Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

求心性神経は正常な生理機能に関する情報を伝えるだけでなく、中枢神経系に向かって周囲から乱れ恒常性と異なる器官系の病態生理学的プロセスを知らせるだけでなく。このように、腸間膜求心性神経の活性の増加または「感作」は、内臓過敏症と腹部の疼痛症候群の病態生理に重要な役割を割り当てられています。

腸間膜求心性神経活動は、専用の器官浴中に取り付けられ、そこから内臓神経は、研究者が直接消化管セグメントに隣接する神経活動を評価することを可能にする、単離されている単離された腸セグメントにおいてインビトロで測定することができます。活動は、セグメントの膨満または管腔内またはserosally配信薬理学的化合物の添加後の間に、標準化された状態で、ベースラインで記録することができます。この技術は、可能研究者は、簡単コントロール検体における末梢神経系を標的とする薬剤の効果を研究します。他にも、それは病気の間に変更されている方法ニューロン活動に関する重要な情報を提供します。 例えば、後根神経節、脊髄または中枢神経系(求心性ニューロンの発火活性を測定することのみシグナル伝達カスケードの複雑な神経で1つの中継局を構成し、研究者は他のレベルでの神経活動を見落とさないように心に留めなければならないことに留意すべきです)完全に健康と病気における複雑な神経生理学を解明するためです。

一般的に使用されるアプリケーションは、リポ多糖の投与に応答した神経活動の研究、および過敏性腸症候群の動物モデルでの求心性神経活動の研究が含まれます。より翻訳アプローチでは、単離されたマウスの腸セグメントは、IBS患者の結腸の上清に曝露することができます。また、修正この技術の最近のヒト結腸検体において適用可能であることが示されています。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

感覚シグナリングおよび疼痛知覚は、求心性神経、脊髄神経細胞、昇順と降順促通と抑制性経路およびいくつかの異なる脳領域間の複雑な相互作用から生じる複雑なプロセスです。このように、これらのレベルの一つ以上における変化は、変化した感覚シグナリングおよび疾患状態における内臓痛をもたらすことができます。感覚シグナリング複数の技術のすべてのこれらのさまざまな側面を研究するために、単一細胞実験に至るまで開発されている( 例えば、神経細胞上のカルシウムイメージング)は、全体の動物モデルに( 例えば、内臓運動応答として行動反応)。この論文に記載された技術は、研究者は、具体的にげっ歯類において小腸または結腸の孤立したセグメントからin vitroでの求心性神経活動を評価することができます。要するに、孤立した胃腸のセグメントは、(通常は空腸または結腸)生理Kで灌流専用記録チャンバー内に搭載されていますrebsソリューション。内臓神経は自由解剖し、内臓や骨盤の求心性神経における求心性神経活動の登録を可能にする電極に接続されています。神経活動は、求心性放電1-6に対する効果を評価するために、基底にまたは直接記録チャンバー(serosally)に適用することができる管腔内圧力および/または薬理学的化合物の増加に応じて記録された、または腔内灌流(粘膜)を介してすることができます。注目すべきは、内臓神経はまた、求心性感覚神経に加えて、遠心性繊維とviscerofugal求心性神経が含まれています。 ex vivoで内臓神経の記録の主要な利点の一つは、研究者が、神経活動に局所的に適用される化合物の直接の効果を研究するために、1つを可能にする、中枢神経系からの変調または入力なしで神経活動を定量化することができるという事実です。さらに、 インビボでのアプローチを使用して必要であるとして重要なパラメータの監視は、(下記参照)、nはO長く関連する。 インビトロ内臓記録は最終的にはるかに少ない時間がかかり、そのin vivoでの対応を超えています。

このような粘膜なでるなどの他の刺激、フォン・フレイ毛を使用したプロービングまたはセグメントの延伸に応じて、求心性神経活動は、腸組織が釘付けとは対照的である(縦方向に開放された修正された実験で研究することができます前号7,8で説明したように、無傷のセグメントを使用して私たちのセットアップ)、。また、ごく最近になって、技術が再び縦方向にセグメント9を開いて、釘付け使用して、カルシウムイメージングを介した結腸壁自体に結腸求心性神経の活性化を研究するために説明しました。

