Abstract
Afferent sinirlerin normal fizyoloji konusunda bilgi sağlar ama aynı zamanda bozulmuş homeostazı ve merkezi sinir sistemine yönelik çevrelerinden farklı organ sistemlerinde patofizyolojik süreçleri sinyal sadece. Bu nedenle, artmış aktivite veya mezenterik afferent sinirlerin 'hassaslaşması' visseral hipersensitivite ve karın ağrısı sendromların patofizyolojisinde önemli bir rol tahsis edilmiştir.
Mezenterik afferent sinir aktivitesi, amaçlı olarak inşa edilmiş bir organ banyosu içine monte edilmiştir ve başka splanknik sinir araştırmacılar doğrudan mide bağırsak segmenti bitişik sinir aktivitesini değerlendirmek için izin izole edilir, izole edilmiş bir barsak segmentinde in vitro ölçülebilir. Etkinlik segmentinin şişkinlik veya lümen veya serosally verilen farmakolojik bileşikler ilave edildikten sonra sırasında standart koşullarda başlangıçta kaydedilebilir. Bu teknik sağlarAraştırmacı kolaylıkla kontrol örneklerinde periferik sinir sistemini hedef alan ilaçların etkisini incelemek için; yanı sıra, hastalık sırasında değişmiş nasıl nöronal aktivitenin hakkında önemli bilgiler sağlar. Afferent nöron ateşleme aktivitesini ölçmek sadece kaskad sinyalizasyon karmaşık nöron bir röle istasyonunu teşkil etmektedir ve araştırmacılar diğer seviyelere (örneğin, arka kök ganglionlar, omurilik veya merkezi sinir sistemi nöronal aktiviteyi kaçırmak akılda değil ayı gerektiğini ancak unutulmamalıdır ) tam Sağlıkta ve hastalıkta karmaşık nöronal fizyolojisini aydınlatmak için.
Yaygın olarak kullanılan uygulamaların lipopolisakkarid uygulamasına tepki olarak nöronal aktivitenin incelenmesi ve irritabl barsak sendromu, hayvan modellerinde afferent sinir etkinliğinin incelenmesi yer almaktadır. Daha öteleme yaklaşımda, izole fare bağırsak segmenti IBS hastalarında kolonik süpernatantlar maruz kalabilir. Bundan başka, bir modifikasyonBu tekniğin en son insan kolonik örneklerinde uygulanabilir olduğu gösterilmiştir.
Introduction
Duyu sinyalizasyon ve ağrı algısı afferent sinirler, spinal nöronlar, artan ve azalan kolaylaştıran ve engelleyen yolların ve birkaç farklı beyin bölgeleri arasında karmaşık bir etkileşiminden kaynaklanan karmaşık bir süreçtir. Bu şekilde, bu seviyelerde bir veya daha fazla değişiklikler değiştirilmiş duyu sinyalizasyon ve hastalık durumlarında organ ağrısı neden olabilir. Duyusal sinyal birden teknikleri tüm bu farklı yönlerini incelemek için tek hücre deneyleri arasında değişen geliştirilmiştir (örneğin, nöronlar üzerinde kalsiyum görüntüleme) tüm hayvan modellerinde (örneğin, örneğin viseromotor tepki olarak davranışsal tepkileri). Bu yazıda anlatılan teknik araştırmacılar özellikle kemirgenlerde ince barsak veya kolon izole bir segmentten in vitro afferent sinir aktivitesini değerlendirmek için izin verir. Kısaca, izole edilmiş bir mide-bağırsak segmenti (genellikle jejunum ve kolon) bir fizyolojiksel K ile perfüze amaca kayıt odasına monte edilirRebs çözeltisi. splanknik sinir kesilerek splanknik veya pelvik afferent sinirlerin afferent nöronal aktivitenin kayıt sağlayan bir elektrot bağlanır. Sinir aktivitesi bazal biçimde ya da ya da (mukozal) lümen içi perfüzat ile kayıt odasına (serosally) içine doğrudan doğruya uygulanabilir intraluminal basınçlar ve / veya farmakolojik bileşikleri karşılık olarak giderek aferent deşarj 1-6 üzerindeki etkisini değerlendirmek için kaydedilebilir . notun, splanknik sinirler de efferent lifleri ve duyusal aferentlerde ilaveten viscerofugal afferentleri içerirler. Ex vivo splanknik sinir kayıt önemli avantajlarından biri araştırmacı sinir aktivitesi üzerindeki lokal olarak uygulanan bileşiklerin doğrudan etkisini araştırmak için izin, merkezi sinir sisteminden modülasyonu veya girişi olmadan sinir aktivitesini ölçmek gerçektir. In vivo yaklaşımı kullanarak gerekli olan ek, yaşamsal parametrelerinin izlenmesi, n, (aşağıya bakınız)O artık ilgili. In vitro splanknik kayıt nihayet çok daha az zaman alıcı olan in vivo meslektaşı daha.
