Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bestemmelse af Zeta Potentielle via Nanopartikel Translokation Hastigheder gennem en Tunable nanopore: Brug af DNA-modificerede Partikler som eksempel

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Her bruger vi en polyurethan afstemmelig nanopore integreret i en resistiv puls sensing teknik til at karakterisere nanopartikler overfladekemi via målingen af ​​partikel- translokation hastigheder, som kan anvendes til at bestemme zetapotentialet af individuelle nanopartikler.

Abstract

Nanopore teknologier, kendt kollektivt som Resistive Pulse sensorer (RPS), bliver brugt til at påvise, kvantificere og karakterisere proteiner, molekyler og nanopartikler. Tunable resistiv puls sensing (TRP) er en forholdsvis ny tilpasning til RPS, der inkorporerer en afstemmelig pore, der kan ændres i realtid. Her, bruger vi TRP at overvåge translokation tider af DNA-modificerede nanopartikler, når de krydser den afstembare pore membran som en funktion af DNA-koncentrationen og struktur (dvs. enkeltstrenget til dobbeltstrenget DNA).

TRP er baseret på to Ag / AgCl elektroder, adskilt af en elastomer pore membran, der etablerer en stabil ionstrømmen på en påført elektrisk felt. I modsætning til forskellige optiske-baserede partikel karakterisering teknologier, kan TRP karakterisere enkelte partikler blandt en stikprøve, der giver mulighed for multimodale prøver, der skal analyseres med lethed. Her viser vi Zetapotential målingervia partikel translokation hastigheder af kendte standarder og anvende disse til prøveanalyt translokation gange, hvilket resulterer i at måle zetapotentialet af disse analytter.

Samt erhvervelse middelværdier Zetapotential værdier prøverne alle målt ved anvendelse af en partikel-by-partikel perspektiv udviser mere information om en given prøve gennem prøven populationsfordelinger, f.eks. Af sådan, denne metode viser potentiale inden for sensing applikationer til både medicinske og miljømæssige område.

Introduction

Funktionaliserede nanopartikler bliver stadig mere populære som biosensorer i både medicinske og miljømæssige område. Evnen til at ændre en nanopartikel overflade kemi, med DNA, for eksempel, har vist sig nyttig til målrettet lægemiddelafgivelsessystemer 1 og overvågning DNA-protein-interaktioner 2-4. En stadig mere almindelig nanopartikel ejendom udnyttes i bioassays og i leveringen af terapi er superparamagnetisme 5. Superparamagnetiske partikler (SPPS) er særdeles nyttige i at identificere og fjerne specifikke analytter fra komplekse blandinger og kan gøre det med den simple brug af en enkelt magnet. Når fjernet, de analyt-bundne partikler kan karakteriseres og analyseres egnet til formålet.

Tidligere metoder til påvisning og karakterisering af nanopartikler omfatter optiske teknikker såsom dynamisk lysspredning (DLS), også kendt som fotonkorrelationsspektroskopi. Selv om en high throughput teknik, er DLS begrænset til at være en gennemsnitsberegning baseret teknik og ved analysering multimodale prøver uden tilsætning af specialiseret software, vil de større partikler producere en langt mere dominerende signal, efterlader nogle af de mindre partikler helt ubemærket 6,7. Partikel-by-partikel karakteriseringsteknikker er derfor meget mere gunstigt at analysere nanopartikler og funktionaliserede nanopartikel-systemer.

