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Neuroscience

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

nervi afferenti non solo forniscono informazioni relative normale fisiologia, ma anche segnale omeostasi disturbato e processi patofisiologici dei diversi organi dalla periferia verso il sistema nervoso centrale. Come tale, l'aumentata attività o 'sensibilizzazione' dei nervi afferenti mesenterici è stato attribuito un ruolo importante nella fisiopatologia dell'ipersensibilità viscerale e sindromi da dolore addominale.

Mesenterica attività del nervo afferente può essere misurata in vitro in un segmento intestinale isolato che è montato in un bagno per organi appositamente costruito e da cui il nervo splancnico è isolato, consentendo ai ricercatori di valutare direttamente attività nervosa adiacente al segmento gastrointestinale. L'attività può essere registrata al basale in condizioni standardizzate, durante la distensione del segmento o dopo l'aggiunta di composti farmacologici consegnati via endoluminale o serosally. Questa tecnica permetteil ricercatore di studiare facilmente l'effetto di farmaci destinati al sistema nervoso periferico nei campioni di controllo; inoltre, fornisce informazioni cruciali su come neuronale attività è alterato durante la malattia. Va notato, tuttavia, che la misura afferenti l'attività neuronale costituisce solo una stazione di rilancio del complesso neuronale cascata di segnalazione, ed i ricercatori dovrebbero tenere a mente di non trascurare l'attività neuronale in altri livelli (ad esempio, gangli spinali, midollo spinale o centrale del sistema nervoso ) al fine di chiarire completamente il complesso fisiologia neuronale in salute e malattia.

applicazioni comunemente utilizzate comprendono lo studio dell'attività neuronale in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaride, e lo studio delle attività del nervo afferente in modelli animali della sindrome dell'intestino irritabile. In un approccio più traslazionale, il segmento isolato mouse intestinale può essere esposto a supernatanti colon da pazienti affetti da IBS. Inoltre, una modificadi questa tecnica è stato recentemente dimostrato di essere applicabile in campioni umano del colon.

Introduction

segnalazione sensoriale e la percezione del dolore è un processo complesso che deriva da una complessa interazione tra nervi afferenti, i neuroni spinali, ascendente e discendente percorsi facilitatori e inibitori e diverse regioni del cervello differenti. Come tale, modifiche in uno o più di questi livelli possono provocare segnalazione sensoriale alterata e dolore viscerale negli stati di malattia. Per studiare tutti questi diversi aspetti della segnalazione sensoriale più tecniche sono state sviluppate che vanno da esperimenti sulle cellule singole (ad esempio, l'imaging del calcio sui neuroni) per modelli animali interi (ad esempio, le risposte comportamentali, come la risposta visceromotoria). La tecnica descritta in questo documento permette ai ricercatori di valutare in concreto l'attività del nervo afferente in vitro da un segmento isolato di piccolo intestino o colon nei roditori. In breve, un isolato segmento gastrointestinale (di solito digiuno o del colon) è montato in una camera di registrazione costruito appositamente perfusi con K fisiologicasoluzione Rebs. Il nervo splancnico è sezionato libero e collegato ad un elettrodo che permette la registrazione dell'attività neuronale afferenti a nervi afferenti splancnici o pelviche. L'attività del nervo può essere registrato basale o in risposta alle crescenti pressioni intraluminali e / o composti farmacologici che possono essere applicati direttamente nella camera di registrazione (serosally), o tramite il perfusato endoluminale (mucosally) per valutare il loro effetto sul discarico afferente 1-6 . Da segnalare, nervi splancnici contengono anche fibre efferenti e afferenze viscerofugal in aggiunta alle afferenze sensoriali. Uno dei principali vantaggi di ex vivo registrazione nervo splancnico è il fatto che i ricercatori possono quantificare l'attività del nervo senza modulazione o ingresso dal sistema nervoso centrale, che permette di studiare l'effetto diretto dei composti applicati localmente sulla attività del nervo. Inoltre, il monitoraggio dei parametri vitali, come è necessario, utilizzando l'approccio in vivo (vedi sotto), è no è più rilevante. In vitro registrazione splancnico è finalmente molto meno in termini di tempo rispetto al suo omologo in vivo.

Afferent attività neuronale in risposta ad altri stimoli, come mucosale carezze, tastatura utilizzando peli von Frey o allungamento del segmento, può essere studiata in una configurazione sperimentale modificata, in cui il tessuto intestinale viene immobilizzato e aperto longitudinalmente (che è in contrasto la nostra messa a punto utilizzando un segmento intatto), come è stato descritto in un numero precedente 7,8. Inoltre, solo di recente, una tecnica è stata descritta per studiare attivazione nervosa afferente del colon nella stessa parete del colon tramite l'imaging di calcio, ancora una volta con un immobilizzato, longitudinalmente aperto segmento 9.

Una versione alternativa di questa tecnica in vivo consiste di misurazione attivazione neuronale in prossimità dell'ingresso del afferente nel midollo spinale. In breve, l'animale sedato viene posto in posizione prona, exposing il midollo spinale lombosacrale cui afferente nervo progetti di interesse mediante laminectomia, costruendo una paraffina pieno pozzetto utilizzando la pelle dell'incisione e copertura del rootlet dorsale su un elettrodo di platino bipolare 10,11. Questa tecnica permette inoltre ai ricercatori di caratterizzare le fibre in base al loro velocità di conduzione, e distinguono fibre C amieliniche da sottili mieliniche Aδ fibre. Inoltre, radichette dorsali contengono esclusivamente fibre afferenti sensoriali, in contrasto con i afferenti ed efferenti nervi splancnici misti citati in precedenza.

Registrazione afferente scarico nervoso in vitro da segmenti intestinali isolate può anche essere fatto usando campioni umani, come due gruppi di ricerca pubblicati in modo indipendente prime-in-man manoscritti registrazione del colon attività del nervo afferente a resezione umana provini 12,13. L'attuazione di questa tecnica potrebbe risultare in un più facilmente translatisu dei dati murini allo stato umano, e potrebbe consentire ai ricercatori di identificare facilmente farmaci destinati al nervo sensitivo sensibilizzata. L'importanza clinica di caratterizzare l'attività afferente del nervo, così come la scoperta di nuovi reagenti terapeutici che hanno come target esorbitante attività del nervo afferente, è stato elaborato discusso da molti esperti nel campo 14-19.

Il suddetto tecnica in vitro integra il più comunemente noto nella misurazione vivo di attività afferente del nervo. Durante la misura attività neuronale in vivo, attività nervosa può essere misurata direttamente nell'animale sedato durante il quale viene identificato il segmento di interesse e intubato in seguito, e un liquido di paraffina riempito pozzo è costruito utilizzando la parete addominale e la pelle del roditore 20. Il nervo afferente di interesse viene identificato, sezionato e posto su un elettrodo di platino bipolare, consentendo MISURE attività neuronalet. Questa tecnica permette al ricercatore di modulare l'attività del nervo afferente a vivere anche se gli animali sedati; come tale, si può studiare l'attività neuronale rispondere alle interferenze come distensione luminale o la somministrazione endovenosa di un composto.

Ricerca traslazionale si concentra oggi principalmente sull'applicazione dei surnatanti di derivazione umana (ad es., Da biopsie del colon, le cellule mononucleate del sangue periferico coltivate, ecc) su afferenze digiunali e / o del colon del mouse 21,22. I ricercatori possono applicare direttamente surnatanti o nel bagno di organo o nella soluzione endoluminale che perfuses il segmento intestinale, in modo che gli effetti differenziali della sierosa rispetto dell'applicazione della mucosa possono essere studiate sul discarico nervose afferenti. Come tale, è stato dimostrato che le colon supernatans biopsia della mucosa di pazienti con sindrome dell'intestino irritabile possono causare ipersensibilità nel topo afferenze del colon, cavia neuroni sottomucosi e la radice del mouse dorsalineuroni gangliari 21,23,24.

Infine, la registrazione dell'attività neuronale non è limitata alla mesenterica e / o neuroni pelvici innervano il tratto gastrointestinale. Altri hanno dimostrato che le registrazioni nervose possono essere eseguite in afferenti fornitura del ginocchio 25, mentre altri hanno caratterizzato vescica attività nervosa afferente e 26-28, e ha dimostrato che afferenze pelvici dalla vescica e anche il tratto gastrointestinale convergono, possibilmente con conseguente neuronale crosstalk 29.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti di seguito sono stati approvati dal Comitato per l'Etica medica e l'uso di animali sperimentali presso l'Università di Anversa (numero di file 2012-42).

1. Preparazione del tessuto di digiunale e del colon afferenti nervi

  1. Preparazione del nervo afferente digiunale
    1. Eseguire roditore eutanasia del roditore adolescente o adulto che è stato approvato prima dell'esperimento dal Comitato Etico locale (ad es., Sedazione terminale seguita da puntura cardiaca, dislocazione cervicale, ecc).
      NOTA: Abbiamo usato dislocazione cervicale sacrificare animali conseguente esperimenti, senza la necessità di ulteriori anestesia o cura post-chirurgica come tessuti vengono ulteriormente elaborati in vitro.
      NOTA: Age ha dimostrato di attenuare mesenterica afferenti funzioni meccanosensoriali 30, abbiamo quindi consigliano ricercatori di aderire a una determinata fascia di età per la durata delun singolo esperimento.
    2. Posizionare il laboratorio animale sacrificato in posizione supina ed eseguire un'incisione mediana addominale attraverso lo strato di pelle e muscoli addominali con un bisturi, che si estende dal processo xifoideo fino a quando l'osso pubico.
    3. Bagnare la cavità addominale con soluzione fredda Krebs per evitare i tessuti intra-addominali si secchi (composizione Krebs: 120.03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15.43 mM NaHCO 3, 1,21 mM MgSO 4, 11.52 mM D-glucosio e 1,52 mM CaCl 2).
    4. Rapidamente asportare l'intero digiuno usando forbici affilate da asportare circa 20 cm del piccolo intestino iniziando immediatamente distale della flessione duodenojejunal, facendo attenzione a non danneggiare le strutture circostanti e mantenendo intatto mesentere del colon, che contiene i vasi sanguigni del digiuno e nervi afferenti.
      NOTA: Per la semplice dissezione digiunale nella cavità addominale, uno non ha bisogno di usareuno stereomicroscopio, in quanto questo può essere facilmente visualizzato con l'occhio nudo.
    5. Posizionare il digiuno asportato in soluzione di Krebs ghiacciata e tenere in ghiaccio, mentre ossigenare la soluzione di Krebs continuamente con CarboGen (95% O 2, 5% di CO 2).
    6. Tagliare il digiuno con forbici affilate in lunghi cicli di circa 3 cm. Osservare il bundle mesenterica che contiene i vasi e nervi splancnico da qualche parte vicino al centro del rispettivo ciclo.
    7. Lavare ciascun segmento con soluzione di Krebs utilizzando un catetere smussato per rimuovere contenuto luminale e chimo come questi contengono enzimi digestivi in grado di accelerare il deterioramento del campione di tessuto in vitro.
      NOTA: fare attenzione a non danneggiare il lume del ciclo durante il lavaggio, come la distruzione dei villi comporterà il rilascio di mediatori che possono alterare l'attività nervosa afferente.
    8. Identificare il segmento per misurare l'attività del nervo afferente (ad esempio, il primo segme digiunalent distale del legamento di Treitz o flessura duodenojejunal), e posto questo in una camera di registrazione costruito appositamente rivestito con uno strato di elastomero siliconico.
      NOTA: L'inizio del digiuno è anatomicamente definita come la parte del piccolo intestino dove il legamento di Treitz attraversa il piccolo intestino, chiamato anche il supporto flessibile duodenojejunal.
      NOTA: Coprire il fondo della camera di registrazione con un sottile strato di elastomero di silicone con largo anticipo prima dell'inizio dell'esperimento. La preparazione di questo strato elastomerico deve essere eseguita secondo le istruzioni del produttore 1.
    9. Profumato camera costantemente con il caldo, carbogenated soluzione Krebs ad una velocità di 10 ml / min e mantenere la temperatura Krebs 'nella costante camera di registrazione a 34 ° C.
    10. Montare il segmento digiunale nel bagno per organi in modo che l'estremità orale è collegato alla siringa temporizzata fornendo un flusso luminale e la fine aboral collega al deflusso. leggermente stvomitare il segmento, ma fate attenzione a non esercitare una tensione eccessiva. Fissare entrambe le estremità saldamente utilizzando 4/0 legature di seta alle porte di afflusso e deflusso.
    11. Attaccare la siringa temporizzata alla fine orale e profumato segmento digiunale endoluminale con soluzione di Krebs (non ossigenato, temperatura ambiente) ad una velocità di 10 ml / h.
    12. Pin il mesentere del piatto segmento intestinale montata contro lo strato inferiore in elastomero siliconico, con perni di insetti. Allungare il mesentere al fine di ottimizzare la visualizzazione del fascio mesenterica; non esercitare pressione sul pacchetto o il digiuno.
    13. Eseguire una distensione test di rampa (vide infra) chiudendo la porta di uscita finché la pressione intraluminale del segmento intestinale raggiunge i 60 mmHg, al fine di verificare che nessuna soluzione intraluminale Krebs fuoriesce dal segmento montato. Osservare un aumento uniforme della pressione intraluminale senza interruzioni.
    14. Osservare piccole contrazioni del segmento (wav peristalticaes) durante la fase di distensione iniziale. Se necessario, bloccare l'attività peristaltica aggiungendo 1 mM di L-tipo calcio-antagonista nifedipina alla soluzione Krebs.
      NOTA: Aggiungere 1 mM di atropina alla soluzione Krebs oltre alla nifedipina, sarà completamente paralizzare il segmento intestinale. Noi però non abbiamo esperienza personale con l'uso e l'effetto di atropina sulla registrazione dei nervi afferenti.
    15. Sotto uno stereomicroscopio, iniziare delicatamente per staccare il tessuto adiposo dal mesentere tirando delicatamente con due piccole pinzette, facendo attenzione a non danneggiare i vasi ei nervi afferenti che giacciono sepolti nel tessuto grasso.
    16. Inizia a distanza a distanza dal digiuno, ed esporre entrambi i vasi sanguigni nel bundle mesenterica.
    17. Osservare il nervo digiunale afferente tra entrambe le navi come un sottile filo, bianco incapsulato nel tessuto adiposo. Solo sezionare più prossimale verso il digiuno dal peeling delicatamente il tessuto grasso via con una pinzetta, quando iidentificazione iniziale di entrambi i vasi mesenterici e / o il nervo afferente è difficile.
    18. Sezionare il nervo mesenterica digiuno del segmento libera su una distanza di alcuni millimetri, rimuovendo il tessuto adiposo aderenti al nervo.
    19. Transetto il nervo con le forbici affilate dei tessuti. Se necessario, staccare il tessuto adiposo e connettivo, rimanendo, così come la guaina epineuronal tirando delicatamente con le pinzette.
    20. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo di aspirazione, collegato ad una siringa con pistone, nel bagno per organi; poi, manipolando lo stantuffo, aspirare delicatamente qualche soluzione Krebs dal bagno per organi in modo che la punta dell'elettrodo viene immerso nella soluzione di Krebs (Figura 1). Assicurarsi che la soluzione Krebs copre l'elettrodo a filo all'interno dell'elettrodo di aspirazione.
      NOTA: Preparare il capillare di aspirazione vetro borosilicato che contiene l'elettrodo a filo prima dell'inizio dell'esperimento noiing un estrattore pipetta.
    21. Posizionare la punta dell'elettrodo di aspirazione immediatamente accanto al filo dei nervi afferenti sezionato e disegnare il filamento nervoso sezionato nel capillare su tutta la sua lunghezza.
    22. Manovrare la punta dell'elettrodo verso qualche tessuto adiposo e aspirare questo nel capillare di vetro mentre saldamente aspirazione con lo stantuffo, così meccanicamente 'tenuta' nervo nel capillare dal contenuto del bagno per organi.
    23. Verifica registrazione dell'attività del nervo afferente utilizzando il sistema di acquisizione dati, ad esempio, eseguendo un aumento distensione indotta rampa in afferente cottura (vide infra). Dopo l'isolamento del nervo nell'elettrodo di aspirazione, stabilizzare la preparazione per 15 minuti per ottenere uno stato stazionario afferente spontanea attività nervosa prima di eseguire degli esperimenti reali.
    24. Per eseguire distensione rampa, distendere il segmento intestinale chiudendo la porta di uscita, che conduce al gradaumento sessuale in pressione nel segmento intestinale (fino a 60 mmHg). Effettuare solo il protocollo sperimentale desiderata quando tre dilatazioni rampa consecutivi (con un intervallo di 15 min) producono un riproducibile scarico più unità (Figura 2).
  2. Preparazione del afferente lombare splancnico (afferenti ai nervi del colon)
    NOTA: La dissezione dei nervi afferenti colon richiede una dissezione più dettagliata. Deviazioni dal primo protocollo di 'digiuno' sono elencati di seguito:
    1. Eutanasia dell'animale mediante metodi umanitari, collocarlo in posizione supina, eseguire una laparotomia mediana ed eccessivamente versare soluzione di Krebs ghiacciata nella cavità addominale. NOTA: Krebs composizione: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1.2 mM MgSO 4, 11 mM D-glucosio e 2.5 mM CaCl 2, 3 mM indometacina.
      NOTA: Notare la composizione modificata della soluzione Krebs; indometacina viene aggiunto in modoluzione per evitare alterazioni della attività nervosa afferente da prostaglandine.
    2. Eliminare il tessuto adiposo, vescica e genitali interni e spostare delicatamente il piccolo intestino su un lato nella cavità addominale. Eseguire prelevation estesa della parte distale del colon con nervi mesenterici intatti dall'addome.
      NOTA: punti di riferimento importanti che possono essere inclusi in questa dissezione per facilitare ulteriormente la preparazione del tessuto includono l'aorta addominale e la vena cava, il rene sinistro e la muscolatura del pavimento pelvico.
      NOTA: Durante la dissezione, fare attenzione a non esercitare una trazione sul tessuto di collegamento tra i due punti e l'aorta addominale, in quanto questa regione contiene i lombari nervi splancnici.
    3. Trasferire il segmento di tessuto in elastomero di silicone rivestito di registrazione da camera. Utilizzare l'arteria renale sinistra, che origina dall'aorta addominale, come punto di partenza. Seguire l'aorta addominale in direzione aboral, incontrare i mesenteri superioric dell'arteria insieme alla celiaca e mesenterica superiore ganglio. Infine, arrivano in un tessuto connettivo tra la parte distale del colon e l'aorta, in cui si trova il nervo di interesse.
    4. Identificare mesenterica inferiore proveniente dall'aorta addominale. Il nervo splancnico lombare afferente può essere identificato alla base dell'arteria mesenterica inferiore; corre parallelamente all'arteria (Figura 3).
    5. Dopo la resezione del nervo, delicatamente rimuovere la guaina di tessuto connettivo circostante e prendere in giro il nervo in più fili sottili. Assicurarsi di mantenere una distanza di sicurezza dal colon.
    6. Disegnare uno di questi singoli fili nella elettrodo di aspirazione, 'sigillo' il capillare con circostante tessuto adiposo come precedentemente descritto ed eseguire il protocollo sperimentale desiderato.
    7. Scartare qualsiasi tessuto superfluo che è presente nel bagno per organi (ad esempio, reni, vasi addominali, tessuto muscolare), uns questi possono disturbare il segnale afferente.
      NOTA: Nifedipina (1μM) può essere aggiunto alla soluzione Krebs nel caso il segnale nervoso afferente è disturbato dal movimento intestinale spontanea dovuta a contrazioni delle cellule muscolari lisce.
      NOTA: I farmaci possono essere somministrati in tre diversi siti: 1) serosally sciogliendo il composto desiderato nel Krebs che perfuses camera di registrazione, 2) direttamente nel bagno per organi mentre sospendere temporaneamente la perfusione o 3) endoluminale sciogliendo il composto di interesse nella soluzione Krebs nella siringa temporizzata. Desensibilizzazione del nervo afferente può verificarsi quando i dosaggi cumulativi di un composto vengono somministrati troppo veloce consecutivamente.

Figura 1
Figura 1: Schema del Costruito appositamente camera di registrazione e di elettrodi di aspirazione panoramica dettagliata della Techni. configurazione cal con l'elettrodo di aspirazione e camera di registrazione a posto. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Tracing rappresentante della registrazione in vitro di digiunale afferenti attività del nervo di registrazione tipico di digiuno multi-unità di attività afferente del nervo (imp.sec -1) (pannello superiore) al basale e in risposta a 2 distensioni di rampa fino a 60 mmHg. (pannello inferiore), e la successiva identificazione (analisi wavemark) di diverse singole-quote del segnale nervoso (terzo pannello). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3:. Neuroanatomy del Colon A) Le informazioni sensoriali dal colon viene convogliata attraverso i nervi colon lombari (LCN) verso il sistema nervoso centrale, con il LCN esecuzione in prossimità mesenterica inferiore (IMA). Una parte delle fibre da questo nervo colon lombare sarà naturalmente lungo il nervo intermesenteric (IMN) per formare i nervi splancnici lombari (LSN). Il ganglio mesenterico inferiore (IMG) si trova all'origine della IMA dall'aorta addominale. Registrazione distale della IMG è obbligatoria dovrebbe ricercatori vogliono studiare viscerofugal attività afferente del nervo. B) Una panoramica schematica del set-up sperimentale. registrazione afferente del LCN viene eseguita in un organo sia mediante un elettrodo di aspirazione collegato al sistema di acquisizione dati. Ramp distensione può essere eseguita alla chiusura della luce di uscita mentre continua l'afflusso diSoluzione di Krebs. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Acquisizione Dati

  1. Registrare l'attività del nervo tramite un elettrodo di aspirazione collegato ad un headstage. Amplifica (guadagno 10k) e filtrare il segnale (passa-banda 500 - 5000 Hz) 20.
    NOTA: A 50/60 Hz Rumore Eliminator dovrebbero essere inclusi nel setup sperimentale al fine di rimuovere 50/60 Hz segnali di rumore interferenze elettriche. Il segnale viene automaticamente digitalizzato e campionato a 20 kHz per l'analisi.

3. Analisi 5,20

  1. Riportare la scarica afferente del nervo come il numero totale di impulsi / secondo per l'intero nervo o utilizzare software specializzato per eseguire ulteriori analisi, come registrazioni multi-unità di attività complessiva del nervo contengono potenziali di azione di diversa forma, ampiezza e larghezza corrispondente a nervi diversa unitàin ogni fibra afferente (Figura 2).
  2. Abbinare i singoli wavemarks a modelli predefiniti, che permettono la discriminazione tra singoli, gruppi. Prima della destinazione di un picco ad un certo onda mark, un rapporto segnale-rumore di> 2: 1 dovrebbero essere applicate.
    NOTA: Durante l'analisi wavemark, costruiamo un nuovo modello in cui almeno 10 picchi simili sono identificati con il software di analisi. Nessun modello è costruito per le forme più rare di 1 su 50 punte. Un picco è abbinato a un modello usando il principio analisi delle componenti quando almeno l'80% dei suoi punti sono identiche al modello picco. corrispondenza modello è operatore-dipendente, e deve sempre essere eseguita dallo stesso ricercatore in modo cieco.
  3. Calcolare i potenziali risposte azione sottraendo l'attività spontanea al basale (pressione endoluminale di 0 mmHg) dalla risposta durante distensione a tempi fissi (5 mmHg di incremento da 0 a 20 mmHg pressione intraluminale, incrementi di 10mmHg da 20 mmHg in poi). Misurare basale scarica afferente utilizzando una dimensione bidone di 10 sec.
  4. Utilizzare l'analisi singola unità per classificare le fibre in base al loro profilo di scarico durante la distensione rampa (Figura 4). Inoltre, l'analisi singola unità può essere utilizzata per studiare il profilo chemiosensibile di diversi tipi di unità, come non tutti i tipi di unità mostreranno la stessa attività di cottura alterata in risposta ad un farmaco o composto.
  5. Adesso fibre come le fibre a bassa soglia ( 'LT', in genere esercitano un aumento delle perdite alle pressioni distensione inferiori), fibre ad alta soglia ( 'HT', esercitare un aumento delle perdite ai massimi pressioni distensione), fibre gamma ampia dinamica ( 'WDR', dimostrare aumento di tiro durante l'intero distensione rampa) o afferenti meccanicamente insensibili ( 'MIA', le fibre nervose che in genere non rispondono a far decollare distensioni) 5; 20.
  6. Esprimere la risposta cottura nervo a 20 mmHg come il percentuale della risposta massima di cottura durante distensione (LT%) in quanto riflette il grado di cottura a bassa pressione distensione.
    NOTA: Pertanto, fibre LT sono caratterizzati da un LT%> 55%, mentre HT sono definiti da un valore <15%. I valori per unità WDR variano tra il 15 e il 55% (20). A MIA mostra cottura afferente spontanea che non è influenzato da distensioni.

Figura 4
Figura 4:. Rappresentazione schematica delle diverse unità afferenti fibra in base al loro profilo meccanosensibili Le unità sono classificate in base alla percentuale (LT%) della loro frequenza di scarica a 20 mmHg di pressione distensione rispetto alla risposta massima di cottura durante la distensione. fibre a bassa soglia (pannello in alto a sinistra) prevalentemente mostrano un aumento dell'attività nervosa a pressioni basse distensione, con un conseguente LT% di oltre il 55%. unità soglia alta (in alto a destrapanel) al contrario visualizzare solo un aumento della frequenza di attivazione a pressioni nocive (% LT <15). fibre Wide Dynamic Range (pannello in basso a sinistra) mostrano un graduale aumento dell'attività nervosa durante l'intero distensione (LT% compresa tra 15 e 55), mentre le fibre meccanicamente insensitive (pannello in basso a destra) non rispondono alle crescenti pressioni distensione. LT%: (afferente a sparare a 20 mmHg / massimo cottura afferente) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Digiunale attività del nervo afferente è stata misurata al basale e in risposta alla rampa distensione in 9 di otto settimane vecchio maschio OF-1 topi. Gli animali sono stati alloggiati in gruppi in condizioni standardizzate (6 animali per gabbia, 20 - 22 ° C, umidità 40 - 50%, 12 ore ciclo luce-buio) con accesso illimitato all'acqua di rubinetto e chow regolare. segmenti digiunale di topi esposti irregolare scarico nervo afferente spontanea al basale ad una pressione endoluminale di 0 mmHg (media attività spontanea 11.47 ± 3.31 imp / sec).

L'attività del nervo afferente digiuno è aumentato su esecuzione di distensioni di rampa fino a 60 mmHg. Tipicamente, l'aumento dell'attività del nervo afferente seguito all'aumento della pressione intraluminale è caratterizzata da una risposta bifasica (Figura 5), costituito da un rapido aumento iniziale dell'attività cottura fino alla pressione intraluminale raggiunge i 20 mmHg, which è principalmente attribuibile alla maggiore frequenza di scarica delle fibre a bassa soglia. Questo è seguito da una fase di plateau, dopo di che un secondo aumento dell'attività cottura può essere osservata da 40 mmHg in poi, che rappresenta l'attivazione delle fibre prevalentemente soglia alta.

In base alle loro forme d'onda, singolo-unità possono essere discriminati in ogni registrazione multi-unità e classificate in una delle suddette quattro categorie. In 9 topi, abbiamo discriminati 40 unità differenti (4,44 ± 1,01 unità / digiunale nervose afferenti), con le unità LT essendo i più diffusi, seguiti da WDR e fibre HT (Figura 6). L'attività di cottura delle diverse unità in risposta a rampa distensione può essere osservato nella Figura 7.

Figura 5
Figura 5: g> mesenterica afferenti scarico Nerve (imp.sec - 1). a Wild-type topi durante la rampa di distensione mesenterica multi-unità scarica afferente del nervo (imp / sec -1) nei topi wild-type durante la distensione rampa per tutta nervi. I valori rappresentano scarica afferente media ± sem, n = 9 topi. imp.sec -1:. impulsi al secondo Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. Singolo Distribuzione Unità di 40 unità identificate nei nervi afferenti digiunale da 9 topi wild-type HT: fibra ad alta soglia, LT: fibra di bassa soglia, MIA: fibra meccanicamente insensibile, WDR: fibra ampia gamma dinamica._blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7:. Curve di pressione-risposta per i diversi tipi di subunità a Wild-tipo Mice La scarica afferente nervo singola unità (imp.sec -1) dalle quattro diverse unità che possono essere identificati, nei topi wild-type durante la decelerazione distensioni. Una fibra soglia bassa (LT, figura in alto a sinistra) è caratterizzato da un rapido aumento iniziale attività di tiro durante distensioni, mentre le fibre ad alta soglia (HT, inferiore figura a sinistra) solo visualizzazione aumentata sparare durante pressioni endoluminali nocivi. Ampi fibre Dynamic Range (WDR, figura in alto a destra) mostrano un costante aumento di attività di tiro durante l'intero distensione, e fibre afferenti meccano-insensitive (MIA, la figura in basso a destra) non rispondono alle crescenti pressioni endoluminali. valori reprisentirsi portata media afferente ± sem imp.sec -1:. impulsi al secondo Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo in questo documento descrive una tecnica di laboratorio riproducibili per studiare mesenterica attività del nervo afferente nei roditori usati per il nostro gruppo e altri 3,4,7,8,12,20,21,31. Passaggi critici all'interno del protocollo includono l'isolamento rapido del tessuto, l'aspirazione del filamento nervoso nell'elettrodo di aspirazione e l'adeguata 'tenuta' del capillare di vetro dal bagno per organi aspirando tessuto adiposo circostante nel capillare. L'apertura del capillare di vetro deve essere determinato con precisione: un'apertura che è troppo piccolo complicare l'aspirazione del filo nervosa nell'elettrodo, mentre una troppo largo diaframma ostacolare la 'tenuta' del capillare con tessuto adiposo, con conseguente ridondante rumore di fondo che ostacolerà le analisi (registrazioni a basso segnale-rumore). Per consentire affidabile classificazione singola unità, afferenti splancnico dovrebbero essere divisi in diversi filoni per ridurre lanumero di unità nella registrazione. In genere, suggeriamo l'obiettivo di avere un massimo di 4 - 5 unità in ogni registrazione. Ricercatori dovrebbe dunque regolare l'apertura basato sulla fibra di interesse, e l'animale da laboratorio che viene applicato.

Un altro punto critico comprende la messa a terra sufficiente del setup sperimentale. L'elettrodo di aspirazione e camera di registrazione devono essere adeguatamente messi a terra e coperti da una gabbia di Faraday in modo da minimizzare interferire campi elettrici che impediscono l'analisi dell'attività neuronale, mentre tutte le altre attrezzature, compresi gli apparati di registrazione, siringa temporizzata eccetera dovrebbe essere installato al di fuori della gabbia .

Registrando l'attività del nervo afferente in prossimità del digiuno o del colon, si può isolare la prima parte della catena di trasduzione del segnale afferente e studiare facilmente il contributo e le alterazioni che si verificano a livello di esclusiva afferente senza interferenze da parte NERV centraleSistema di unità organizzative. Uno dei limiti di questa tecnica è il fatto che in osservazioni in vitro possono non essere sempre facile estrapolati per l'impostazione in vivo, come impostazione in vitro incorpora una sola stazione relè nel complesso segnalazione nervosa cascata. In quanto tale, un quadro più ampio deve essere effettuato incorporando tutte le altre stazioni, come ad esempio i gangli delle radici dorsali, sistema nervoso centrale (ad esempio, l'imaging funzionale del cervello) e discendente (inibitori) vie efferenti.

Un altro vantaggio di questo metodo costituisce la procedura tecnica piuttosto semplice, come non si ha più di monitorare il benessere degli animali da laboratorio che fornisce il campione gastrointestinali. D'altra parte è la misurazione in vitro dell'attività neuronale non adatto per chiarire l'effetto di un farmaco somministrato per via sistemica sul discarico nervosa afferente, ma i ricercatori possono teoricamente superare questo ostacolo sistemica somministrazione del farmaco of interessi all'animale, seguita dalla ex vivo in vitro registrazione dell'attività nervosa afferente. Tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione al fatto che ogni farmaco presente nella camera di registrazione viene diluito a causa della perfusione bagno durante la dissezione e registrazioni successive. Infine, esibendosi in vitro registrazioni dei nervi splancnici utilizzando animali geneticamente modificati potrebbe consentire ai ricercatori di chiarire completamente il ruolo dei diversi canali e recettori espressi sulle fibre afferenti.

I ricercatori di tentare di implementare questa tecnica deve anche tenere a mente che l'identificazione e l'isolamento del afferente mesenterica e afferenze pelvici, ovviamente, richiede conoscenze di anatomia di base e la formazione tecnica, ed i ricercatori dovrebbero essere a conoscenza dei principi di base della elettrofisiologia neuronale.

L'impostazione in vitro permette inoltre ai ricercatori di identificare facilmente possibile tar farmacologicoottiene, e fornisce la comprensione del ruolo fisiologico dell'attività neuronale e segnalazione sensoriale alterata in diversi processi patologici.

Nel caso di misure afferenti digiunali, diversi segmenti di tessuto di un singolo animale possono essere studiati contemporaneamente, una caratteristica che è piuttosto difficile utilizzare un setup in vivo. I ricercatori però devono cautela interpretare i risultati ottenuti dai diversi segmenti, come le differenze regionali potrebbero risultati di polarizzazione. Pertanto si consiglia di misurare costantemente l'attività del nervo afferente dallo stesso sito (ad esempio, primo segmento distale del legamento di Treitz o di flessione duodenojejunal).

Applicazioni tipiche attuali e future di questa tecnica comprendono lo screening di composti farmacologici che possono alterare la sensibilizzazione delle afferenze mesenterici durante patologie che sono caratterizzati da ipersensibilità viscerale e dolore. Come già accennato in precedenza, l'obiettivo dellacomposti SE possono essere incontrati da qualche parte lungo il sistema nervoso intricato vanno dalla enterica sistema nervoso intrinseco al cervello; come tale, la caratterizzazione e modulando l'attività del nervo afferente contribuisce al quadro più ampio che comprende anche il Calcio Imaging del intrinseci nervi enterici e dei gangli spinali, la misurazione della risposta visceromotoria come un indicatore di ipersensibilità viscerale in vivo, e di imaging funzionale del cervello, tra gli altri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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References

  1. Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24, (10), 956-e465 (2012).
  2. Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98, (1), 123-133 (2013).
  3. Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586, (18), 4517-4530 (2008).
  4. Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17, (1), 89-101 (2005).
  5. Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27, (12), 1709-1720 (2015).
  6. Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27, (Suppl 2), 22 (2015).
  7. Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, (1), 166-178 (2004).
  8. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
  9. Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
  10. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G245-G253 (2008).
  11. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, (6), 2046-2060 (1994).
  12. Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60, (2), 281-282 (2011).
  13. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60, (2), 204-208 (2011).
  14. Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (5), 286-296 (2013).
  15. Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11, (6), 575-581 (2011).
  16. De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16, (44), 5523-5535 (2010).
  17. Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, (7), 923-929 (2008).
  18. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586, (21), 5247-5258 (2008).
  19. Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698, (1-3), 404-412 (2013).
  20. Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20, (2), 149-158 (2008).
  21. Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62, (10), 1456-1465 (2013).
  22. Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
  23. Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99, (10), 1299-1311 (2014).
  24. Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. (2016).
  25. Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56, (1), 351-359 (2007).
  26. Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128, (3), 235-243 (2007).
  27. Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58, (1), 22-28 (2010).
  28. Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190, (3), 1123-1130 (2013).
  29. Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190, (2), 765-771 (2013).
  30. Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. (2015).
  31. Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108, (10), 1634-1643 (2013).
<em>In Vitro</em> registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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