Abstract
Афферентные нервы не только передают информацию относительно нормальной физиологии, но и сигнал нарушенного гомеостаза и патофизиологические процессы различных органов и систем от периферии к центральной нервной системе. Таким образом, повышенная активность или «сенсибилизация» брыжеечных афферентных нервов было выделено важную роль в патофизиологии висцеральной гиперчувствительностью и брюшных болевых синдромов.
Мезентериальный афферентного нерва активность может быть измерена в пробирке в изолированной кишечного сегмента , который установлен в ванночку специально построенном и из которого выделяют чревного нерва, что позволяет исследователям непосредственно оценить нервную активность , примыкающий к желудочно - кишечного сегмента. Активность может быть записан на базовой линии в стандартных условиях, во время вздутие сегмента или после добавления фармакологических соединений, поставляемых intraluminally или serosally. Этот метод позволяетисследователь легко изучить влияние препаратов, нацеленных на периферическую нервную систему в контрольных образцах; кроме того, она предоставляет важную информацию о том, как нейронная активность изменяется во время болезни. Следует отметить , однако , что измерение афферентный нейронную огневую активность только составляет одну ретрансляционную станцию в комплексе нейронального сигнального каскада, и исследователи должны иметь в виду , чтобы не упускать из виду нейронную активность на других уровнях (например, ганглии задних корешков, спинного мозга или центральной нервной системы ) для того, чтобы полностью уяснения сложную нейронную физиологию в отношении здоровья и болезни.
Часто используемые приложения включают в себя изучение активности нейронов в ответ на введение липополисахарида и изучение афферентной нервной активности на животных моделях синдрома раздраженного кишечника. В более поступательным подходе сегмент кишечного изолированный мышь может подвергаться ободочной супернатанатах пациентов с СРК. Кроме того, модификацияэтой техники было недавно показано, что применимо в ободочной образцов человека.
Introduction
Сенсорная сигнализация и восприятие боли представляет собой сложный процесс, который является результатом сложной взаимосвязи между афферентных нервов, нейронов спинного мозга, восходящей и нисходящей облегчающее и ингибирующих путей и нескольких различных областях мозга. Таким образом, изменения в одном или нескольких из этих уровней может привести к сенсорной сигнализации измененном и висцеральной боли при болезненных состояниях. Для того, чтобы изучить все эти различные аспекты нескольких методов сенсорной сигнализации были разработаны в диапазоне от экспериментов одиночных клеток (например, изображений кальция на нейроны) до целых животных моделях (например, поведенческие реакции , такие как ответ висцеромоторный). Техника , описанная в данной статье позволяет исследователям конкретно оценивать афферентную активность нерва в пробирке из изолированного сегмента тонкой кишки или толстой кишки у грызунов. Короче говоря, изолированный желудочно-кишечный сегмент (обычно тощей или толстой кишки) установлен в регистрирующей камере, специально построенном перфузией физиологическим KРЭП решение. Внутренностный нерв отсекали и соединен с электродом, позволяющим регистрацию афферентной активности нейронов в висцеральных или тазовых афферентных нервов. Нервные активность может быть записана базально или в ответ на повышение внутрипросветного давления и / или фармакологические соединения , которые могут быть применены либо непосредственно в камеру для записи (serosally), или с помощью внутриполостной перфузату ( через слизистую оболочку) , чтобы оценить их воздействие на афферентную разряда 1-6 , Следует отметить, что Висцеральные нервы также содержат эфферентные волокна и viscerofugal афферентов в дополнение к сенсорному афферентов. Одним из основных преимуществ экс естественных условиях висцеральной записи нерва является тот факт , что исследователи могут количественно нервную активность без модуляции или входного сигнала от центральной нервной системы, позволяя изучать прямое действие локально применяемых соединений на нервную активность. Кроме того, мониторинг жизненно важных параметров, как это необходимо , используя подход , в естественных условиях (см ниже), равно по более актуальной. В пробирке внутренностный записи наконец -то гораздо меньше времени , чем его коллега в естественных условиях.
Афферентный нейронная активность в ответ на другие раздражители, такие как слизистые оболочки поглаживание, зондирующих с помощью волосков фон Фрея или растягивающих сегмента, могут быть изучены в модифицированной экспериментальной установки, в которых кишечная ткань возлагали и разложен в продольном направлении (что, в отличие от наша установка , используя неповрежденный сегмент), как это было описано в предыдущем выпуске 7,8. Кроме того, совсем недавно, методика была описана для изучения ободочной активации афферентных нервных в самой кишечной стенки через визуализации кальция, снова используя скована, продольно открыт сегмент 9.
Альтернативная версия этой методики в естественных условиях состоит из измерения нейронную активацию вблизи входа в афферентной в спинной мозг. Короче говоря, седативные животное помещается в положении лежа, еxposing пояснично - крестцового спинного мозга , к которому афферентный нерв процентных проектов посредством ламинэктомии, строя парафином заполненные хорошо используя кожу разреза и драпировка спинной корешок над платиновым биполярного электрода 10,11. Этот метод, кроме того, позволяет исследователям характеризовать волокна, основанные на их скорости проводимости, и различают немиелинизированные С-волокна из тонко миелиновых Aδ-волокон. Кроме того, спинные корешки исключительно содержат сенсорные афферентные волокна, в отличие от неоднозначного афферентные и эфферентные висцеральных нервов, упомянутых ранее.
Запись афферентного разряда нерва в пробирке из изолированных сегментов кишечника также может быть сделано с использованием человеческих образцов, как две исследовательские группы независимо друг от друга , опубликованных первый в человеке рукописи записи ободочной афферентную активность нервной системы у человека резекции образцов 12,13. Реализация этого метода может привести к более легко translatiна мышиных данных в гуманной состоянии, и может позволить исследователям легко идентифицировать наркотики с таргетингом на сенсибилизированные чувствительного нерва. Клиническое значение , характеризующее афферентного нерва активности, а также открытие новых терапевтических реагентов , которые нацелены на непомерную афферентную нервную активность, был подробно обсужден многими специалистами в области 14-19.
Вышеупомянутая технология в пробирке дополняет более широко известный в измерении естественных условиях афферентной нервной активности. Во время измерения нейрональной активности в естественных условиях, нервной активности может быть измерено непосредственно в седации животного , в течение которого сегмент интереса, была идентифицирована и впоследствии интубацию, и жидкий парафин заполненные хорошо строится с помощью брюшной стенки и кожи грызуна 20. Афферентных нервов, представляющий интерес, а затем идентифицированы, разрезали и помещали на биполярного платинового электрода, что позволяет нейронные активности проводились измереният. Этот метод позволяет исследователю модулировать афферентную нервную активность в живых хотя и седативных животных; как таковой, можно изучить нейронную активность в ответ на помехах, таких как полостной растяжением или внутривенного введения соединения.
Поступательное исследование в настоящее время в основном сосредоточена на применении надосадочных человека , полученных (например., Из ободочной биопсий, культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови и т.п.) на тощей кишки и / или толстой афферентов мыши 21,22. Исследователи могут непосредственно применять супернатантов либо в ванночку или в просвете решение, которое perfuses сегмент кишечника, так что дифференциальные эффекты серозной против применения слизистых оболочек могут быть изучены на афферентного разряда нерва. Таким образом, было показано, что ободочной слизистой биопсии supernatans у пациентов с синдромом раздраженного кишечника может вызвать повышенную чувствительность мыши в ободочной афферентов, морской свинки субмукозных нейронов и мыши спинного корняганглиозные нейроны 21,23,24.
И, наконец, запись нейронную активность не ограничивается мезентериальные и / или тазовой нейронов, иннервирующих желудочно-кишечного тракта. Другие продемонстрировали , что нервные записи могут быть выполнены в афферентов подачи коленного сустава 25, тогда как другие охарактеризовали мочевой пузырь афферентный нервную активность , а также 26-28, и показали , что тазовые афферентов из мочевого пузыря, а также желудочно - кишечного тракта сходятся, что может привести к нейрональной перекрестные помехи 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные ниже, были одобрены Комитетом по медицинской этике и использование экспериментальных животных в Университете Антверпена (номер файла 2012-42) путем.
1. Подготовка ткани из тощей и ободочной Афферентные Нервы
- Получение тощей афферентного нерва
- Выполните грызуна эвтаназии подростка или взрослого грызуна , который был утвержден до эксперимента местным Ethical комитетом (например., Терминал седации с последующим пункции сердца, цервикальной дислокации и т.д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали цервикальной дислокацией пожертвовать животным , таким образом , в результате в экспериментах без необходимости дополнительной анестезии или после хирургической помощи , как ткани подвергаются дальнейшей обработке в лабораторных условиях .
Примечание: Возраст Было показано , что затухают брыжеечных афферентные механосенсорные функции 30, мы поэтому советуют исследователей придерживаться определенной возрастной группы в течение всего срокаодин эксперимент. - Поместите принесена в жертву лабораторных животных в положении лежа на спине и выполнять брюшной срединный разрез через кожу и брюшной мышечный слой с помощью скальпеля, продлив от мечевидный отросток до лобковой кости.
- Купайтесь в брюшную полость с холодным раствором Кребса, чтобы предотвратить внутрибрюшного ткани от высыхания (Кребса состав: 120,03 мМ NaCl, 6,22 мМ KCl, 1,57 мМ NaH 2 PO 4, 15,43 мМ NaHCO 3, 1,21 мМ MgSO 4, 11.52 мМ D-глюкозы и 1,52 мМ CaCl 2).
- Быстро иссечь весь тощей, используя острые ножницы вырезанием около 20 см тонкой кишки, начиная сразу дистальнее дуоденоеюнального изгибом, следя за тем, чтобы не повредить окружающие структуры и поддержания брыжейки кишечника, которая содержит тощей кровеносные сосуды и афферентные нервы, нетронутыми.
Примечание: Для простого тощей рассечение в брюшной полости, нет необходимости использоватьВысококласнный стереоскопический, так как это может быть легко визуализируется невооруженным глазом. - Поместите вырезанную тощей в ледяной раствор Кребса и держать на льду, в то время как оксигенировать раствор Кребса непрерывно с карбогена (95% O 2, 5% CO 2).
- Вырезать тощей с острыми ножницами в приблизительно 3 см длиной петли. Обратите внимание на брыжеечной сверток, содержащий сосуды и спланхнической нерв где-то вблизи центра соответствующего контура.
- Промыть каждый сегмент с раствором Кребса с помощью тупой катетер для удаления содержимого и просвета химуса , поскольку они содержат пищеварительные ферменты , которые ускоряют износ образца ткани в пробирке.
Примечание: Следите за тем, чтобы не повредить просвет петли во время промывки, так как разрушение ворсинок приведет к высвобождению медиаторов , которые могут изменить афферентные нервную активность. - Определить сегмент для измерения активности нервных афферентный (например, первый тощей segmeнт дистальнее связки Treitz или дуоденоеюнального изгибом), а также место в этой камере записи специально построенном покрытой слоем силиконового эластомера.
Примечание: В начале тощей анатомически определяется как часть тонкой кишки, где связки Treitz пересекает тонкую кишку, которая также называется дуоденоеюнального прогиб.
Примечание: Крышка нижней части записи камеры с тонким слоем силиконового эластомера задолго до начала эксперимента. Получение этого слоя эластомера должен быть выполнен в соответствии с инструкциями производителя 1. - Заливать камеру постоянно с теплым, carbogenated раствор Кребса со скоростью 10 мл / мин и держать температуру Кребса в постоянной записи в камере при температуре 34 ° C.
- Установить тощей сегмент в ванночку так, что пероральное конец соединен с драйвером шприца, обеспечивающего поток и люминальную аборальной конец подключается к оттоку. Слегка ултужиться сегмент, но будьте осторожны, чтобы не оказывать чрезмерного натяжения. Прикрепите оба конца плотно используя 4/0 шелковые лигатуры на входных и выходных отверстий.
- Приложить драйвер шприц к оральной концу, и заливать тощей сегмент intraluminally раствором Кребса (неокисленные, температура окружающей среды) со скоростью 10 мл / ч.
- Закрепление брыжейки смонтированного кишечника плоского участка с нижним слоем силиконового эластомера, используя насекомых булавками. Stretch брыжейки в целях оптимизации визуализации брыжеечной пучка; не оказывают нагрузку на пачке или тощей.
- Выполните тест рампы вздутие (смотри ниже) путем закрытия выходного порта пока внутрипросветное давление кишечного сегмента не превышает 60 мм рт.ст., с тем чтобы проверить, что ни один внутрипросветное раствор Кребса не подтекает из установленного сегмента. Отметим, плавный подъем внутрипросветного давления без перерывов.
- Заметим, небольшие сокращения сегмента (перистальтический WAVов) во время начальной фазы вздутие. При необходимости блок перистальтической активности путем добавления 1 мкМ L-типа блокатора кальциевых каналов нифедипин в раствор Кребса.
Примечание: Добавление 1 мкМ атропина в растворе Кребса в дополнение к нифедипин, полностью парализуют кишечный сегмент. Однако мы не имеем никакого личного опыта использования и влияния атропина на афферентной записи нерва. - Под стереомикроскопа, аккуратно начинают шелушиться от жировой ткани брыжейки, осторожно дергая ее с двумя маленькими щипчиками, следя за тем, чтобы не повредить сосуды и афферентный нерв, которые погребены в жировой ткани.
- Старт на удаленном расстоянии от тощей, и выставляют как кровеносные сосуды в брыжеечной пучке.
- Обратите внимание на афферентную тощей нерв между обоими судами как тонкой, белой нитью, инкапсулированного в жировой ткани. Только рассекают более проксимально к тощей, осторожно пилинга жировой ткани прочь с помощью пинцета, когдапервоначальное определение обоих сосудов брыжейки и / или афферентной нерва трудно.
- Рассеките тощей брыжеечной нерв сегмента свободной на расстоянии нескольких миллиметров, путем удаления прилипших жировой ткани нерва.
- Трансекте нерва с помощью острые ножницы ткани. При необходимости, снимите оставшиеся жира и соединительной ткани, а также epineuronal оболочку, осторожно дергая его с маленькими щипчиками.
- Использование микроманипулятора, опустить кончик всасывающего электрода, соединенного с помощью шприца с поршнем, в ванночку; Затем, манипулируя поршень, мягко аспирата некоторое Кребса раствора из ванночку так, чтобы кончик электрода , погруженного в раствор Кребса (рисунок 1). Убедитесь в том, что раствор Кребса охватывает проволочного электрода внутри всасывающего электрода.
Примечание: Подготовьте боросиликатного стекла всасывания капилляр, который содержит проволочного электрода до начала эксперимента насING пипетки съемник. - Поместите наконечник всасывающего электрода непосредственно рядом с пересечённого афферентного нерва нити и рисовать перерезанного нерва прядь в капилляр по всей его длине.
- Маневр кончик электрода по отношению к какой-то жировой ткани и аспирата это в стеклянный капилляр, пока прочно аспирационных с плунжером, таким образом, механически '' уплотнение нерва в капилляре из содержимого ванны органа.
- Проверьте запись нервной активности афферентной с использованием системы сбора данных, например, путем выполнения рампы вздутие индуцированных увеличение афферентных стрельбы (смотри ниже). После изоляции нерва во всасывающий электрод, стабилизируют препарат в течение 15 мин, чтобы получить устойчивое состояние нервную активность спонтанное афферентный перед выполнением фактических экспериментов.
- Для выполнения наклонную вздутие, разбухают кишечного сегмента путем закрытия выходного порта, что приводит к градПовышение давления в UAL в сегменте кишечника (до 60 мм ртутного столба). Только выполнить требуемый протокол эксперимента , когда три последовательных distensions рампы (с интервалом в 15 мин) дают воспроизводимые разряда нескольких единиц (рисунок 2).
- Выполните грызуна эвтаназии подростка или взрослого грызуна , который был утвержден до эксперимента местным Ethical комитетом (например., Терминал седации с последующим пункции сердца, цервикальной дислокации и т.д.).
- Получение поясничной висцеральной афферентной (ободочной афферентного нерва)
Примечание: Рассечение ободочной афферентных нервов требует более детального рассечение. Отклонения от бывшего "тощей" протокола перечислены ниже:- Усыпить животное с помощью гуманным методом, поместите его в положении лежа на спине, выполнить срединной лапаротомии и чрезмерно налить ледяной раствор Кребса в брюшной полости. Примечание: Кребса состав: 118 мМ NaCl, 4,75 мМ KCl, 1 мМ NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1,2 мМ MgSO 4, 11 мМ D-глюкозы и 2,5 мМ CaCl 2, 3 мкМ индометацина.
Примечание: Обратите внимание на измененный состав раствора Кребса; индометацин добавляется к таклюция в целях предотвращения изменения афферентной нервной активности простагландины. - Выбросите жировой ткани, мочевого пузыря и внутренних половых органов, и осторожно сдвигать тонкой кишки в одну сторону в брюшной полости. Выполните расширенный prelevation дистальной части толстой кишки с неповрежденными брыжеечных нервов из брюшной полости.
Примечание: Важные ориентиры, которые могут быть включены в эту рассечения, чтобы облегчить дальнейшую подготовку ткани включают брюшную аорту и полую вену, левую почку и мускулатуру тазового дна.
Примечание: Во время вскрытия, заботиться, чтобы не оказывать тягу на соединительной ткани между толстой кишки и брюшной аорты, так как эта область содержит поясничные висцеральной нервы. - Перенести сегмент ткани в силиконового эластомера подкладке записи камеры. С помощью левой почечной артерии, которая берет свое начало из брюшной аорты, в качестве отправной точки. Следуйте брюшной аорты в аборальной направлении, столкнулись с превосходящими mesenteriс артерией вместе с целиакией и брыжеечной ганглиев. И, наконец, приходим к соединительной ткани между дистальной части толстой кишки и аортой, в котором нерв интерес находится.
- Определение нижней брыжеечной артерии, происходящих из брюшной аорты. Поясничные висцеральный афферентный нерв может быть идентифицирован у основания нижней брыжеечной артерии; она проходит параллельно артерии (рисунок 3).
- После перерезки нерва, аккуратно отделите окружающую оболочку соединительной ткани и дразнить нерва на несколько тонких нитей. Убедитесь в том, чтобы держать на безопасном расстоянии от толстой кишки.
- Нарисуйте одну из этих одиночных нитей во всасывающий электрод, 'уплотнения' капилляра с окружающей жировой ткани, как описано выше, и выполнить требуемый экспериментальный протокол.
- Отменить любые лишние ткани, которая присутствует в ванне для органов (например, почек, абдоминальные сосуды, мышечные ткани), вS это может нарушить сигнал афферентный.
Примечание: нифедипин (1 мкМ), могут быть добавлены в раствор Кребса в случае афферентный сигнал нерва нарушается спонтанным кишечного движения из-за сокращений гладких мышечных клеток.
Примечание: Препараты могут быть введены в трех различных местах: 1) serosally путем растворения требуемого соединения в растворе Кребса, который perfuses записи камеры, 2) непосредственно в ванну органа в то время как временно останавливая перфузию или 3) intraluminally путем растворения соединения интерес в раствор Кребса в шприце приводе. Десенситизация афферентного нерва может произойти, если кумулятивные дозы соединения вводят слишком быстро последовательно.
- Усыпить животное с помощью гуманным методом, поместите его в положении лежа на спине, выполнить срединной лапаротомии и чрезмерно налить ледяной раствор Кребса в брюшной полости. Примечание: Кребса состав: 118 мМ NaCl, 4,75 мМ KCl, 1 мМ NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1,2 мМ MgSO 4, 11 мМ D-глюкозы и 2,5 мМ CaCl 2, 3 мкМ индометацина.
Рисунок 1: Схема Цель встроенной записи камерной и электродов Всасывающая Подробный обзор техни. установка кал с всасывающим электродом и записи камеры на месте. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель Розыск In Vitro записи из тощей афферентными нервными активность Типичная запись тощей неунитарное афферентной нервной активности (imp.sec -1) (верхняя панель) в исходном состоянии и в ответ на 2 рампы distensions вплоть до 60 мм рт. (нижняя панель), а также последующей идентификации (анализ wavemark) различных отдельных единиц в сигнале нерва (третья панель). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"Рисунок 3" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
Рисунок 3:. Нейроанатомию ободочной A) Сенсорная информация из толстого кишечника передается через поясничных ободочной нервов (LCN) по отношению к центральной нервной системе, с LCN работает в непосредственной близости от нижней брыжеечной артерии (IMA). Часть волокон из этого поясничного нерва ободочной будет курс вдоль intermesenteric нерва (IMN), чтобы сформировать поясничные нервы висцеральной (LSN). Нижней брыжеечной ганглиев (IMG) находится в начале ИМА из брюшной аорты. Запись дистальнее IMG обязательно должен исследователи хотят учиться viscerofugal афферентного нерва активность. Б) схематический обзор экспериментальной установки. Афферентная запись LCN осуществляется в органе, как с помощью всасывающего электрода, соединенного с системой сбора данных. Рампа вздутие может быть выполнена после закрытия выпускного окна, продолжая при этом притокКребс решение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
2. Сбор данных
- Запись активности нерва через всасывающий электрод, соединенный с headstage. Amplify (усиление 10k) и фильтрации сигнала (полосовой 500 - 5000 Гц) 20.
Примечание: А, 50/60 Гц Шум Элиминатор должны быть включены в экспериментальную установку с целью удаления 50/60 Гц шумовых сигналов электрических помех. Сигнал автоматически оцифровываются и дискретизации с частотой 20 кГц для анализа.
3. Анализ 5,20
- Отчет разряда афферентных нервов, как от общего числа импульсов / секунду для всего нерва или использовать специализированное программное обеспечение для выполнения дальнейшего анализа, как мульти-блок записи общей активности нервов содержат потенциалы действия различной формы, амплитуды и ширины, соответствующих различным нерва единицыв каждом афферентного волокна (рисунок 2).
- Матч отдельных wavemarks заранее определенные шаблоны, позволяющие дискриминации между одиночными единиц. Перед выделением всплеска до некоторой волны знака, отношение сигнал-шум> 2: 1 должно быть приведено в исполнение.
Примечание: Во время анализа wavemark, мы строим новый шаблон, когда по меньшей мере 10 подобных пиков определяются программным обеспечением анализа. Ни один шаблон не строится для форм встречается реже, чем 1 из 50 шипов. Шип сравнивается с шаблоном, используя принцип компонентного анализа, когда по меньшей мере 80% его точек идентичны шаблона шипа. Шаблон соответствия является функция зависит от оператора, и всегда должны быть выполнены одним и тем же исследователем слепым методом. - Вычислим действие возможные ответные меры путем вычитания спонтанной активности на исходном уровне (внутрипросветное давление 0 мм ртутного столба) от ответа при растяжением в фиксированных временных точках (5 мм рт.ст. приращения от 0 до 20 мм ртутного столба внутрипросветного давления, с шагом 10мм рт.ст. от 20 мм рт.ст. и выше). Измерение базового разряда афферентный с использованием размера бункера 10 сек.
- Используйте анализ моноблочный для классификации волокон на основе их профиля разряда во время разгона растяжению (рисунок 4). Кроме того, с одним блок анализа может быть использован для изучения chemosensitive профиля различных типов единиц, так как не все типы устройств будут отображать один и тот же измененную огневую активность в ответ на лекарства или соединения.
- Классифицировать волокна как низкий порог волокон ( 'LT', как правило, оказывают повышенной разряда при низких давлениях вздутие), высокий порог волокон ( 'HT', оказывают повышенное разряда при самых высоких давлениях вздутие), широкий динамический диапазон волокон ( 'WDR', демонстрируют увеличилась стрельбы в течение всего рампы растяжением) или механически нечувствительной афферентные ( 'МВД', нервные волокна , которые , как правило , не реагируют на пандус distensions) 5; 20.
- Экспресс ответ нерва стрельбы на 20 мм ртутного столба, как рercentage максимального ответа обжига во время растяжению (LT%), поскольку он отражает степень обжига при низком давлении вздутие.
Примечание: Таким образом, LT волокна характеризуются LT%> 55%, в то время как HT определяются значением <15%. Значения единиц WDR в диапазоне от 15 до 55% (20). МВД показывает спонтанное афферентный стрельбы, которое не зависит от distensions.
Рисунок 4:. Схематическое представление различных подразделений Афферентный волокна в зависимости от их профиля механочувствительных единицы классифицируются на основе процент (LT%) от их скорости стрельбы при давлении 20 мм рт.ст. растяжению по сравнению с максимальной ответной реакции во время стрельбы растяжением. Низкий порог волокна (верхняя левая панель) в основном проявляют повышенную активность нерва при низких давлениях растяжению, что приводит к LT% более чем на 55%. Высокие пороговые единицы (верхний правыйпанель), наоборот отображать только увеличение скорострельность при давлениях (ядовитыми% LT <15). Широкий динамический диапазон волокон (нижняя левая панель) отображает постепенное увеличение нервной активности в течение всего растяжению (% LT в диапазоне от 15 до 55 лет), в то время как механически нечувствительные волокна (нижняя правая панель) не реагируют на повышение давления вздутие. LT%: (афферентные обжига при 20 мм рт.ст. / максимального афферентной обжига) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тощей афферентного нерва активность измеряли в исходном состоянии и в ответ на пандус вздутие в 9 из восьми недельных самец-1 мышей. Животных содержали в группах в стандартных условиях (6 животных в клетке, 20 - 22 ° C, влажность 40 - 50%, 12 ч светло-темного цикла) с неограниченным доступом к водопроводной воде и регулярные чау. Тощей кишки сегментов мышей отображается скачками спонтанное афферентный разряда нерва на исходном уровне при внутриполостной давлении 0 мм рт.ст. (среднее значение спонтанной активности 11,47 ± 3,31 имп / с).
Тощей афферентного нерва активность возрастает при выполнении рампы не distensions вплоть до 60 мм ртутного столба. Как правило, увеличение нервной активности афферентной после роста внутрипросветного давления характеризуется двухфазным ответом (рисунок 5), состоящий из первоначального быстрого увеличения огневой активности вплоть до внутрипросветный давление не достигает 20 мм рт.ст., whicч может быть , главным образом , связано с увеличением скорости стрельбы низкопорогового волокон. Это затем следует фаза плато, после чего второе повышение огневой активности можно наблюдать с 40 мм рт.ст. и далее, представляющие активацию преимущественно высоких пороговых волокон.
На основе их форм волны, Однополочные единицы могут дискриминировать в каждой записи многоэлементной и классифицированы в одной из вышеупомянутых четырех категорий. В 9 мышей, мы предвзято 40 различных единиц (4,44 ± 1,01 ед / тощей афферентного нерва), с единицами LT , являющихся наиболее распространенными из них, за которыми следуют WDR и HT волокон (рисунок 6). Обжиг деятельность различных подразделений в ответ на пандус вздутие можно наблюдать на рисунке 7.
Рисунок 5:
Рис . 6: Single Распределение Единица 40 частей , идентифицированных в тощей афферентных нервах из 9 мышей дикого типа HT: высокий порог волокна, LT: низкий порог волокна, MIA: механически нечувствительной волокно, WDR: широкий динамический диапазон волокон._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 7: Кривые давления отклика для различных типов субъединиц у мышей дикого типа Сингл-блок афферентного нерва разряда (imp.sec -1) из четырех различных единиц , которые могут быть идентифицированы, у мышей дикого типа во время рампы distensions. Низкий порог волокна (LT, левый верхний рисунок) характеризуется начальным быстрым увеличением огневой активности во время distensions, в то время как высокий порог волокон (HT, левый нижний рисунок) только дисплей увеличился стрельбы во вредных внутрипросветных давлениях. Широкий динамический диапазон волокон (WDR, верхний правый рисунок) показывают устойчивый рост огневой активности в течение всего растяжением и механохимических нечувствительным афферентных волокон (МИА, нижний правый рисунок) не отвечают на повышение внутрипросветного давления. Значения респнегодуют средний афферентный разряд ± РЭМ imp.sec -1:. импульсов в секунду Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол , используемый в данной работе описан воспроизводимый лабораторной техники для изучения брыжеечной нерва активность афферентный у грызунов, которые используются в нашей группе и других 3,4,7,8,12,20,21,31. Критические шаги в рамках протокола включают быструю изоляцию ткани, стремление нервной цепи во всасывающий электрод и адекватную "запечатывание" стеклянного капилляра из ванны органа путем аспирационной окружающих жировой ткани в капилляр. Апертура стеклянного капилляра должен быть точно определен: отверстие, что слишком мало усложнит стремление нервной цепи в электрод, в то время как слишком широкая диафрагма будет мешать "запечатывание" капилляра с жировой тканью, что приводит к излишним фоновый шум, который будет мешать анализа (низкие записи сигнала к шуму). Для обеспечения надежного моноблочный классификации, Висцеральные афферентов должны быть разделены в различных нитей, с тем чтобы уменьшитьколичество единиц в записи. Как правило, мы хотели бы предложить с целью иметь максимум 4 - 5 единиц в каждой записи. Поэтому исследователи должны настроить диафрагму, основанную на волокна интереса и лабораторного животного, которое применяется.
Другой важный пункт включает в себя достаточное заземление экспериментальной установки. Всасывающий электрод и записи камера должна быть надлежащим образом заземлены и покрыты клетки Фарадея, чтобы минимизировать вмешательство электрических полей, которые препятствуют анализ нейрональной активности, в то время как все другое оборудование, включая записывающих устройств, водитель шприц и так далее должны быть установлены вне клетки ,
Записывая афферентную активность нерва в непосредственной близости от тощей или толстой кишки, можно выделить первую часть трансдукции цепи афферентного сигнала и легко изучить вклад и изменения, которые происходят на уровне единственного афферентной без вмешательства со стороны центрального NERVOUs система. Одним из недостатков этого метода является то , что в пробирке наблюдений не всегда могут быть экстраполированы усилий к установке в естественных условиях, так как установка в пробирке только включает в себя одну ретрансляционную станцию в сложной нервной сигнализации каскада. Таким образом , более широкая картина должна быть сделана с учетом всех других станций, таких как спинной ганглии, центральной нервной системы (например, функциональной визуализации мозга) и нисходящих (подавляющих) эфферентных путей.
Еще одним преимуществом этого метода является достаточно простой технической процедурой, как можно больше не нужно следить за благополучие лабораторного животного, которое обеспечивает желудочно-кишечного тракта образца. С другой стороны , это измерение в пробирке нейронной активности не подходит для выяснения эффекта системно вводимого лекарства при выписке афферентного нерва, но исследователи теоретически могут преодолеть это препятствие путем системного введения лекарственной OF интерес к животному, а затем экс виво в пробирке записи афферентных нервных активности. Тем не менее, следует быть внимательными к тому, что любое лекарственное средство присутствует в записи камеры будет разбавлен за счет ванны перфузии во время вскрытия и последующих записей. Наконец, выступая в пробирке чревного нерва записи с использованием генетически модифицированных животных могли позволить исследователям в полной мере выяснить роль различных каналов и рецепторов , выраженных на афферентных волокон.
Исследователи пытаются внедрить эту технику также должны иметь в виду, что идентификация и выделение брыжеечной афферентных и тазовых афферентов, очевидно, требует знания базовой анатомии и технической подготовки, и исследователи должны быть знакомы с основными принципами нейронного электрофизиологии.
Установка в пробирке , кроме того , позволяет исследователям легко определить возможную фармакологическую деготьполучает, и дает представление о физиологической роли нейрональной активности, а также сенсорных сигналов измененном в нескольких болезненных процессов.
В случае тощей кишки афферентных измерений, несколько сегментов ткани одного животного можно изучать одновременно, особенность , которая является довольно трудно с помощью установки в естественных условиях. Исследователи, однако следует осторожно интерпретировать результаты, полученные из различных сегментов, как региональные различия могут результаты смещения. Поэтому мы рекомендуем последовательно измерять афферентную нервную активность с того же сайта (например, первого сегмента дистально от связки Treitz или дуоденоеюнального прогиб).
Типичные текущие и будущие применения этой методики включают скрининг фармакологических соединений, которые могут изменить сенсибилизации брыжейки афферентов во время патологий, которые характеризуются висцеральной гиперчувствительностью и боли. Как уже упоминалось ранее, мишеньюкак таковые соединения могут встречаться где-то вдоль сложной нервной системы, начиная от кишечно внутренней нервной системы в головном мозге; как таковые, характеризующие и модуляции афферентного нерва активность способствует более широкой картине , которая также охватывает визуализации кальция непреходящую кишечно нервов и спинномозговых ганглиев, измерение реакции висцеромоторный как индикатор висцеральной гиперчувствительностью в естественных условиях, и функциональной визуализации мозга, среди других.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