mukoza strok gibi diğer uyarıcıların, von Frey kılları kullanılarak sondalama veya parçanın gerilmesine karşılık afferent nöron faaliyeti bağırsak doku Please ve aksine olan (uzunlamasına açılmış olduğu bir modifiye edilmiş deney düzeneği incelenebilir bir önceki sayısında 7,8 tanımlanmıştır) bozulmamış bir segmenti kullanarak kurulum. Buna ek olarak, sadece son zamanlarda, bir teknik yine uzunlamasına segmenti 9 açıldı, aşağı tuş kullanarak, kalsiyum görüntüleme yoluyla kolon duvarında kendisi kolon afferent sinir aktivasyonu incelemek için tanımlanmıştır.
Bu in vivo tekniğin alternatif bir versiyonu omuriliğe afferent girişine yakın nöronal aktivasyon ölçüm dışında oluşur. Kısacası, sedasyon hayvan yüzüstü pozisyon, e yerleştirilirinşa laminektomi vasıtasıyla faiz projelerinin hangi afferent sinir etmek lumbosakral spinal kord FrmKD Yepyeni bir parafin dolu kesi cilt kullanarak ve bir platin iki kutuplu bir elektrot 10,11 üzerinde dorsal ince kök dökümlü iyi. Bu teknik ayrıca araştırmacılar ince miyelinli Aδ-liflerden miyelinsiz C-lifleri kendi iletim hızının dayalı lifleri karakterize ve ayırmasına olanak sağlar. Bundan başka, sırt kökçükler özel daha önce sözü edilen karma afferent ve efferent splanknik sinirlerin aksine, duyu aferent lifler içerir.
İzole bağırsak segmentlerinden in vitro afferent sinir deşarjı Kayıt ayrıca bağımsız insan rezeksiyon kolonik afferent sinir etkinliği kaydederek ilk-in-man el yazmaları 12,13 örneklerinde yayınlanan iki araştırma grubu olarak, insan örnekler kullanılarak yapılabilir. Bu tekniğin uygulanması daha kolay Alan Çevirisi neden olabilirinsani duruma fare verilerin üzerine ve araştırmacılar kolayca duyarlı duyusal sinir hedefleyen ilaçlar tanımlamak için izin verebilir. Afferent sinir aktivitesini yanı sıra fahiş afferent sinir aktivitesini hedefleyen yeni tedavi reaktiflerin keşfini karakterize klinik önemi, özenle alanda 14-19 birçok uzman tarafından tartışılmıştır.
Bahsedilen laboratuar tekniğidir daha sık afferent sinir aktivitesinin in vivo ölçümü bilinen tamamlar. In vivo nöronal aktivite ölçümü sırasında sinir aktivitesi ilgi kademeli entübe ardından belirlenmiş ve bu süre boyunca sedasyon hayvanda doğrudan ölçülebilir ve bir sıvı parafın doldurulmuş de kemirgen 20 karın duvarı ve deri kullanılarak elde edilebilmektedir. ilgi afferent sinir sonra nöronal aktivitenin ÖLÇME izin tespit kesitli ve iki kutuplu bir platin elektrotta yerleştirilirt. Bu teknik sedasyon hayvanlarda da olsa yaşayan afferent sinir aktivitesini modüle araştırmacı sağlar; gibi böyle bir lümen gerilmenin ya da bir bileşimin damar içine uygulama gibi etkileşimler yanıt nöronal aktivitenin çalışma olabilir.
Translasyonel araştırmalar günümüzde esas olarak insandan türetilmiş yüzer uygulanmasına yöneliktir (örneğin., Kolon biyopsi, kültive periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, vb) jejunum ve / veya kolon fare afferent 21,22 üzerine. mukozal uygulamanın karşı serozal o diferansiyel etkisi afferent sinir boşalması üzerine okudu böylece Araştırmacılar, doğrudan organ banyosuna ya da bağırsak segmenti perfuses lümen çözeltisi içine ya süpernatantlar uygulayabilirsiniz. Bunun gibi, fare kolon afferentleri, kobay submüköz nöronlar ve fare dorsal kök hassasiyetine neden olabilir irritabl barsak sendromu olan hastaların bu kolon mukoza biyopsi supernatans gördügangliyon nöronlarının 21,23,24.
Son olarak, nöronal aktivitenin kayıt mezenterik sınırlı ve / veya pelvik nöronlar gastrointestinal sistem innerve değildir. Diğerleri sinir kayıtları diz eklem 25 tedarik afferentleri yapılabilir olduğunu diğerleri de 26-28 mesane afferent sinir aktivitesini karakterize gelirken gösterdi ve mesaneden pelvik afferentleri yanı sıra gastrointestinal sistem muhtemelen nöronal neden yakınsama ortaya koymuştur çapraz 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan deneyleri Tıp Etiği Komitesi ve Anvers Üniversitesi (dosya numarası 2012-42) Deneysel Hayvanların kullanımı tarafından kabul edildi.
1. jejunal Doku Hazırlanması ve Kolon Afferent Sinirler
- jejunal afferent sinir hazırlanması
- Yerel Etik Komitesi tarafından deney öncesinde onaylandı ergen ya da erişkin kemirgen kemirgen ötenazi gerçekleştirin (örn., Kardiyak delme, servikal dislokasyon, vb ardından Terminal sedasyon).
NOT: dokular bundan başka in vitro işleme gibi başka anestezi veya ameliyat sonrası bakım ihtiyacı olmadan bu şekilde deneylerde elde edilen hayvanlar kurban servikal dislokasyon kullanılır.
NOT: Yaş mezenterik afferent mechanosensory fonksiyonlar 30, biz bu nedenle süresi için belirli bir yaş grubundaki uyması araştırmacıları tavsiye azaltmak gösterilmiştirTek bir deney. - yatar pozisyonda kurban laboratuvar hayvan koyun ve kasık kemiğine kadar xiphoid süreç uzanan bir neşter kullanılarak deri ve karın kas tabakası ile karın orta hat kesi yapmak.
- (Krebs bileşimin kurumasını karın içi dokuları önlemek için soğuk Krebs çözeltisi ile karın boşluğuna yıkayın: 120,03 mM NaCI, 6.22 mM KCI, 1.57 mM NaH 2 PO 4, 15.43 mM NaHCO 3, 1.21 mM MgSO 4, 11.52 mM D-glikoz ve 1.52 mM CaCl2).
- Hızla çevredeki yapılara zarar vermemeye özen ve sağlam jejunal kan damarları ve afferent sinirleri içeren barsak en mezenterin tutarak, hemen distale Duodenojejunal esneme başlangıç ince barsağın yaklaşık 20 cm kesilmesiyle keskin bir makas kullanarak tüm jejunum tüketim.
NOT: karın boşluğunda sadece jejunal diseksiyon için birini kullanmak gerekmezBu bir stereomikroskopta, kolayca çıplak gözle görülebilir. - Buz soğukluğunda Krebs çözeltisi içinde kesilmiş jejunum yerleştirin ve karbojen (% 95 O2,% 5 CO2) sürekli Krebs çözeltisi oksijenleme ise, buz üzerinde tutulur.
- yaklaşık 3 cm uzunluğunda döngüler içinde keskin bir makas ile jejunum kesin. bir yerde, ilgili döngü merkezine yakın damarları ve splanknik sinir içeren mezenterik paket gözlemleyin.
- Lümen alınız ve bu in vitro doku örneğinin bozulmasını hızlandırır sindirim enzimleri içeren olarak besin bulamacı için bir kör kateter kullanılarak Krebs çözeltisi ile her bir segmenti yıkayın.
NOT: villus imha afferent sinir aktivitesini değiştirebilir aracıların ortaya çıkmasına neden olacaktır olarak, yıkama sırasında döngünün lümen zarar vermemeye özen gösterin. - Afferent sinir aktivitesini ölçmek için segmenti belirlemek (örneğin, ilk jejunal BÖLÜMLEREnt distal bir silikon elastomer tabakası ile kaplanmış bir amaca kayıt odasına Treitz'in ligamentinden ya Duodenojejunal esneme) ve bir yer bu.
NOT: jejunum başlangıcı anatomik Treitz bağ ince bağırsak haçlar ince bağırsağın bir parçası olarak tanımlanan, ayrıca Duodenojejunal eğilme denir.
Not: iyi deney başlamadan önce önceden ince silikon elastomer tabakası ile kayıt odasının alt kapağı. Bunun, elastomer tabakanın hazırlama işlemi, üretici talimatlarına 1 'e göre yapılmalıdır. - sürekli sıcak odasını serpmek, 10 ml / dakika bir oranda bir Krebs çözeltisi carbogenated ve 34 ° C'de bir kayıt odası sabiti Kreb sıcaklığı tutmak.
- Oral sonu lümen akışı ve aboral son çıkışına bağlanır sağlayan şırınga sürücüye bağlı olduğu, böylece organ banyosunda jejunal segmenti monte edin. biraz stsegmenti retch ama aşırı gerilim uygulamak için özen gösterin. hem sıkıca içi ve çıkış portlarına 4/0 ipek bitişik harfler kullanarak biter takın.
- Oral ucuna şırınga sürücü takın ve 10 ml / st bir oranda lümen Krebs solüsyonu (oksijenli ortam sıcaklığında) ile jejunum segmenti serpmek.
