Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تقرير زيتا المحتملة عبر جسيمات متناهية الصغر إزفاء السرعات من خلال الانضباطي ثقب النانو: استخدام الجسيمات المعدلة الحمض النووي كمثال

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

نحن هنا استخدام ثقب النانو البولي الانضباطي دمجها في تقنية الاستشعار عن نبض مقاوم للتميز الكيمياء السطحية النانوية عن طريق قياس سرعات الجسيمات النبات، والتي يمكن استخدامها لتحديد إمكانات زيتا من الجسيمات النانوية الفردية.

Abstract

تقنيات ثقب النانو، والمعروفة ب مجسات نبض مقاوم (RPS)، وتستخدم لكشف وتحديد وتوصيف البروتينات والجزيئات والجسيمات النانوية. الاستشعار عن الانضباطي مقاوم النبض (TRPS) هو التكيف حديث نسبيا إلى RPS أن يشتمل على المسام الانضباطي التي يمكن تغييرها في الوقت الحقيقي. هنا، ونحن نستخدم TRPS لمراقبة مرات النبات النانوية المعدلة الحمض النووي لأنها تعبر الغشاء مسام الانضباطي بوصفها وظيفة من تركيز الحمض النووي والهيكل (أي، واحد الذين تقطعت بهم السبل على الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل).

ويستند TRPS على قطبين حج / أجكل، مفصولة غشاء المسام من اللدائن المرنة التي تؤسس تيار الأيونية مستقر على حقل كهربائي التطبيقية. وخلافا لمختلف التكنولوجيات الجسيمات توصيف مقرها البصرية، ويمكن TRPS تميز الجزيئات الفردية بين عينة من السكان، مما يسمح للعينات متعددة الوسائط ليتم تحليلها بكل سهولة. هنا، علينا أن نظهر القياسات المحتملة زيتاعبر سرعات الجسيمات النبات من المعايير المعروفة وتطبيق هذه لعينة مرات النبات تحليلها، مما أدى إلى قياس زيتا المحتملة من تلك التحاليل.

وكذلك اكتساب القيم المحتملة زيتا متوسط، يتم قياس جميع العينات باستخدام منظور الجسيمات التي الجسيمات واظهار مزيد من المعلومات على عينة معينة من خلال توزيعات السكان عينة، على سبيل المثال. هذا، يوضح هذه الطريقة إمكانية ضمن تطبيقات الاستشعار عن كل من المجالات الطبية والبيئية.

Introduction

النانوية Functionalized تزداد شعبية كما أجهزة الاستشعار في كل المجالات الطبية والبيئية. القدرة على تغيير كيمياء سطح جسيمات متناهية الصغر، ومع الحمض النووي، على سبيل المثال، تثبت مفيدة لأنظمة توصيل الدواء المستهدف 1، ورصد تفاعلات الحمض النووي والبروتينات 2-4. خاصية جسيمات متناهية الصغر شائعة بشكل متزايد يجري استخدامها في اختبارات بيولوجية وفي تقديم العلاجات غير superparamagnetism 5. الجسيمات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (SPPS) مفيدة للغاية في تحديد وإزالة التحاليل محددة من مخاليط معقدة ويمكن أن تفعل ذلك مع الاستخدام البسيط للمغناطيس واحد. إزالة مرة واحدة، والجسيمات ملزمة تحليلها يمكن وصفها وتحليلها يصلح للغرض.

وتشمل الطرق السابقة المستخدمة للكشف وتوصيف الجسيمات النانوية التقنيات البصرية مثل تشتت الضوء الحيوي (DLS)، والمعروف باسم التحليل الطيفي الفوتون الارتباط. على الرغم من أن مرحباغ التقنية الإنتاجية، DLS يقتصر على كونه الطريقة القائمة على المتوسط وعند تحليل عينات متعددة الوسائط بدون إضافة برنامج متخصص، فإن الجزيئات الكبيرة تنتج إشارة أكثر هيمنة من ذلك بكثير، وترك بعض من جسيمات أصغر دون أن يلاحظها أحد تماما 6،7. الجسيمات التي الجسيمات تقنيات توصيف وبالتالي أكثر ملاءمة لتحليل جسيمات متناهية الصغر وأنظمة جسيمات متناهية الصغر functionalized.

وتعتمد التكنولوجيات القائمة RPS حول تطبيق حقل كهربائي على عينة ومراقبة آلية نقل الجزيئات من خلال ثقب النانو الاصطناعية أو البيولوجي. وكشف جسيمات متناهية الصغر وتوصيف تقنية حديثة نسبيا استنادا RPS هو مقاوم الانضباطي نبض الاستشعار (TRPS) 8-16. TRPS هو نظام ثنائي القطب مفصولة، غشاء المسام الانضباطي من اللدائن المرنة. يسمح طريقة الانضباطي المسام للالتحاليل مجموعة من شكل 17 و حجم المراد قياسها عن طريق العابرة لهاآليات الميناء من خلال المسام. وقد سبق أن استخدمت المسام الانضباطي للكشف عن الجسيمات الصغيرة (70-95 قطرها نانومتر) تحقيق نتائج مماثلة لغيرها من التقنيات مثل التحليل الطيفي انتقال الإلكترون (تيم) 10. عندما يتم تطبيق حقل كهربائي، لوحظ حدوث تيار الأيونية وبمرور الجزيئات / الجزيئات من خلال المسام، ومنع مؤقتا المسام، مما تسبب في انخفاض الحالية التي يمكن تعريفها بأنها "حدث الحصار". كل حدث الحصار هو ممثل جسيم واحد بحيث أن كل الجسيمات في عينة يمكن وصفها على أساس فردي على حجم الحصار، Δ المعادلة 1 ، والعرض الكامل نصف كحد أقصى، FWHM، فضلا عن غيرها من الخصائص الحصار. تحليل الجزيئات الفردية لأنها تمر من خلال ثقب النانو هو مفيد للعينات متعددة الوسائط كما TRPS يمكن بنجاح وفعالية يميز مجموعة من الجسيمات أحجام آمونGST عينة واحدة. الانضباطي الاستشعار نبض مقاوم يكمل حجم 10، زيتا المحتملة 12،18 وتركيز 15 القياسات في وقت واحد في شوط واحد، وبالتالي لا تزال تفرق عينات من ما شابه ذلك، إن لم يكن بنفس الحجم من قبل المسؤول سطحها 19. ميزة على تقنيات التحجيم بديلة.

ويعرف إمكانات زيتا كما إمكانات الكهربائي في الطائرة من القص 20، وتحتسب من سرعات الجسيمات لأنها تعبر مسام (19). قياسات المحتملة زيتا من الجزيئات الفردية مما يعطي نظرة ثاقبة على آليات النبات وسلوك النظم جسيمات متناهية الصغر في حل، معلومات قيمة لمستقبل تصاميم جسيمات متناهية الصغر فحص لمجموعة من التطبيقات. الجسيمات التي الجسيمات تحليل من هذا النوع يسمح أيضا لانتشار وتوزيع القيم المحتملة زيتا بين عينة من السكان من يكتشفها، والسماح لمزيد من المعلومات سحركية التفاعل ن (واحد الذين تقطعت بهم السبل على الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل، على سبيل المثال) وبثبات الجسيمات في الحل التي ينبغي تحقيقها.

هنا، نحن تصف تقنية يكتشف ويميز كل السطوح SPP معدلة وتعديل الحمض النووي. بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق على مجموعة من الجسيمات النانوية غير العضوية والبيولوجية، ولكن علينا أن نظهر الإجراء باستخدام أسطح تعديل الحمض النووي نظرا لمداها واسعة من التطبيقات. تقنية تسمح للمستخدم للتمييز بين الأهداف الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل وتقطعت بهم السبل مزدوجة على سطح جسيمات متناهية الصغر، استنادا إلى سرعات الجسيمات النبات من خلال نظام المسام وبالتالي إمكاناتها زيتا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جعل الفوسفات مخزنة المالحة مع توين-20 (PBST) العازلة

  1. حل واحد PBS قرص (0.01 عازلة M الفوسفات، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم، 0.137 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) في 200 مل من الماء منزوع الأيونات (18.2 MΩ سم).
  2. إضافة 100 ميكرولتر (0.05 (ت / ت)٪) توين-20 إلى الحل 200 مل العازلة كما السطحي.

2. إعداد معايير الجسيمات كربوكسيل البوليستيرين

  1. دوامة الجسيمات معايرة لمدة 30 ثانية قبل صوتنة لمدة 2 دقيقة في 80 واط لخلق monodispersity من الجسيمات.
  2. تمييع الجسيمات معايرة 1 في 100 إلى تركيز 1X10 10 الجسيمات / مل في المخزن PBST ودوامة لمدة 30 ثانية.

3. إعداد الجسيمات Streptavidin المغلفة

  1. دوامة جسيمات لمدة 30 ثانية قبل صوتنة لمدة 2 دقيقة في 80 واط لضمان monodispersity.
  2. تمييع الجسيمات streptavidin المغلفة 1 في 100 العازلة في PBST إلى تيار مترددhieve تركيز الناتجة من 1X10 9 الجسيمات / مل ودوامة لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: حجم عينة نموذجية 200 ميكرولتر. على سبيل المثال، إذا تحقق إعداد خمسة تركيز الحمض النووي 1 مل من الجسيمات streptavidin المغلفة المخفف.

4. إعداد أليغنوكليوتيد]

  1. إعادة أليغنوكليوتيد مع الماء منزوع الأيونات إلى تركيز الناتج من 100 ميكرومتر.

5. إضافة لقطة التحقيق (CP) الحمض النووي للجسيمات Streptavidin المغلفة

  1. قبل الحمض النووي ملزمة، دوامة streptavidin المغلفة الجسيمات (200 حجم العينة ميكرولتر) لمدة 30 ثانية تليها صوتنة 2 دقيقة في 80 واط.
  2. واستنادا إلى قدرة الملزمة التي يقدمها المورد (4352 بمول / ملغ)، إضافة التركيز المناسب من الحمض النووي للجسيمات لتركيزات الناتجة من 10، 20، 30، 40، 47، 95، 140، و 210 نانومتر الحمض النووي.
  3. دوامة العينات لمدة 10 ثانية ومكان على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفةلمدة 30 دقيقة للسماح الحمض النووي لربط أسطح الجسيمات عن طريق التفاعل streptavidin البيوتين.
  4. مرة واحدة تم إضافة الحمض النووي التقاط وحضنت مع جزيئات streptavidin المغلفة، وإزالة الحمض النووي الزائد في حل عن طريق الفصل المغناطيسي عن طريق وضع العينات على الرف المغناطيسي لمدة 30 دقيقة.
  5. إزالة طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو الكتلة التي تكونت حديثا من الجسيمات الأقرب إلى المغناطيس، واستبدالها مع نفس الحجم من العازلة PBST الجديد.

6. التهجين الحمض النووي التكميلي للجسيمات CP

  1. إضافة المبلغ المطلوب من الحمض النووي الهدف (ما يزيد على 500 نانومتر) لضمان أقصى قدر من الأهداف الممكنة تم التوصل ملزمة.
  2. دوامة العينات لمدة 10 ثانية ومكان على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. وبمجرد أن التهجين كاملة، إزالة الحمض النووي الهدف الزائد عن طريق الفصل المغناطيسي عن طريق وضع العينات على الرف المغناطيسي لمدة 30 دقيقة.
  4. إزالة طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو الكتلة التي تكونت حديثا من الجسيمات الأقرب إلى المغناطيس، واستبدالها مع نفس الحجم من العازلة PBST الجديد.
  5. كرر الخطوات من 6،1-6،4 لعينات المكررة ووضع هذه العينات على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة للتحقيق في الأوقات تهجين الحمض النووي.

إعداد 7. TRPS

  1. سد العجز في الصك في نظام الكمبيوتر مع البرمجيات في المكان.
  2. معايرة تمتد الأولي باستخدام الفرجار.
    1. قياس المسافة بين السطح الخارجي للاثنين فكي موازية.
    2. مساهمة في البرنامج عن طريق كتابة تمتد في الحقل "تمتد" في علامة التبويب "إعدادات صك" والنقر على "معايرة تمتد" تحت علامة التبويب.
  3. تناسب أفقيا غشاء من مادة البولي يوريثين ثقب النانو من التحجيم المناسب للتحليل على الفكين مع رقم ثقب النانو تواجه التصاعدي. ثم، وتمتد بين فكي على امتداد المطلوبة للتحليل باستخداممقبض تعديل تمتد على الجانب الصك. تمتد بين فكي بين 43 و 48 ملم.
    ملاحظة: يتم تحديد القيمة الدقيقة للامتداد إلى جانب الجهد التطبيقي بحيث الحصار معايرة الجسيمات ما لا يقل عن 0.3 غ في الحجم. وإدخالها تمتد بالفعل في البرنامج في الخطوة 7.2 وسوف تعدل تلقائيا كما امتدت بين فكي.
  4. ضع 80 ميكرولتر من العازلة PBST في الخلية أقل السوائل، تحت ثقب النانو، وضمان عدم وجود فقاعات الحالية التي قد تؤثر على القياس. إذا كان هناك فقاعات ينظر، وإزالة واستبدال العازلة.
  5. انقر فوق الخلية السوائل العليا في مكانه ووضع 40 ميكرولتر من العازلة في ذلك، ضمان مرة أخرى عدم وجود فقاعات الحاضر. إذا فقاعات موجودة في الخلية السوائل العليا، إزالتها عن طريق استبدال السائل.
  6. عندما تم التوصل إلى خط الأساس الحالية استنساخه من استبدال الخلايا السوائل العليا مع العازلة، إضافة 40 ميكرولتر من عينة إلى الخلية السوائل العليا والتدبير النقر على 'شارعالفن "في" علامة التبويب الحصول على البيانات "على شاشة البرنامج.
    ملاحظة: يتم الانتهاء من الحصول على البيانات على تردد 50 كيلوهرتز مع الحد الأدنى لحجم الحصار المفروض على 0.05 غ، على الرغم من أن هذا يمكن تغييرها باستخدام البرنامج عبر علامة التبويب "بيانات تحليل" (تحت "إعدادات تحليل" و "مقاوم الحصارات ') .
  7. ضع قفص فاراداي على الجزء العلوي من نظام خلايا السائل للحد من الضوضاء الخلفية الكهربائي على القياسات.
  8. استخدام وحدات ضغط متغير (VPM) لتطبيق ضغط أو فراغ للعينات.
    1. لتطبيق الضغط الخارجي ربط فوهة إلى الخلية السوائل العليا، ثم تدوير الذراع الضغط والنقر في مكان (اعتمادا على ما إذا كان ضغط إيجابي (PRE) أو فراغ (VAC) سيتم تطبيق).
    2. الضغط في "سم" أو الحجم "مم" باستخدام مقبض مرحلة الضغط التي تقع على الجزء العلوي من VPM. اضغط على مقبض الباب وصولا الى ممارسة الضغط على مقياس "سم" وتسحبه إلى أعلى رس الضغط على مقياس "ملم".

8. عينات التحضير لتحليل TRPS

  1. عينات دوامة لمدة 30 ثانية، ويصوتن لمدة 2 دقيقة في 80 واط قبل التحليل TRPS.

9. معايرة ثقب النانو لتحليل زيتا

  1. بعد وضع 40 الجسيمات معايرة ميكرولتر (1X10 10 الجسيمات / مل) في الخلية السوائل العليا، واستكمال قياس TRPS (الإعداد كما في القسم 7) في 3 الفولتية المطبقة. تغيير الجهد عن طريق النقر على '+' و '-' أزرار على مقياس الجهد في علامة التبويب "إعدادات أداة" على البرنامج.
  2. تأكد من أن 3 الفولتية تعود التيارات خلفية ما يقرب من 140، 110، و 80 غ. ضمان على الجهد المتوسط ​​الجسيمات معايرة تنتج متوسط ​​حجم الحصار المفروض على 0.3 على الأقل غ.
  3. تطبيق الضغط حتى متوسط ​​الكامل نصف عرض الحد الأقصى (FWHM) المدد من الجسيمات معايرة ما لا يقل عن0.15 ميللي ثانية. القيام بذلك يدويا باستخدام ذراع الضغط تعلق على وحدة ضغط متغير. حدد الضغط (PRE) أو فراغ (VAC) عن طريق تدوير الذراع حتى تستقر في الموضع المطلوب وتطبق وفقا لذلك ما يلي تعليمات الإعداد في خطوة 7.8.2. متى تحققت هذه الشروط، بدء التشغيل عن طريق النقر على 'بداية' على البرنامج في علامة التبويب "الحصول على البيانات.
  4. استكمال تشغيل عن طريق الضغط على "وقف" في علامة التبويب "الحصول على البيانات" عندما تم قياسها لا يقل عن 500 الجسيمات (انظر "عدد الجسيمات" في الجزء السفلي من الشاشة البرنامج خلال قياس) وعلى المدى قد تجاوزت 30 ثانية (انظر " وقت تشغيل 'أيضا باتجاه الجزء السفلي من الشاشة).
  5. معايرة نظام من خلال استكمال تشغيل المعايرة كما هو موضح في كل مرة يتم إدخال ثقب النانو الجديد أو كل يوم جديد من التحليل من قبل إكمال الخطوة 9،1-9،4.

10. تشغيل عينة

  1. تشغيل عينات على أعلى أوثاني أعلى الجهد كما العينات المعايرة في ضمان مماثل (± 10 غ)، إن لم يكن نفسه، التيار الأساسي.
    1. مرة واحدة ويتحقق الأساس التيار المناسب، استبدال بالكهرباء في الخلية السوائل العليا مع 40 ميكرولتر من العينة. عندما يتم إدخال العينة، وسوف ينظر الحصار على تتبع الإشارة. بدء عينة تشغيل عن طريق النقر على "ابدأ" في علامة التبويب "الحصول على البيانات" وتسجيل ما لا يقل عن 500 الجسيمات (راجع "عدد الجسيمات" تقع تحت التتبع إشارة) وضمان وقت التشغيل هو الحد الأدنى من 30 ثانية (انظر "تشغيل الوقت "تقع أيضا تحت أثر إشارة).
    2. لإتمام القياس، انقر فوق "إيقاف" في "علامة التبويب الحصول على البيانات" وحفظ ملف البيانات.
  2. لحفظ الملف، وإدخال معلومات الملف في الشكل التالي. "التحقيق" هو ​​المجلد سيتم حفظ الملف في، "ثقب النانو معرف 'هو الرقم التسلسلي للمسام المستخدمة،' الجزء # 'طق نوع من المسام (أي NP150 / NP200)، 'معرف نموذج' هو اسم العينة، 'معايرة أو عينة "تفاصيل ما إذا كان هو معايرة أو عينة القياس،" التخفيف "يستخدم إذا تم تخفيفه العينة ( اكتب 100 اذا كان المخفف العينة 100 أضعاف)، 'الضغط' هو الضغوط التي مورست على عينة (في سم - انظر القسم 7.8)، 'معرف بالكهرباء' هو اسم العازلة تم عينة تصل في، و" تلاحظ "هي أي ملاحظات شخصية حول العينة أو التشغيل.
  3. بين كل تشغيل عينة، وغسل النظام من خلال وضع 40 ميكرولتر من PBST المخزن المؤقت في الخلية السوائل العليا عدة مرات وتطبيق الضغوط المختلفة (عادة في -10، -5 سم (فراغ)، و 5 و 10 سم (ضغط إيجابي)) حتى لا مزيد من الأحداث الحصار موجودة، ضمان عدم وجود جزيئات المتبقية المتبقية في النظام وبالتالي عدم وجود تلوث المتبادل بين العينات. عينات تشغيل في ثلاث نسخ مع هذه الخطوة غسل الانتهاء بين كل تكرار نموذج تشغيل وأهلا وسهلال كما بين عينات مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

شكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لعمليات تنقية المغناطيسي وقياس TRPS. أ) مثال لتنقية المغناطيسية للعينة بدءا من عينة تحتوي على فائض، غير منضم القبض على التحقيق الحمض النووي. ب) TRPS سبيل المثال قياس ط) الجسيمات التي تمر عبر ثقب النانو والثاني) حالة الحصار التي تنتج من الجسيمات الاغلاق مؤقتا الأيونات في المسام مما تسبب في انخفاض مؤقت في التيار. المعلومات التي يتم استخدامها لحساب السرعات الجسيمات النبات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إزالة أي الحمض النووي الزائدة التي لم منضمة إلى سطح الجسيمات من العينات هي سابقة مهمة لتحليل TRPS، حتى لا الإبلاغ عن أينتائج "إيجابية كاذبة". القدرة على استخدام مغناطيس لاستخراج وغسل SPPS هو مكسب كبير للTRPS (الشكل 1A). ويصف الشكل 1B مثال الأساسي لقياس TRPS ومثال "حدث الحصار" التوصل إليها جسيم يخترق المسام. أولا، لقد أثبتنا أن TRPS هي تقنية إنتاجية عالية يمكن أن تميز بين العينات ذات حجم مماثل ولكن من تهمة مختلفة إلى حد كبير. قدرته على إكمال سواء من حيث الحجم ورسوم تحليل في وقت واحد في قياس واحد يمكن أن ينظر إليها في الشكل 2 الشكل 2 مثال أ) حجم وب) تحليل المحتملة زيتا من streptavidin جسيمات المغلفة مع أي تعديلات (ضوء مجموعة البيانات وردي) و streptavidin المغلفة الجزيئات المشبعة مع الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل على السطح (الأزرق مجموعة البيانات). على الرغم من أن كل من العينات كانت ذات حجم مماثل، كانت إمكانات زيتا مختلفة إلى حد كبير وأكبر من ذلك بكثير عندما كان الحمض النووي functionalized على سطح الجسيم.

الشكل 2
الشكل 2. حجم وزيتا تحليل المحتملين النانوية المعدلة الحمض النووي وstreptavidin معدلة المغلفة، والحانات وردي فاتح تمثل جزيئات معدلة streptavidin المغلفة وأشرطة زرقاء تمثل الجزيئات المعدلة الحمض النووي. أ) تردد (٪) مقابل قطر الجسيمات (نانومتر). ب) تردد (٪) مقابل إمكانات زيتا (بالسيارات). الرقم مقتبس من بيانات تكميلية في بلونديل وآخرون. 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا يمكن إلا أن تقنية تفرق بين جزيئات معدلة وتعديلها مع الحمض النووي، TRPS يمكن أيضا أن يفرق بين العينات بتركيزات مختلفة من الحمض النووي تهجين إلى المساواةيظهر جسيما السطح. الشكل (3) حجم وزيتا البيانات المحتملة عرضت للعينات مع أدنى (10 نانومتر، وعلى ضوء مجموعة البيانات الأخضر) وأعلى (210 نانومتر، الأزرق مجموعة البيانات) تركيزات الحمض النووي تهجين إلى جزيئات streptavidin المغلفة. يتم تسجيل القيمة المحتملة زيتا أكبر للجسيمات تهجين مع تركيز أعلى من الحمض النووي.

الشكل (3)
الشكل 3. حجم في وقت واحد والبيانات المحتملة زيتا تم الاستيلاء عليها من قياس TRPS واحد. القضبان / نقاط البيانات الزرقاء هي تمثيلية من الجسيمات streptavidin المغلفة تهجين مع 210 نيوتن متر الحمض النووي CP والحانات ضوء أخضر / تمثل نقاط البيانات streptavidin المغلفة الجسيمات تهجين مع 10 نانومتر CP الحمض النووي. شخصية مقتبسة من بلونديل وآخرون. 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ومن المفيد أن نلاحظ أن كل نقطة من نقاط البيانات في المؤامرة مبعثر يمثل جسيم واحد من بين عينة من السكان، مما يسمح لتحليل متعمق الجسيمات التي الجسيمات مع كل عينة. الشكل 4 يدعم فعالية هذه التقنية في تحديد التغييرات الطفيفة في بنية الحمض النووي ( أهداف واحدة الذين تقطعت بهم السبل ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي)، فضلا عن تحديد الاختلافات في عينات الحمض النووي مع الهدف من نفس الحجم، ولكن منضمة إلى منطقة مختلفة من التحقيق القبض على إظهار مستويات عالية من الحساسية (أي ملزمة الأوسط وإنهاء ملزمة أظهرت في الشكل 4). الجسيمات هو مبين في الشكل (4) هي تلك مع التعديلات سطح التالية، من اليسار إلى اليمين. التحقيق القبض على (CP) الحمض النووي فقط، CP والهدف الحمض النووي مكملة تماما، CP وملزمة منتصف الهدف الحمض النووي، CP، ووضع حد هدف الحمض النووي ملزمة، CP والهدف الحمض النووي المتدلية.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (4)
. الشكل 4. التغيير النسبي في إمكانية زيتا قياس للجزيئات تعديل الحمض النووي مع مجموعة من الأهداف الحمض النووي تغيير في إمكانات زيتا، بالسيارات، من ط) CP functionalized الجسيمات إلى مجموعة من الأهداف الحمض النووي. ب) مكملة بالكامل، الثالث) ملزمة الأوسط، والرابع) وضع حد ملزم والهدف الخامس) تشرف غرفها. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري حيث n = 3. شخصية مقتبسة من بلونديل وآخرون. 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حساب لإمكانات زيتا استخدام طريقة تستند معايرة المتعلقة بالعمل التي كتبها Arjmandi وآخرون. 21. مدة النبات من الجزيئات لأنها تعبر يقاس على ثقب النانو بوصفها وظيفة من الجهد التطبيقية، وذلك باستخدام متوسط ​​الكهربائية السرعات الميدانية والجسيمات على كامل المسام مخروطي منتظم. التنقل الكهربي هو مشتق من 1 / T (حيث T هي مدة الحصار) فيما يتعلق الجهد، مضروبة في مربع طول منطقة الاستشعار عن بعد، ل. يتم قياس متوسط ​​السرعات على نقاط مرجعية متعددة من خلال منطقة الاستشعار لإتاحة الحد الأدنى من الأخطاء في حساب إمكانات زيتا باستخدام هذا الأسلوب.

ويستند معايرة المسام على الخطي من 1 / T مقابل الجهد، والخامس، في كل نقطة مرجعية في منطقة الاستشعار عن بعد. سرعات الجسيمات حركي كهربي المعايرة وعينة الجسيمات،تحميل / 54577 / 54577eq2.jpg "/> و المعادلة 3 على التوالي، ترتبط إمكانات زيتا، و المعادلة 4 و المعادلة 5 ، كما هو مبين في المعادلة 1، على افتراض وجود علاقة خطية بين الجانبين على النحو الوارد في تقريب Smoluchowski 12،20. صافي القيم المحتملة زيتا لكل من المعايرة والعينة هي الاختلافات في إمكانات زيتا الجسيمات وغشاء المحتملة زيتا، المعادلة 6 . وقد تم قياس إمكانات زيتا من المسام البولي باستخدام تدفق التقنيات المحتملة 12،18 كما -11 بالسيارات في برنامج تلفزيوني لهذه الدراسة.

المعادلة 7 (1)

إمكانات زيتا من كل الجسيمات الفردية، ط، المعادلة 8 هو موقف من الجسيمات داخل المسام بعد مرة، تي = س T، و معادلة 10 هي سرعة الجسيمات من عينة جسيم واحد أنا في النسبية مواقف ل س. معادلة 12 ، معادلة 14 ، P، والخامس وسرعة حركي كهربي لكل وحدة الجهد، وسرعة الحمل الحراري في الضغط وحدة ومارس ضغطا والجهد للحصول على نموذج يمتد على التوالي، ويمكن الاطلاع على اشتقاق الكامل لهذه المعادلة في العمل من قبل بلونديل وآخرون. 19.

معادلة 16

عند ربط الحمض النووي القبض على التحقيق لالنانوية streptavidin المغلفة، فمن الأهمية بمكان أن الباحث يزيل الزائد، غير منضم الحمض النووي القبض على التحقيق اليسار في الحل. ويتم ذلك بسهولة باستخدام SPPS ومغناطيس بسيط يسمح استبدال السريع والسهل من طاف العازلة مع PBST الجديد. إذا تم ترك الزائد القبض على الحمض النووي في حل وتستهدف أضاف الحمض النووي، والحمض النووي الهدف قد ربط الحمض النووي التقاط الحرة في الحل، بدلا من ذلك على سطح SPP. سيتم فقط وحظ وجود تغير في سرعة الجسيمات وزيتا المحتملة إذا يربط الحمض النووي الهدف إلى القبض على التحقيق موجودة على سطح الجسيم.

تحليل ومقارنة عدد كبير من العينات في العديد من أيام باستخدام TRPS قد تتطلب استخدام غشاء المسام أكثر من واحد. يمكن لبعض المسام لديها بعض الاختلافات الطفيفة في حجمها نتيجة لعملية التصنيع وفي هذه الحالات، يجب على المستخدم التأكد من التيار الأساسي يبقى متطابقة في جميع رونانو ثانية. إذا لوحظ الأساس الحالي نفسه، فإن النتائج التي تم الحصول عليها قابلة للمقارنة بين المسام. وبمجرد أن الأساس هو نفس الاختبارات السابقة، لا بد من أن المستخدم يحتفظ تمتد دون تغيير بين المعايرة وعينة أشواط للسماح لتحديد دقيق للسرعات الجسيمات النبات لأنها تعبر المسام.

التكنولوجيا TRPS لديها مجموعة بسيطة نسبيا يصل، والتي يمكن تفكيكها بسهولة وسرعة خلال التجربة. إذا استكشاف المشاكل، وهذا يمكن جعل العملية أسهل كثيرا. على سبيل المثال، من المهم عدم السماح لأي فقاعات في الخلية أقل السوائل أو خلية السوائل العليا عند إجراء تحليل. وسوف يؤدي ذلك إلى خط الأساس الحالية غير مستقرة. إذا فقاعات موجودة في الخلية السوائل العليا، قد يتم إزالة عينة واستبدالها. في حالة ظهور فقاعات في الخلية السوائل أقل، يجب إزالة العازلة واستبدالها عازلة جديدة. إذا كانت الفقاعات هي مشكلة مستمرة، ثم قد يكون هناك الكثير من التوتر السطحيفي حل لذلك هذا قد يكون من الضروري تخفيض 16 (ونحن نستخدم فقط 0.05٪ توين 20). بعض العينات قد تمنع المسام إذا حجمها يفوق حجم المسام أو إذا كان تركيز العينة مرتفع جدا. لتصحيح هذا الوضع، يمكن زيادة حجم المسام عن طريق زيادة التمدد أو يمكن أن تضعف العينة إلى انخفاض تركيز الجسيمات 16. لتحليل جسيم واحد، قد العينة أيضا عرقلة المسام إذا كان هناك الكثير من المجاميع الكبيرة الحاضر، من المهم أن دوامة ويصوتن العينة قبل تشغيله من خلال TRPS.

من بين الأساليب الأخرى، TRPS مزاياه المختلفة بما في ذلك القدرة على إنجاز حجم ورسوم قياس الجزيئات الفردية في وقت واحد. السماح للعينات متعددة الوسائط ليتم تحليلها على نحو فعال باستخدام هذا الأسلوب. ميزة واحدة هي إشارة / الحصار المنتجة يمكن أن يكون الأمثل في دقائق لعينة معينة ببساطة عن طريق تغيير امتداد والجهد للحصول على حجم الحصار، Δ </ م> المعادلة 1 ، أكبر بكثير من الضوضاء في الخلفية (الحصار هي على نطاق وغ بالمقارنة مع ضجيج في الخلفية <10 سنويا). أن تكون قادرة على تغيير امتداد المسام يجعل أسلوب أكثر تنوعا على تقنيات المسام الحالة الصلبة ك حجم المسام يمكن تعديلها فيما يتعلق بحجم الحليلة في المسألة؛ مفيدة بشكل خاص عند التحقيق في الآثار المترتبة على مثل تجميع والحمض النووي والبروتينات الملزمة التي قد تؤدي إلى أحجام تحليلها تجاوز الحالة الصلبة نطاق حجم المسام الأصلي. الجانب المفيد آخر من TRPS هو مستوى حساسية من هذه التقنية. القدرة على اكتشاف الفروق الدقيقة في الحمض النووي ملزمة (حيث تمت إضافة نفس الكمية من الحمض النووي (نفس كمية الشحنة المضافة) وعينات من نفس الحجم) على أساس الموقف من الحمض النووي هدف ملزم عميقة جدا في هذا المجال من وتحليل وتكون ذات فائدة كبيرة لمنصات تصميم جسيمات متناهية الصغر فحص في المستقبل. كل خفية تختلفسينعقد يمكن الكشف عن ومعزولة باستخدام طبيعة الجسيمات التي الجسيمات التكنولوجيا TRPS. يتجاوز هذا التحليل أنه من تقنيات المجموعات مثل تشتت الضوء الحيوي أو الفوتون ارتباط التحليل الطيفي الذي لن يؤدي إلا إلى سبر في المتوسط من السكان عينة تحليل ولا يمكن أن تفرق في حالات عينات المتعدد الوسائط 6،7.

كما استخدمت nanopores الحالة الصلبة الصغيرة (100-200 نانومتر) لمراقبة ديناميكا الجسيمات ولقد وجد أن الجسيمات التنقل يمكن أن تتأثر كما قطر من الجسيمات يبدأ في الاقتراب أن من ثقب النانو 22،23. Nanopores أكبر بكثير من الجزيئات التي يجري تحليلها (كما استخدم في هذه الدراسة) لديها أقل من تأثير على حركة الجسيمات وبالتالي ديناميات النبات داخل المسام. لكن والمسام المستخدمة في هذه الدراسة تقتصر على نطاقاتها حجم تحليلها، وNP150 على سبيل المثال لديها مجموعة وحجم 60-480 نانومتر حتى إذا تكونت عينة المتعدد الوسائط من الجزيئات داخل وتزيد هذهالحد، فإنها لا يمكن تحليلها على نفس المسام التي قد ثم انسداد المسام. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن قياس عينة ذات النسقين تحتوي على 60 و 480 الجسيمات نانومتر (أولئك على المطلقة في الحدود الدنيا والعليا للمسام)، على سبيل المثال، سوف تتطلب مختلفة تمتد والجهد الظروف، على الرغم من أن كلاهما ضمن نطاق تحليل حجم من المسام. وذلك لأن تمتد المطلوبة للجسيمات أكبر سيؤدي إلى وجود جسيمات أصغر قوته الحصار ضئيلة جدا (استنادا إلى انخفاض المقاومة) التي يمكن اعتبارها الضوضاء الخلفية، وبالتالي لا تقاس بالضرورة أثناء تشغيل العينة.

الفقاعات قد يكون هناك مشكلة مع القياسات عينة كما فقاعات في الخلية السفلية أو العلوية السائل سيتم إنشاء خط الأساس الحالية غير المستقرة، والتي لا يمكن أن تكتمل أشواط العينة. قد تكون الشوارد ذات طبيعة فوارة (بعض وسائل الاعلام البيولوجية مركزة للغاية، على سبيل المثال) من الصعب تشغيل وبالتالي عينات مساuiring تعليق في هذه وسائل محددة قد تكون مشكلة. معظم العينات ومع ذلك، يمكن أن تضعف إلى حد كبير أو علقت في مخازن بديلة قبل تحليل TRPS.

هذه الطريقة قابلة للتكيف، ويمكن استخدامها لتحليل مجموعة من التحاليل القائمة على جسيمات متناهية الصغر، بما في ذلك تحليل البروتينات والحمض النووي، وجزيئات صغيرة، المقايسات تجميع 17،24 والجسيمات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. براعة TRPS في وصف مجموعة واسعة من التحاليل تبين التقنيات المحتملة في مجموعة من المجالات مثل تسليم المخدرات 1،25، biosensing 26-28، والاختبارات البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويدعم ELCJB التي كتبها Izon العلوم المحدودة

Acknowledgments

الكتاب أشكر Izon العلوم المحدودة لدعمهم. وأيد هذا العمل من قبل المفوضية الأوروبية للأبحاث (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
  2. Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
  3. Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
  4. Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
  5. Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
  6. Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
  7. Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
  8. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
  9. Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
  10. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
  11. Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
  12. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
  13. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
  14. Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
  15. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
  16. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
  17. Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
  18. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
  19. Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
  20. Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
  21. Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
  22. Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
  23. Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
  24. Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
  25. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
  26. Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
  27. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  28. Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 116، جهاز الاستشعار البيولوجي، TRPS، ثقب النانو، زيتا المحتملة، والحمض النووي، والجسيمات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic
تقرير زيتا المحتملة عبر جسيمات متناهية الصغر إزفاء السرعات من خلال الانضباطي ثقب النانو: استخدام الجسيمات المعدلة الحمض النووي كمثال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R.,… More

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example. J. Vis. Exp. (116), e54577, doi:10.3791/54577 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter