Abstract
עצבים מביאים לא רק להעביר מידע הנוגע הפיסיולוגיה נורמלית, אלא גם לאותת הומאוסטזיס מופרע ותהליכי pathophysiological של מערכות האיברים השונות מהפריפריה כלפי מערכת העצבים המרכזית. ככזה, הפעילות המוגברת או 'הרגישות' עצבים מביאים mesenteric הוקצתה תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של רגישות יתר קרבית ותסמונות כאב בטן.
ניתן למדוד Mesenteric פעילות עצבית מביאה במבחנה בתוך קטע מעי מבודד כי הוא רכוב באמבט שנבנה במיוחד איברים שממנו העצב splanchnic מבודד, ומאפשר לחוקרים להעריך את פעילות עצב ישירות בסמוך במגזר העיכול. פעילות ניתן להקליט בתחילת המחקר בתנאים סטנדרטיים, במהלך ההתנפחות של המגזר או בעקבות התוספת של תרכובות תרופתיות נמסרו intraluminally או serosally. טכניקה זו מאפשרתהחוקר כדי לחקור את ההשפעה של תרופות המכוונות למערכת העצבים ההיקפית בקלות דגימות שליטה; וחוץ מזה, זה מספק מידע חיוני על איך העצבית פעילות משתנה במהלך המחלה. אצוין עם זאת כי מדידת פעילות ירי עצבית מביאה רק מהווה תחנת ממסר אחד העצבי מורכב מפל איתות, וחוקרים צריכים לזכור שלא להתעלם פעילות עצבית ברמות אחרות (למשל, גרעיני שורש הגבה, חוט שדרה או מרכזי מערכת עצבים ) על מנת להבהיר את הפיזיולוגיה העצבית מורכבים מלא בבריאות ובחולי.
בדרך כלל יישומים בשימוש כוללים את חקר פעילות עצבית בתגובת הממשל של lipopolysaccharide, ואת המחקר של פעילות עצבית מביאה במודלים של בעלי חיים של תסמונת מעי רגיז. בגישה translational יותר, קטע מעי העכבר המבודד יכול להיחשף supernatants גס מחולי IBS. יתר על כן, שינויבטכניקה זו הוצגה לאחרונה לחול בדגימות הגס האנושי.
Introduction
איתות חושית תפיסת כאב היא תהליך מורכב נובע גומלין מורכב שבין העצבים מביאים, הנוירונים שדרה, עולה ושבילי facilitatory מעכבים וכמה אזורים שונים במוח יורדים. ככזה, שינויים באחת או יותר של רמות אלו עלולים לגרום איתות חושית שינתה וכאב בטן במדינות מחלה. כדי ללמוד את כל ההיבטים השונים הללו של מספר רב של טכניקות חושיות איתות פותחיו החל ניסויי תא בודדים (למשל, הדמית סידן על נוירונים) כדי במודלים של בעלי חיים שלמים (למשל, תגובות התנהגותיות כגון תגובת visceromotor). הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשרת לחוקרים להעריך את פעילות עצב מביאה במיוחד במבחנה מפלחת מבודדת של מעי דק או מעי גס במכרסמים. בקיצור, פלח עיכול מבודד (בדרך כלל מְעִי צָם או מעי גס) מותקן בתא הקלטה ייעודי perfused עם K פיסיולוגיפתרון ריב '. עצב splanchnic הוא גזור חינם ומחובר לאלקטרודה המאפשר רישום של פעילות עצבית מביאה בעצבים מביאים splanchnic או אגן. ניתן להקליט פעילות עצבית basally או בתגובת הגדלה לחצי intraluminal ו / או תרכובות תרופתיות שניתן ליישם באופן ישיר לתוך תא ההקלטה (serosally), או באמצעות perfusate intraluminal (mucosally) כדי להעריך את השפיע על פריקה מביא 1-6 . ראוי לציין, עצבים splanchnic מכילים גם סיבים efferent ו afferents viscerofugal בנוסף afferents חושית. אחד היתרונות הגדולים של הקלטה עצב splanchnic vivo לשעבר היא העובדה כי החוקרים יכולים לכמת פעילות עצבית ללא אפנון או קלט ממערכת העצבים המרכזית, המאפשר אחד כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של תרכובות מיושם באופן מקומי על פעילות עצבית. יתר על כן, ניטור של פרמטרים חיוניים, ככל שיהיה דרוש בגישת in vivo (ראה להלן), הוא no הכלח. הקלטה splanchnic במבחנה הוא סוף סוף הרבה פחות זמן רב יותר מאשר עמיתו vivo ב שלה.
הביא פעילות עצבית בתגובה לגירויים אחרים, כגון ליטוף רירי, חיטוט באמצעות שערות פון פריי או מתיחה של המגזר, ניתן ללמוד בתוך הגדרת ניסוי שונה שבו רקמת המעי היא מרותקת ופתח longitudinally (וזה בניגוד ההגדרה שלנו באמצעות מגזר שלם), כפי שתוארה בגיליון קודם 7,8. בנוסף, רק לאחרונה, טכניקה תוארה ללמוד הפעלת עצבים מביאים גסה בקיר הגס עצם באמצעות הדמית סידן, שוב באמצעות מרותקים, longitudinally נפתח קטע 9.
גרסה אלטרנטיבית של טכניקת in vivo זה מורכב מתוך מדידת הפעלה עצבית ליד הכניסה מביאה אל חוט השדרה. בקיצור, החיה המסוממת היא להציב בעמדה, דואר נוטהxposing חוט השדרה lumbosacral שאליו העצב מביא פרויקטים עניין באמצעות laminectomy, בניית היטב מולא פרפין באמצעות העור של החתך ומקשטות את הגב שָׁרשׁוֹן על אלקטרודה דו קוטבית פלטינה 10,11. טכניקה זו יתר על כן מאפשרת לחוקרים לאפיין סיבים מבוססים על מהירות ההולכה שלהם, ולהבדיל C-סיבי unmyelinated מ Aδ-סיב myelinated הדק. יתר על כן, שורשונים הגבו בלעדי מכילים סיבים חושיים מביאים, בניגוד עצבי splanchnic מביא ו efferent המעורבים כאמורים.
הקלטה פריקה עצב מביא במבחנה מפלחת בטן מבודדת יכול להיעשות גם באמצעות דגימות אנושיות, כמו שתי קבוצות מחקר שפורסמו עצמאי כתבי היד הראשונות ב-אדם הקלטת פעילות עצב מביא גס כריתת אדם דגימות 12,13. יישום טכניקה זו יכולה לגרום יותר בקלות translatiעל נתוני murine למדינה ההומנית, ויכול לאפשר לחוקרים לזהות תרופות מיקוד העצב התחושתי הרגיש בקלות. החשיבות הקלינית של מאפיינים את פעילות עצבים מביאים, כמו גם גילוי ריאגנטים טיפוליים חדשים כי למקד פעילות עצבית מביאה מופקעת, כבר ונדונה בהרחבה על ידי מומחים רבים בתחום 14-19.
האמורה במבחנת הטכניקה משלימה את ידוע יותר בכינויו במדידת vivo של פעילות עצבית מביא. במהלך in vivo מדידת פעילות עצבית, פעילות עצבית ניתן למדוד ישירות את החיה המסוממת שבמהלכו הקטע של עניין מזוהה ולאחר מכן מחובר לצינורות, וכן פרפין מלא נוזל גם נבנה באמצעות דופן הבטן והעור של המכרסמים 20. העצב של עניין המביא מזוהה אז, מחולק והניח על אלקטרודה פלטינה דו קוטבית, המאפשר measuremen פעילות העצביתt. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לווסת פעילות עצבית מביאה לחיות אם כי חיות מסוממות; ככזה, אפשר ללמוד הפעילות העצבית להגיב הפרעות כגון התנפחות לומינל או עירוי לוריד של תרכובת.
מחקר Translational כיום בעיקר מתמקד ביישום של supernatants נגזרות האנושיות (למשל., ביופסיות גסות, תאי הדם היקפיים mononuclear מעובדים, וכו ') על afferents עכבר jejunal ו / או מעי הגס 21,22. חוקרים יכולים ישירות להחיל supernatants או לאמבטית האיבר או לתוך תמיסת intraluminal כי perfuses במגזר המעי, כך השפעות שונות של serosal לעומת יישום רירי ניתן ללמוד על פריקת עצב מביאה. ככזה, הוא הוצג supernatans ביופסיה של רירית מעי גס כי מחולים עם תסמונת מעי רגיז יכול לגרום רגישות יתר ב afferents גס עכבר, נוירונים submucous שרקן ואת שורש הגבה עכברנוירונים גנגליון 21,23,24.
לבסוף, להקליט פעילות עצבית אינו מצטמצם אך בפגיעת mesenteric ו / או נוירונים אגן innervating מערכת העיכול. אחרים הוכיחו כי הקלטות עצבות יכולות להתבצע afferents באספקת הברך 25 משותפים, בעוד שאחרים הגדירו שלפוחית פעילות עצבית מביא גם 26-28, והוכיחו כי afferents אגן משלפוחית השתן וכן מערכת העיכול להתכנס, ואולי וכתוצאה מכך עצבי crosstalk 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים כמתואר להלן אושרו על ידי ועדת לאתיקה רפואית ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת אנטוורפן (מספר התיק 2012-42).
1. רקמות הכנת Jejunal ועצבים גסים מביא
- הכנת העצב מביא jejunal
- בצע מכרסם המתת חסד של המכרסמים המתבגר או מבוגרים אשר אושר לפני הניסוי על ידי הוועדה האתית המקומית (למשל., הרגעת מסוף ואחריו לנקב לב, נקע בצוואר רחם, וכו ').
הערה: השתמשנו נקע בצוואר רחם להקריב חיות ולכן התוצאה בניסויים ללא הצורך בהרדמה נוספת או טיפול לאחר הניתוח כמו רקמות נוספות מעובד במבחנה.
הערה: גיל הוכח להחליש פונקציות mechanosensory מביא mesenteric 30, ולכן אנו ממליצים החוקרים לדבוק גיל-קבוצה ספציפית למשךניסוי בודד. - מניח את החיה במעבדה הקריבה במצב שכיבה ולבצע חתך קו אמצע בטן דרך שכבת העור שרירי בטן באמצעות אזמל, המשתרע תהליך xyphoid עד עצם הערווה.
- לרחוץ את חלל הבטן עם פתרון קרבס קר כדי למנוע הרקמות התוך בטני מהתייבשות (הרכב קרבס: 120.03 NaCl מ"מ, 6.22 KCl מ"מ, 1.57 מ"מ לאא 2 4 PO, 15.43 מ"מ 3 NaHCO, 1.21 מ"מ 4 MgSO, 11.52 מ"מ D- גלוקוז ו 1.52 מ"מ CaCl 2).
- במהירות שיחתוך את מְעִי צָם כולו באמצעות מספריים חדים ידי מוציא כ 20 ס"מ של המעי הדק מתחיל מיד distally של כפף duodenojejunal, נזהרת שלא לפגוע מבנים המקיפים ושמירה לפדר של המעי, אשר מכיל כלי דם jejunal ועצבים מביא, ללא פגע.
הערה: עבור לנתיחה jejunal בלבד בתוך חלל הבטן, אין צורך להשתמשסטראו, כמו זה יכול להיות דמיינו בקלות בעין בלתי מזוינת. - מניח את מְעִי צָם נכרת בתמיסה קרה כקרח קרבס ולשמור על קרח, בעוד חמצון הפתרון קרבס ברציפות עם carbogen (95% O 2, 5% CO 2).
- חותך את מְעִי צָם במספריים חדים כ לולאות ארוכות 3 סנטימטר. שים את צרור mesenteric המכיל את הכלי ועצב splanchnic איפשהו ליד המרכז של הלולאה בהתאמה.
- רוקן כל קטע עם פתרון קרבס באמצעות קטטר בוטה להסיר תוכן luminal ו chyme כמו אלה מכילים אנזימי עיכול שיאיצו את ההידרדרות של דגימת רקמה במבחנה.
הערה: יש להיזהר שלא לפגוע לומן של הלולאה במהלך שטיפה, כמו חורבן villi יגרום לשחרור מתווך שיכול לשנות את פעילות עצבים מביאים. - זהה את הקטע למדוד את פעילות העצבים מביאים (למשל, segme jejunal הראשוןNT distally של רצועה של Treitz או כפף duodenojejunal), והמקום הזה בתא הקלטה ייעודית מצופה בשכבת סיליקון אלסטומר.
הערה: תחילתו של מְעִי צָם מוגדר מבחינה אנטומית כחלק של המעי הדק כאשר הרצועה של Treitz חוצה את המעי הדק, המכונה גם כפף duodenojejunal.
הערה: מכסה את התחתית לתא ההקלטה בשכבת אלסטומר סיליקון דקה מבעוד מועד לפני תחילת הניסוי. הכנת שכבת אלסטומר זו צריכה להתבצע על פי הוראות היצרן 1. - Perfuse החדר כל הזמן עם חם, carbogenated פתרון קרבס בשיעור של 10 מ"ל / דקה ולשמור על טמפרטורת קרבס בקבוע לתא הקלטה ב 34 מעלות צלזיוס.
- הר במגזר jejunal באמבטית האיבר כך בסוף האוראלי מחובר לנהג מזרק מתן זרימה לומינל וסוף aboral מתחבר היצוא. מעט stלהקיא במגזר אך היזהר שלא להפעיל מתח מוגזם. צרף בשני הקצוות באמצעות בתקיפות 4/0 ליגטורה משי ליציאות in- ו יצוא.
- צרף הנהג מזרק עד הסוף אוראלי, ו perfuse במגזר jejunal intraluminally עם פתרון קרבס (שאינו רווי, טמפרטורת הסביבה) בשיעור של 10 מ"ל / שעה.
- צמד לפדר של דירת קטע המעי רכובה נגד שכבת סיליקון אלסטומר התחתונה, באמצעות סיכות חרקים. למתוח לפדר את מנת לייעל הדמיה של צרור mesenteric; לא להפעיל עומס על צרור או מְעִי צָם.
- בצע התנפחות רמפת בדיקה (אינפרא vide) על ידי סגירת יציאת הפלט עד שלחץ intraluminal של קטע המעי מגיע 60 מ"מ כספי, על מנת לוודא כי אין פתרון קרבס intraluminal דולף מהמגזר הרכוב. שים עלייה חלקה בלחץ intraluminal ללא הפרעות.
- שימו לב התכווצויות קטנות של המגזר (WAV peristaltices) בשלב ההתנפחות הראשוני. במידת הצורך, לחסום פעילות peristaltic ידי הוספת 1 מיקרומטר של nifedipine חוסם תעלות סידן L-סוג לפתרון קרבס.
הערה: הוספת 1 מיקרומטר של אטרופין לפתרון קרבס בנוסף nifedipine, תשתוק את קטע המעי לחלוטין. יש לנו אולם שום ניסיון אישי עם השימוש ותוצאה של אטרופין על הקלטה עצבה מביאה. - תחת סטראו, להתחיל בעדינות לקלף את רקמת השומן מן לפדר על ידי משייך אותו בעדינות עם שתי פינצטה קטנה, נזהר שלא לפגוע כלי ועצב מביא כי קבור בתוך רקמת השומן.
- התחל ממרחק רחוק מן מְעִי צָם, ולחשוף הן כלי דם בתוך צרור mesenteric.
- שימו לב העצב jejunal מביא בין שני כלי השיט כמו חוט דק, לבן במארז ברקמת השומן. רק לנתח יותר proximally כלפי מְעִי צָם ידי קילוף רקמת שומן בעדינות באמצעות פינצטה כאשרזיהוי ראשוני של כלי הן mesenteric ו / או העצב מביא קשה.
- לנתח את עצב mesenteric jejunal המגזר חינם על פני מרחק של מילימטרים אחדים, על ידי הסרת חסיד רקמת שומן אל העצב.
- Transect עצב באמצעות מספרי רקמה חדים. במידת הצורך, לקלף את רקמת שומן חיבור שנותרה, כמו גם את נדן epineuronal על ידי משייך אותו בעדינות עם פינצטה הקטנה.
- באמצעות micromanipulator, מנמיכים את קצה האלקטרודה יניקה, מחובר מזרק עם הבוכנה, לאמבטיה איברים; אז, על ידי מניפולציה של הבוכנה, לשאוב בעדינות איזה פתרון קרבס מהאמבטיה איבר כך קצה האלקטרודה הוא שקוע בפתרון קרבס (איור 1). ודא כי פתרון קרבס מכסה אלקטרודה החוט בתוך האלקטרודה היניקה.
הערה: הכן את נימי יניקה בורוסיליקט זכוכית המכילה האלקטרודה החוט לפני תחילת הניסוי לנוing חולץ פיפטה. - מקם את קצה האלקטרודה היניקה מייד ליד גדיל העצב מביא transected לצייר את גדיל עצב transected לתוך הנימים מעל לכל אורכו.
- לתמרן את קצה האלקטרודה לעבר כמה רקמת שומן לשאוב זה לתוך נימי זכוכית בעת aspirating בחוזקה עם הבוכנה, ובכך מכנית 'איטום "העצב של נימי מן התוכן של באמבטיה איברים.
- בדוק את ההקלטה של פעילות עצבית מביא באמצעות המערכת לאיסוף וניתוח נתונים, למשל, על ידי ביצוע עליית רמפה נגרם התנפחות ב מביא ירי (אינפרא vide). בעקבות הבידוד של העצב לתוך האלקטרודה יניקה, לייצב את ההכנה במשך 15 דקות כדי להשיג פעילות עצבית ספונטנית מביא למצב יציב לפני ביצוע ניסויים בפועל.
- כדי לבצע התנפחות רמפה, להתנפח במגזר המעיים על ידי סגירת יציאת הפלט, מה שמוביל גראדעלייה רע"מ בלחץ במגזר מעיים (עד 60 מ"מ כספית). רק לבצע את פרוטוקול הניסוי הרצוי כששלושה distensions רמפה רצוף (עם מרווח 15 דקות) להניב פריקת יחידה רבה לשחזור (איור 2).
- בצע מכרסם המתת חסד של המכרסמים המתבגר או מבוגרים אשר אושר לפני הניסוי על ידי הוועדה האתית המקומית (למשל., הרגעת מסוף ואחריו לנקב לב, נקע בצוואר רחם, וכו ').
- הכנת הביא splanchnic המותני (עצב מביא גס)
הערה: דיסקציה של עצבים מביאים גסים דורשת לנתיחה מפורטת יותר. סטיות מן הפרוטוקול 'jejunal' לשעבר מפורטות להלן:- להרדימו באמצעות שיטה הומנית, ולמקם אותו במצב שכיבה, לבצע פיום בטן קו האמצע ויוצקים פתרון קרבס קר כקרח מוגזם בתוך חלל הבטן. הערה: ההרכב קרבס: 118 mM NaCl, 4.75 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1.2 מ"מ MgSO 4, 11 מ"מ D- גלוקוז ו -2.5 מ"מ CaCl 2, 3 מיקרומטר indomethacin.
הערה: הערה בהרכב השונה של הפתרון קרבס; אינדומטצין מתווסף כךlution כדי למנוע שינויים של פעילות עצבית מביאה ידי פרוסטגלנדינים. - מחק את רקמת השומן, שלפוחית השתן ואיברי המין הפנימיים, בעדינות להעביר את המעי הדק לצד אחד בתוך חלל הבטן. בצעו prelevation המורחבת של החלק הדיסטלי של המעי הגס עם עצבים mesenteric ללא פגע מן הבטן.
הערה: ציוני דרך חשובים שעשויים להיכלל זה לנתיחה כדי לסייע להכנות נוספות של הרקמה כוללים את אבי העורקים בבטן ואת הווריד הנבוב, הכליה עזב ואת השרירים של רצפת האגן.
הערה: במהלך דיסקציה, לדאוג שלא להפעיל כוח משיכה על רקמות חיבור בין המעי הגס לבין אבי העורקים בבטן, כמו האזור הזה מכיל את העצבים splanchnic המותני. - מעבירים את קטע רקמה לתוך אלסטומר סיליקון מצופה הקלטה קאמרית. השתמש עורק הכליה השמאלי, אשר מקורו אבי העורקים בבטן, כנקודת מוצא. בצע את אבי העורקים בבטן בכיוון aboral, נתקלים mesenteri מעולהג העורק יחד עם צליאק ו גנגליון mesenteric מעולה. לבסוף, מגיע רקמת החיבור בין החלק הדיסטלי של המעי הגס לבין אב העורקים, שבו עצב העניין ממוקם.
- זהה את עורק mesenteric הנח שמקורם אב העורקים בבטן. עצב splanchnic המותני מביא ניתן לזהות בבסיס של העורק mesenteric הנח; זה מקביל העורק (איור 3).
- בעקבות חיתוך הרוחב של העצב, בעדינות לקלף את נדן רקמת חיבור שמסביב ומקניטי העצב למספר חוטים דקים. הקפד לשמור על מרחק בטוח מן המעי הגס.
- צייר אחד נושאים יחידים אלה לתוך האלקטרודה היניקה, 'החותמת' הנימים עם לרקמות שומן כפי שתואר לעיל ולבצע את פרוטוקול הניסוי הרצוי.
- לבטל את כל רקמה מיותר, כי נוכח באמבטית האיבר (למשל, כליות, כלי בטן, רקמת שריר) חברהזה אלה עשויים להפריע אות מביא.
הערה: Nifedipine (1μM) ניתן להוסיף את הפתרון קרבס למקרה האות העצבי מביא מוטרד תנועת מעיים ספונטנית בשל התכווצויות תא שריר חלק.
הערה: יכול להיות מנוהל סמים בשלושה אתרים שונים: 1) serosally ידי המסת המתחם הרצוי לתוך קרבס כי perfuses לתא הקלטה, 2) ישירות לאמבטיה איברים תוך עצירת זלוף זמני או 3) intraluminally ידי המסת המתחם של עניין לתוך תמיסת קרבס בכונן המזרק. הפחתת רגישות של העצב מביא יכולה להתרחש כאשר מינונים מצטברים של תרכובת מנוהלים מהר מדי ברציפות.
- להרדימו באמצעות שיטה הומנית, ולמקם אותו במצב שכיבה, לבצע פיום בטן קו האמצע ויוצקים פתרון קרבס קר כקרח מוגזם בתוך חלל הבטן. הערה: ההרכב קרבס: 118 mM NaCl, 4.75 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1.2 מ"מ MgSO 4, 11 מ"מ D- גלוקוז ו -2.5 מ"מ CaCl 2, 3 מיקרומטר indomethacin.
איור 1: סקירה כללית סכמטי של אלקטרודה הקאמרית יניקת הקלטה הייעודית סקירה מפורטת של techni. קאל התקנה עם האלקטרודה היניקה לתא ההקלטה במקום. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Tracing נציג של הקלטה במבחנה של פעילות עצבית Jejunal מביא הקלטה אופיינית של פעילות עצבית מביא יחידה רב jejunal (imp.sec -1) (הפאנל העליון) בתחילת המחקר והן בתגובה 2 הרמפה distensions עד 60 מ"מ כספית. (פנל תחתון), ואת ההזדהות עקב (ניתוח wavemark) של יחידות בודדות שונות האות העצבי (פנל שלישי). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 54,576 / 54576fig3.jpg" />
איור 3:. הנוירואנטומיה של קולון א) מידע חושי מהמעי מועבר באמצעות העצבים הגסים המותני (LCN) כלפי מערכת העצבים המרכזית, עם LCN פועל בסמיכות לעורק mesenteric הנח (הר"י). חלק מן הסיבים עצביים גס המותני זה יהיה כמובן לאורך עצב intermesenteric (IMN) כדי ליצור את עצבי splanchnic המותני (LSN). גנגליון mesenteric הנח (IMG) ממוקם על המקור של הר"י מן אב העורקים בבטן. הקלטת distally של IMG חובה צריך חוקרים המבקשים ללמוד פעילות עצבית מביא viscerofugal. B) סקירה סכמטי של ניסוי ההגדרה. הקלטה מביאה של LCN מתבצעת איבר הוא באמצעות אלקטרודה יניקה המחוברת למערכת רכישת נתונים. התנפחות Ramp יכולה להתבצע על סגירת פתח היציאה תוך המשך היבוא שלקרבס פתרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. קליטת נתונים
- רשום את פעילות העצבים באמצעות אלקטרודה יניקה המחוברת headstage. להגביר את (לקבל 10k) ולסנן את האות (bandpass 500 - 5,000 הרץ) 20.
הערה: רעש 50/60 רץ Eliminator צריך להיכלל בהגדרת הניסוי על מנת להסיר 50/60 רץ הפרעות חשמליות אותות רעש. האות הוא דיגיטציה שנדגמו באופן אוטומטי ב -20 kHz לניתוח.
3. 5,20 ניתוח
- דווח על פריקת עצב מביא כמספר הכוללים של דחפים / שניית העצב כולו או להשתמש בתוכנה מיוחדת כדי לבצע ניתוח נוסף, כמו הקלטות-יחידה רבה של פעילות עצבית הכוללת מכילות פוטנציאל פעולה של צורה, משרעת ורוחב שונים, מתאים עצב שונה יחידותבכל סיב מביא (איור 2).
- התאם wavemarks פרט תבניות מוגדרות מראש, המאפשר אפליה בין-יחידות בודדות. לפני הקצאת ספייק לגל-סימן מסוים, יחס אות לרעש של> 2: 1 יש לאכוף.
הערה: במהלך ניתוח wavemark, אנו בונים תבנית חדשה כאשר לפחות 10 קוצים דומים מזוהה על ידי תוכנת הניתוח. אין תבנית נבנית עבור צורות נדירות יותר 1 ב 50 קוצים. ספייק מותאמת תבנית באמצעות ניתוח גורמים ראשי כאשר לפחות 80% של הנקודות שלו זהים ספייק התבנית. התאמת תבנית היא מפעילה תלוי, ותמיד צריכה להתבצע על ידי אותו החוקר באופן עיוור. - חשב את תגובות פוטנציאל פעולה על ידי הפחתת הפעילות הספונטנית בתחילת המחקר (לחץ intraluminal של 0 מ"מ כספי) מהתגובה במהלך התנפחות בנקודות קבועות זמן (5 מ"מ הכספי של תוספת מ 0 כדי 20 mmHg לחץ intraluminal, במרווחים של 10mmHg מ -20 מ"מ כספית ואילך). מדוד פריק מביאים בסיס באמצעות גודל סל של 10 שניות.
- השתמש ניתוח היחידה האחת לסווג סיבים על בסיס פרופיל שחרורם במהלך התנפחות רמפה (איור 4). בנוסף, ניתוח חד יחיד יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את פרופיל chemosensitive של סוגים שונים של יחידות, שלא כל סוגי יחידות יציגו אותה פעילות הירי שינתה בתגובת תרופה או תרכובת.
- לסווג סיבי סיבי סף נמוך ( 'LT', בדרך כלל להפעיל פריקה גדלה ב לחצי ההתנפחות הנמוכים), סיבי סף גבוה ( 'HT', להפעיל פריקה גדלה ב לחצי ההתנפחות הגבוהים ביותר), סיבי טווח דינמיים רחב ( 'WDR', להפגין ירי גבר במהלך התנפחות הרמפה כולו) או מביאים רגישות מכאנית ( "MIA", סיבי עצב, כי בדרך כלל אינו מגיב כבש distensions) 5; 20.
- אין מהיר התגובה לירי עצב ב 20 מ"מ כספית כמו percentage תגובת הירי המקסימלי במהלך התנפחות (% LT) שכן הוא משקף את היקף ירי בלחץ התנפחות נמוך.
הערה: לכן, סיבי LT מאופיינים LT%> 55%, ואילו HT מוגדרת על ידי ערך של <15%. ערכים ליחידות WDR נעים בין 15 ל 55% (20). MIA מציג ירי מביא ספונטני כי הוא מושפע distensions.
איור 4:. ייצוג סכמטי של היחידות מביאים סיבים השונים בהתבסס על פרופיל Mechanosensitive שלהם יחידות מסווגות בהתבסס על (% LT) אחוז קצב הירי שלהם בלחץ התנפחות 20 מ"מ כספי לעומת תגובת הירי המקסימלי במהלך התנפחות. סיבי סף נמוך (פאנל השמאלית העליונה) בעיקר להציג פעילות עצבית מוגברת בלחצים התנפחות נמוך, וכתוצאה מכך% LT של יותר מ -55%. יחידות סף גבוהות (ימני עליונהפנל) להיפך רק להציג גידול בירי שיעור בלחצים מזיקים (% LT <15). סיבי טווח דינמיים רחבים (פנל שמאלי תחתון) להציג עלייה הדרגתית בפעילות עצבה במהלך ההתנפחות כולו (% LT הנע בין 15 ו -55), בעוד סיבים רגישים מכאני (פנל ימני תחתון) אינם מגיבים הגדלה לחצי התנפחות. LT%: (מביא יורה 20 מ"מ כספי / ירי מביא מקסימאלי) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פעילות העצבית Jejunal מביאה נמדדה בתחילת מחקר והן בתגובת כבש ההתנפחות ב 9 זכר בן שמונה שבועות עתיקים-1 עכברים. בעלי חיים שוכנו בקבוצות בתנאים סטנדרטיים (6 חיות לכל כלוב, 20 - 22 מעלות צלזיוס, לחות 40 - 50%, 12 מחזור hr אור כהה) עם גישה בלתי מוגבלת מי ברז ו צ'או קבוע. מגזרי Jejunal של עכברים מוצגים פריקת עצב מביא ספונטנית סדירה בתחילת המחקר לעבר לחץ intraluminal של 0 mmHg (ממוצע פעילות ספונטנית 11.47 ± 3.31 שד / sec).
פעילות עצב מביא jejunal גדל אחרי שביצעתי distensions הרמפה עד 60 מ"מ כספית. בדרך כלל, הגידול בפעילות עצבה מביא בעקבות העלייה בלחץ intraluminal מאופיין תגובה בי-פאזית (איור 5), המורכב מגידול מהיר ראשוני בפעילות להצתה עד שלחץ intraluminal מגיע 20 מ"מ כספי, whicח יכול בעיקר לייחס קצב ירי המוגבר של סיבי סף נמוכים. זה ואחריו מכן על ידי שלב מפנה, שלאחריו עלייה שנייה בפעילות ירי ניתן לצפות מ- 40 מ"מ כספי ואילך, המייצגת את הפעלת סיבי סף גבוהים בעיקרה.
בהתבסס על הגל שלהם, קשרים וואב יחידים יכול להיות מופלה בכל הקלטה יחידה רבות ומסווגים אחד מארבע הקבוצות הנ"ל. ב -9 עכברים, אנו מופלים 40 יחידות שונות (4.44 ± 1.01 יחידות / עצב מביא jejunal), עם יחידות LT להיות אלה הנפוצים ביותר, ואחריו WDR וסיבי HT (איור 6). פעילות ירי של היחידות השונות בתגובה כבש התנפחות ניתן לצפות באיור 7.
איור 5:
איור 6:. הפצה יחידה אחת של 40 יחידות שזוהו עצבי Jejunal מביא מ -9 עכברי-בר HT: סיבי סף גבוה, LT: סיבי סף נמוכים, MIA: סיבים רגישים מכאני, WDR: סיבי טווח דינמיים רחב._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7:. תגובה עקומות לחץ עבור סוגים שונים של יחידות משנה ב עכברי-בר פריקה עצב מביא יחידה אחת (imp.sec -1) מארבע היחידות השונות שניתן לזהותו, ב עכברי-בר במהלך הרמפה distensions. סיב סף נמוך (שעון מקומי, דמות שמאלית עליונה) מאופיין עלייה מהירה ראשונית בפעילות ירי במהלך distensions, בעוד סיבי הסף הגבוה (HT, נמוך דמות משמאל) רק תצוגה גדלה ירי במהלך לחצי intraluminal רעילים. סיבי טווח דינמי רחב (WDR, למעלה מימין דמות) להראות עלייה מתמדת בפעילות ירי במהלך התנפחות כולו, וסיבים מביא רישיות mechano (MIA, בפינה הימנית התחתונה דמות) אינם מגיבים הגדלת לחצים intraluminal. נציג ערכיםלהתרעם פריקה מביאה ממוצעת ± SEM imp.sec -1:. דחפים בשניים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול במאמר זה מתאר טכניקת מעבדה לשחזור ללמוד פעילות עצבית מביא mesenteric במכרסמים כפי שמוצג על ידי הקבוצה שלנו ואחרים 3,4,7,8,12,20,21,31. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים את הבידוד המהיר של הרקמה, שאיפה של גדיל העצב לתוך האלקטרודה היניקה ו 'איטום' הנאה של נימי הזכוכית מאמבטית האיבר ידי aspirating רקמת שומן שמסביב לתוך הנימים. הצמצם של נימי הזכוכית צריך להיקבע דווקא: צוהר קטן מדי יסבך את השאיפה של גדיל העצב לתוך האלקטרודה, ואילו צוהר רחב מדי יפריע את 'האיטום' של הנימים עם רקמת שומן, וכתוצאה מכך מיותר רקע רעש שיקשה על הניתוח (נמוכות אות לרעש הקלטות). כדי לאפשר סיווג יחידה אחת אמין, יש לחלק afferents splanchnic בקווצות שונים על מנת לצמצם אתמספר יחידות ההקלטה. בדרך כלל, היינו ממליצים במטרה להיות לכל היותר 4 - 5 יחידות בכל הקלטה. חוקרים ולכן צריכים להתאים את הצמצם מבוסס על הסיבים של עניין, ואת חיית המעבדה מוחלת.
עוד נקודה קריטית מקיפה את ההארקה המספקת של ההתקנה הניסיונית. האלקטרודה יניקת תא הקלטה צריכה להיות מעוגן כראוי ומכוסים כלוב פאראדיי כדי למזער הפרעת שדות חשמליים כי לעכב הניתוח של פעילות עצבית, בעוד כל הציוד האחר לרבות מנגנוני ההקלטה, נהג מזרק וכולי צריך להיות מותקן מחוץ לכלוב .
לפי הקלטת פעילות עצבית מביאה בסמיכות אל מְעִי צָם או המעי הגס, אפשר לבודד את החלק הראשון של שרשרת העברת אותות מביאים ובקלות ללמוד תרומה ושינויים המתרחשים ברמת המביא הבלעדית ללא התערבות מצד nerv המרכזימערכת מפוקפקת. אחת המגבלות של טכניקה זו היא העובדה כי תצפיות במבחנה לא יכול תמיד להיות מאמץ אקסטרפולציה להגדרת in vivo, כמו ההתקנה במבחנה רק משלבת תחנת ממסר אחד מפל איתות העצב המורכב. ככזה, תמונה רחבה יותר חייבת להתבצע המאגדת את כל התחנות אחרות, כגון בגרעין השורש הגבה, מערכת עצבים מרכזית (כגון, הדמיה תפקודית של מוח) ויורדים (מדכאים) מסלולים efferent.
יתרון נוסף של שיטה זו מהווה את ההליך הטכני פשוט למדי, כמו שאף אחד כבר לא צריך שיפקח על שלומו של חיית המעבדה המספקת דגימת העיכול. מצד השני היא מדידת חוץ גופייה של פעילות עצבית לא מתאימה הבהרת השפעת תרופה באופן מערכתי על הפרשות עצב מביא, אבל חוקרים יכולים תיאורטית להתגבר על מכשול זה באמצעות מתן מערכתי תרופת of ריבית לבעל החיים, ואחריו ההקלטה vivo לשעבר במבחנה של פעילות עצבית מביא. עם זאת, אחד צריך להיות קשוב העובדה שכל נוכחי סמים בחדר ההקלטה תדולל בשל זלוף האמבטיה במהלך הניתוח והקלטות הבאות. לבסוף, ביצוע במבחנת הקלטות עצבות splanchnic שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטי עלולה לאפשר לחוקרים להבהיר את התפקיד במלואו ערוצים קולטנים שונים הביעו על סיבים הביא.
חוקרים מנסים ליישם את הטכניקה הזו צריכה גם לזכור כי זיהוי והבידוד של מביא mesenteric ו afferents אגן כמובן דורשים ידע באנטומיה בסיסית והכשרה טכנית, וחוקרים צריכים להכיר את העקרונות הבסיסיים של אלקטרופיזיולוגיה עצבית.
ההגדרה במבחנת יתר מאפשרת לחוקרים לזהות בקלות זפת אפשרית תרופתיתמקבל, ומספק תובנה על עצמו את התפקיד הפיזיולוגי של הפעילות העצבית, כמו גם איתות חושית שינו תהליכי מחלה שונים.
במקרה של מדידות מביאות jejunal, קטעי רקמה כמה חיה אחת ניתן ללמוד בו זמנית, תכונה שקשה למדי באמצעות התקנת vivo. חוקרים עם זאת צריך לפרש את התוצאות בזהירות המתקבל מגזרים שונים, כמו הבדלים אזוריים תוצאות הטיה יכול. לכן היינו ממליצים למדוד פעילות עצבית מביא בעקביות מאותו אתר (למשל, הקטע הראשון distally מן רצועה של Treitz או כפף duodenojejunal).
יישומים נוכחיים ועתידיים אופייניים של טכניקה זו מהווים את הקרנת תרכובות תרופתיות שיכול לשנות רגישות של afferents mesenteric במהלך פתולוגיות המאופיינות על ידי רגישות יתר וכאב בטן. כפי שכבר ציינו קודם לכן, היעד שלתרכובות se ניתן נתקלו איפשהו לאורך מערכת עצבים המורכבת החל ממערכת העצבים המהותית המעיים למוח; ככזה, אפיון ויסות פעילות עצבית מביאה תורם לתמונה הרחבה יותר, כוללת גם את הדמית סידן של הגרעינים עצבי שורש הגבה מעיים הפנימיים, מדידת תגובת visceromotor כאינדיקטור של רגישות יתר קרבי in vivo, הדמיה תפקודית של המוח, בין היתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
