Summary
Aqui usamos um nanoporo sintonizável poliuretano integrados em uma técnica de detecção de impulsos resistiva para caracterizar nanopartículas química da superfície por meio da medição das velocidades das partículas de translocação, que pode ser usado para determinar o potencial Zeta de nanopartículas individuais.
Abstract
tecnologias Nanopore, conhecidos coletivamente como resistivas sensores de pulso (RPS), estão sendo usados para detectar, quantificar e caracterizar proteínas, moléculas e nanopartículas. detecção de impulsos resistiva ajustável (TRPS) é uma adaptação relativamente recente de RPS que incorpora uma poro sintonizável que pode ser alterada em tempo real. Aqui, nós utilizamos TRPS para monitorar os tempos de translocação de nanopartículas de ADN-modificado, enquanto atravessam a membrana de poro sintonizável como uma função da concentração de DNA e da estrutura (ou seja, de cadeia simples ao ADN de cadeia dupla).
TRPS baseia-se em dois eléctrodos de Ag / AgCl, separados por uma membrana de poros elastomérico que estabelece uma corrente iónica estável sobre um campo eléctrico aplicado. Ao contrário de várias tecnologias de caracterização de partículas ópticos à base, TRPS pode caracterizar partículas individuais entre uma amostra da população, permitindo amostras multimodais a ser analisado com facilidade. Aqui, demonstramos medidas de potencial zetavia velocidades de partículas de translocação de padrões conhecidos e aplicá-las a experimentar momentos de translocação de analitos, resultando assim na medição do potencial zeta dos analitos.
Bem como a aquisição de valores de potencial zeta médios, as amostras são todos medidos usando uma perspectiva de partícula-a-partícula exibindo mais informações sobre uma dada amostra através de distribuições população de amostra, por exemplo. De tal, este método demonstra potencial dentro de aplicações de detecção para ambos os campos médicos e ambientais.
Introduction
nanopartículas funcionalizadas estão se tornando cada vez mais popular como biossensores em ambos os campos médicos e ambientais. A capacidade de alterar a química de superfície de uma nanopartícula, com o DNA, por exemplo, está a revelar útil para sistemas de distribuição de drogas-alvo 1, o controlo interações DNA-proteína 2-4. Uma propriedade cada vez mais comum de nanopartículas sendo utilizado em bioensaios e na entrega de agentes terapêuticos é superparamagnetismo 5. partículas superparamagnéticas (SPPS) são extremamente úteis na identificação e remoção de analitos específicos a partir de misturas complexas e podem fazê-lo com o simples uso de um único íman. Uma vez removido, as partículas ligadas a analitos podem ser caracterizados e analisados apto para o efeito.
Os métodos anteriores utilizados para a detecção e caracterização de nanopartículas incluem técnicas ópticas, tais como dispersão de luz dinâmica (DLS), também conhecido como espectroscopia de correlação de fotões. Embora um oitécnica de transferência de GH, DLS está limitado a ser uma técnica de base média e ao analisar amostras multimodais, sem a adição de software especializado, as partículas maiores irão produzir um sinal muito mais dominante, deixando algumas das partículas menores completamente despercebido 6,7. Partícula-a-partícula técnicas de caracterização são, portanto, muito mais favorável para analisar sistemas de nanopartículas funcionalizadas de nanopartículas e.
tecnologias baseadas RPS se baseiam em torno da aplicação de um campo eléctrico a uma amostra e de controlo do mecanismo de transporte das partículas através de um nanoporo sintético ou biológico. Uma técnica relativamente recente detecção de nanopartículas e caracterização com base em RPS é resistiva ajustável sensor de pulso (TRPS) 8-16. TRPS é um sistema de dois eléctrodos separados por uma membrana de poros elastomérico, sintonizável. Um método de poro sintonizável permite a analitos de uma gama de 17 forma e tamanho para ser medido através do seu transmecanismos de portas através do poro. Poros sintonizáveis foram anteriormente utilizados para a detecção de partículas pequenas (70-95 nm de diâmetro) produzir resultados comparáveis a outras técnicas, tais como a espectroscopia electrónica de transmissão (MET) 10. Quando um campo eléctrico é aplicado, uma corrente iónica é observada e medida que as partículas / moléculas de passar através do poro, eles bloqueiam temporariamente os poros, causando uma redução da corrente que pode ser definido como um "evento de bloqueio '. Cada evento de bloqueio é representativa de uma única partícula, para que cada partícula dentro de uma amostra pode ser caracterizado com base na magnitude individualmente bloqueio, Δ 
E largura a meia-máxima, FWHM, bem como outras propriedades de bloqueio. Analisando as partículas individuais que passam através de um nanoporo é vantajosa para amostras multimodais como TRPS pode com sucesso e eficazmente distinguir uma gama de tamanhos de partículas amonGST de uma única amostra. Sensor de pulso resistiva ajustável completa tamanho 10, Potencial Zeta 12,18 e concentração 15 medições simultaneamente em uma única corrida e, portanto, ainda pode diferenciar amostras de semelhante, se não o mesmo tamanho de sua carga de superfície 19; uma vantagem sobre as técnicas de dimensionamento alternativos.
O potencial zeta é definido como o potencial electrostático no plano de corte 20, e é calculada a partir de velocidades das partículas, enquanto atravessam um poro 19. as medições do potencial zeta das partículas individuais, assim, dá conhecimento sobre os mecanismos de translocação e o comportamento dos sistemas de nanopartículas em solução, a informação valiosa para futuro ensaio de modelos de partículas para uma gama de aplicações. análise de partículas-a-partícula de tal natureza também permite a propagação e distribuição de valores de potencial zeta entre uma amostra da população a ser explorado, permitindo a mais informaçãocinética de reacção de N (de cadeia simples ao ADN de cadeia dupla, por exemplo) e estabilidades das partículas na solução a ser atingido.
Aqui, descrevemos uma técnica que detecta e caracteriza ambas as superfícies SPP não modificados e modificados-DNA. O protocolo aqui descrito é aplicável a uma variedade de nanopartículas inorgânicas e biológicos, mas que demonstram o procedimento usando superfícies modificadas-ADN devido à sua ampla gama de aplicações. A técnica permite que o utilizador para distinguir entre alvos de ADN de cadeia simples e de cadeia dupla numa superfície de nanopartículas, baseado em velocidades das partículas de translocação através de um sistema de poros e, consequentemente, os seus potenciais zeta.
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Protocol
1. Fazer a salina de tampão fosfato com Tween-20 (PBST) Tampão
- Dissolve-se um comprimido PBS (tampão de fosfato 0,01 M, 0,0027 M cloreto de potássio, 0,137 M de cloreto de sódio, pH 7,4) em 200 ml de água desionizada (18,2 mohms cm).
- Adiciona-se 100 ul (0,05 (v / v)%) de Tween-20 à solução 200 ml de tampão, como um tensioactivo.
2. Preparar o grupo carboxilo de poliestireno partículas Standards
- Agitar as partículas de calibragem para 30 seg antes de sonicação durante 2 minutos a 80 watts para criar monodispersity das partículas.
- Dilui-se a partículas de calibração 1 em 100 a uma concentração de 1x10 10 partículas / ml em tampão PBST e vortex durante 30 seg.
3. preparação de partículas revestidas com estreptavidina
- Agitar as partículas durante 30 segundos antes de sonicação durante 2 minutos a 80 watts a assegurar monodispersity.
- Diluir as partículas revestidas com estreptavidina 1 em 100 em tampão PBST para achieve a consequente concentração de 1x10 9 partículas / ml e vortex por 30 segundos.
Nota: Um volume de amostra típico é de 200 uL. Por exemplo, se as concentrações de ADN a investigar cinco preparar 1 ml de partículas revestidas com estreptavidina diluídas.
4. Preparação de oligonucleótidos
- Reconstituir oligonucleótidos com água desionizada para uma concentração resultante de 100 uM.
5. A adição de sonda de ADN de captura (CP) com as partículas revestidas com estreptavidina
- Antes de ligação ao ADN, de vórtice as partículas revestidas com estreptavidina (200 ul de volume da amostra) durante 30 seg, seguido de 2 minutos de sonicação a 80 watts.
- Com base na capacidade de ligação fornecidas pelo fornecedor (4352 pmol / mg), adicionar a concentração apropriada do DNA para as partículas resultantes para as concentrações de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, e 210 nM de ADN.
- Vortex as amostras para 10 segundos e coloque em uma roda giratória à temperatura ambientedurante 30 min para permitir o ADN se liguem às superfícies das partículas através de uma interacção estreptavidina-biotina.
- Uma vez que o ADN de captura foi adicionado e incubou-se com as partículas revestidas com estreptavidina, remover o excesso de DNA na solução através de separação magnética, colocando as amostras sobre uma cremalheira magnética durante 30 min.
- Remover o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o conjunto recém-formado de partículas mais próximas do ímã, e substituir com o mesmo volume de novos tampão PBST.
6. hibridação DNA complementar às CP-partículas
- Adicionar a quantidade necessária de ADN alvo (em excesso a 500 nm) para assegurar o máximo de ligação foi alcançada alvo possível.
- Agitar as amostras para 10 seg e o lugar numa roda rotativa à temperatura ambiente durante 30 min.
- Uma vez que a hibridização estar completa, remover o excesso de ADN alvo através de separação magnética, colocando as amostras sobre uma cremalheira magnética durante 30 min.
- Remover o sobrenadante, Tomando cuidado para não perturbar o conjunto recém-formado de partículas mais próximas do ímã, e substituir com o mesmo volume de novos tampão PBST.
- Repita os passos 6.1 a 6.4 para amostras em duplicado e colocar essas amostras numa roda rotativa à temperatura ambiente durante 16 horas para investigar vezes de hibridação de ADN.
Setup 7. TRPS
- Ligue o instrumento em um sistema de computador com software no lugar.
- Calibrar o trecho inicial usando uma pinça.
- Medir a distância entre o exterior das duas maxilas paralelas.
- Entrada para o software digitando o estiramento no campo 'stretch' no separador 'Definições Instrumento "e clicando em" Calibrar trecho "sob a aba.
- Lateralmente encaixar uma membrana nanopore de poliuretano de dimensionamento adequado para a análise sobre as mandíbulas com o número nanopore ID voltada para cima. Em seguida, esticar as mandíbulas para o estiramento necessário para análise, usando ocomando de ajuste de estiramento no lado do instrumento. Esticar as mandíbulas entre 43 e 48 mm.
Nota: O valor exato do trecho é determinado ao lado de tensão aplicada de modo que os bloqueios de partículas de calibração são pelo menos 0,3 nA em tamanho. O trecho já está inserido no software na etapa 7.2 e irá ajustar automaticamente à medida que as mandíbulas são esticados. - Coloque 80 mL de tampão PBST na célula de fluido inferior, abaixo da nanopore, assegurando que não existem bolhas de presentes que podem afetar a medição. Se houver bolhas de visto, remover e substituir o tampão.
- Clique na célula de fluido superior no lugar e colocar 40 ul de tampão para ele, novamente assegurando que não existem bolhas existentes. Se as bolhas estiverem presentes na célula de fluido superior, removê-los através da substituição do líquido.
- Quando uma corrente de linha de base reprodutível foi alcançado a partir substituindo a célula superior fluido com tampão, adicionar 40 ul da amostra de fluido para a célula superior e medida clicando »rart 'no' guia de Aquisição de Dados "na tela do software.
Nota: A aquisição de dados é concluída com uma frequência de 50 kHz, com limite de uma magnitude bloqueio inferior de 0,05 nA, embora esta possa ser alterada utilizando o software através da aba 'Data Analyse' (em "Configurações de análise" e "resistiva Bloqueios ') . - Coloque uma gaiola de Faraday sobre a parte superior do sistema de células de fluido para reduzir o ruído de fundo eléctrico sobre as medições.
- Usar um módulo de pressão variável (VPM) para aplicar uma pressão de vácuo ou com as amostras.
- Para aplicar uma pressão externa conectar o bico para a célula de fluido superior, em seguida, girar o braço de pressão e clique no lugar (dependendo se uma pressão positiva (PRE) ou um vácuo (VAC) serão aplicadas).
- Aplique pressão em um 'cm' ou escala de 'mm' utilizando o botão de nível de pressão situado no topo da VPM. Pressione o botão para baixo para aplicar pressão sobre a escala 'cm' e puxe-o para cima to aplicar pressão sobre a escala de "mm".
8. As amostras preparando para Análise TRPS
- amostras vortex durante 30 seg e sonicado durante 2 minutos a 80 watts antes da análise TRPS.
9. A calibragem do Nanopore para Análise Zeta
- Depois de colocar 40 partículas de calibração ul (1x10 10 partículas / ml) para dentro da célula de fluido superior, completar uma medição TRPS (configuração como no ponto 7) a 3 tensões aplicadas. Alterar a tensão clicando no '+' e '-' botões na escala de tensão na guia "Configurações Instrument" no software.
- Verifique se as 3 tensões retornar correntes de cerca de 140, 110 de fundo, e 80 nA. Certifique-se de que, na média tensão das partículas de calibração produzir uma média magnitude bloqueio de pelo menos 0,3 nA.
- Aplicar uma pressão de modo que a largura total média metade do valor máximo (FWHM) durações das partículas de calibração são pelo menos0,15 mseg. Fazer isso manualmente usando o braço de pressão ligado ao módulo de pressão variável. Select pressão (PRE) ou a vácuo (VAC), rodando o braço até que ele se encaixe na posição desejada e aplicar em conformidade seguinte configurar instruções no passo 7.8.2. Uma vez que estas condições foram alcançados, iniciar a execução clicando em 'start' no software no separador "Aquisição de Dados".
- Concluir a execução pressionando 'stop' no separador "Aquisição de Dados" quando pelo menos 500 partículas foram medidos (ver "contagem de partículas" na parte inferior da tela do software durante a medição) ea corrida excedeu 30 segundos (ver " Run Time ', também em direção à parte inferior da tela).
- Calibrar o sistema através do preenchimento de uma corrida de calibração conforme descrito cada vez que um novo nanopore é introduzido ou para cada novo dia de análise ao concluir a etapa 9,1-9,4.
10. Execução de uma Amostra
- Executar os exemplos ao mais alto ousegunda tensão mais elevada, como as amostras de calibração no sentido de assegurar um semelhante (± 10 nA), se não for o mesmo, a corrente de linha de base.
- Uma vez que a corrente de linha de base apropriada é alcançada, substituir o electrólito na célula superior fluido com 40 ul de amostra. Quando uma amostra é introduzida, bloqueios será visto no traçado de sinal. Comece a amostra executar clicando em "Iniciar" no separador "Aquisição de Dados" e gravar um mínimo de 500 partículas (confira 'contagem de partículas' situado sob o sinal de rastreamento) e garantir o tempo de execução é um mínimo de 30 segundos (ver 'Run Time 'também situado abaixo do sinal de rastreamento).
- Para completar a medição, clique em 'stop' no 'guia de Aquisição de Dados "e salve o arquivo de dados.
- Para salvar o arquivo, a entrada de informações de arquivos no seguinte formato; 'Investigação' é a pasta do arquivo será salvo em "Nanopore ID" é o número de série do poro sendo usado, 'Part #' ié o tipo de poros (ou seja, NP150 / NP200), "ID Amostra" é o nome da amostra, 'calibração ou amostras' detalhes se é uma medida de calibração ou amostra, «diluição» é utilizado se a amostra foi diluída ( digite 100 se a amostra foi diluída 100 vezes), "pressão" é a pressão aplicada à amostra (em cm - ver secção 7.8), 'Electrólito ID "é o nome do tampão da amostra é composta em, e' Notes "são quaisquer notas pessoais sobre a amostra ou correr.
- Entre cada amostra de execução, o sistema de lavagem através da colocação de 40 ul de tampão PBST para dentro da célula de fluido superior várias vezes e aplicando diversas pressões (normalmente a -10, -5 cm (vácuo), e 5 e 10 cm (pressão positiva)) até sem mais eventos de bloqueio estão presentes, assegurando que não existem partículas residuais remanescentes no sistema e, portanto, nenhuma contaminação cruzada entre as amostras. amostras em triplicado com esta etapa de lavagem concluída entre cada amostra repeat executar, bem assiml como entre diferentes amostras.
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Representative Results
Figura 1. Representação esquemática dos processos de purificação magnética e uma medição de TRPS. A) Exemplo de purificação magnética da amostra de partida com uma amostra contendo excesso, o ADN sonda de captura não ligado. B) PG exemplo de medição i) partículas que passa através do nanoporos e ii) evento bloqueio produzido a partir de partículas oclusão temporária iões na poro causando uma diminuição temporária na actual; Informações a partir do qual é usado para calcular velocidades de partículas de translocação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A remoção de qualquer excesso de ADN que não se tenha ligado à superfície de partículas a partir das amostras é importante antes da análise TRPS, para não denunciar qualquerresultados 'falso-positivos ". A capacidade de utilizar um magneto para extrair e lavar a SPPS é um enorme benefício para TRPS (Figura 1A). A Figura 1B descreve um exemplo de base de uma medição de TRPS e um exemplo 'evento bloqueio' conseguido como uma partícula atravessa os poros. Em primeiro lugar, nós demonstramos que TRPS é uma técnica de alto rendimento que podem distinguir entre amostras de um tamanho semelhante, mas de uma carga consideravelmente diferente. A sua capacidade para completar ambas as análises tamanho e carga simultaneamente numa única medição pode ser visto na Figura 2. A Figura 2 é um exemplo de uma) de tamanho e b) análise de potencial Zeta de estreptavidina partículas revestidas, sem modificações (como a luz do conjunto de dados rosa) e partículas revestidas com estreptavidina saturadas com o DNA de cadeia simples na superfície (azul conjunto de dados). Embora ambas as amostras eram de um tamanho semelhante, o potencial zeta foi significativamente diferente e muito maior quando o DNA foi functionalized na superfície da partícula.
Figura 2. Tamanho e Zeta análise de potencial de nanopartículas revestidas modificado com DNA e estreptavidina não modificado. A luz barras rosas representam partículas revestidas de estreptavidina não modificadas e as barras azuis representam partículas modificados-DNA. A) Frequência (%) vs diâmetro das partículas (nm). B) Freqüência (%) vs potencial zeta (mV). Figura adaptada de dados suplementares em Blundell et al. 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não somente pode a técnica distinguir entre partículas não modificados e modificados com DNA, TRPS também pode diferenciar entre amostras com diferentes concentrações de DNA hibridaram com a partigo superfície. A Figura 3 mostra o tamanho ea zeta de dados potenciais exibidos para as amostras com o menor (10 milhas náuticas, a luz do conjunto de dados verde) e mais alto (210 nm, azul conjunto de dados) concentrações de DNA hibridaram com as partículas revestidas com estreptavidina. Um valor maior potencial zeta é registada para partículas hibridadas com uma concentração mais elevada de ADN.
Figura 3. Tamanho e dados simultâneos em potencial zeta capturadas a partir de uma única medição TRPS. As barras azuis / pontos de dados são representativos de partículas revestidas com estreptavidina hibridizaram com 210 DNA nM CP ea luz barras verdes / pontos de dados representam as partículas revestidas com estreptavidina hibridizaram com DNA CP 10 nM. Figura adaptada de Blundell et al. 19. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.
É interessante notar que cada ponto de dados no gráfico de dispersão representa uma única partícula entre uma amostra da população, permitindo a análise de partículas-a-partícula em profundidade com cada amostra. Figura 4 suporta a eficácia da técnica para determinar pequenas alterações na estrutura do DNA ( alvos de cadeia simples e de cadeia dupla do ADN), bem como a identificação de diferenças nas amostras com ADN-alvo do mesmo tamanho, mas ligada a uma área diferente da sonda de captura demonstrando níveis elevados de sensibilidade (ou seja, ligação de meio e fim de ligação mostrado na Figura 4). As partículas mostrados na Figura 4 são aqueles com as seguintes modificações de superfície, da esquerda para a direita; sonda de captura (CP), apenas DNA, CP e um alvo DNA totalmente complementar, CP e um alvo de ADN de ligação do meio, CP e um alvo de ADN de ligação final, CP e um alvo DNA saliente.
. Figura 4. mudança relativa no potencial zeta medido para partículas modificadas com ADN com uma variedade de alvos de ADN alteração no potencial zeta, mV, a partir de i) CP funcionalizado de partículas para uma gama de alvos de ADN; ii) totalmente complementar, iii) ligação Médio, iv) End, alvo v) Pendendo vinculativo. As barras de erro representam o desvio padrão, onde n = 3. Figura adaptada de Blundell et al. 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O cálculo do potencial zeta usado um método baseado calibração relacionados ao trabalho por Arjmandi et al. 21. A duração da translocação de partículas, enquanto atravessam um nanoporo é medida como uma função da tensão aplicada, utilizando um campo médio de partícula e velocidades eléctricos sobre a totalidade de uma poro cónica regular. A mobilidade electroforética é o derivado de 1 / T (em que T é a duração do bloqueio) em relação à tensão, multiplicado pelo quadrado do comprimento da zona de detecção, l. velocidades médias em múltiplos pontos de referência através da zona sensora são medidas para permitir o mínimo de erros no cálculo potencial zeta usando este método.
A calibração do poro é baseado na linearidade de 1 / T vs voltagem, V, em cada ponto de referência na zona de detecção. As velocidades das partículas eletrocinéticos de partículas de calibração e de amostra,upload / 54577 / 54577eq2.jpg "/> e 
respectivamente, estão relacionados com os seus potenciais zeta, 
e 
, Como mostrado na Equação 1, assumindo uma relação linear entre os dois, tal como consta na aproximação Smoluchowski 12,20. Os valores de potencial zeta líquida, tanto para a calibração e a amostra são as diferenças de potencial zeta das partículas e o potencial zeta da membrana, 
. O potencial zeta da poro de poliuretano foi medido utilizando técnicas de potencial de corrente 12,18 como -11 mV em PBS durante este estudo.
(1)
O potencial zeta de cada partícula individual, i, ![equação 8]("/files/ftp_upload/54577/54577eq8.jpg")
é a posição da partícula no interior da poro após o tempo, t = x, e 
é a velocidade da partícula de partícula única amostra i em posições relativas l x; 
, 
, P e V estão velocidade electrocinético por unidade de tensão, a velocidade convectivo por unidade de pressão, a pressão aplicada e a tensão para o exemplo é executado, respectivamente, uma derivação completa desta equação pode ser encontrada na obra por Blundell et ai. 19.
Quando a ligação do DNA sonda de captura para as nanopartículas revestidas com estreptavidina, é fundamental que o pesquisador remove o excesso não ligado DNA, sonda de captura deixado em solução. Isso é feito facilmente usando o SPPs e um ímã simples que permite a substituição rápida e fácil do sobrenadante com o novo tampão PBST. Se a captura de DNA em excesso é deixado em solução e adicionado ADN alvo, o ADN alvo podem ligar-se ao ADN de captura livre em solução, em vez do que sobre a superfície do spp. Uma variação na velocidade das partículas e potencial zeta só será observado se o ADN alvo se liga à sonda de captura, presente na superfície da partícula.
Análise e comparação de um grande número de amostras através de muitos dias, utilizando TRPS pode exigir a utilização de mais de uma membrana de poro. Alguns poros pode ter algumas pequenas diferenças no seu tamanho, devido ao processo de fabricação e, nestes casos, o usuário deve assegurar a atual linha de base continua a ser idêntica em todos os runs. Se a mesma corrente de base é observado, os resultados obtidos são comparáveis entre os poros. Uma vez que a linha de base é o mesmo que as execuções anteriores, é imperativo que o utilizador mantém o estiramento inalterada entre calibração e de amostra é executado para permitir a determinação exacta de velocidades das partículas de translocação, enquanto atravessam o poro.
A tecnologia de TRPS tem um conjunto relativamente simples para cima, que pode ser desmontado facilmente e rapidamente durante uma experiência. Se a resolução de problemas, isso pode tornar o processo muito mais fácil. Por exemplo, é importante para não permitir que quaisquer bolhas na célula de fluido inferior ou célula de fluido superior ao realizar análise. Isto irá levar a uma corrente de referência instável. Se as bolhas estiverem presentes na célula de fluido superior, a amostra pode ser removido e substituído. Se as bolhas aparecem na célula de fluido mais baixo, o tampão deve ser removido e substituído com tampão fresco. Se as bolhas são um problema persistente, então não pode ser demasiado surfactantena solução de modo que este pode ter de ser reduzida de 16 (só usamos 0,05% de Tween-20). Algumas amostras podem bloquear os poros se o seu tamanho excede o tamanho de poro ou, se a concentração de amostra é demasiado elevada. Para rectificar esta situação, o tamanho de poro pode ser aumentada, aumentando o estiramento ou a amostra pode ser diluída a uma concentração de partícula inferior 16. Para a análise de uma única partícula, a amostra pode também bloquear os poros se houver uma grande quantidade de agregados grandes presente, é importante a vórtice e sonicar a amostra antes de ser executado através de TRPS.
Entre outros métodos, TRPS tem várias vantagens, incluindo a capacidade de realizar medições tamanho e carga de partículas individuais simultaneamente; permitindo multimodais amostras a serem analisadas de forma eficaz utilizando este método. Uma vantagem é a relação sinal / bloqueios produzidos podem ser optimizados em minutos para uma determinada amostra, alterando simplesmente o estiramento e tensão para obter uma grandeza bloqueio, Δ </ Em> , Significativamente maior do que o ruído de fundo (bloqueios de escala são nA em comparação com o ruído de fundo <10 Pa). Ser capaz de alterar o alongamento da poro torna o método mais versátil em relação às técnicas de poros de estado sólido como o tamanho dos poros pode ser ajustada com respeito ao tamanho da substância a analisar em questão; particularmente úteis na investigação de efeitos, tais como a agregação e a ligação que pode resultar em tamanhos que excedam o analito de estado sólido intervalo de tamanho de poro inicial de ADN-proteína. Um outro aspecto vantajoso da TRPS é o nível de sensibilidade da técnica. A capacidade para detectar diferenças subtis na ligação de ADN (que foi adicionada a mesma quantidade de ADN de (a mesma quantidade de carga adicionada) e as amostras são do mesmo tamanho) com base na posição de ADN alvo de ligação é bastante profundo nesta área de análise e será de grande utilidade para futuras plataformas de design de nanopartículas-ensaio. Cada sutil diferemcia pode ser detectado e isolado utilizando uma natureza de partícula-a-partícula de tecnologia TRPS. Esta análise excede a de técnicas de ensemble, tais como dispersão de luz dinâmica ou espectroscopia de correlação de fotões que apenas calibrar uma média da população amostra analisada e não é possível diferenciar nos casos de amostras multimodais 6,7.
Pequenas nanoporos de estado sólido (100-200 nm), também têm sido utilizados para controlar a dinâmica das partículas e descobriram que a mobilidade das partículas pode ser afectada como o diâmetro da partícula começa a aproximar-se do nanoporo 22,23. Nanoporos muito maiores do que as partículas que estão sendo analisados (como utilizado no presente estudo) tem um menor efeito sobre a mobilidade das partículas e, assim, a dinâmica de translocação dentro do poro. Os poros usados neste estudo são no entanto limitadas às suas gamas de tamanho de analito, um NP150 por exemplo, tem uma gama de tamanhos de 60-480 nm, por isso, se uma amostra multimodal consistia de partículas dentro de e superior a estelimite, que não podem ser analisados no mesmo poro como a poro pode então tornar-se bloqueado. É também importante notar que a medição de uma amostra bimodal contendo 60 e 480 partículas nm (aqueles para os limites inferiores e superiores absolutos do poro), por exemplo, irá requerer diferentes condições de estiramento e tensão, embora ambos estão dentro da faixa de análise de tamanho do poro. Isto é porque o estiramento necessário para que as partículas maiores irão resultar em que as partículas mais pequenas têm uma pequena magnitude particularmente bloqueio (com base na resistência reduzida) que poderiam ser consideradas como ruído de fundo e, portanto, não necessariamente medidos durante um exemplo de execução.
Bubbles pode ser um problema com as medições de amostras como bolhas na célula de fluido inferior ou superior irá criar uma corrente de linha de base instável, aos quais exemplo é executado não pode ser concluída. Eletrólitos de natureza efervescente (alguns meios biológicos altamente concentradas, por exemplo) podem ser difíceis de executar e, portanto, amostras requiring suspensão nestes meios específicos pode revelar-se problemática. A maioria das amostras no entanto, pode ser muito diluída ou suspensa em tampões alternativos antes da análise TRPS.
O método é adaptável e pode ser utilizado para analisar uma variedade de analitos com base em nanopartículas, incluindo a análise de proteínas, DNA, moléculas pequenas, ensaios de agregação e partículas 17,24 biologicamente relevantes. A versatilidade do TRPS na caracterização de uma vasta gama de analitos mostra as técnicas possíveis em uma variedade de áreas como a entrega da droga 1,25, Biossensoriais 26-28 e testes ambientais.
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Disclosures
ELCJB é suportado por Izon Ciência Ltd.
Acknowledgments
Os autores agradecem Izon Ciência Ltd por seu apoio. O trabalho foi apoiado pela Comissão Europeia para a Investigação (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
| Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
| Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
| Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
| Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
| Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
| Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
| Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
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