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Bioengineering

Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d'ADN modifié comme un exemple

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Ici, nous utilisons un nanopore accordable en polyuréthane intégré dans une technique de détection d'impulsions résistif pour caractériser les nanoparticules de la chimie de surface par la mesure des vitesses de translocation de particules, qui peut être utilisé pour déterminer le potentiel zéta des nanoparticules individuelles.

Abstract

technologies de Nanopore, connus collectivement comme capteurs de pulsations résistifs (RPS), sont utilisées pour détecter, quantifier et caractériser les protéines, les molécules et les nanoparticules. détection d'impulsion résistive accordable (de TRPS) est une adaptation relativement récente au RPS qui incorpore un pore accordable peut être modifiée en temps réel. Ici, nous utilisons TRPS pour surveiller les temps de translocation des nanoparticules d'ADN modifiées comme ils traversent la membrane poreuse réglable en fonction de la concentration d'ADN et de la structure ( par exemple, simple brin en ADN double brin).

TRPS repose sur deux électrodes Ag / AgCl, séparés par une membrane poreuse en élastomère qui établit un courant ionique stable lors d'un champ électrique appliqué. Contrairement à diverses technologies de caractérisation des particules optiques à base, TRPS peuvent caractériser des particules individuelles dans une population de l'échantillon, ce qui permet pour les échantillons multimodales à analyser avec facilité. Ici, nous démontrons mesures du potentiel zêtavia des vitesses de translocation de particules de normes connues et les appliquer à l'échantillon des temps de translocation analyte, conduisant ainsi à la mesure du potentiel zeta de ces analytes.

En plus d'acquérir des valeurs de potentiel zêta moyennes, les échantillons sont tous mesurés en utilisant une perspective particule par particule présentant plus d'informations sur un échantillon donné par l'échantillon répartition de la population, par exemple. De ce fait, cette méthode démontre un potentiel dans les applications de détection pour les domaines médicaux et environnementaux.

Introduction

nanoparticules fonctionnalisés sont de plus en plus populaire en tant que biocapteurs dans les deux domaines de la médecine et de l'environnement. La possibilité de modifier la chimie de surface d'une nanoparticule, avec de l' ADN, par exemple, se révèle utile pour les systèmes de délivrance de médicaments ciblés 1 et de suivi des interactions ADN-protéines 2-4. Une propriété de nanoparticules de plus en plus commun étant utilisé dans des essais biologiques et dans la prestation de produits thérapeutiques est superparamagnétisme 5. particules superparamagnétiques (SPPS) sont extrêmement utiles pour identifier et éliminer les analytes spécifiques à partir de mélanges complexes et peuvent le faire avec la simple utilisation d'un seul aimant. Une fois enlevés, les particules d'analyte lié peuvent être caractérisés et analysés adaptés à l'usage.

Les procédés antérieurs utilisés pour la détection et la caractérisation des nanoparticules comprennent des techniques optiques telles que la diffusion dynamique de lumière (DLS), autrement connu comme la spectroscopie de corrélation de photons. Bien qu'un saluttechnique de débit gh, DLS est limitée à être une technique basée sur la moyenne et lors de l' analyse des échantillons multimodaux sans ajout de logiciels spécialisés, les plus grosses particules produisent un signal beaucoup plus dominante, laissant certaines des plus petites particules complètement inaperçues 6,7. Particule par particule techniques de caractérisation sont donc beaucoup plus favorable pour analyser nanoparticule et les systèmes de nanoparticules fonctionnalisés.

technologies basées RPS sont basés sur l'application d'un champ électrique à un échantillon et la surveillance du mécanisme de transport des particules à travers un nanopore synthétique ou biologique. Une technique relativement récente de détection de nanoparticules et la caractérisation basée sur RPS est résistive accordable impulsion de détection (TRPS) 8-16. TRPS est un système à deux électrodes séparées par une membrane poreuse en élastomère, accordable. Une méthode accordable de pores permet analytes d'une gamme de forme 17 et la taille à mesurer via leur transdes mécanismes de port à travers les pores. Les pores accordables ont déjà été utilisés pour la détection de petites particules (diamètre 70-95 nm) produisant des résultats comparables à d' autres techniques telles que la spectroscopie électronique à transmission (MET) 10. Lorsqu'un champ électrique est appliqué, un courant ionique est observé et que des particules / molécules passent à travers les pores, ils bloquent temporairement les pores, ce qui provoque une réduction du courant qui peut être défini comme un «événement de blocage. Chaque événement de blocus est représentatif d'une seule particule de sorte que chaque particule dans un échantillon peut être caractérisé individuellement en fonction de l'ampleur du blocus, Δ L'équation 1 Et toute la largeur à mi-hauteur, LMH, ainsi que d' autres propriétés de blocus. L'analyse des particules individuelles lors de leur passage à travers un nanopore est avantageux pour les échantillons multimodales comme TRPS peuvent réussir et efficacement distinguer une gamme de tailles de particules amongst un seul échantillon. Accordable détection d'impulsion résistive complète taille 10, zeta potentiels 12,18 et la concentration de 15 mesures simultanément en une seule opération et peut donc différencier encore des échantillons de semblable, sinon la même taille par leur charge de surface 19; un avantage par rapport aux techniques de dimensionnement alternatives.

Le potentiel zêta est défini comme étant le potentiel électrostatique au niveau du plan de cisaillement 20, et elle est calculée à partir des vitesses de particules comme ils traversent un pore 19. mesures de potentiel Zeta de particules individuelles donne ainsi un aperçu des mécanismes et le comportement des systèmes de nanoparticules en solution, de précieuses informations pour l'avenir des modèles de test de nanoparticules pour une gamme d'applications translocation. analyse de particules par particule de cette nature permet également la diffusion et la distribution des valeurs de potentiel zêta parmi un échantillon de population à explorer, permettant plus d'informations ocinétique n de réaction (simple brin à l'ADN double brin, par exemple) et des stabilités de particules en solution à atteindre.

Ici, nous décrivons une technique qui détecte et caractérise les deux surfaces SPP non modifiées et modifiées par l'ADN. Le protocole décrit ici est applicable à toute une gamme de nanoparticules inorganiques et biologiques, mais nous démontrons la procédure en utilisant des surfaces d'ADN modifiées en raison de leur large éventail d'applications. Cette technique permet à l'utilisateur de distinguer entre les cibles d'ADN simple brin et double brin sur une surface nanoparticulaire, sur la base des vitesses de translocation de particules à travers un système de pores et donc leurs potentiels zêta.

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Protocol

1. Faire de la saline tamponnée au phosphate avec du Tween-20 (PBST) Buffer

  1. Dissoudre un comprimé de PBS (0,01 M tampon phosphate 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4) dans 200 ml d'eau déminéralisée (18,2 MQ cm).
  2. Ajouter 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 à la solution tampon de 200 ml en tant que tensio-actif.

2. Préparation des normes de particules Carboxyl Polystyrène

  1. Vortexer les particules d'étalonnage pendant 30 secondes avant la sonification pendant 2 minutes à 80 watts pour créer monodispersité des particules.
  2. Diluer les particules d'étalonnage à 1 100 à une concentration de 1x10 10 particules / ml dans un tampon PBST et vortexer pendant 30 secondes.

3. Préparation des particules recouvertes de streptavidine

  1. Vortex les particules pendant 30 secondes avant sonication pendant 2 min à 80 watts pour assurer monodispersité.
  2. Diluer les particules revêtues de streptavidine 1 à 100 dans un tampon PBST à courant alternatifHieve une concentration résultante de 1x10 9 particules / ml et vortexer pendant 30 secondes.
    Remarque: Un volume d'échantillon typique est de 200 ul. Par exemple, si l'instruction cinq concentrations d'ADN préparer 1 ml de particules revêtues de streptavidine diluées.

4. Préparation d'oligonucléotides

  1. Reconstituer oligonucléotides avec de l'eau déminéralisée à une concentration résultante de 100 uM.

5. Ajout de capture de la sonde (CP) de l'ADN aux particules recouvertes de streptavidine

  1. Avant de liaison à l'ADN, vortex les streptavidine particules enrobées (200 volumes d'échantillon pi) pendant 30 secondes, suivie d'une 2 min sonication à 80 watts.
  2. Sur la base de la capacité de liaison fournie par le fournisseur (4352 pmol / mg), d'ajouter la concentration appropriée de l'ADN aux particules pour les concentrations résultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nM d'ADN.
  3. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiantependant 30 minutes pour permettre à l'ADN de se lier aux surfaces des particules par l'intermédiaire d'une interaction streptavidine-biotine.
  4. Une fois que l'ADN de capture a été ajouté et mis en incubation avec les particules revêtues de streptavidine, éliminer l'excès d'ADN en solution par l'intermédiaire d'une séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min.
  5. Retirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l'aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST.

6. Hybridation ADN complémentaire aux CP-particules

  1. Ajouter la quantité requise de l'ADN cible (en excès à 500 nM) pour assurer la liaison a été atteint la cible maximale possible.
  2. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiante pendant 30 min.
  3. Une fois que l'hybridation est terminée, retirez l'ADN cible en excès par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min.
  4. Retirer le surnageant, En prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l'aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST.
  5. Répétez les étapes 6.1 à 6.4 pour les échantillons en double et placer ces échantillons sur une roue rotative à la température ambiante pendant 16 heures pour étudier les temps d'hybridation d'ADN.

Configuration 7. TRPS

  1. Branchez l'appareil dans un système informatique avec le logiciel en place.
  2. Calibrer le tronçon initial à l'aide d'un étrier.
    1. Mesurer la distance entre l'extérieur des deux mâchoires parallèles.
    2. Entrée dans le logiciel en tapant l'étirement dans le champ «stretch» ​​dans l'onglet «Paramètres Instrument et en cliquant sur« Calibrer stretch 'sous l'onglet.
  3. Latéralement adapter une membrane de polyuréthane nanopore de dimensionnement approprié pour l'analyse sur les mâchoires avec le nombre nanopore ID vers le haut. Ensuite, étirer les mâchoires à l'étirement nécessaire à l'analyse à l'aide duPoignée de réglage extensible sur le côté de l'instrument. Étirez les mâchoires entre 43 et 48 mm.
    Note: La valeur exacte de l'étendue est déterminée aux côtés de la tension appliquée afin que les blocages d'étalonnage de particules sont au moins 0,3 nA en taille. Le tronçon est déjà entré dans le logiciel à l'étape 7.2 et ajustera automatiquement les mâchoires sont tendues.
  4. Placez 80 pi de tampon PBST dans la cellule fluide inférieure, sous le nanopore, assurant qu'il n'y a pas de bulles présentes qui peuvent affecter la mesure. S'il y a des bulles vu, enlever et remplacer le tampon.
  5. Cliquez sur la cellule de fluide supérieure en place et placer 40 ul de tampon en elle, assurant à nouveau il n'y a pas de bulles présente. Si des bulles sont présentes dans la cellule fluide supérieur, retirez-les en remplaçant le liquide.
  6. Lorsqu'un courant de référence reproductible a été atteint de remplacer la cellule de fluide supérieure avec un tampon, ajouter 40 ul de l'échantillon dans la cellule de mesure de fluide supérieure et en cliquant sur "start "dans l'onglet" Data Acquisition "sur l'écran du logiciel.
    Remarque: L'acquisition des données est terminée à une fréquence de 50 kHz avec une limite d'une magnitude de blocage inférieure de 0,05 nA, même si cela peut être modifié à l'aide du logiciel via l'onglet 'Analyse de données' (sous la rubrique «Paramètres d'analyse» et «Resistive Blockades ') .
  7. Placer une cage de Faraday sur la partie supérieure du système de cellules de fluide pour réduire le bruit de fond électrique sur les mesures.
  8. Utilisez un module de pression variable (VPM) pour appliquer une pression ou un aspirateur pour les échantillons.
    1. Pour appliquer une pression externe Brancher la buse sur la cellule fluide supérieur, puis tourner le bras de pression et cliquez en place (selon que la pression positive (PRE) ou un vide (VAC) seront appliqués).
    2. Appliquer une pression dans un «cm» ou échelle »mm» en utilisant le bouton de niveau de pression situé sur le haut de la VPM. Appuyez sur le bouton vers le bas pour appliquer une pression sur l'échelle «cm» et tirer vers le haut to appliquer une pression sur l'échelle 'mm'.

8. Préparation des échantillons pour l'analyse de TRPS

  1. échantillons Vortex pendant 30 secondes et sonication pendant 2 min à 80 watts avant l'analyse de TRPS.

9. Calibrage de l'Nanopore pour l'analyse Zeta

  1. Après avoir placé 40 particules d'étalonnage ul (1x10 10 particules / ml) dans la cellule fluide supérieur, effectuer une mesure de TRPS (configuration comme dans la section 7) à 3 tensions appliquées. Modifiez la tension en cliquant sur le '+' et '-' des boutons sur l'échelle de tension dans l'onglet "Paramètres Instrument sur le logiciel.
  2. Vérifiez que les 3 tensions retour courants d'environ 140, 110 arrière-plan, et 80 nA. Veiller à ce que, à la tension moyenne des particules d'étalonnage produisent une magnitude de blocage moyenne d'au moins 0,3 nA.
  3. Appliquer une pression de sorte que la moitié pleine largeur maximale moyenne (FWHM) durées des particules d'étalonnage sont au moins0,15 ms. Pour ce faire manuellement à l'aide du bras de pression fixé au module de pression variable. Sélectionnez la pression (PRE) ou vide (VAC) en faisant tourner le bras jusqu'à ce qu'il clique dans la position désirée et appliquer en conséquence ce qui suit a mis en place des instructions à l'étape 7.8.2. Une fois que ces conditions ont été atteints, commencer la course en cliquant sur «start» sur le logiciel dans l'onglet «Acquisition des données».
  4. Terminez la course en appuyant sur «stop» dans l'onglet «Acquisition des données» quand au moins 500 particules ont été mesurées (voir «comte de particules" au bas de l'écran du logiciel lors de la mesure) et la course a dépassé 30 sec (voir ' Run Time 'également vers le bas de l'écran).
  5. Calibrer le système en remplissant une course d'étalonnage comme indiqué chaque fois qu'une nouvelle nanopore est introduite ou pour chaque nouveau jour de l'analyse en remplissant étape 9.1-9.4.

10. Exécution d'un échantillon

  1. Exécutez les échantillons au plus haut oudeuxième tension la plus élevée que les échantillons d'étalonnage à assurer un similaire (± 10 nA), sinon le même, le courant de référence.
    1. Une fois que le courant de référence approprié est atteint, remplacer l'électrolyte dans la cellule de fluide supérieure à 40 pl de l'échantillon. Quand un échantillon est introduit, les blocages seront visibles sur la trace du signal. Démarrez l'échantillon exécuter en cliquant sur 'start' dans l'onglet "Data Acquisition" et enregistrer un minimum de 500 particules (cocher «nombre de particules» situé sous la trace du signal) et assurer le temps d'exécution est un minimum de 30 secondes (voir 'Run Time 'également situé au-dessous de la trace du signal).
    2. Pour terminer la mesure, cliquez sur «stop» dans l'onglet "Data Acquisition" et enregistrez le fichier de données.
  2. Pour enregistrer le fichier, saisissez les informations de fichier dans le format suivant; «Enquête» est le dossier le fichier sera enregistré dans, 'Nanopore ID' est le numéro de série du pore utilisé, 'Part #' iest le type de pores (ie, NP150 / NP200), «ID échantillon» est le nom de l'échantillon, 'étalonnage ou de l' échantillon "détails si elle est une mesure d'étalonnage ou de l' échantillon,« Dilution »est utilisé si l'échantillon a été dilué ( tapez 100 si l'échantillon a été dilué 100 fois), «pression» est la pression appliquée à l'échantillon (en cm - voir la section 7.8), 'Electrolyte ID' est le nom de la mémoire tampon de l'échantillon est composé de, et ' Remarques »sont des notes personnelles sur l'échantillon ou courir.
  3. Entre chaque échantillon run, laver le système en plaçant 40 pl de PBST tampon dans la cellule fluide supérieur à plusieurs reprises et en appliquant différentes pressions (habituellement à -10, -5 cm (vide), et 5 et 10 cm (à pression positive)) jusqu'à ce que pas plus d'événements de blocus sont présents, assurant qu'il n'y a pas de particules résiduelles dans le système, et donc pas de contamination croisée entre les échantillons. échantillons en triple avec cette étape de lavage terminé entre chaque échantillon de répétition fonctionnent comme well entre différents échantillons.

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Representative Results

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique des procédés de purification magnétique et une mesure de TRPS. A) Exemple de purification magnétique de l' échantillon à partir d'un échantillon contenant un excès, l' ADN de sonde de capture non lié. B) TRPS exemple de mesure i) des particules passant par le nanopore et ii) événement Blockade produite à partir de particules d' ions occlusifs temporairement dans les pores provoquant une diminution temporaire en cours; Informations qui est utilisée pour calculer les vitesses de translocation de particules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'élimination de tout excès d'ADN qui n'a pas été lié à la surface des particules à partir des échantillons est important, avant l'analyse de TRPS, pour ne pas signaler touterésultats «faux positifs». La possibilité d'utiliser un aimant pour extraire et laver les RRS est un énorme avantage pour TRPS (figure 1A). Figure 1B décrit un exemple de base d'une mesure de TRPS et un exemple 'événement de blocus »réalisé comme une particule traverse le pore. Tout d'abord, nous avons démontré que TRPS est une technique à haut débit qui permet de distinguer entre les échantillons d'une taille similaire, mais d'une charge considérablement différente. Sa capacité à compléter la taille et la charge à la fois l' analyse simultanément dans une seule mesure peut être vu dans la figure 2. La figure 2 est un exemple de a) la taille et b) analyse du potentiel zeta de streptavidine particules enrobées sans modifications (ensemble de données rose clair) et particules revêtues de streptavidine saturées avec de l'ADN simple brin sur la surface (ensemble de données bleu). Bien que les deux échantillons étaient d'une taille similaire, le potentiel zêta a été significativement différent et beaucoup plus important lorsque l'ADN est fonctionalized sur la surface de la particule.

Figure 2
Figure 2. La taille et la Zeta analyse du potentiel des nanoparticules d'ADN modifiée et de la streptavidine non modifié revêtu. Les barres rose clair représentent des particules enrobées de streptavidine non modifiés et les barres bleues représentent des particules d'ADN modifié. A) Fréquence (%) vs diamètre de particule (nm). B) Fréquence (%) vs potentiel zêta (mV). Figure adaptation de données supplémentaires dans Blundell et al. 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Non seulement la technique de la différence entre les particules non modifiées et modifiées avec de l'ADN, TRPS peut également différencier les échantillons contenant différentes concentrations d'ADN hybride à la normaleticle surface. La figure 3 montre la taille et zeta données potentielles exposées pour les échantillons ayant la plus faible (10 nM, ensemble de données vert clair) et le plus élevé (210 nM, ensemble de données bleu) concentrations d'ADN hybridées aux particules revêtues de streptavidine. Une valeur plus importante du potentiel zêta est enregistrée pour les particules hybrides avec une concentration plus élevée d'ADN.

Figure 3
Figure 3. Taille simultanée et des données de potentiel zêta capturées à partir d' une mesure de TRPS unique. Les barres / bleu points de données sont représentatifs des particules revêtues de streptavidine hybrides avec 210 nM d'ADN CP et les barres vert clair / points de données représentent des particules revêtues de streptavidine hybridées avec de l'ADN CP 10 nm. Figure adaptée de Blundell et al. 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.

Il est utile de noter que chaque point de données dans le nuage de points représente une seule particule parmi un échantillon de population, ce qui permet à l'analyse approfondie des particules par particules avec chaque échantillon. La figure 4 prend en charge l'efficacité de la technique dans la détermination des changements mineurs dans la structure de l' ADN ( des objectifs contraignants à simple brin et double brin d' ADN), ainsi que l' identification des différences dans les échantillons avec de l' ADN cible de la même taille, mais lié à une autre zone de la sonde de capture montrant des niveaux élevés de sensibilité (c. -à- liaison milieu et fin indiqués la figure 4). Les particules représentées sur la figure 4 sont ceux avec les modifications de surface suivantes, de gauche à droite; la sonde de capture (CP) de l'ADN uniquement, CP et d'un ADN cible parfaitement complémentaire, le CP et une cible de liaison à l'ADN du milieu, le CP et une cible de liaison à l'ADN d'extrémité, le CP et une cible d'ADN en surplomb.


. Figure 4. Changement relatif dans le potentiel zeta mesuré pour des particules d'ADN modifié avec une gamme de cibles d'ADN Changement de potentiel zêta, mV, à partir i) CP fonctionnalisés particules à une gamme de cibles d'ADN; ii) entièrement complémentaire, iii) la liaison Moyen, iv) Fin de liaison, cible v) Saillie. Les barres d'erreur représentent l'écart-type n = 3. Figure adaptée de Blundell et al. 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le calcul du potentiel zêta utilisé une méthode basée sur l' étalonnage lié au travail par Arjmandi et al. 21. La durée de la translocation des particules lorsqu'elles traversent un nanopore est mesurée en fonction de la tension appliquée, en utilisant une vitesse moyenne de champ électrique et de particules sur la totalité d'un pore conique régulière. La mobilité électrophorétique est la dérivée de 1 / T (où T est la durée du blocage) par rapport à la tension, multipliée par le carré de la longueur de la zone de détection, l. vitesses moyennes aux points de référence multiples à travers la zone de détection sont mesurés pour permettre un minimum d'erreurs dans le calcul du potentiel zêta en utilisant cette méthode.

L'étalonnage de la porosité est basée sur la linéarité de 1 / T vs tension V, à chaque point dans la zone de détection de référence. Les vitesses des particules électrocinétiques de particules d'étalonnage et de l'échantillon,upload / 54577 / 54577eq2.jpg "/> et l'équation 3 respectivement, sont liés à leurs potentiels zêta, l'équation 4 et l'équation 5 Comme représenté dans l' équation 1, en supposant une relation linéaire entre les deux , tel qu'il figure dans l'approximation Smoluchowski 12,20. Les valeurs du potentiel zéta net pour le calibrage et l'échantillon sont les différences de potentiel zêta des particules et le potentiel zêta de la membrane, L'équation 6 . Le potentiel zêta du pore de polyuréthane a été mesurée en utilisant des techniques de diffusion possibles 12,18 -11 mV comme dans du PBS pour cette étude.

L'équation 7 (1)

Le potentiel zêta de chaque particule individuelle, i, L'équation 8 est la position de la particule à l'intérieur des pores , après un temps t = T x, et Equation 10 est la vitesse des particules de l' échantillon seule particule i au rapport positions l x; équation 12 , Equation 14 , P et V sont la vitesse électrocinétique par tension de l' unité, de la vitesse convective par pression de l' unité, la pression appliquée et la tension pour l'échantillon exécute respectivement, une dérivation complète de cette équation peut être trouvée dans le travail par Blundell et al. 19.

Equation 16

Lors de la liaison de l'ADN de la sonde de capture pour les nanoparticules revêtues de streptavidine, il est essentiel que le chercheur élimine l'excès, non lié l'ADN de sonde de capture à gauche en solution. Cela se fait facilement en utilisant le RRS et un simple aimant permettant le remplacement rapide et facile du surnageant avec un nouveau tampon de PBST. Si l'ADN de capture est laissée en excès dans la solution et l'ADN cible ajouté, l'ADN cible peut se lier à l'ADN de capture libre en solution, plutôt que sur la surface du PSP. Un changement de la vitesse des particules et le potentiel zêta ne sera observé si l'ADN cible se lie à la sonde de capture présente sur la surface de la particule.

L'analyse et la comparaison d'un grand nombre d'échantillons sur plusieurs jours à l'aide TRPS peut nécessiter l'utilisation de plus d'une membrane poreuse. Certains pores peuvent avoir quelques différences mineures dans leur taille en raison du processus de fabrication et dans ces cas, l'utilisateur doit assurer le courant de base reste identique dans tous runs. Si le même courant de référence est observé, les résultats obtenus sont comparables entre les pores. Une fois que la ligne de base est la même que la série précédente, il est impératif que l'utilisateur maintient le tronçon inchangé entre l'échantillon d'étalonnage et essais pour permettre une détermination précise des vitesses de translocation de particules lorsqu'ils traversent les pores.

La technologie TRPS dispose d'un ensemble relativement simple up, qui peut être démonté facilement et rapidement lors d'une expérience. Si les problèmes de dépannage, cela peut rendre le processus beaucoup plus facile. Par exemple, il est important de ne pas laisser de bulles dans la cellule de fluide inférieure ou supérieure lorsque la cellule de fluide réalisation d'une analyse. Cela conduira à un courant de référence instable. Si des bulles sont présentes dans la cellule de fluide supérieure, l'échantillon peut être enlevé et remplacé. Si des bulles apparaissent dans la cellule de fluide inférieure, le tampon doit être retiré et remplacé par du tampon frais. Si les bulles sont un problème persistant, il peut y avoir trop de tensioactifdans la solution donc cela peut être réduit 16 (nous utilisons seulement 0,05% de Tween-20). Certains échantillons peuvent bloquer les pores si leur taille est supérieure à la taille des pores ou si la concentration de l'échantillon est trop élevé. Pour y remédier, la taille des pores peut être augmentée en augmentant l'étirement ou l'échantillon peut être dilué à une concentration en particules inférieure 16. Pour l'analyse de particules isolées, l'échantillon peut également bloquer les pores s'il y a beaucoup de grands agrégats présents, il est important de vortex et de sonication l'échantillon avant de l'exécuter à travers TRPS.

Parmi les autres méthodes, TRPS présente divers avantages, y compris la possibilité de compléter la taille et de charge des mesures de particules individuelles simultanément; permettant d'échantillons multimodal à analyser efficacement en utilisant cette méthode. Un avantage est le signal / blocages produits peuvent être optimisés en quelques minutes pour un échantillon particulier en changeant simplement l'étirement et la tension pour obtenir une grandeur de blocus, Δ </ Em> L'équation 1 , Significativement plus grande que le bruit de fond (barrages sont d'échelle nA par rapport au bruit de fond <10 pA). Le fait de pouvoir modifier la portion de la porosité rend le procédé plus souple par rapport aux techniques de pores à l'état solide que la taille des pores peut être ajustée par rapport à la taille de l'analyte en question; particulièrement utile lors d'enquêtes sur des effets tels que l'agrégation et de liaison qui peut entraîner des tailles d'analyte supérieures à l'état solide gamme originale de la taille des pores de l'ADN-protéines. Un autre aspect avantageux de TRPS est le niveau de sensibilité de la technique. La capacité à détecter des différences subtiles dans la liaison à l'ADN (où la même quantité d'ADN a été ajouté (la même quantité de charge ajoutée) et les échantillons sont de la même taille) en fonction de la position de l'ADN cible de liaison est assez profonde dans ce domaine de analyse et sera d'une grande utilité pour les futures plates-formes de conception nanoparticule-dosage. Chaque subtile diffèrentrence peut être détecté et isolé à l'aide d'une nature particule par particule de la technologie de TRPS. Cette analyse est supérieure à celle des techniques d' ensemble comme la diffusion dynamique de la lumière ou de photons spectroscopie par corrélation qui simplement gage une moyenne de la population de l' échantillon analysé et ne peut pas différencier dans les cas d'échantillons multimodales 6,7.

Nanopores semi-conducteurs de petite taille (100 à 200 nm) ont également été utilisés pour contrôler la dynamique des particules et ont trouvé que la mobilité des particules peut être affecté que le diamètre de la particule commence à approcher celle du nanopore 22,23. Nanopores beaucoup plus grandes que les particules sont analysées (telle qu'elle est utilisée dans la présente étude) ont moins d'effet sur la mobilité des particules, et donc la dynamique de translocation à l'intérieur du pore. Les pores utilisés dans cette étude sont cependant limitées à leurs plages de tailles d'analyte, par exemple un NP150 a une gamme de taille de 60 à 480 nm, donc si un échantillon multimodal est composée de particules à l'intérieur et dépassant celimite, ils ne peuvent pas être analysés sur le même pore que le pore peut alors devenir bloqué. Il est également important de noter que la mesure d'un échantillon bimodal contenant 60 et 480 particules nm (ceux aux limites absolues inférieures et supérieures du pore), par exemple, il faudra différentes conditions d'étirement et de tension, bien que les deux sont dans la plage d'analyse de taille des pores. En effet, le tronçon requis pour les plus grosses particules se traduira par des particules plus petites ayant une magnitude de blocage particulièrement faible (en fonction de la résistance réduite) qui pourraient être considérés comme un bruit de fond et donc pas nécessairement mesurés lors d'un exemple d'exécution.

Les bulles peuvent être un problème avec les mesures d'échantillons sous forme de bulles dans la cellule de fluide inférieure ou supérieure va créer un courant de base instable, à laquelle l'échantillon courses ne peuvent pas être accomplies. Electrolytes de nature effervescente (certains médias biologiques très concentrés, par exemple) peuvent être difficiles à exécuter et donc des échantillons requiring suspension dans ces milieux spécifiques peut se révéler problématique. Cependant la plupart des échantillons, peut être dilué ou mis en suspension dans des tampons de rechange avant l'analyse TRPS considérablement.

Le procédé est adaptable et peut être utilisé pour analyser un ensemble d'analytes à base de nanoparticules, y compris l'analyse des protéines, l' ADN, des petites molécules, des essais d'agrégation 17,24 et des particules biologiquement pertinentes. La polyvalence de TRPS pour caractériser une vaste gamme d'analytes montre les techniques potentielles dans un éventail de domaines tels que l' administration de médicaments 1.25, biocapteurs 26-28, et les essais environnementaux.

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Disclosures

ELCJB est soutenu par Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Izon Science Ltd pour leur soutien. Le travail a été soutenu par la Commission européenne pour la recherche (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

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References

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Bioengineering No. 116 biocapteurs TRPS Nanopore le potentiel Zeta l'ADN les particules superparamagnétiques
Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d&#39;ADN modifié comme un exemple
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