このin vivoでの技術の代替バージョンは、脊髄への求心性のエントリの近くに神経活動を測定するの外に構成されています。要するに、鎮静させた動物は、腹臥位で電子を配置されています、椎弓切除術による関心のプロジェクトの求心性神経に腰仙脊髄をxposingパラフィンで満たされただけでなく、切開部の皮膚を使用して、白金双極電極10,11の上に背細根を立体裁断を構築します。この技術は、さらに、研究者が彼らの伝導速度に基づいて、繊維を特徴付けることができ、薄く有髄Aδ線維から無髄C線維を区別する。また、背側根は、排他的に前述の混合求心性と遠心性内臓神経とは対照的に、感覚求心性繊維を含んでいます。

2つの研究グループが独立して人間の切除標本12,13における結腸求心性神経活動を記録するファースト・イン・マン写本を公開している、単離された腸セグメントからのin vitroでの求心性神経放電を記録することは、人間の標本を使用しても行うことができます。この技術の実装がより容易にtranslatiにつながる可能性人道的な状態にネズミのデータの上に、と研究者が容易に増感知覚神経を標的とする薬剤を同定する可能性があります。求心性神経活動を特徴づけるの臨床的重要性だけでなく、法外な求心性神経活動を標的とする新しい治療薬の発見、精巧フィールド14-19で多くの専門家によって議論されてきました。

上記のインビトロ技術は、より一般的に求心性神経活動のin vivoでの測定知られ補完します。 インビボでのニューロンの活性測定の間、神経活動は、目的のセグメントが識別され、続いて挿管し、そして液体よくパラフィン充填されている間鎮静動物において直接測定することができる齧歯類20の腹壁および皮膚を用いて構成されています。関心の求心性神経は、その後、神経活動のmeasuremenを可能にする、双極白金電極上に切断し、置かれ、識別されトン。この技術は、鎮静動物いえ生きで求心性神経活動を調節するために研究を可能にします。以下のような、1は、このような管腔膨満または化合物の静脈内投与などの干渉に応答するニューロンの活動を学ぶことができます。

トランスレーショナル研究は、最近、主にヒト由来の上清のアプリケーションに焦点を当てて( 例えば 、結腸生検、栽培末梢血単核細胞などからの)空腸および/または結腸マウスの求心性神経21,22上。粘膜アプリケーションに対する漿膜の差動効果が求心性神経放電に研究することができるので、研究者は直接、臓器浴にまたは腸セグメントを灌流管腔内溶液中にいずれかの上清を適用することができます。このように、それは過敏性腸症候群の患者からの結腸粘膜生検supernatansは、マウス結腸求心性神経、モルモット粘膜下神経細胞とマウスの後根に過敏症を引き起こすことができることが示されました神経節ニューロン21,23,24。

最後に、神経活動を記録することは腸間膜に制限および/または骨盤神経細胞は、胃腸管を支配されていません。他の人が他の人が26-28と同様の膀胱求心性神経活動を特徴とし、膀胱から骨盤の求心性神経だけでなく、消化管が収束することを証明し、おそらく神経細胞が得られているのに対し、神経録音は、25膝関節を供給求心性神経で実行することができることを実証しましたクロストーク29。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

