskede forsøgsprotokollen, når tre på hinanden følgende rampe distensioner (med en 15 min interval) give en reproducerbar multi-enhed udledning (figur 2).
- Udfør gnaver aflivning af den unge eller voksne gnaver, der er blevet godkendt inden forsøget af den lokale etiske udvalg (f.eks., Terminal sedation efterfulgt af hjertepunktur, cervikal dislokation, etc.).
- Forberedelse af lumbal splanknisk afferent (colon afferent nerve)
BEMÆRK: dissektion af colon afferente nerver kræver en mere detaljeret dissektion. Afvigelser fra tidligere "jejunum 'protokol er angivet nedenfor:- Aflive dyret ved hjælp af en human måde, som anbringes i liggende stilling, udføre en midterlinjen laparotomi og overdrevent hælde iskold Krebs løsning i bughulen. BEMÆRK: Krebs sammensætning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glucose og 2,5 mM CaCl2, 3 pM indomethacin.
BEMÆRK: Bemærk den ændrede sammensætning af Krebs-opløsning; indomethacin sættes til sålution for at forhindre ændringer af afferent nerve aktivitet ved prostaglandiner. - Kassér fedtvæv, blære og interne genitalier, og forsigtigt flytte tyndtarmen til den ene side i bughulen. Udfør en udvidet prelevation af den distale del af colon med intakte mesenteriske nerver fra maven.
BEMÆRK: Vigtige landmærker, der kan indgå i denne dissektion for at hjælpe til fortsat behandling af vævet omfatter den abdominale aorta og vena cava, venstre nyre og bækkenbundsmuskulaturen.
BEMÆRK: Under dissektion, passe på ikke at lægge trækkraft på den forbindende væv mellem tyktarmen og den abdominale aorta, da denne region indeholder lumbal splanknisk nerver. - Overfør vævssegment ind silikoneelastomeren foret optagelse kammer. Brug venstre nyrearterie, som stammer fra den abdominale aorta, som udgangspunkt. Følg den abdominale aorta i aboral retning, støder de overlegne mesenteric arterie sammen med cøliaki og overlegen mesenteriallymfeknuderne ganglion. Endelig ankommer til forbindende væv mellem den distale del af colon og aorta, hvor nerven af interesse er placeret.
- Identificer ringere mesenterialarterie stammer fra den abdominale aorta. Den lumbal splanknisk afferent nerve kan identificeres på bunden af den nedre mesenterialarterie; det løber parallelt med arterie (figur 3).
- Efter transection af nerve, forsigtigt skrælle omgivende bindevæv kappe og drille nerven i flere fine tråde. Sørg for at holde en sikker afstand fra tyktarmen.
- Tegn en af disse enkelte tråde ind i suge elektrode, "sæl 'kapillarrøret med omgivende fedtvæv, som tidligere beskrevet, og udføre den ønskede forsøgsprotokol.
- Kassér overflødig væv, der er til stede i organbadet (f.eks, nyrer, abdominale kar muskelvæv), ens disse kan forstyrre afferent signal.
BEMÆRK: Nifedipin (1 uM) kan tilsættes til Krebs-opløsning i tilfælde af afferent nerve signal forstyrres af spontan intestinal bevægelse på grund af glatte muskelceller sammentrækninger.
BEMÆRK: Lægemidler kan indgives på tre forskellige steder: 1) serosally ved opløsning af den ønskede forbindelse i Krebs, der gennemløber vævet optagelsen kammeret, 2) direkte i organbadet under midlertidig standsning af perfusion eller 3) intraluminalt ved at opløse forbindelsen af interesse ind i Krebs-opløsning i sprøjten drevet. Desensibilisering af afferent nerve kan opstå, når kumulative doser af en forbindelse administreres for hurtigt efter hinanden.
- Aflive dyret ved hjælp af en human måde, som anbringes i liggende stilling, udføre en midterlinjen laparotomi og overdrevent hælde iskold Krebs løsning i bughulen. BEMÆRK: Krebs sammensætning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glucose og 2,5 mM CaCl2, 3 pM indomethacin.
Figur 1: Skematisk Oversigt over specialbyggede Recording Afdeling og Suge elektrode Detaljeret overblik over Techni. cal setup med suge elektrode og optagelsen kammer på plads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentant Sporing af In Vitro Registrering af jejunal Afferent nerveaktivitet Typisk optagetid af jejunal multi-enhed afferent nerveaktivitet (imp.sec -1) (øverste panel) ved baseline og som svar på 2 ramp distensioner indtil 60 mmHg. (nederste panel), og den efterfølgende identifikation (wavemark analyse) af forskellige single-enheder i nerve signal (tredje panel). klik her for at se en større version af dette tal.
"Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54.576 / 54576fig3.jpg" />
Figur 3:. Neuroanatomi af tyktarmen A) sensorisk information fra tyktarmen føres via lumbale colonic nerver (LCN) mod centralnervesystemet, med LCN kører i umiddelbar nærhed af den nedre mesenterialarterie (IMA). En portion af fibrene fra denne lumbal colon nerve vil naturligvis langs intermesenteric nerve (IMN) til dannelse lænde splanknisk nerver (LSN). Den ringere mesenterica ganglion (IMG) er placeret på oprindelsen af IMA fra den abdominale aorta. Optagelse distalt for IMG er obligatorisk bør forskerne ønsker at studere viscerofugal afferent nerveaktivitet. B) En skematisk oversigt over den eksperimentelle set-up. Afferente registrering af LCN udføres i et organ både ved hjælp af en suge elektrode forbundet til dataopsamlingssystem. Rampe udspiling kan udføres ved lukning af udløbsporten samtidig med indstrømningen afKrebs løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Data Acquisition
- Notér nerveaktivitet via en suge elektrode forbundet til et hovedtrin. Forstærk (vinde 10k) og filtreres signalet (båndpas 500 - 5.000 Hz) 20.
BEMÆRK: En 50/60 Hz Noise Eliminator bør indgå i forsøgsopstillingen for at fjerne 50/60 Hz elektrisk interferens støjsignaler. Signalet er automatisk digitaliseret og samples ved 20 kHz til analyse.
3. Analyse 5,20
- Rapportere afferente nerve udledning som det samlede antal impulser / sekund for hele nerve eller bruge specialiseret software til at udføre yderligere analyse, som multi-unit optagelser af overordnede nerveaktivitet indeholde aktionspotentialer af forskellig form, amplitude og bredde, som svarer til forskellige nerve enhederi hvert afferente fibre (figur 2).
- Match individuelle wavemarks til foruddefinerede skabeloner, der tillader diskriminering mellem enkelt-enheder. Før tildeling af et spyd til en bestemt bølge-mark, et signal-til-støj-forhold på> 2: bør håndhæves en.
BEMÆRK: Under wavemark analyse, vi konstruere en ny skabelon, når mindst 10 lignende pigge identificeres ved analysen software. Nr skabelon er konstrueret til figurer sjældnere end 1 i 50 spikes. Et spyd er tilpasset til en skabelon ved hjælp principal komponent analyse, når mindst 80% af dets punkter er identisk med templaten spike. Skabelonsammenligning er operatørafhængigt, og bør altid udføres af samme forsker i en blindet måde. - Beregn aktionspotentialet responser ved at subtrahere den spontane aktivitet ved baseline (intraluminale tryk på 0 mmHg) fra reaktion under distension på faste tidspunkter (5 mmHg af tilvækst fra 0 til 20 mmHg intraluminale tryk, trin på 10mmHg fra 20 mmHg og frem). Mål baseline afferente udledning ved anvendelse af en bin størrelse på 10 sek.
- Brug enkelt enhed analyse til at klassificere fibre baseret på deres udledning profil under rampe distension (figur 4). Derudover kan en enkelt enhed analyse anvendes til at undersøge chemosensitive profil forskellige typer enheder, som ikke alle typer enheder vil vise den samme ændrede fyring aktivitet som respons på et lægemiddel eller forbindelse.
- Klassificere fibre som lav tærskel fibre ( 'LT', typisk øve øget udledning på de lavere distension tryk), høj tærskel fibre ( »HT«, udøver øget udledning på højeste distension tryk), stort dynamikområde fibre ( 'WDR «, demonstrere øget fyring under hele rampen udspiling) eller mekanisk ufølsom afferent ( 'MIA ", nervefibre, der typisk ikke reagerer på rampe distensioner) 5; 20.
- Udtryk nerve fyring respons på 20 mmHg som percentage af den maksimale fyring respons under distension (LT%) som det afspejler omfanget af skyde på lavt udspiling tryk.
BEMÆRK: Derfor er LT fibre karakteriseret ved et LT%> 55%, mens HT defineres af en værdi på <15%. Værdier for WDR enheder spænder mellem 15 og 55% (20). En MIA viser spontan afferent fyring, der er upåvirket af distensioner.
Figur 4:. Skematisk fremstilling af de forskellige Afferent Fiber Units baseret på deres mekanosensitive Profil Enheder er klassificeret baseret på den procentvise (LT%) af deres fyring hastighed 20 mmHg udspiling pres i forhold til den maksimale fyring respons under distension. Lav tærskel fibre (øverste venstre panel) overvejende vise en forøget nerveaktivitet ved lave distension tryk, hvilket resulterer i et LT% på over 55%. Høj tærskel enheder (øverst til højrepanel) derimod viser kun en forøgelse fyring hastighed skadelige tryk (% LT <15). Bredt dynamikområde fibre (nederste venstre panel) vise en gradvis stigning i nerveaktivitet under hele distension (% LT på mellem 15 og 55), mens mekanisk ufølsomme fibre (nederste højre panel) ikke reagerer på stigende distension pres. LT%: (afferent skyde på 20 mmHg / maksimal afferent fyring) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jejunum afferent nerve-aktivitet blev målt ved basislinje og i respons til rampe udspiling i 9 otte uger gammel mand AF-1-mus. Dyr blev holdt i grupper i standardiserede betingelser (6 dyr pr bur blev 20 - 22 ° C, fugtighed 40 - 50%, 12 timers lys-mørke-cyklus) med ubegrænset adgang til ledningsvand og almindeligt foder. Jejunum segmenter af mus viste uregelmæssig spontan afferent nerve udledning ved baseline på en intraluminale tryk på 0 mmHg (betyde spontane aktivitet 11,47 ± 3,31 imp / sek).
Den jejunale afferent nerveaktivitet forøget ved udførelse ramp distensioner indtil 60 mmHg. Typisk er stigningen i afferent nerve aktivitet efter stigningen i intraluminale tryk kendetegnet ved en bifasisk respons (figur 5), der består af en indledende hurtig stigning i fyring aktivitet indtil intraluminale trykket når 20 mmHg, which kan primært henføres til den øgede fyring sats af lave tærskel fibre. Dette efterfølges af et plateau fase, efter som kan observeres en anden stigning i fyring aktivitet fra 40 mmHg fremefter, repræsenterer aktiveringen af overvejende høj tærskel fibre.
Baseret på deres bølgeformer kan enkelt-enheder diskrimineres i hver multi-enhed optagelse og klassificeres i en af de ovennævnte fire kategorier. I 9 mus, vi diskrimineret 40 forskellige enheder (4,44 ± 1,01 enheder / jejunal afferente nerve), med LT enheder er de mest udbredte dem, efterfulgt af WDR og HT fibre (figur 6). Brændingen aktivitet af de forskellige enheder i afhængighed af rampe udspiling kan observeres i figur 7.
Figur 5:
Figur 6:. Single Unit Fordeling af 40 enheder identificeret i jejunal afferente nerver fra 9 Wild-type mus HT: høj tærskel fiber, LT: lav tærskel fiber, MIA: mekanisk ufølsom fiber, WDR: stort dynamisk område fiber._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:. Pressure-respons kurver for de forskellige typer af underenheder i vildtypemus Den fælles-enhed afferent nerve udledning (imp.sec -1) fra de fire forskellige enheder, der kan identificeres, i vildtype-mus under rampe distensioner. En lav tærskel fiber (LT, øverste venstre figur) er kendetegnet ved en initial hurtig stigning i fyring aktivitet under distensioner, mens den høje tærskel fibre (HT, nederste venstre figur) kun display øget fyring under skadelige intraluminale pres. Bredt dynamikområde fibre (WDR, øverste højre figur) viser en støt stigning i fyring aktivitet under hele distension, og mekanisk-ufølsom afferente fibre (MIA, nederste højre figur) reagerer ikke på stigende intraluminale pres. Værdier repharmes gennemsnitlige afferente udledning ± sem imp.sec -1:. impulser per sekund Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen i dette papir beskriver en reproducerbar laboratorium teknik til at studere mesenteriske afferent nerveaktivitet hos gnavere som bruges af vores gruppe og andre 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritiske trin i protokollen omfatte hurtig isolering af vævet, aspiration af nerve-strengen ind i suge- elektrode og tilstrækkelig "forsegling" af glaskapillar fra organbadet ved sugning omgivende fedtvæv i kapillarrøret. Åbningen af glasset kapillar skal bestemmes præcist: en blænde, der er for lille, vil komplicere aspiration af nerve streng ind i elektroden, mens en for bred blændeåbning vil hindre den "forsegling" af kapillar med fedtvæv, hvilket resulterer i overflødige baggrundsstøj, der vil hæmme analysen (lave signal-til-støj-optagelser). For at muliggøre en enkelt enhed klassificering pålidelige, bør splanknisk afferenter opdeles i forskellige strenge for at reducere denantal enheder i optagelsen. Typisk vil vi foreslå sigter for at have maksimalt 4 - 5 enheder i hver optagelse. Forskere bør derfor justere blænden baseret på fiber af interesse og laboratoriet dyr, der anvendes.
Et andet kritisk punkt omfatter tilstrækkelig jordforbindelse af forsøgsopstillingen. Suget elektrode og optagelse kammer bør være tilstrækkeligt jordet og dækket af et Faraday bur for at minimere forstyrrende elektriske felter, der hindrer analyse af neuronal aktivitet, mens alt andet udstyr, herunder optagelsen apparater, bør sprøjte driver et cetera installeres uden for buret .
Ved at registrere afferent nerveaktivitet i umiddelbar nærhed af jejunum eller colon, kan man isolere den første del af afferente signaltransduktion kæde og let studere bidraget og ændringer, der forekommer ved den eneste afferente niveau uden indblanding fra den centrale Nervskellige system. En af begrænsningerne ved denne teknik er, at in vitro-observationer kan ikke altid ubesværet ekstrapoleres til in vivo indstilling, som in vitro setup inkorporerer kun én relæstation i komplekset nerve signaleringskaskade. Som sådan skal et bredere billede gøres omfatter alle andre stationer, såsom dorsalrodsganglier, centralnervesystemet (fx funktionel hjernescanning) og faldende (hæmmende) efferente veje.
En anden fordel ved denne fremgangsmåde er den forholdsvis enkel teknisk procedure, som man ikke længere skal overvåge velfærd laboratoriet dyr, der giver de gastrointestinale prøve. På den anden side er in vitro måling af neuronal aktivitet ikke egnet til at belyse effekten af en systemisk administreret lægemiddel på afferent nerve udledning, men forskerne kan teoretisk overvinde denne hindring ved systemisk indgivelse af lægemidlet of interesse til dyret, efterfulgt af ex vivo in vitro optagelse af afferent nerveaktivitet. Man skal dog være opmærksom på, at ethvert lægemiddel til stede i optagelsen kammeret vil blive fortyndet på grund badet perfusion under dissektion og efterfølgende optagelser. Endelig udfører in vitro splanknisk nerve optagelser ved hjælp af gensplejsede dyr kunne give forskere til fuldt ud at belyse den rolle, som forskellige kanaler og receptorer udtrykt på afferente fibre.
Forskere forsøger at gennemføre denne teknik skal også huske på, at identifikationen og isolation af mesenteriske afferente og bækken afferente naturligvis kræver kendskab til grundlæggende anatomi og teknisk uddannelse, og forskerne burde være bekendt med de grundlæggende principper for neuronal elektrofysiologi.
In vitro indstilling kan desuden forskere til nemt at identificere mulig farmakologisk tjærefår, og giver indblik på den fysiologiske rolle af neuronal aktivitet samt ændret sensorisk signalering i adskillige sygdomsprocesser.
I tilfælde af jejunale afferente målinger kan flere væv segmenter af et enkelt dyr undersøges samtidigt, en funktion, der er temmelig vanskeligt at bruge en in vivo setup. Forskerne bør dog forsigtigt fortolke resultater fra forskellige segmenter, som de regionale forskelle kan indflydelse på resultaterne. Derfor vil vi anbefale at konsekvent måle afferent nerveaktivitet fra samme sted (f.eks første segment distalt fra ligament af Treitz eller duodenojejunal bøjning).
Typiske aktuelle og fremtidige anvendelser af denne teknik omfatter screening af farmakologiske forbindelser, der kan ændre sensibilisering af mesenteriske afferenter under patologier, der er karakteriseret ved visceral hypersensitivitet og smerte. Som allerede nævnt før, målet forSE forbindelser kan forekomme et sted langs den indviklede nervesystem strækker sig fra det enteriske iboende nervesystem til hjernen; som sådan, karakterisere og modulering afferent nerve aktivitet bidrager til bredere billede, der også omfatter calcium billeddannelse af iboende enteriske nerver og dorsalrodsganglier målingen af visceromotor respons som indikator for visceral hypersensitivitet in vivo og funktionelle brain imaging, blandt andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