- böcek pimleri kullanarak, silikon elastomer alt tabaka karşı monte bağırsak segmenti dairenin mezenterin sabitleyin. mezenterik demetin görselleştirme optimize etmek için mezenterin uzat; demet veya jejunum üzerindeki yükü uygulamayın.
- Çıkış portunu kapatarak bir test rampa şişliği (bakınız) gerçekleştirin barsak segmentinin lümen içi basınç hiçbir intraluminal Krebs çözümü monte segmentte sızan olduğunu doğrulamak amacıyla 60 mmHg, ulaşana kadar. kesintisiz intraluminal basınç pürüzsüz bir artış gözlemliyoruz.
- segmentin küçük kasılmalar gözlemleyin (peristaltik wavlar) başlangıç gerilme fazında. Gerekirse, Krebs çözeltisi L-tipi kalsiyum kanalı blokaj maddesinin nifedipin 1 uM eklenerek peristaltik aktivitesini bloke.
NOT: nifedipin'e ilave olarak Krebs solüsyonu ile atropin 1 mcM ekleme, tamamen bağırsak segmenti felç olacak. Ancak afferent sinir kayıt üzerinde atropin kullanımı ve etkisi ile hiçbir kişisel deneyime sahip. - Bir stereomikroskop altında, hafifçe aşağı yağ dokusunda mezarları damarları ve afferent sinir zarar vermemeye özen iki küçük cımbız ile asılarak mezenterden yağ dokusu kalkmasına başlar.
- jejunum uzak bir mesafede başlatın ve mezenterik paket hem kan damarları açığa.
- adipoz dokuda kapsüllü ince, beyaz ipliği hem gemiler arasında afferent jejunal sinir gözlemleyin. Sadece hafifçe cımbız kullanarak uzak yağ dokusunun soyulması ile jejunum karşı daha proksimale teşrihmezenterik kaplar ve / veya taşıyıcı sinir hem ilk tespiti zordur.
- , Sinir adipoz doku yapışık kaldırarak birkaç milimetrelik bir mesafede serbest segmentin jejunal mezenterik sinir teşrih.
- Keskin doku makas kullanılarak sinir transect. Gerekirse, yavaşça küçük cımbız ile asılarak kalan yağ ve bağ dokusu yanı sıra epineuronal kılıfı soyulabilir.
- Bir mikromanipülatör kullanarak organ banyosuna piston ile bir şınngaya bağlanmış emme elektrodunun ucu, alt; Daha sonra, piston işleyerek, yavaşça elektrot ucu Krebs çözeltisi (Şekil 1) içine daldırılmış şekilde organ banyosu bazı Krebs çözeltisi aspire. Krebs çözüm emme elektrot içine tel elektrot kapsar emin olun.
NOT: Deneyin bize başlamadan önce tel elektrot içeren borosilikat cam emme kapiller hazırlayınBir pipet çektirmesi ing. - hemen yanında kesilen afferent sinir sarmalına emme elektrot ucu yerleştirin ve tüm uzunluğu boyunca kılcal içine nakledilmiş sinir teli çizin.
- Bazı yağ dokusunun doğru elektrot ucu Manevra ve sıkıca, piston ile böylece mekanik 'sızdırmazlık' organ banyosuna içeriğinden kılcal sinir aspire ederken cam boru içine bu aspire.
- (Aşağı bakınız) ateşleme ileticisinden bir rampa gerilme-bağlı artışı gerçekleştirerek, veri toplama sistemi kullanılarak afferent sinir aktivitesi, örneğin kayıt edin. Emme elektrodu içine sinir izolasyonundan sonra, gerçek deney yapmadan önce sabit durum kendiliğinden afferent sinir aktivitesi elde etmek için, 15 dakika için hazırlık stabilize eder.
- Rampa şişliği gerçekleştirmek için, grad yol açan, çıkış noktasını kapatarak bağırsak segmenti distend(60 mmHg kadar) barsak segmentinde basınç ual yükselişi. Sadece (15 dk arayla) arka arkaya üç rampa distensions tekrarlanabilir çoklu birim deşarj (Şekil 2) elde istenen deney protokolünde gerçekleştirin.
- Yerel Etik Komitesi tarafından deney öncesinde onaylandı ergen ya da erişkin kemirgen kemirgen ötenazi gerçekleştirin (örn., Kardiyak delme, servikal dislokasyon, vb ardından Terminal sedasyon).
- lomber Splanknik afferent hazırlanması (kolon afferent sinir)
NOT: Kolon afferent sinirlerin diseksiyonu daha ayrıntılı diseksiyon gerektirir. Eski 'jejunal' protokolü sapmalar aşağıda listelenmiştir:- karın boşluğunda buz Krebs solüsyonu dökün aşırı, insancıl bir yöntemle hayvan Euthanize yatar pozisyonda yerleştirin, bir orta hat laparotomi yapmak ve. NOT: Krebs kompozisyon: 118 mM NaCl, 4.75 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1.2 mM MgSO 4, 11 mM D-glikoz ve 2.5 mM CaCl2, 3 uM indometasin.
Not: Krebs çözeltisi değiştirilmiş bileşimin not edin; indometasin şekilde ilave edilirProstaglandin aferent sinir aktivitesinin değişiklikleri önlemek amacıyla dökülmesinden. - yağ dokusu, mesane ve iç genital atın ve yavaşça karın boşluğunda bir tarafa ince bağırsak kaydırır. karın bozulmamış mezenterik sinirler kolon distal kısmının genişletilmiş prelevation gerçekleştirin.
NOT: doku daha fazla hazırlanmasına yardımcı olmak için bu diseksiyon dahil edilebilir Önemli noktaları abdominal aorta ve vena kava, sol böbrek ve pelvik taban kas bulunur.
NOT: Bu bölge lomber splanknik sinirler içerdiğinden diseksiyonu sırasında, kolon ve abdominal aorta arasındaki bağlantı dokusu üzerinde çekiş uygulamak için özen gösterin. - odasına kayıt kaplı silikon elastomer içine doku segmenti aktarın. bir başlangıç noktası olarak, abdominal aort kaynaklı sol renal arter kullanın. Üstün mesenteri karşılaşmak, aboral yönde abdominal aorta izleyinÇölyak ve superior mezenterik ganglion ile birlikte c arter. Son olarak, ilgi sinir bulunur, burada kolon ve aort, distal kısmı arasında bağlantı dokusu geliyor.
- abdominal aort kaynaklanan inferior mezenterik arter belirleyin. Lomber splanknik afferent sinir inferior mezenterik arter dibinde tespit edilebilir; bu arterin (Şekil 3) paralel olarak çalışır.
- sinir kesisi sonrası, yavaşça çevredeki bağ dokusu kılıfı soyulabilir ve birkaç ince parçacıkları içine sinir alay. kolon güvenli bir mesafede tutmak için emin olun.
- Emme elektrot, 'mühür' daha önce açıklanan ve istenen deney protokolünde yapmak gibi yağ dokusu çevreleyen kılcal içine bu tek evrelerden birini çizin.
- Organ banyosu (örneğin, böbrek, karın kaplar, kas dokusu) bir mevcut olan herhangi bir gereksiz doku atınBu afferent sinyal rahatsız edebilir s.
Not: Nifedipin (1 uM), esas olarak yumuşak kas hücre kasılması afferent sinir uyarısı kendiliğinden bağırsak hareketi rahatsız durumunda Krebs çözeltisi ilave edilebilir.
Not: 3) lümen ilgi konusu bileşiği çözmek suretiyle 1) serosally geçici perfüzyon durma veya da 2) doğrudan bir organ banyosuna, kayıt odası perfuses Krebs halinde istenen bileşik çözülmesiyle: ilaçlar, üç farklı sahada uygulanabilir şırınga sürücüye Krebs çözeltisi içine. bir bileşiğin kümülatif dozları arka arkaya çok hızlı uygulandığında afferent sinir duyarsızlaştırma oluşabilir.
- karın boşluğunda buz Krebs solüsyonu dökün aşırı, insancıl bir yöntemle hayvan Euthanize yatar pozisyonda yerleştirin, bir orta hat laparotomi yapmak ve. NOT: Krebs kompozisyon: 118 mM NaCl, 4.75 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1.2 mM MgSO 4, 11 mM D-glikoz ve 2.5 mM CaCl2, 3 uM indometasin.
Şekil 1: Amaca Kayıt Odası ve Emme Elektrot şematik bakış Techni detaylı bakış. Emme elektrot ve yerinde kayıt odası ile cal kurulum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Jejunal afferent sinir etkinliğinin in vitro Kaydın Örnek Takip başlangıçta 2 rampa distensions kadar kadar 60 mm Hg yanıt olarak jejunum çoklu ünite afferent sinir aktivitesi (imp.sec 1) (üst panel) tipik kaydı. (alt panel) ve sinir sinyali (üçüncü paneli) farklı tek birimlerinin sonraki tanımlama (wavemark analizi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"Şekil 3" src = "/ files / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
Şekil 3:. Kolon A nöroanatomi) kolondan Duyusal bilgiler LCN inferior mezenterik arter (İMA) yakın çalışan, merkezi sinir sistemi doğru lomber kolon sinirlerin (LCN) üzerinden iletilir. Bu lomber kolon sinirden liflerin bir kısmı ders intermesenteric sinirin (IMN) boyunca lomber splanknik sinirler (SSN) oluşturmak için olacaktır. inferior mezenterik ganglion (IMG) abdominal aorta İMA kökeni yer almaktadır. Distale IMG kayıt araştırmacılar viscerofugal afferent sinir aktivitesini. B) Deneysel set-up şematik bir bakış okumak isteyen gerekir zorunludur. LCN afferent kayıt veri toplama sistemine bağlı bir emme elektrodu vasıtasıyla bir organın hem de gerçekleştirilir. akışının devam ederken Rampa şişme çıkış portu kapatılması üzerine yapılabilirKrebs çözeltisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Veri Toplama
- Bir headstage bağlı bir emme elektrot aracılığıyla sinir etkinliğini kaydedebilirsiniz. 20 - sinyal (5.000 Hz bant geçiren 500) yükseltmek (10k kazanç) ve süzün.
NOT: 50/60 Hz Gürültü Eliminator 50/60 Hz elektrik paraziti gürültü sinyalleri kaldırmak için deney düzeneği dahil edilmelidir. sinyal otomatik olarak sayısallaştırılmış ve analiz için 20 kHz örneklenmiş olduğunu.
3. Analiz 5,20
- Genel olarak sinir aktivitesinin çok üniteli kayıtları farklı şekil, amplitüd ve genişlik aksiyon potansiyelleri içeren farklı sinir tekabül eden tüm sinir genel uyarı sayısının / saniye olarak afferent sinir boşaltma rapor ya da daha fazla analiz yapmak için özel bir yazılım kullanmak birimlerHer bir götürücü elyaf (Şekil 2).
- Tek birimler arasındaki ayrımı sağlayan önceden tanımlanmış şablonlar bireysel wavemarks, maç. 1 uygulanmalıdır: Belirli bir dalga işareti, 2> bir sinyal-gürültü oranı bir başak tahsis önce.
NOT: En az 10 benzer sivri analiz yazılımı tarafından tespit edildiğinde wavemark analizi sırasında, yeni bir şablon oluşturmak. Hiçbir şablon 50 kramponları 1'den daha nadir şekiller için inşa edilmiştir. Bir başak noktalarının en az% 80 şablon başak aynıdır temel bileşenler analizi kullanılarak bir şablona eşleştirilir. Şablon eşleme operatöre bağlıdır ve her zaman bir kör bir şekilde aynı araştırmacı tarafından yapılmalıdır. - , Sabit zaman noktalarında distansiyon (0 ila 20 mmHg intraluminal basınç artışının 5 mmHg sırasında yanıtı (0 mmHg intraluminal basınç) başlangıçta spontan aktivite çıkarılarak 10 artışlarla aksiyon potansiyeli yanıtları hesaplamakmmHg) itibaren 20 mmHg dan. 10 saniyelik bir kutu boyutunu kullanarak bazal afferent deşarj ölçün.
- Rampa distansiyon (Şekil 4) sırasında deşarj profiline dayalı lifleri sınıflandırmak için tek ünite analizi kullanın. Buna ek olarak, tek ünite analizi birimlerin olmayan her türlü ilaç veya bileşiğe karşılık olarak, aynı değiştirilmiş ateşleme faaliyet gösterecektir olarak, birimlerin değişik türde kemosensitif profilini incelemek için kullanılabilir.
- Düşük eşik lifleri ( 'LT', alt şişme basınçlarında tipik artmış uygulamayın deşarj), yüksek eşik lifleri ( 'HT', en yüksek şişme basınçlarında artış deşarj uygulamayın), geniş dinamik aralık lifleri ( 'WDR' olarak lifleri sınıflandırır, göstermek tüm rampa distansiyon sırasında artan ateşleme) veya mekanik duyarsız afferent ( 'MIA' tipik distensions rampa yanıt vermeyen sinir lifleri) 5; 20.
- p 20 mmHg sinir ateşleme yanıtını Expressdüşük distansiyon basıncı ateş ölçüde yansıtmaktadır olarak şişkinlik (LT%) sırasında maksimum atış yanıtının okuma yapan manometre.
NOT: Bu yüzden, LT elyaf HT ise, bir LT%>% 55 ile karakterize edilir <% 15 değeri ile tanımlanır. WDR birimleri için değerler, 15 ve 55 (% 20) arasında değişmektedir. Bir MIA distensions etkilenmez spontan afferent ateşleme görüntüler.
Şekil 4:. Onların Mechanosensitive Profil dayanarak Farklı Afferent Fiber Birimleri şematik Temsil Birimleri distansiyon sırasında maksimum atış yanıtı ile karşılaştırıldığında 20 mmHg şişme basıncında ateşleme oranının yüzde (LT%) dayalı sınıflandırılır. Düşük eşik lifler (sol üst panel) ağırlıklı olarak 55% in üzerinde LT% sonuçlanan düşük şişme basınçlarında artmış bir sinir aktivitesini gösterir. Yüksek eşik birimleri (sağ üsttersine panel) sadece zararlı basınçta (% LT <15) ateşleme hızı bir artış gösterir. mekanik duyarsız lifler (sağ alt panel) gerilme baskıları artırarak yanıt vermeyen oysa geniş dinamik aralık lifleri (Sol alt panel), tüm distansiyon sırasında sinir aktivitesinde kademeli bir artış (15 ve 55 arasında değişen% LT) görüntüler. LT:% (afferent 20 mmHg / maksimum afferent ateş ateş), bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jejunal afferent sinir aktivitesi başlangıçta ölçüldü ve yanıt OF-1 fareler 9 sekiz haftalık erkek distansiyonu rampa. su ve düzenli chow dokunun sınırsız erişim Hayvanlar standardize koşullarda gruplar halinde (% 50, 12 saat ışık-karanlık döngüsü - - 22 ° C, nem 40 kafes başına 6 hayvan, 20) yerleştirildi. Farelerin jejunal kesimleri (spontan faaliyeti 11.47 ± 3.31 ith / sn ortalama) 0 mmHg intraluminal basınçta başlangıçta düzensiz spontan afferent sinir boşalması görüntülenir.
jejunal afferent sinir aktivitesi 60 mmHg kadar rampa distensions kadar performans üzerine yükselmiştir. Tipik haliyle, intraluminal basınç artışı, aşağıdaki afferent sinir aktivitesi artışı lümen içi basınç 20 mmHg ulaşıncaya kadar kadar ateş aktivitesinde bir ilk hızla artması oluşan iki fazlı bir cevap (Şekil 5) ile karakterize edilir, yüklenebileceğiniH esas olarak düşük eşikli liflerinin artan atış oranı atfedilebilir. Bu, daha sonra, ateşleme aktivitesi ikinci bir artış ağırlıklı olarak, yüksek eşik liflerin aktivasyonu temsil itibaren 40 mm Hg de görülebileceği üzere, daha sonra, bir plato fazı takip eder.
kendi dalga şekilleri dayanarak, tek birimlerinin her biri çok üniteli kaydında ayırt edilebilir ve yukarıda belirtilen dört kategoriden birine sınıflandırılır. 9 farelerde, biz WDR ve HT lifleri (Şekil 6) takip en yaygın olanları, varlık LT birimleri ile, 40 farklı birimler (4.44 ± 1.01 birimleri / jejunum afferent sinir) ayrımcılık. Distansiyon rampa yanıt olarak farklı birimler ateşlenme Şekil 7'de görülmektedir.
Şekil 5:
Şekil 6:. 9 Yabani tip fareler ile jejunal Afferent Sinir Tespit 40 Birimleri Tek Ünite Dağılımı HT: yüksek eşik lif, LT: düşük eşik lif, MIA: mekanik duyarsız lif, WDR: geniş dinamik aralık elyaf."_blank> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7:. Yabani tip farelerde alt birimlerin Çeşitli için basınç-tepki eğrileri, tek ünite afferent sinir akıntı (imp.sec -1) rampasında vahşi tip farelerde tespit edilebilir dört farklı birimlerden distensions. Düşük bir baraj lif (LT, sol üst resim) sadece ekran zararlı intraluminal basınçlar sırasında ateş artan yüksek eşik lifleri (HT, sol alt şekil) iken, distensions sırasında ateşleme aktivitesinde bir başlangıç hızlı artış ile karakterizedir. Geniş dinamik aralık lifler (WDR, sağ üst resim) lümen baskıları artırıyor cevap vermeyen bir bütün distansiyon sırasında ateşleme aktivitesinde istikrarlı artış, ve mekano duyarsız afferent lifler (MIA, sağ alt resim) gösterir. değerler temsilcisisem imp.sec -1 ortalama ± afferent deşarj gönderme:. Saniyede dürtüler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda protokol grubumuza ve diğerleri 3,4,7,8,12,20,21,31 tarafından kullanılan kemirgenlerde mezenterik afferent sinir aktivitesini incelemek için tekrarlanabilir laboratuar teknik anlatılmaktadır. protokolü içinde kritik adımlar doku hızla izolasyon, emme elektrot içine sinir telinin aspirasyon ve kılcal içine çevreleyen yağ dokusu aspire organ banyosuna gelen cam kapiller yeterli 'sızdırmazlık' yer alıyor. Cam kılcal açıklık kesin belirlenmesi gerekir: bir çok geniş diyafram yağ dokusu ile kılcal 'sızdırmazlık' engel olacak ise çok küçük bir açıklık yedekli sonuçlanan, elektrot içine sinir telinin aspirasyonu zorlaştıracaktır analizi (düşük sinyal-gürültü kayıtları) engel olacaktır arka plan gürültüsü. tek-birimli sınıflandırma için izin vermek için, splanknik afferentleri azaltmak için farklı şeritlerin bölünmüş olmalıdırkayıt birimlerinin sayısıdır. Her kayıt 5 adet - Tipik olarak, biz 4 en fazla amaçlayan öneririz. Araştırmacılar, bu nedenle ilgi lif dayalı diyafram ve uygulanan laboratuar hayvanı ayarlamak gerek.
Bir başka kritik nokta deney düzeneği yeterli topraklama kapsar. Emme elektrodu ve kayıt odası yeterince topraklı ve kayıt cihazlarına da dahil olmak üzere tüm diğer ekipmanların ise, şırınga sürücü ve saire kafes dışına monte edilmelidir nöronal aktivitenin analizi engelleyen elektrik alanları müdahale en aza indirmek için bir Faraday kafesi ile kaplanmış olmalıdır .
jejunum veya kolon yakın afferent sinir aktivitesini kaydederek, bir afferent sinyal iletim zincirinin ilk bölümünü izole etmek ve kolayca merkezi NERV müdahalesi olmadan tek afferent düzeyinde meydana gelen katkı ve değişiklikler inceleyebilirizlı sistemi. Bu tekniğin sınırlamaları biri in vitro kurulum sadece karmaşık sinir sinyal kademeli olarak bir röle istasyonunu içeriyor olarak in vitro gözlemler her zaman, in vivo ortamda zahmetsiz çıkarım olamaz olmasıdır. Bu şekilde, daha geniş bir görüntü arka kök ganglia, merkezi sinir sistemi (örneğin, fonksiyonel beyin görüntüleme) ve inen (önleyici) çıkan yollar gibi diğer istasyonlar, içeren yapılmalıdır.
Bir artık mide numunesini içerir laboratuar hayvanları sağlığını izlemek için olduğu gibi, bu yöntemin diğer bir avantajı, oldukça basit teknik prosedür oluşturmaktadır. Öte yandan, nöronal aktivitenin in vitro ölçümü afferent sinir deşarj bir sistemik olarak uygulanan bir ilacın etkisi ortaya çıkması için uygun değildir, ancak araştırmacılar teorik sistemik ilaç o tatbik edilmesiyle bu engeli aşmakafferent sinir aktivitesi ex vivo, in vitro kayıt ve ardından hayvana F ilgi çekmektedir. Ancak, bir kayıt odasına herhangi bir ilaç mevcut diseksiyonu ve sonraki kayıtları sırasında banyo perfüzyon nedeniyle seyreltilmiş olacağı gerçeğine dikkatli olmalıdır. Son olarak, in vitro genetiği hayvanları kullanarak splanknik sinir kayıtları gerçekleştiren araştırmacılar tam afferent liflerin ifade farklı kanalların ve reseptörlerinin rolünü aydınlatmak için izin verebilir.
Araştırmacılar ayrıca mezenterik afferent ve pelvik afferentlerdeki belirlenmesi ve izolasyonu açıkça temel anatomi ve teknik eğitim bilgi gerektirir akılda tutulması gereken bu tekniği uygulamak için çalışırken, ve araştırmacılar nöronal elektrofizyoloji temel ilkeleri ile tanışmış gerektiğini.
In vitro ayar ayrıca araştırmacılar kolayca mümkün farmakolojik tar belirlemenizi sağlaralır ve çeşitli hastalık süreçlerinde nöronal aktivite ve değiştirilmiş duyu sinyallerinin fizyolojik rolü hakkında bilgiler sağlar.
Jejunal aferent ölçümleri durumunda, tek bir hayvanın çeşitli doku parçaları, aynı zamanda bir in vivo kurulumu kullanarak oldukça zor bir özelliği incelenebilir. Araştırmacılar, ancak dikkatli bölgesel farklılıklar olabilir önyargı sonuçları olarak, farklı segmentlerdeki elde edilen sonuçları yorumlama gerekir. Bu nedenle sürekli aynı sitede (distale Treitz ligaman veya Duodenojejunal fleksuradan örneğin, ilk segment) afferent sinir aktivitesini ölçmek için tavsiye ederim.
Bu tekniğin tipik mevcut ve gelecekteki uygulamalar viseral aşırı duyarlılık ve ağrı ile karakterize patolojiler sırasında mezenterik afferentleri duyarlılığa değiştirebilir farmakolojik bileşiklerin tarama oluşmaktadır. Daha önce belirtildiği gibi, daha önce hedef sözse bileşikler beyne enterik sinir sistemi içsel kadar karmaşık sinir sistemi boyunca bir yerde karşılaşılabilir; karakterize ve aynı zamanda içsel enterik sinir ve dorsal kök gangliyon kalsiyum görüntüleme kapsar geniş resme katkıda afferent sinir aktivitesini modüle gibi, bir in vivo visseral aşırı duyarlılık göstergesi ve fonksiyonel beyin görüntüleme gibi viseromotor yanıt ölçümü, ve diğerleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