以下で説明する全ての動物実験は医学倫理委員会とアントワープ大学(ファイル番号2012から42)での実験動物の使用によって承認されました。

1.空腸の組織調製および結腸求心性神経

  1. 空腸求心性神経の調製
    1. 地元の倫理委員会により、実験前に承認された青年期または成人げっ歯類のげっ歯類の安楽死を実行します( 例えば 、心臓穿刺、頸椎脱臼などが続く終末期の鎮静)。
      注:私たちは、組織はさらに、in vitroで処理されるように、さらに麻酔や手術後のケアを必要とせず、したがって実験で得られた動物を犠牲に頸椎脱臼を使用しました。
      注:年齢は腸間膜求心性機械刺激機能30を減衰させることが示されている、我々はそのための期間中、特定の年齢層に付着する研究者にアドバイス単一の実験。
    2. 仰臥位で犠牲に実験動物を置き、メスを用いて皮膚や腹部の筋肉層を介して腹部正中切開を行い、恥骨まで剣状突起から延びます。
    3. (クレブス組成物を乾燥から腹腔内の組織を防止するために、冷クレブス溶液で腹腔入浴:120.03 mMの塩化ナトリウム、6.22ミリモルのKCl、1.57ミリモルのNaH 2 PO 4、15.43 mMの炭酸水素ナトリウム、1.21 mMのMgSO 4を、11.52 mMのD-グルコースおよび1.52 mMのCaCl 2を)。
    4. 急速に周囲の構造に損傷を与えないように注意しながらと、そのまま空腸の血管と求心性神経が含まれている腸の腸間膜を、維持、すぐ遠位十二指腸空腸曲の開始小腸の約20cmを切り出すことにより、鋭いハサミを使用して、全体の空腸を切除。
      注:腹腔内単なる空腸切開のために、1を使用する必要はありません。このような実体顕微鏡は、容易に肉眼で可視化することができます。
    5. カルボゲン(95%O 2、5%CO 2)で連続的にクレブス溶液を酸素化しながら、氷冷クレブス溶液中で切除した空腸を置き、氷上に保ちます。
    6. 約3センチ長いループの鋭いハサミで空腸をカット。どこかに、各ループの中心付近の血管や内臓神経を含む腸間膜バンドルを確認します。
    7. これらは、 インビトロでの組織試料の劣化を加速する消化酵素を含有するように管腔内容と糜粥を除去するための鈍カテーテルを用いてクレブス液で各セグメントをフラッシュします。
      注: 絨毛の破壊が求心性神経活動を変化させることができるメディエーターの放出につながるよう、フラッシング時のループの内腔を傷つけないように注意してください。
    8. 求心性神経活動を測定するために、セグメントを識別する( 例えば 、第1 空腸segmeNT遠位トライツ靱帯または十二指腸空腸曲の)、およびシリコーンエラストマー層で被覆された専用の記録室でこれを配置します。
      注:空腸の始まりは、解剖学的にトライツ靭帯が小腸を横断小腸の一部として定義され、また十二指腸空腸曲と呼ばれます。
      注意:ウェル実験の開始前にあらかじめ薄いシリコーンエラストマー層を有する記録チャンバーの底部を覆います。このエラストマー層の調製は、製造業者の説明書1に従って実施されるべきです。
    9. 常に温かい有するチャンバを灌流、10ミリリットル/分の速度でクレブス溶液をcarbogenatedし、34℃で記録チャンバーを一定にクレブス温度を保ちます。
    10. 経口端が管腔の流れを提供するシリンジポンプに接続され、尾方端は、流出に接続されているように、臓器浴中に空腸セグメントをマウントします。少し目セグメントを吐くが、過度の緊張を発揮しないように注意してください。両方がしっかり入口および流出ポートに4/0絹の合字を使用して終了取り付けます。
    11. 経口最後にシリンジポンプを取り付け、10ミリリットル/時の速度でクレブス溶液(非酸素、周囲温度)で腔内空腸セグメントを灌流。
    12. 虫ピンを使用して、ピンシリコーンエラストマー底層に対して平らに取り付けられた腸セグメントの腸間膜、。腸間膜バンドルの可視化を最適化するために、腸間膜を伸ばします。バンドルまたは空腸に負担を与えません。
    13. 出力ポートを閉じることにより、テストランプ膨満( 下記参照)を実行 腸セグメントの管腔内圧力までは管腔内クレブス溶液が搭載されたセグメントから漏れていないことを確認するために、60 mmHgのに達します。中断することなく、管腔内圧力の円滑な上昇を観察します。
    14. セグメントの小さな収縮を観察(蠕動wavファイル最初の膨張段階の間ES)。必要に応じて、クレブス溶液にL型カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの1μMを添加することにより、蠕動活性を遮断します。
      注:ニフェジピンに加えて、クレブス溶液にアトロピンの1μMを追加し、完全に腸のセグメントを麻痺されます。しかし我々は、求心性神経記録にアトロピンの使用と効果との個人的な経験を持っていません。
    15. 実体顕微鏡下では、静かに静かに脂肪組織に埋もれうそ血管および求心性神経を損傷しないように注意しながら、二つの小さなピンセットでそれを引っ張ることにより、腸間膜から脂肪組織を剥離し始めます。
    16. 空腸からの遠隔距離で起動し、腸間膜バンドルの両方で血管を露出させます。
    17. 脂肪組織にカプセル化された薄い、白い糸のように両方の容器の間での求心性空腸の神経を観察します。のみそっとピンセット使用して離れて脂肪組織を剥離することにより、空腸に向けて、より近位解剖腸間膜血管および/または求心性神経の両方の最初の同定は困難です。
    18. 神経に脂肪組織の接着性を除去することにより、数mmの距離にわたって空きセグメントの空腸腸間膜神経を解剖。
    19. シャープな組織のはさみを使用して神経を横断。必要に応じて、そっと小さなピンセットでそれを引っ張ることにより、残りの脂肪および結合組織、ならびにepineuronalシースをはがします。
    20. 臓器浴に、プランジャーとシリンジに接続され、マイクロマニピュレータを用いて、吸引電極の先端を下げます。その後、プランジャを操作することによって、穏やかに電極の先端は、クレブス溶液( 図1)に浸漬されるように、器官浴から一部クレブス溶液を吸引します。クレブス溶液を吸引電極内部のワイヤ電極を覆っていることを確認してください。
      注:実験たちの開始に先立ってワイヤ電極が含まれているホウケイ酸ガラス吸引毛細管を準備ピペットプラーをる。
    21. すぐに次の離断求心性神経鎖に吸引電極の先端を置き、その全長にわたってキャピラリーに切断された神経鎖を描きます。
    22. いくつかの脂肪組織に向けて電極の先端を操縦し、しっかりと、プランジャーと、それによって機械的に「シール」臓器浴の内容から毛細血管の神経を吸引しながら、ガラスキャピラリーにこれを吸引除去します。
    23. 下記参照)を発射求心性におけるランプ膨満誘発性の増加を実行することにより、 例えば 、データ収集システムを使用して求心性神経活動の記録を確認してください。吸引電極への神経の単離に続いて、実際の実験を行う前に、定常状態の自発的な求心性神経の活性を得るために15分の準備を安定化させます。
    24. ランプの膨張を実行するために、卒業生につながる、出力ポートを閉じることにより、腸のセグメントを膨張させます(60 mmHgのまで)腸セグメント内の圧力UAL上昇。 (15分間隔で)3回連続のランプ膨満が再現可能なマルチユニット放電( 図2)を得た場合にのみ、所望の実験プロトコルを実行します。
  2. 腰椎内臓求心性(結腸求心性神経)の調製
    注:結腸求心性神経の解剖は、より詳細な解剖が必要です。前者の「空腸」プロトコルからの逸脱は次のとおりです。
    1. 人道的な方法を用いて動物を安楽死させる、仰臥位に置き、正中開腹術を行い、過度に腹腔内、氷冷クレブス溶液を注ぎます。注:クレブス組成:118のNaCl、4.75のKCl、1 mMののNaH 2 PO 4、22のNaHCO 3、1.2mMのMgSO 4を、11mMのD-グルコースおよび2.5 mMのCaCl 2を、3μMインドメタシン。
      注:クレブス溶液の変化した組成物を注意してください。インドメタシンはそうに追加されますプロスタグランジンによって求心性神経活動の変化を防止するためにリューション。
    2. 脂肪組織、膀胱および内部生殖器を捨てて、静かに腹腔内の一方の側に小腸をシフト。腹部から無傷で腸間膜神経と、結腸の遠位部分の延長prelevationを実行します。
      注:組織の更なる準備を支援するために、この切開中に含めることができる重要なランドマークは、腹部大動脈と大静脈、左腎臓および骨盤底筋群が含まれます。
      注:この領域は腰部内臓神経を含んでいるとして解剖時には、コロンと腹部大動脈との間の接続組織に牽引力を発揮しないように注意してください。
    3. チャンバーを記録並んシリコーンエラストマーに組織セグメントを転送します。出発点として、腹部大動脈に由来する左腎動脈を、使用してください。優れたmesenteriが発生し、尾方方向に腹部大動脈に従ってくださいセリアック病と上腸間膜神経節と一緒になってC動脈。最後に、関心対象の神経が位置する結腸および大動脈の先端部との間の接続の組織に到達します。
    4. 腹部大動脈から発信下腸間膜動脈を識別します。腰部内臓求心性神経は、下腸間膜動脈の基部に識別することができます。それは動脈( 図3)と平行に走ります。
    5. 神経の切断に続いて、静かに周囲の結合組織鞘を剥離し、いくつかの細かいスレッドに神経をいじめます。結腸から安全な距離を保つようにしてください。
    6. 先に説明し、所望の実験プロトコルを実行するように脂肪組織を取り巻くにキャピラリー「シール」、吸引電極にこれらの単一スレッドのいずれかを描画します。
    7. 臓器浴( 例えば、腎臓、腹部の血管、筋肉組織)に存在する任意の余分な組織を破棄し、Aこれらは、求心性信号を妨害することができますよ。
      注:求心性神経信号により平滑筋細胞の収縮に自発的腸管運動によって乱される場合にニフェジピン(1μM)をクレブス溶液に添加することができます。
      注:一時的に目的物を溶解させることにより管腔内の灌流を停止または3)しながら、2)直接臓器浴に、1)serosally記録チャンバーを灌流クレブスに所望の化合物を溶解して:薬物は、3つの異なる部位に投与することができシリンジポンプ内のクレブス溶液中に。化合物の累積投与量が連続して速すぎて投与される場合、求心性神経の脱感作が発生する可能性があります。