RPS baserede teknologier er baseret omkring påføring af et elektrisk felt til en prøve og kontrol transportmekanismen af ​​partiklerne gennem en syntetisk eller biologisk nanopore. En forholdsvis ny nanopartikel påvisning og karakterisering teknik baseret på RPS er justerbar resistiv puls sensing (TRP) 8-16. TRP er en to-elektrodesystem adskilt af en elastomer, afstemmelige pore membran. Afstemmelig pore fremgangsmåde muliggør analytter af en række af form 17 og størrelse, der skal måles via deres transport mekanismer gennem poren. Afstemmelige porer er tidligere blevet anvendt til påvisning af små partikler (70-95 nm diameter) producerer sammenlignelige resultater til andre teknikker, såsom transmissionselektronmikroskopi spektroskopi (TEM) 10. Når et elektrisk felt anvendes, er en ionisk strøm observeret og som partikler / molekyler passere gennem poren, de midlertidigt blokere pore, hvilket medfører en reduktion i strøm, der kan defineres som en "blokade begivenhed«. Hver blokade begivenhed repræsenterer en enkelt partikel, således at hver partikel i en prøve kan karakteriseres individuelt på basis af blokaden størrelsesorden, Δ ligning 1 Og fuld bredde halvt maksimum, FWHM, samt andre blokade egenskaber. Analysere individuelle partikler, når de passerer gennem en nanopore er fordelagtig til multimodale prøver som TRP succes og effektivt kan skelne en række partikelstørrelser amonGST en enkelt prøve. Tunable resistiv puls sensing fuldender størrelse 10, Zetapotential 12,18 og koncentration 15 målinger samtidig i en enkelt kørsel og kan derfor stadig skelne prøver af tilsvarende, hvis ikke den samme størrelse ved deres overfladeladning 19; en fordel i forhold alternative dimensionering teknikker.

Zeta potentiale defineres som det elektrostatiske potentiale på planet af shear 20, og beregnes ud fra partikelhastigheder, når de krydser en pore 19. Zeta potentielle målinger af de enkelte partikler giver således indsigt i de translokation mekanismer og adfærd nanopartikler systemer i opløsning, værdifulde oplysninger for fremtiden for nanopartikel assay design til en række applikationer. Partikel-by-partikel analyse af en sådan art giver også mulighed for udbredelsen og fordelingen af ​​zeta potentielle værdier blandt en stikprøve befolkningen til at blive udforsket, giver mulighed for mere information on reaktionskinetik (single-strandede til dobbeltstrenget DNA, for eksempel) og partikel stabiliteter i opløsning, der skal nås.

Her beskriver vi en teknik, der detekterer og karakteriserer både umodificerede og DNA-modificeret SPP overflader. Den heri beskrevne protokol for en række uorganiske og biologiske nanopartikler, men vi vise proceduren ved anvendelse af DNA-modificerede overflader på grund af deres brede vifte af anvendelser. Teknikken tillader brugeren at skelne mellem enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-mål på en nanopartikel overflade, baseret på partikel translokation hastigheder gennem et poresystem og dermed deres zeta potentialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gøre Fosfat saltvand med Tween-20 (PBST) Buffer

  1. Opløs en PBS tablet (0,01 M phosphatpuffer, 0,0027 M kaliumchlorid, 0,137 M natriumchlorid, pH 7,4) i 200 ml deioniseret vand (18,2 MOhm cm).
  2. Tilsættes 100 pi (0,05 (vol / vol)%) Tween-20 til 200 ml bufferopløsning som et overfladeaktivt middel.

2. Forberedelse carboxyl polystyren Partikel Standards

  1. Vortex kalibreringspartikler i 30 sek, før sonikering i 2 minutter ved 80 watt for at skabe monodispersitet af partiklerne.
  2. Fortynde kalibreringspartikler 1 i 100 til en koncentration på 1x10 10 partikler / ml i PBST-buffer og vortex i 30 sek.

3. Forberedelse af streptavidin-coatede partikler

  1. Vortex partiklerne i 30 sek, før sonikering i 2 minutter ved 80 watt for at sikre monodispersitet.
  2. Fortynde streptavidin overtrukne partikler 1 i 100 i PBST buffer til achieve en resulterende koncentration på 1x10 9 partikler / ml og vortex i 30 sek.
    Bemærk: En typisk prøvevolumen er 200 pi. For eksempel, hvis undersøgelse fem DNA-koncentrationer forberede 1 ml fortyndet streptavidin overtrukne partikler.

4. Fremstilling af oligonukleotider

  1. Rekonstituer oligonukleotider med deioniseret vand til en resulterende koncentration på 100 uM.

5. Tilsætning af Capture Probe (CP) DNA til streptavidin overtrukne partikler

  1. Forud for DNA-binding, vortex de streptavidinovertrukne partikler (200 pi prøve volumen) i 30 sekunder efterfulgt af en 2 min lydbehandling ved 80 watt.
  2. Baseret på bindingskapaciteten tilvejebragt af leverandøren (4.352 pmol / mg), tilsættes en passende koncentration af DNA til partiklerne for resulterende koncentrationer på 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, og 210 nM DNA.
  3. Vortex prøverne i 10 sek og sted på en roterende hjul ved stuetemperaturi 30 minutter for at tillade for DNA til at binde til partikeloverfladerne via et streptavidin-biotin-interaktion.
  4. Når indfangning DNA er blevet tilsat og inkuberet med streptavidin overtrukne partikler, fjerne det overskydende DNA i opløsning via magnetisk separation ved at placere prøverne på en magnetisk stativ i 30 min.
  5. Fjern supernatanten, pas på ikke at forstyrre det nydannede klynge af partikler tættest på magneten, og erstatte med den samme mængde af nye PBST buffer.

6. Hybridiserende Komplementær DNA til CP-partikler

  1. Tilføj den nødvendige mængde mål-DNA (over ved 500 nM) for at sikre den størst mulige mål binding blev nået.
  2. Vortex prøverne i 10 sek og sted på en roterende hjul ved stuetemperatur i 30 min.
  3. Når hybridiseringen er afsluttet, fjernes den overskydende mål-DNA via magnetisk separation ved at placere prøverne på en magnetisk stativ i 30 min.
  4. Fjern supernatanten, Pas på ikke at forstyrre det nydannede klynge af partikler tættest på magneten, og erstatte med den samme mængde af nye PBST buffer.
  5. Gentag trin 6.1 til 6.4 dobbelte prøver og placere disse prøver på en roterende hjul ved stuetemperatur i 16 timer for at undersøge DNA-hybridisering gange.

7. TRP Setup

  1. Tilslut instrumentet i et edb-system med software på plads.
  2. Kalibrere oprindelig forlængelse ved anvendelse af en skydelære.
    1. Måle afstanden mellem ydersiden af ​​to parallelle kæber.
    2. Input i softwaren ved at skrive stræk i den "stræk" feltet i fanen 'Instrument Settings "og klikke på" Kalibrer stretch' under fanen.
  3. Sideværts passe en polyurethan nanopore membran af passende dimensionering til analyse på kæberne med nanopore ID-nummer opad. Derefter strække kæberne til strækning kræves til analyse under anvendelse afstretch justering håndtag på siden af ​​instrumentet. Stræk kæberne mellem 43 og 48 mm.
    Bemærk: Den nøjagtige værdi af strækningen bestemmes sammen påtrykt spænding, således at blokader kalibrering partikel er mindst 0,3 nA i størrelse. Strækningen er allerede indlæst i softwaren i trin 7.2 og justerer automatisk som kæberne er strakt.
  4. Placer 80 pi PBST buffer i den nederste flydende celle, under nanopore, sikre, at der ikke er nogen bobler til stede, som kan påvirke målingen. Hvis der er bobler set, fjerne og udskifte bufferen.
  5. Klik på den øverste væske celle på plads og placere 40 pi buffer ind i det, igen sikre, at der ikke er nogen bobler til stede. Hvis der er luftbobler i det øvre fluid celle, fjerne dem ved at erstatte væsken.
  6. Når en reproducerbar baseline strøm er nået fra at erstatte den øverste væske celle med buffer, tilsættes 40 ul af prøven til den øverste væske celle og foranstaltning ved at klikke på 'start 'i' Data Acquisition 'fane på software skærmen.
    Bemærk: Købet data er afsluttet ved en frekvens på 50 kHz med en blokade størrelsesorden nedre grænse på 0,05 nA, selv om dette kan ændres ved hjælp af softwaren via fanen 'Analyse af data "(under' Analyse Indstillinger" og "Resistive Blokade«) .
  7. Placer et Faradays bur over toppen af ​​fluidet cellesystem til at reducere elektrisk baggrundsstøj på målingerne.
  8. Brug et variabelt tryk modul (VPM) for at anvende et tryk eller vakuum til prøverne.
    1. Hvis du vil anvende et ydre tryk forbinde dysen til den øverste væske celle, og drej trykket arm og klikker på plads (afhængigt af, om et positivt tryk (PRE) eller et vakuum (VAC) vil blive anvendt).
    2. Påfør tryk i en "cm" eller "mm" skala ved hjælp af trykket scenen knop ligger på toppen af ​​VPM. Tryk på knappen ned for at lægge pres på den "cm" skala og træk den opad to lægge pres på den "mm" skala.

8. Forberedelse Prøver til TRP Analysis

  1. Vortex prøver til 30 sek og soniker i 2 minutter ved 80 watt før TRP analyse.

9. Kalibrering af nanopore for Zeta Analysis

  1. Efter placering 40 pi kalibrering partikler (1x10 10 partikler / ml) i den øverste væske celle, udfyld en TRP måling (setup som i afsnit 7) ved 3 anvendte spændinger. Alter spændingen ved at klikke på '+' og '-' knapperne på spændingen skalaen i 'Instrument Settings' fane på softwaren.
  2. Kontroller, at de 3 spændinger returnere baggrundsstrømme på ca. 140, 110, og 80 nA. Sørg for, at på mellemspænding kalibrerings- partikler producerer en gennemsnitlig blokade størrelsesorden på mindst 0,3 nA.
  3. Påfør et tryk så gennemsnitlige fuld bredde halv maksimum på (FWHM) varigheder af kalibrerings-partikler er mindst0,15 msek. Gøre dette manuelt ved hjælp trykarmen fastgjort til variabelt tryk modulet. Vælg tryk (PRE) eller vakuum (VAC) ved at dreje armen, indtil det klikker på den ønskede position og anvendes i overensstemmelse hermed følgende opsætning instruktioner i trin 7.8.2. Når disse betingelser er opfyldt, starte kørslen ved at klikke på 'start' på softwaren i fanen 'dataopsamling.
  4. Gennemfør kørslen ved at trykke "stop" i fanen 'Data Acquisition', når mindst 500 partikler er blevet målt (se 'Particle Count "nederst af softwaren skærmen under måling) og kørslen har oversteget 30 sek (se' Run Time 'også mod bunden af ​​skærmen).
  5. Kalibrere systemet ved at udfylde en kalibrering køre som beskrevet, hver gang en ny nanopore indføres eller for hver ny dag i analyse ved at fuldføre trin 9,1-9,4.

10. Løb en prøve

  1. Kør prøverne ved den højeste ellernæsthøjeste spænding som kalibreringsprøverne sikre en tilsvarende (± 10 nA), hvis ikke det samme, baseline strøm.
    1. Når den relevante baseline strøm opnås, udskifte elektrolytten i det øvre fluid celle med 40 pi prøve. Når en prøve indføres, vil blokader ses på signalet spor. Start prøven køres ved at klikke på 'Start' i fanebladet 'Data Acquisition "og optage mindst 500 partikler (tjek" Particle Count' placeret under signal spor) og sikre køretid er minimum 30 sek (se 'Run Time 'også ligger under signal spor).
    2. For at fuldende målingen, skal du klikke på "stop" i 'Data Acquisition fanen' og gemme datafilen.
  2. Hvis du vil gemme filen, input filoplysningerne i følgende format; 'Undersøgelse' er den mappe filen skal gemmes i, "nanopore ID 'er serienummeret på den pore bliver brugt," Part #' ier den type pore (dvs. NP150 / NP200), "prøve-ID 'er navnet på prøven," Kalibrering eller prøve' detaljer, om det er en kalibrering eller prøve måling, der anvendes »udvanding«, hvis prøven blev fortyndet ( skriv 100, hvis prøven blev fortyndet 100 gange), »tryk« er det påførte tryk til prøven (i cm - se afsnit 7.8), »Elektrolyt id" er navnet på den buffer prøve sammensættes i, og ' noter 'er personlige noter om prøven eller løb.
  3. Mellem hver prøve sigt vaske systemet ved at placere 40 pi PBST-buffer i den øvre fluidcellen flere gange og anvende forskellige tryk (sædvanligvis ved -10, -5 cm (vakuum) og 5 og 10 cm (positiv tryk)), indtil ikke flere blokade begivenheder er til stede, sikre, at der ikke er nogen tilbageværende partikler tilbage i systemet, og derfor ingen krydskontaminering mellem prøver. Køre prøver i tre eksemplarer med dette vasketrin afsluttet mellem hver gentagen prøve køres som welll mellem forskellige prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

figur 1
Figur 1. Skematisk gengivelse af de processer af magnetisk oprensning og en TRP måling. A) Eksempel på magnetisk oprensning af prøve startende med en prøve indeholdende overskud, ubundet indfangningsprobe DNA. B) TRP måling eksempel i) Particle passerer gennem nanopore og ii) Blockade begivenhed fremstillet af partikel midlertidigt okkluderende ioner i pore forårsager et midlertidigt fald i strøm; Oplysninger fra som bruges til at beregne partikel translokation hastigheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fjernelse af overskydende DNA, der er ikke bundet til partiklerne overflade fra prøverne er vigtig forud for TRP analyse, for ikke at indberette enhver"falsk-positive resultater. Muligheden for at bruge en magnet til at udtrække og vaske SPPs er en enorm fordel for TRP (figur 1A). Figur 1B beskriver et grundlæggende eksempel på et TRP måling og et eksempel »blokade begivenhed« opnået som en partikel bevæger sig gennem pore. For det første har vi påvist, at TRP er et højt gennemløb teknik, der kan skelne mellem prøver af samme størrelse, men af ​​en væsentlig anderledes ladning. Dens evne til at fuldføre både størrelse og ladning analyse samtidigt i en enkelt måling kan ses i figur 2. Figur 2 er et eksempel på a) størrelse og b) zetapotentialet analyse af streptavidin coatede partikler uden ændringer (lyserødt datasæt), og streptavidinovertrukne partikler mættet med enkeltstrenget DNA på overfladen (blå datasæt). Selvom begge prøver var af samme størrelse, zetapotentialet var signifikant forskellig og meget større, når DNA var functionalized på partiklens overflade.

Figur 2
Figur 2. Størrelse og Zetapotentialet analyse af DNA-modificeret og umodificeret streptavidinovertrukne nanopartikler. De lyserøde søjler repræsenterer umodificerede streptavidin coatede partikler og de blå søjler repræsenterer DNA-modificerede partikler. A) Frekvens (%) versus partikeldiameter (nm). B) Frekvens (%) vs zetapotentialet (mV). Figur tilpasset fra supplerende data i Blundell et al. 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Ikke alene kan teknikken skelne mellem partikler umodificerede og modificerede med DNA, kan TRP også skelne mellem prøver med forskellige koncentrationer af DNA hybridiseret til parikel overflade. Figur 3 viser størrelse og zeta potentielle data udstillet for prøver med den laveste (10 nm, lysegrøn data sæt) og højeste (210 nM, blå datasæt) koncentrationer af DNA hybridiseret til streptavidinovertrukne partikler. En større zeta potentiel værdi registreres for partikler hybridiseret med en højere koncentration af DNA.

Figur 3
Figur 3. Samtidig størrelse og zeta potentielle data erobret fra en enkelt TRP måling. De blå søjler / datapunkter er repræsentative for streptavidin partikler hybridiseret med 210 nM CP-DNA og lysegrønne søjler / datapunkter repræsenterer streptavidinovertrukne partikler hybridiseret med 10 nM CP-DNA. Figur tilpasset fra Blundell et al. 19. Klik her for at seen større version af denne figur.

Det er nyttigt at bemærke, at hvert datapunkt i scatter plot repræsenterer en enkelt partikel blandt en stikprøve, hvilket muliggør indgående partikel-by-partikel-analyse med hver prøve. Figur 4 understøtter teknikkens effektivitet ved fastsættelsen mindre ændringer i DNA-struktur ( enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA), samt at identificere forskelle i prøver med mål-DNA af samme størrelse, men bundet til et andet område af indfangningsproben viser høje niveauer af følsomhed (dvs. Mellemøsten bindende og End bindende mål vist i figur 4). De i figur 4 partikler er dem med de følgende overflademodifikationer fra venstre mod højre; opfangningsprobe (CP) DNA kun, CP og et fuldt komplementær DNA-mål, CP og en midt bindende DNA-mål, CP og en afslutning bindende DNA-mål, CP og en overhængende DNA-mål.


. Figur 4. Relativ ændring i zetapotentialet målt for DNA-modificerede partikler med en række DNA-mål Ændring i zetapotentialet, mV, fra i) CP funktionaliseret partikel til en række DNA-mål; ii) Fuldt komplementære, iii) Mellemøsten binding, iv) end binding, v) udhængende mål. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen hvor n = 3. Figur tilpasset fra Blundell et al. 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beregningen for zetapotentialet anvendes en kalibrering baseret metode relateret til arbejde ved Arjmandi et al. 21. Varigheden af ​​translokationen af ​​partikler, når de krydser en nanopore måles som en funktion af påtrykt spænding, ved hjælp af en gennemsnitlig elektriske felt og partikelhastigheder priserne i hele en regelmæssig konisk pore. Den elektroforetiske mobilitet er differentialkvotienten af 1 / T (hvor T er blokaden varighed) med hensyn til spænding multipliceret med kvadratet på følezonen længde, l. Gennemsnitlige hastigheder på flere referencepunkter gennem sensing zone måles at give mulighed for minimal fejl i beregningen af ​​zeta potentiale ved hjælp af denne metode.

Kalibreringen af pore er baseret på lineariteten af 1 / T vs spænding, V, i hvert referencepunkt i følezonen. De elektrokinetiske partikel hastigheder af kalibrering og prøve partikler,upload / 54.577 / 54577eq2.jpg "/> og ligning 3 henholdsvis er relateret til deres zeta potentialer, ligning 4 og ligning 5 Som vist i ligning 1, under forudsætning af en lineær relation mellem de to som angivet i Smoluchowski tilnærmelse 12,20. De netto Zetapotential værdier for både kalibrering og prøve er forskellene i partikel zeta-potentialet og membranen zetapotentialet, ligning 6 . Zetapotentialet af polyurethan pore blev målt ved anvendelse streaming potentielle teknikker 12,18 som -11 mV i PBS til denne undersøgelse.

ligning 7 (1)

Zetapotentialet enkelte partikel, i, ligning 8 er positionen af partiklen inden pore på gang, t = t x, og ligning 10 er partiklens hastighed enkelt prøve partikel I ved relative positioner l x; ligning 12 , ligning 14 , P og V er elektrokinetisk hastighed pr spænding, konvektive hastighed pr tryk, påført tryk og spænding for prøven løber henholdsvis en fuld afledning af denne ligning kan findes i arbejdet af Blundell et al. 19.

ligning 16

Når binding indfangningsproben DNA til de streptavidinovertrukne nanopartikler, er det afgørende, at forskeren fjerner overskydende, ubundet indfangningsprobe DNA efterlades i opløsning. Dette gøres nemt ved hjælp af SPPs og en enkel magnet der muliggør en hurtig og nem udskiftning af supernatanten med nye PBST buffer. Hvis overskydende capture DNA efterlades i opløsning og mål-DNA tilsat, mål-DNA kan binde til frie capture DNA i opløsning, snarere end på SPP overflade. En ændring i partikelhastighed og zeta potentiale vil kun observeres, hvis mål-DNA'et binder til indfangningsproben stede på partiklens overflade.

Analyse og sammenligning af et stort antal prøver på tværs af mange dage under anvendelse TRP kan kræve brug af mere end en pore membran. Nogle porer kan have nogle mindre forskelle i deres størrelse på grund af fremstillingsprocessen og i disse tilfælde, at brugeren skal sikre baseline strøm forbliver identisk på tværs af alle runs. Hvis der observeres den samme baseline strøm, de opnåede resultater er sammenlignelige mellem porerne. Når basislinjen er det samme som tidligere kørsler, er det bydende nødvendigt, at brugeren holder strækning uændret mellem kalibrerings- og prøve løber for at muliggøre nøjagtig bestemmelse af partikel translokation hastigheder, når de krydser pore.

Den TRP teknologi har en forholdsvis enkel opsætning, som kan skilles ad nemt og hurtigt under et eksperiment. Hvis fejlfinding problemer, kan det gøre processen meget lettere. For eksempel er det vigtigt ikke at tillade eventuelle bobler i den nedre fluid celle eller øvre fluidumcelle Under gennemførelsen. Dette vil føre til en ustabil baseline strøm. Hvis bobler i den øverste væske celle, kan prøven fjernes og erstattes. Hvis bobler i det nederste væske celle, bør bufferen fjernes og erstattes med frisk puffer. Hvis boblerne er et vedvarende problem, så kan der være for meget tensidi opløsningen så dette kan være nødvendigt at reducere 16 (vi bruger kun 0,05% Tween-20). Nogle prøver kan blokere pore hvis deres størrelse overstiger porestørrelsen eller hvis koncentrationen af ​​prøven er for høj. At afhjælpe dette, kan porestørrelsen forøges ved at forøge strækket eller prøven kan fortyndes til en lavere partikelkoncentration 16. For enkelt partikel analyse, kan prøven også blokere pore, hvis der er en masse store aggregater til stede, er det vigtigt at vortex og sonikeres prøven før du kører det gennem TRP.

Blandt andre fremgangsmåder, TRP har forskellige fordele, herunder evnen til at fuldføre størrelse og ladning målinger af individuelle partikler samtidigt; giver mulighed for multimodale prøver, der skal analyseres effektivt ved hjælp af denne metode. En fordel er signal / blokader produceret kan optimeres i minutter for en bestemt prøve ved blot at ændre stræk og spændingen indtil en blokade størrelsesorden, Δ </ Em> ligning 1 , Betydeligt større end baggrundsstøjen (blokade er af nA skala i forhold til baggrundsstøjen <10 Pa). At kunne ændre den strækning af pore gør fremgangsmåden mere alsidig i solid-state pore teknik som porestørrelsen kan justeres med hensyn til størrelsen af ​​den pågældende analyt; særlig nyttig når han undersøger effekter såsom aggregering og DNA-proteinbinding, som kan resultere i analyt størrelser overskrider den oprindelige solid-state porestørrelsesområde. Et andet fordelagtigt aspekt af TRP er niveauet af følsomhed fra teknikken. Evnen til at detektere små forskelle i DNA-binding (hvor den samme mængde DNA er blevet tilsat (samme mængde af tilsat gebyr) og prøverne er af samme størrelse) baseret på positionen af ​​mål-DNA binding er ganske dybtgående i dette område af analyse og vil være til stor nytte for fremtidige nanopartikel-assay design platforme. Hver subtil adskillerdelse kan detekteres og isoleres under anvendelse af en partikel-by-partikel karakter TRP teknologi. Denne analyse overstiger værdien af ensemble teknikker såsom dynamisk lysspredning eller fotonkorrelationsspektroskopi, der blot vil gage et gennemsnit af prøven populationen analyseres og kan ikke differentiere i tilfælde af multimodale prøver 6,7.

Små solid state nanopores (100-200 nm) er også blevet anvendt til at overvåge partikeldynamik og har fundet, at partikel mobilitet kan påvirkes som diameteren af partiklen begynder at nærme sig den nanopore 22,23. Nanopores meget større end de partikler analyseres (som anvendt i denne undersøgelse) har en mindre virkning på mobiliteten partiklen og dermed translokation dynamik i pore. Porerne, der anvendes i denne undersøgelse er imidlertid begrænset til deres analyt størrelsesintervaller, et NP150 f.eks har et størrelsesområde fra 60 til 480 nm, så hvis en multimodal prøve bestod af partikler i og overstiger dettegrænse, kan de ikke analyseres samme pore som pore kan så blive blokeret. Det er også vigtigt at bemærke, at måle en bimodal prøve indeholdende 60 og 480 nm partikler (dem på de absolutte lavere og højere grænser for pore), for eksempel, vil kræve forskellige stretch og spænding betingelser, selv om begge er inden for størrelsesanalyse interval af poren. Dette skyldes, at strækning kræves for de større partikler vil resultere i de mindre partikler med en særligt lille blokade størrelsesorden (baseret på den reducerede resistens), der kan betragtes som baggrundsstøj og dermed ikke nødvendigvis målt under en prøve løb.

Bobler kan være et problem med prøven målinger som bobler i den nedre eller øvre væske celle vil skabe en ustabil baseline strøm, hvortil prøve kørsler ikke kan gennemføres. Elektrolytter af en brusende karakter (nogle stærkt koncentrerede biologiske medier, for eksempel) kan være vanskeligt at køre og dermed prøver requiring suspension i disse specifikke medier kan vise sig problematisk. De fleste prøver kan dog langt fortyndes eller suspenderes i alternative buffere før TRP analyse.

Fremgangsmåden er fleksibel og kan anvendes til at analysere en række nanopartikel-baserede analytter, herunder en analyse af proteiner, DNA, små molekyler, aggregation assays 17,24 og biologisk relevante partikler. Alsidigheden i TRP i kendetegner en bred vifte af analytter viser de teknikker potentiale i en række områder såsom drug delivery 1,25, biosensorer 26-28, og miljøtest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ELCJB er støttet af Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Forfatterne takker Izon Science Ltd for deres støtte. Arbejdet blev støttet af Europa-Kommissionen for forskning (PCIG11-GA-2012 til 321.836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
  2. Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
  3. Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
  4. Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
  5. Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
  6. Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
  7. Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
  8. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
  9. Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
  10. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
  11. Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
  12. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
  13. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
  14. Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
  15. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
  16. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
  17. Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
  18. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
  19. Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
  20. Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
  21. Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
  22. Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
  23. Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
  24. Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
  25. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
  26. Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
  27. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  28. Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).

Tags

Bioengineering biosensor TRP nanopore Zeta potentielle DNA superparamagnetiske partikler
Bestemmelse af Zeta Potentielle via Nanopartikel Translokation Hastigheder gennem en Tunable nanopore: Brug af DNA-modificerede Partikler som eksempel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R.,… More

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example. J. Vis. Exp. (116), e54577, doi:10.3791/54577 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter