Summary
在这里,我们使用集成到一个电阻脉冲感测技术经由粒子易位速度的测量,这可以被用来确定各个纳米粒子的ζ电位来表征纳米颗粒表面化学的聚氨酯可调谐纳米孔。
Abstract
纳米孔技术,统称为电阻脉冲传感器(RPS),被用来检测,量化和表征的蛋白质,分子和纳米颗粒。可调电阻脉冲感测(TRPS)是一个相对较新的适应RPS并入,可以实时地改变的可调孔径。这里,我们使用TRPS监测DNA改性的纳米粒子的易位倍,因为它们穿过可调孔膜作为DNA浓度和结构的一个功能( 即 ,单链到双链DNA)。
TRPS是基于两个的Ag / AgCl电极,通过它建立在所施加的电场产生稳定的离子电流的弹性体孔膜分离。与各种基于光学颗粒表征技术,TRPS可以表征单个颗粒之间的样本人口,允许能够轻松进行分析多式联运样品。这里,我们证明zeta电位测量通过已知的标准粒子易位速度和应用这些样品的分析物易位倍,从而导致测量这些分析物的Zeta电位。
以及获得的平均ζ电位的值,将样品全部采用的粒子由粒子立体显示通过样品人口分布的给定样品的详细信息,例如测量的。这样,这种方法演示了医疗和环境等领域的传感应用中的潜力。
Introduction
官能化的纳米颗粒变得如在医疗和环境领域的生物传感器日益流行。的能力,以改变纳米颗粒的表面化学,用DNA,例如,被证明是用于靶向药物递送系统1和监测DNA-蛋白质相互作用2-4是有用的。被利用在生物测定一个越来越普遍的纳米颗粒性质和在治疗剂的递送是超顺磁性5。超顺磁性粒子(SPP的)是在确定和从复杂混合物中去除特定分析物是非常有用的,可以用简单的使用单个磁体的这样做。一旦移除,所述分析物结合的颗粒可以被表征和分析适合目的。
用于纳米颗粒的检测和表征以前的方法包括光学技术,诸如动态光散射(DLS),或称为光子相关光谱法。虽然一喜GH可以通过技术,DLS被限定于一个平均为基础的技术,并没有加入专业软件分析多峰样品时,较大的颗粒将产生一个更主导信号,留下一些较小的颗粒完全被忽视6,7。粒子按颗粒表征技术,因此更利于分析和纳米功能化纳米粒子系统。
基于RPS技术基于周围施加电场到样品,并通过合成或生物纳米孔监测粒子的输送机构。根据RPS相对近期的纳米检测与表征技术是可调电阻脉冲感应(TRPS)8-16。 TRPS是由弹性,可调谐孔隙膜分开的两个电极系统。的可调孔径的方法允许在各种形状17和大小的分析物通过其反待测量通过毛孔口的机制。可调孔隙先前已经用于生产比较的结果,其他技术如透射电子光谱法(TEM)10检测的小颗粒(70-95纳米直径)。当施加电场时,离子电流被观察到并作为颗粒/分子穿过孔,它们暂时阻止孔径,导致在当前的减少,可以被定义为一个“封锁事件'。每个封锁事件是代表单个颗粒,使得样本内的每个颗粒可以表征单独基于所述封锁幅度,Δ 和全宽度半最大,FWHM,以及其他封锁性能。判断单个颗粒,因为他们通过纳米孔为多峰的样品有利的,因为TRPS可以成功地和有效区分的范围内的颗粒尺寸阿蒙GST一个样本。可调电阻脉冲感测完成大小10,同时ζ电位12,18和浓度15测量在单次运行,因此,仍可以区分的类似的样品,如果不通过表面电荷19相同的大小;在施胶替代技术的优势。
ζ电位是指在剪切20的平面上的静电势,并作为它们穿过的孔19从粒子速度计算。单个颗粒的ζ电位测量值从而给出洞察易位机制和在溶液中的纳米颗粒系统中,纳米颗粒测定设计未来的有价值的信息用于一系列应用的行为。粒子通过粒子这种性质的分析,还允许之间的样本人群中蔓延,zeta电位值的分布加以探讨,使邻更多信息要达到n个反应动力学(单链到双链DNA,例如)和颗粒稳定性在溶液中。
在这里,我们描述了检测和表征未修饰和DNA修饰SPP表面的技术。本文描述的协议是适用于一系列无机和生物纳米颗粒,但我们证明用DNA修饰表面的方法,由于其广泛的应用。该技术允许用户在纳米颗粒表面的单链和双链DNA靶区分基础上,通过一个孔体系粒子易位速度和因此它们的ζ电势。
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Protocol
1.用吐温20(PBST)缓冲使磷酸盐缓冲液
- 溶解1的PBS片剂(0.01M磷酸盐缓冲液,0.0027 1M氢氯化物,0.137氯化钠,pH值7.4)在200毫升的去离子水(18.2兆欧厘米)。
- 加入100微升(0.05(V / V)%)吐温20至200毫升缓冲液溶液作为表面活性剂。
2.准备羧基聚苯乙烯颗粒标准
- 涡旋超声2分钟前30秒的校准颗粒在80瓦到创建粒子的单分散性。
- 稀释校准颗粒在100 1至在PBST缓冲液和涡旋1×10 10个粒子/ ml的浓度为30秒。
3.准备链亲和素包覆颗粒
- 涡旋超声2分钟前30秒的颗粒在80瓦的单分散性保证。
- 稀释链霉包衣颗粒1 100在PBST缓冲到交流hieve的1×10 9个粒子/ ml,30秒所得浓度和旋涡。
注:一个典型的样本量为200微升。例如,如果调查不同的DNA的浓度制备1ml适当稀释的链霉亲涂覆颗粒。
4.寡核苷酸的制备
- 重构用去离子水的寡核苷酸到所得100μM的浓度。
5.加成捕获探针(CP)的DNA的链亲和素包被的颗粒
- 之前DNA结合,涡流链霉包衣颗粒(200微升样品体积)30秒,随后通过一个2分钟超声处理在80瓦。
- 基于由供应商(4352皮摩尔/毫克)所提供的结合能力,加DNA的适当的浓度在颗粒为10,20,30,40,47,95,140,和210纳米的DNA得到的浓度。
- 涡旋10秒并置于样品上在室温下在旋转轮30分钟以允许将DNA通过链霉抗生物素相互作用结合到粒子表面。
- 一旦捕获的DNA已被添加,并与链霉亲包衣颗粒孵育,通过将试样放在一个磁架30分钟除去在经由磁分离溶液中的过量的DNA。
- 除去上清液,注意不要扰乱最接近磁铁粒子的新形成的群集,并用相同体积的新的PBST缓冲液的更换。
6.杂交的互补DNA到CP颗粒
- 添加所需的靶DNA(超过500纳米)的量,以确保最大可能的靶结合为止。
- 涡旋样品10秒和地点上在室温下在旋转轮30分钟。
- 一旦杂交完成后,通过将样品上的磁架30分钟除去通过磁分离过量的靶DNA。
- 除去上清液,注意不要扰乱最接近磁铁粒子的新形成的群集,并用相同体积的新的PBST缓冲液的更换。
- 重复步骤重复样本6.1至6.4,并放置这些样品,在旋转轮在室温下16小时,以研究DNA杂交时间。
7. TRPS设置
- 插入仪器到计算机系统中以代替软件。
- 校准用卡尺的初始拉伸。
- 测量两个平行夹爪的外侧之间的距离。
- 输入通过在“仪器设置”选项卡中输入在“拉伸”字段拉伸,然后点击“校准舒展”的标签下的软件。
- 横向适合分析适当大小的聚氨酯纳米孔膜上朝上纳米孔ID号钳口。然后,伸展钳口用于使用分析所需的拉伸在仪器的一侧伸展调节手柄。伸展43和48毫米的下颌。
注意:使校准微粒封锁是至少0.3 nA的尺寸是一起施加电压所确定的拉伸的精确值。拉伸已经输入到软件在步骤7.2和作为钳口被拉伸会自动调整。 - 放置80微升PBST缓冲液中的下部流体细胞,纳米孔的下方,以确保不存在本气泡可能影响测量。如果有气泡看出,取出并更换缓冲。
- 点击上方的流体细胞到位,并把40微升缓冲进去,从而也确保没有泡沫存在。如果气泡存在于上部流体细胞,通过更换液体移除。
- 当可再现的基线电流已从用缓冲液更换上部流体细胞达到,通过点击“ST添加40微升样品到上部流体细胞和测量的“中的”数据采集“软件屏幕上标签的艺术。
注:数据采集完成后,在50千赫的0.05呐封锁幅度下限的频率,虽然可以使用通过“分析数据”选项卡中的软件进行更改(在“分析设置”和“电阻式封锁”) 。 - 放置一个法拉第笼在流体电池系统的顶部,以减少对测量电背景噪声。
- 使用一个可变压力模块(VPM)来的压力或真空施加到样品。
- 施加的外部压力,喷嘴连接到该上部流体细胞,然后旋转压力臂和卡入到位(取决于是否将被施加正压力(PRE)或真空(VAC))。
- 在使用位于VPM顶部的压力级旋钮'厘米'或'毫米'刻度施加压力。按下旋钮,适用于“厘米”的规模压力,向上拉Ťo在“毫米”规模施加压力。
8.准备的样品分析TRPS
- 涡旋样品在TRPS分析前80瓦特30秒,超声2分钟。
9.校准纳米孔的泽塔分析
- 将40微升校准颗粒(1×10粒/ ml)倒入上层液体电池后,完成TRPS测量(设置为在第7)在3施加的电压。 “ - ”按钮上的电压规模在“仪器设置”中的软件选项卡中点击“+”和改变电压。
- 检查3电压回到约140,110背景电流和80 nA的。保证在中等电压的校准微粒产生至少0.3的平均阻滞大小nA的。
- 施加压力,使所述校准微粒的平均半峰全宽(FWHM)的持续时间至少是0.15毫秒。为此使用连接到可变压力模块的压力臂手动。选择压力(PRE)或真空(VAC),直到它卡在期望的位置,并且在步骤7.8.2所适用相应以下设置指示所述臂旋转。一旦这些条件已经实现,通过点击“数据采集”选项卡中的软件'开始'开始运行。
- 当至少有500个颗粒进行了测量(见“粒子计数”在软件屏幕在测量过程中底部),运行已超过30秒,由“数据采集”标签按下“停止”完成运行(参见“运行时间'也朝向屏幕的底部)。
- 通过描述每一种新的纳米孔引入时间或分析每一个新的一天完成步骤9.1-9.4完成校准运行校准系统。
10.运行样品
- 运行在最高的样品或第二高电压作为确保类似的(±10 NA)的校准样品,如果不相同,基线电流。
- 一旦适当的基准电流来实现,用40微升样品的替换在上部流体单元中的电解质。当引入的样品,封锁将看到的信号路径。开始通过点击“开始”中的“数据采集”选项卡中运行样品并记录最低500粒子(检查'粒子计数“信号走线下位于),并确保运行时间最少30秒(见”运行时代“也位于信号迹线下方)。
- 要完成测量,点击“停止”中的“数据采集卡”并保存数据文件。
- 要保存文件,输入如下格式的文件信息; '调查'是文件将保存在该文件夹,“纳米孔ID'正在被使用,'部分#'我毛孔的序列号š孔的类型( 即 ,NP150 / NP200),'样品ID'是样品的名字,“校准或样品”的信息是否是一个校准或测量样品,“稀释”,如果样品稀释被使用(键入100如果样品稀释100倍),“压力”是所施加的压力到样品(以厘米 - 见第7.8节),'电解质ID“是的缓冲样品中由姓名,和'注意事项'是有关样本或运行任何个人笔记。
- 每个样品运行之间,通过将40微升的PBST缓冲液到上部流体细胞几次并施加各种压力(在-10通常,-5厘米(真空),以及5和10厘米(正压力)),直到洗系统没有更多的阻断事件都存在,确保有残留在系统中没有残留的粒子和样品之间,因此没有交叉污染。在这种洗涤步骤每个重复样品之间完成一式三份样品运行身份运行WELl由于不同样本之间。
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Representative Results
图1. 磁性纯化和TRPS测量过程的示意图。 A)的开始与含有样品过量,未结合的捕获探针的DNA。B)的样本的磁性纯化的实施例的TRP测定例ⅰ)粒子穿过纳米孔和ii)从在孔粒子暂时阻塞离子封锁事件产生使暂时降低在目前的;从被用来计算粒子易位速度的信息。 请点击此处查看该图的放大版本。
尚未从样品中结合于颗粒表面的任何多余DNA的去除是重要的前TRPS分析,以不报告任何'假阳性'的结果。使用磁铁来提取和洗涤的SPP的能力为TRPS( 图1A)一个巨大的好处。 图1B描述了一个TRPS测量和已取得的粒子,例如“封锁事件”的一个基本例子穿过孔隙。首先,我们已经证明,TRPS是一种高通量的技术,可以类似尺寸的样品之间,但具有相当不同的电荷的区分。其在一个单一的测量同时完成两个大小和电荷的分析能力可以在图2中可以看出, 图2是一个)尺寸的一个例子,和b)的ζ链霉的电位分析包衣颗粒与无修饰(浅粉红色数据组)和同的表面上的单链DNA(蓝色数据集)的饱和链霉包衣颗粒。虽然这两个样品是相似的尺寸,zeta电位为显著不同和更大时的DNA是泛函onalized到颗粒的表面。
图2.大小与DNA修饰和未改性链霉涂上纳米粒子的Zeta电位分析的浅粉色线代表未修改链亲和素包覆颗粒和蓝条表示DNA修饰微粒。A)频率(%)与粒径(纳米)。 B)的频率(%)与ζ电位(毫伏)。图改编布伦德尔等 19补充资料。 请点击此处查看该图的放大版本。
不仅可以在技术颗粒未修饰和修饰的DNA区分,TRPS还可样品之间不同浓度的DNA杂交到面值区分视察表面。 图3示出了表现出对具有最低的样品的大小和ζ电位数据(10nM的,浅绿色数据集)和最高(210纳米,蓝数据集)的DNA的浓度杂交到链霉涂覆颗粒。较大的ζ电位值被记录为与DNA的浓度较高杂交颗粒。
图3同时大小和从单个TRPS测量捕获的ζ电位数据。 蓝色酒吧/数据点都代表与210纳米CP DNA和浅绿色的酒吧杂交链霉亲涂覆颗粒/数据点代表10纳米CP DNA杂交链亲和素包覆颗粒。图改编自布伦德尔等人 19。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
要注意,在散点图的每个数据点代表之间的样品群体单个颗粒,允许在深度粒子通过粒子与每一个样本的分析是有用的。 图4支持在确定DNA的结构小的变化的技术中的效力(示出的单链和双链DNA),以及识别与所述相同尺寸的靶DNA,但结合样品中的差异,以捕获探针展示高水平的灵敏度的不同区域( 即 ,中结合和结束约束力的目标在图4中)。在图4所示的颗粒是那些具有以下的表面改性,从左至右;捕获探针(CP)只有DNA,CP和完全互补的DNA目标,CP和中间DNA结合的目标,CP和结束与DNA结合的目标,CP和悬垂DNA的目标。
图 4. 在用于与范围的DNA靶DNA的改性颗粒测定ζ电位的相对变化更改ζ电位,毫伏,从i)的CP官能粒子到的范围内的DNA的目标; II)完全互补,III)中结合,IV)结束绑定,V)悬垂的目标。误差条表示标准偏差,其中n = 3。图改编自布伦德尔等人 19。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
为ζ电势用于计算由Arjmandi 等人 21的工作有关的校准基础的方法。因为它们穿过纳米孔被测量作为所施加电压的函数,使用平均电场和粒子速度定期锥形孔的整体上颗粒的易位持续时间。的电泳迁移率是1 / T(其中T是封锁持续时间)相对于电压的导数,乘以感应区长度的平方, 湖在通过传感区域的多个基准点的平均速度测量以允许最小的误差在使用这种方法计算ζ电位。
孔的校准是基于1 / T的线性Vs电压,V,在感测区域中的每个参考点。校准和样品粒子的动电粒子速度,上传/ 54577 / 54577eq2.jpg“/>和分别与它们的ζ电势, 和 ,如图方程1,假设如在维Smoluchowski近似12,20给出的两个之间的线性关系。为校准和样品的净ζ电势值是在粒子的ζ电位和膜ζ电位的差异, 。聚氨酯孔的ζ电位使用泳动电势的技术12,18为-11毫伏在PBS这项研究测定。
(1)
每个单个颗粒的zeta电位,I, 是时间后的细孔内的粒子的位置,T = x和是在相对位置长 x单个样品粒子i的粒子速度; , ,P和V是用于样品的每单位电压的电动速度,每单位压力的对流速度,施加的压力和电压下运行分别这个方程的一个完整的推导可以在工作由Blundell 等人的 19中找到。
当绑定捕获探针DNA的链亲和素包覆的纳米微粒,至关重要的是,研究人员去除留在溶液中多余的,未结合的捕获探针DNA。这是使用的SPP和一个简单的磁体允许快速和容易地更换新的PBST缓冲液上清液容易。如果过量捕捉DNA留在溶液和靶DNA添加,靶DNA可以结合到自由捕捉DNA在溶液中,而不是对SPP表面上。如果靶DNA结合到本粒子的表面上的捕获探针在粒子速度和ζ电位的变化会只被观察到。
分析并在使用TRPS可能需要使用一个以上的孔膜的许多天的大量样品的比较。一些孔可以具有在它们的大小,由于制造过程中和在这些情况下,一些小的差异,用户必须确保基线电流保持在所有る相同纳秒。如果观察到相同的基线电流,获得的结果是孔之间可比。一旦基线相同先前运行时,它是必要的用户保持拉伸校准和样品运行之间保持不变,以允许准确地确定颗粒易位速度的,因为它们穿过所述孔。
这些TRP技术有一个相对简单的设置,它可以在实验中很容易和快速拆卸。如果故障排除问题,这样可以使这一过程轻松了许多。例如,它不进行分析时允许在较低的流体细胞或上部流体细胞中的任何气泡是非常重要的。这将导致基线不稳定电流。如果气泡存在于上部流体细胞中,样品可以被移除和更换。如果气泡出现在下部流体细胞,缓冲器应当移除并用新鲜的缓冲液替换。如果气泡是一个老大难的问题,那么有可能是过多的表面活性剂在溶液中,以便这可能要降低16(我们只用0.05%吐温-20)。如果其尺寸超过孔径,或者如果样品的浓度过高一些样品可能会阻塞孔隙。为了改善这种情况,孔的大小可以通过增加的拉伸或可将样品稀释到较低的颗粒浓度16。为单粒子分析,所述样品也可能会阻塞孔隙,如果有大量的大的聚集体的存在,它是对涡旋重要,并通过TRPS运行前超声处理的样品。
除其他方法,TRPS具有各种优点,包括以完成同时单个颗粒的大小和电荷测量的能力;允许多样品以有效地使用该方法进行分析。一个优点是产生可以在几分钟被优化用于特定样品的信号/封锁通过简单地改变拉伸和电压,以获得一个封锁幅度,Δ</ EM> ,比背景噪声显著较大(封锁是nA的规模相比于背景噪声<10 PA)。能够改变孔的拉伸使得该方法在固态孔径技术更通用的孔径可相对于所讨论的分析物的大小来调整;调查的效果,如聚合和DNA-蛋白质结合,可能会导致在分析物的尺寸超过了原来的固态孔径范围时特别有用。 TRPS的另一个有利的方面是从技术的灵敏度的水平。根据靶DNA结合的位置(其中已加入的DNA的相同量(相同量加入电荷)和试样的大小相同的),以检测DNA中的细微差异的结合的能力,是在该领域的相当深刻分析将是为未来的纳米粒子实验设计平台大量使用。每一个细微的差别ENCE可以检测和利用TRPS技术的一个粒子通过粒子自然界分离。这种分析超过集合技术,如动态光散射或光子相关光谱法,这将仅仅量具刃具样本人群的平均分析和多式联运样品6,7的情况下,无法区分。
小的固态纳米孔(100-200纳米)也已用于监测粒子动力学和人已经发现,作为该颗粒的直径开始接近该纳米孔22,23的粒子的流动性可能会受到影响。纳米孔比被分析(如在本研究中使用)的颗粒大得多具有较少的对粒子的流动性和孔隙内的效果从而易位动力学。然而在这项研究中所用的孔被限制在他们的分析物的大小范围,例如一个NP150具有60-480纳米的尺寸范围,所以如果多峰样品内,超出这一组成粒子限制,它们不能在同一孔作为孔可接着被堵塞了分析。同样重要的是要注意,测量含有60和480nm的颗粒(那些在孔的绝对较低和较高的限制)的双峰样品,例如,将需要不同的拉伸和电压条件下,虽然两者都是大小分析范围内的孔。这是因为较大的颗粒所需要的拉伸会导致在具有特别小的封锁大小(基于电阻减小),可以一个样品运行期间被视为背景噪音,因此不一定测量的更小的颗粒。
气泡可以与样品测量作为在下部或上部流体细胞气泡将创建基线不稳定电流,向其中不能完成样品运行的问题。泡腾性质的电解质(一些高度浓缩的生物介质,例如)可能难以REQ运行,因此样本在这些特定的媒介uiring悬挂可能证明是有问题的。大多数样品然而,可以极大地稀释或悬浮于之前TRPS分析替代缓冲器。
该方法是适应性强并且可以用于分析一个范围基于纳米粒子的分析物,包括蛋白质,DNA,小分子,聚合试验17,24和生物相关微粒的分析。在表征广阔范围分析物TRPS的通用性示出了诸如药物递送1,25,生物传感26-28,以及环境试验的技术的范围内的领域的潜力。
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Disclosures
ELCJB由IZON科技有限公司的支持
Acknowledgments
作者感谢IZON科技有限公司的支持。这项工作是由欧洲委员会研究(PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
References
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