図1
図1:専用の録音室と吸引電極の回路図の概要テクニックの詳細な概要吸引電極と所定の位置に記録チャンバーとcalのセットアップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:空腸求心性神経活動のin vitroでのレコーディングの代表的トレース空腸マルチユニット求心性神経活動の典型的な記録(imp.sec -1)(上パネル)、ベースライン時と2ランプ性膨張に応じて最大60 mmHgでまで (下のパネル)、および神経信号(第三パネル)内の異なる単一ユニットのその後の識別(wavemark分析)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

</ htmlの「図3」SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
図3:コロンから大腸の神経解剖学 A)感覚情報は、LCNは、下腸間膜動脈(IMA)に近接して動作していると、中枢神経系に向かって腰椎結腸神経(LCN)を介して伝達されます。この腰椎結腸神経からの繊維の部分はもちろんintermesenteric神経(IMN)に沿って腰部内臓神経(LSN)を形成することになります。下腸間膜神経節(IMG)は、腹部大動脈からのIMAの原点に位置しています。遠位IMGの記録は必須である研究者がviscerofugal求心性神経活動を勉強したいはずです。B)実験設定の概略図。 LCNの求心性記録は、データ収集システムに接続された吸引電極を用いて臓器の両方で行われます。の流入を継続しながらランプ膨張は、出口ポートの閉鎖時に行うことができますクレブス溶液。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.データ集録

  1. ヘッドステージに接続された吸引電極を介して神経活動を記録します。増幅(10Kを獲得)と信号をフィルタ(バンドパス500 - 5000ヘルツ)20。
    注:50/60 Hzのノイズ除去装置は、50/60 Hzの電気的な干渉雑音信号を除去するために、実験に含まれるべきです。信号が自動的にデジタル化され、分析のために20 kHzでサンプリングされます。

3.分析5,20

  1. インパルス/全体の神経のための第二の全体的な数として求心性神経放電を報告したり、全体的な神経活動のマルチユニット記録は異なる神経に対応し、異なる形状、大きさと幅の活動電位を含めるよう、さらなる分析を実行するための特殊なソフトウェアを使用ユニット各求心性繊維で( 図2)。
  2. シングルユニット間の区別を可能にする、事前定義されたテンプレートに、個々のwavemarksと一致しています。特定の波のマークにスパイクの割り当ての前に、> 2の信号対雑音比:1が適用されるべきです。
    注:少なくとも10同様のスパイクは解析ソフトによって識別されたときにwavemark分析中、当社は新しいテンプレートを構築します。いいえテンプレートは、50スパイクで1よりも稀な形状のために構築されていません。スパイクは、その点の少なくとも80%が、テンプレートスパイクと同一である主成分分析を使用してテンプレートに整合されます。テンプレートマッチングは、オペレータに依存しており、常に盲検法で、同じ研究者が行ってください。
  3. 一定の時間点(0〜20 mmHgの管腔内の圧力からの増分の5 mmHgの、10の増分で膨満中に応答からベースライン(0 mmHgでの管腔内圧力)で、自発的活動を差し引くことにより、活動電位応答を計算mmHgの)以降20 mmHgでから。 10秒のビンサイズを使用して、ベースラインの求心性放電を測定します。
  4. ランプ膨満( 図4)の間にそれらの放電プロファイルに基づいて、繊維を分類するために、単一ユニットの分析を使用してください。装置の全ての種類の薬物または化合物に応じて、同じ変更された発火活動を表示するように加えて、単体解析は、単位の異なるタイプの化学感受性プロファイルを研究するために利用することができます。
  5. 低閾値繊維などの繊維( 'LT'、典型的にはより低い膨張圧力で増加した放電を発揮する)を分類し、高閾値繊維( 'HT'は、最高の膨満の圧力で増加した放電を発揮する)、広いダイナミックレンジ繊維( 'WDR'、実証全体のランプ膨満中に発射増加)、または機械的に鈍感求心性(「MIA」、一般的に膨満をランプに応答しません神経線維)5; 20。
  6. pと20 mmHgの時の神経発火応答を表現しますそれは、低膨張圧での焼成の程度を反映するように膨張(LT%)の時の最大発射応答のercentage。
    注:HTは<15%の値によって定義され、一方そのため、LT繊維は、LTの%> 55%により特徴付けられます。 WDR単位の値は、(20)、15〜55%の範囲です。 MIAは膨満によって影響されない自発的な求心性発射が表示されます。

図4
図4:彼らの機械受容プロファイルに基づいて異なる求心性ファイバユニットの略図単位が膨満時の最大発火応答に比べて20 mmHgの膨満の圧力で、その発火率の割合(LTの%)に基づいて分類されています低閾値繊維(左上のパネル)は、主に55%以上のLTの%で、その結果、低膨張圧で増加した神経活動が表示されます。高閾値単位(右上逆にパネル)のみ有害圧(%LT <15)で発火率の増加が表示されます。機械的に鈍感繊維(右下のパネル)が膨張圧力を増加させるには反応しないのに対し、広ダイナミックレンジ繊維(左下のパネル)は、全体の膨満(15と55の間の範囲%LT)中の神経活動の緩やかな増加を表示します。 LT%:(求心性は20 mmHgで/最大の求心性発射で焼成) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

空腸求心性神経活動は、ベースラインで測定し、応答してOF-1マウス9 8週齢の雄で膨満をランプします。水と通常の飼料をタップする無制限のアクセスを持つ動物は、標準化された条件(50%、12時間の明暗サイクル - - 22°C、湿度40ケージ当たり6匹、20)のグループに収容しました。マウスの空腸セグメントは0 mmHgの(自発的活動11.47±3.31悪童/秒を意味する)の管腔内圧力でベースライン時の不規則な自発的な求心性神経放電を示しました。

空腸の求心性神経活動は、60 mmHgでまでランプ膨満を行う際に増加しました。一般的に、管腔内圧力の上昇を次求心性神経活性の増加は、管腔内の圧力が20 mmHgのに達するまでまで発火活性における初期の急激な増加からなる、二相性応答( 図5)によって特徴付けられ、whicHは、主に低閾値繊維の増加発火率に帰することができます。次いで、これを焼成活性の第二の増加は、主に高閾値繊維の活性化を示す、以降40 mmHgでから観察することができ、その後プラトー相が続きます。

それらの波形に基づいて、単一のユニットでは、各マルチユニット記録に判別し、上記の四つのカテゴリーのいずれかに分類することができます。 9マウスでは、我々はWDRとHT繊維( 図6)に続いて最も一般的なものを、あるLTユニットと、40の異なる単位(4.44±1.01単位/空腸の求心性神経)を判別します。膨張をランプに応答して異なる単位の発火活動を図7に観察することができます。

図5
図5: グラム>腸間膜求心性神経放電(imp.sec - 1)。全神経用ランプ膨満中の野生型マウスにおけるランプ膨満中の野生型マウスの腸間膜マルチユニット求心性神経放電(IMP /秒-1)。値は平均±sem求心性放電を表し、nは= 9マウス。 imp.sec -1:毎秒インパルスこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:9野生型マウスからの空腸の求心性神経に同定された40台の単体配布 HT:高閾値繊維、LT:低閾値繊維、MIA:機械的に鈍感繊維、WDR:ワイドダイナミックレンジ繊維。_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7: 野生型マウスにおけるサブユニットの異なるタイプのための圧力-応答曲線シングルユニットの求心性神経放電(imp.sec -1)ランプ中に野生型マウスでは、識別することができる4つの異なるユニットから膨満。低閾値繊維(LT、左上図)が表示のみが有害な管腔内の圧力中に発火の増加高閾値繊維(HT、左下図)しながら、膨満中の発火活動の初期の急速な増加によって特徴付けられます。ワイドダイナミックレンジ繊維(WDR、右上図)は、全膨満時の発火活動が着実に増加を示し、メカノ鈍感求心性線維(MIA、右下図)は、管腔内の圧力を増加させることに応答しません。値の担当者SEM imp.sec -1±平均求心性放電憤慨:毎秒インパルスをこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

本論文ではプロトコルは、当社グループおよびその他3,4,7,8,12,20,21,31によって使用されるようなげっ歯類で腸間膜求心性神経活動を研究するために、再現実験室の技術が記載されています。プロトコル内の重要なステップは、キャピラリーに、周囲の脂肪組織を吸引することにより、吸引電極および器官槽からガラスキャピラリーの適切な「シール」に組織の迅速な単離、神経ストランドの吸引が含まれます。ガラスキャピラリーの開口部は正確に決定する必要があります。広すぎ開口が冗長で、その結果、脂肪組織と毛細血管の「シール」を妨げになるのに対し、小さすぎる開口部は、電極に神経ストランドの吸引が複雑になります分析を妨げるであろうバックグラウンドノイズ(低い信号対雑音録音)。信頼性の高い単一ユニットの分類を可能にするために、内臓求心性神経を削減するために、異なる鎖に分割する必要があります記録中のユニット数。各記録には5台 - 一般的に、我々は4の最大値を持つことを目指してお勧めします。研究者は、したがって、関心の繊維に基づいて絞り、および適用されるラボ動物を調整するべきです。

別の重要な点は、実験のセットアップの十分な接地を包含する。吸引電極と記録室は適切に接地され、記録装置を含む他のすべての機器に対し、シリンジポンプエトセトラがケージの外にインストールする必要があり、神経活動の分析を妨げる電界を妨害最小限にするために、ファラデーケージによってカバーされるべきです。

空腸又は結腸に近接する求心性神経活動を記録することによって、1は求心性シグナル伝達チェーンの最初の部分を分離することができ、簡単に中央NERVからの干渉なしに唯一の求心性レベルで発生貢献と変化を研究しますOUのシステム。この技術の制限の1つは、インビトロの設定でのみ複合神経シグナル伝達カスケード内の1つの中継局を組み込むように、インビトロの観察常に 、in vivoでの設定に楽に外挿することができないという事実です。このように、より広範な絵は、後根神経節、中枢神経系( 例えば 、脳機能イメージング)と降順(抑制)遠心性経路などの他のすべてのステーションを組み込むなされなければなりません。

一つはもはや胃腸の試料を提供する実験室動物の健康を監視する必要がないので、この方法の別の利点は、比較的簡単な技術的手順を構成しています。一方神経活動のin vitro測定は、求心性神経放電に全身投与された薬物の効果を解明するには適していませんが、研究者は理論的には、全身薬物Oを投与することによって、この障害を克服することができます求心性神経活動のex vivoでのin vitro記録に続いて動物にFの関心、。しかし、1は記録チャンバー内に存在する任意の薬物が解剖やその後の録音時に起因するバス灌流に希釈されるという事実に気配りする必要があります。最後に、遺伝子操作された動物を用いたin vitroで行う内臓神経記録は、研究者が完全に求心性線維上に発現し、異なるチャネルや受容体の役割を解明する可能性があります。

この技術を実現しようとする研究者はまた、腸間膜求心性および骨盤求心性神経の同定および単離は明らかに基本的な解剖学と技術トレーニングの知識を必要とし、研究者は神経細胞の電気生理学の基本原則に精通するべきであることを心に留めておかなければなりません。

in vitroでの設定は、さらに研究者が容易に可能薬理タールを識別することができます取得し、いくつかの疾患過程におけるニューロンの活動だけでなく、変更された感覚シグナル伝達の生理的役割についての洞察を提供します。

空腸求心性の測定の場合には、単一の動物のいくつかの組織セグメントは、同時にインビボでのセットアップを使用してかなり困難である特徴を調べることができます。研究者は、しかし慎重に地域差でしバイアスの結果として、異なるセグメントから得られた結果を解釈する必要があります。したがって、我々は一貫して同じサイト(遠位トライツ靱帯または十二指腸空腸曲から例えば、最初のセグメント)からの求心性神経活動を測定することをお勧めします。

この技術の典型的な現在および将来のアプリケーションは、内臓過敏や痛みによって特徴付けられる病理中に腸間膜求心路の感作を変化させることができる薬理学的化合物のスクリーニングを含みます。既に述べたように、前の目標を述べましたSEの化合物は、脳への腸溶性固有の神経系に至るまで複雑な神経系に沿ってどこかに遭遇することができます。特徴づけるとも本質的な腸内の神経および後根神経節のカルシウムイメージングを含むより広範な画像に貢献する求心性神経活動を調節するなど、in vivoでの内臓過敏症の指標、および脳機能イメージングなどの内臓運動応答の測定、とりわけ。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24, (10), 956-e465 (2012).
  2. Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98, (1), 123-133 (2013).
  3. Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586, (18), 4517-4530 (2008).
  4. Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17, (1), 89-101 (2005).
  5. Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27, (12), 1709-1720 (2015).
  6. Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27, (Suppl 2), 22 (2015).
  7. Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, (1), 166-178 (2004).
  8. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
  9. Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
  10. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G245-G253 (2008).
  11. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, (6), 2046-2060 (1994).
  12. Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60, (2), 281-282 (2011).
  13. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60, (2), 204-208 (2011).
  14. Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (5), 286-296 (2013).
  15. Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11, (6), 575-581 (2011).
  16. De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16, (44), 5523-5535 (2010).
  17. Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, (7), 923-929 (2008).
  18. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586, (21), 5247-5258 (2008).
  19. Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698, (1-3), 404-412 (2013).
  20. Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20, (2), 149-158 (2008).
  21. Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62, (10), 1456-1465 (2013).
  22. Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
  23. Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99, (10), 1299-1311 (2014).
  24. Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. (2016).
  25. Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56, (1), 351-359 (2007).
  26. Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128, (3), 235-243 (2007).
  27. Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58, (1), 22-28 (2010).
  28. Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190, (3), 1123-1130 (2013).
  29. Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190, (2), 765-771 (2013).
  30. Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. (2015).
  31. Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108, (10), 1634-1643 (2013).
マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動の<em>in vitro</em>記録<em>で</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter