Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Qui usiamo un nanoporo sintonizzabile poliuretano integrato in una tecnica di rilevamento di impulsi resistivo caratterizzare nanoparticelle chimica di superficie tramite la misura della velocità di traslocazione delle particelle, che può essere utilizzato per determinare il potenziale zeta delle singole nanoparticelle.

Abstract

tecnologie nanoporo, noti collettivamente come sensori resistivi Pulse (RPS), vengono utilizzati per rilevare, quantificare e caratterizzare le proteine, molecole e nanoparticelle. sensing sintonizzabile impulso resistivo (TRPS) è relativamente recente adattamento di RPS che incorpora un poro sintonizzabile che può essere alterato in tempo reale. Qui, usiamo TRPS di monitorare i tempi di traslocazione di nanoparticelle DNA modificato, e attraversa la membrana pori sintonizzabile in funzione della concentrazione di DNA e struttura (cioè, a singolo filamento di DNA a doppio filamento).

TRPS si basa su due elettrodi Ag / AgCl, separate da una membrana elastomerica pori che stabilisce una corrente ionica stabile su un campo elettrico applicato. A differenza di varie tecnologie di caratterizzazione delle particelle ottiche a base, TRPS possono caratterizzare le singole particelle, tra un campione di popolazione, permettendo per i campioni multimodali da analizzare con facilità. Qui, dimostriamo misurazioni potenziale zetatramite velocità traslocazione delle particelle di standard noti e applicarle per assaggiare i tempi traslocazione analiti, con il risultato di misura del potenziale zeta di questi analiti.

Oltre ad acquisire valori di potenziale zeta medi, i campioni sono tutti misurati utilizzando una prospettiva particelle-by-particella esibendo ulteriori informazioni su un determinato campione attraverso distribuzioni di popolazione campione, per esempio. Di conseguenza, il metodo illustrato potenziale all'interno applicazioni di rilevamento per entrambi i campi medico e ambientale.

Introduction

nanoparticelle funzionalizzate stanno diventando sempre più popolare come biosensori in entrambi i campi medico e ambientale. La capacità di alterare la chimica di superficie di una nanoparticella, con il DNA, per esempio, si sta rivelando utile per i sistemi di somministrazione di farmaci mirati 1 e monitoraggio interazioni DNA-proteina 2-4. Una proprietà di nanoparticelle sempre più comune di essere utilizzato nel test biologici e nella consegna di terapie è superparamagnetismo 5. particelle superparamagnetiche (SPP) sono estremamente utili per identificare e rimuovere analiti specifici da miscele complesse e possono farlo con il semplice uso di un unico magnete. Una volta rimosse, le particelle di analiti-bound possono essere caratterizzate e analizzati adatto allo scopo.

I metodi precedenti utilizzati per la rilevazione e la caratterizzazione di nanoparticelle comprendono tecniche ottiche quali light scattering dinamico (DLS), altrimenti noti come la spettroscopia di correlazione di fotoni. Anche se un hitecnica di throughput gh, DLS si limita ad essere una tecnica basata compensazione e nell'analisi di campioni multimodali senza l'aggiunta di software specializzato, le particelle più grandi produrranno un segnale molto più dominante, lasciando alcune delle particelle più piccole completamente inosservato 6,7. Particle-by-particella tecniche di caratterizzazione sono quindi molto più favorevole per analizzare i sistemi di nanoparticelle funzionalizzati nanoparticelle e.

tecnologie basate RPS sono basati su applicazione di un campo elettrico per un campione e monitorare il meccanismo di trasporto delle particelle attraverso un nanoporo sintetico o biologico. Un relativamente recente tecnica di rilevazione e la caratterizzazione di nanoparticelle sulla base di RPS è sintonizzabile resistivo impulso di rilevamento (TRPS) 8-16. TRPS è un sistema a due elettrodi separati da una membrana elastomerica pori sintonizzabile. Metodo pori sintonizzabile permette di analiti di una serie di forma 17 e la dimensione deve essere misurata tramite il loro transmeccanismi di porta attraverso il poro. Pori sintonizzabili sono stati precedentemente utilizzati per la rilevazione di piccole particelle (70-95 nm di diametro) producendo risultati paragonabili a altre tecniche come la spettroscopia elettronica a trasmissione (TEM) 10. Quando un campo elettrico viene applicato, una corrente ionica viene osservata e come particelle / molecole passano attraverso il poro, essi bloccare temporaneamente il poro, provocando una riduzione della corrente che può essere definita come un 'evento blocco'. Ogni evento blocco è rappresentativo di una singola particella in modo che ogni particella di un campione può essere caratterizzato individualmente in base alla grandezza blocco, Δ Equazione 1 E larghezza a metà massimo FWHM, così come altre proprietà del blocco. Analizzando le singole particelle che passano attraverso un nanoporo è vantaggioso per i campioni multimodali come TRPS grado di distinguere correttamente ed efficacemente una gamma di dimensioni delle particelle amonGST un singolo campione. Sintonizzabile rilevamento impulso resistivo completa dimensione 10, potenziale zeta 12,18 e la concentrazione di 15 misurazioni simultaneamente in un unico passaggio e quindi può ancora distinguere campioni di simile, se non la stessa dimensione con la loro carica di superficie 19; un vantaggio rispetto alle tecniche dimensionali alternative.

Potenziale Zeta è definito come il potenziale elettrostatico in corrispondenza del piano di taglio 20, e viene calcolato le velocità delle particelle, e attraversa un poro 19. Zeta potenziali misure delle singole particelle dà quindi informazioni sui meccanismi di traslocazione e il comportamento dei sistemi di nanoparticelle in soluzione, informazioni preziose per il futuro dei disegni di analisi nanoparticelle per una gamma di applicazioni. l'analisi delle particelle-by-particella di natura tale permette anche per la diffusione e la distribuzione dei valori potenziale zeta tra un campione di popolazione da esplorare, consentendo per ulteriori informazioni ocinetica di reazione n (single-stranded di DNA a doppia elica, per esempio) e stabilità di particelle in soluzione da raggiungere.

Qui, descriviamo una tecnica che individua e caratterizza entrambe le superfici modificate e DNA modificato spp. Il protocollo qui descritto è applicabile ad una gamma di nanoparticelle inorganiche e biologiche, ma dimostrano la procedura utilizzando superfici DNA modificato per la loro vasta gamma di applicazioni. La tecnica consente all'utente di distinguere tra obiettivi a filamento singolo e doppio filamento di DNA su una superficie di nanoparticelle, sulla base delle velocità di traslocazione particelle attraverso un sistema di pori e quindi i loro potenziali zeta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rendere il tampone fosfato con Tween-20 (PBST) Buffer

  1. Sciogliere un PBS tablet (0,01 tampone M di fosfato, 0,0027 M cloruro di potassio, 0,137 M di sodio cloruro, pH 7,4) in 200 ml di acqua deionizzata (18,2 MW cm).
  2. Aggiungere 100 pl (0.05 (v / v)%) Tween-20 per la soluzione di 200 ml di buffer come un tensioattivo.

2. Preparazione La particella Standards Carboxyl polistirolo

  1. Agitare le particelle di calibrazione per 30 sec prima sonicazione per 2 min a 80 watt per creare monodispersity delle particelle.
  2. Diluire le particelle di calibrazione 1 in 100 ad una concentrazione di 1x10 10 particelle / ml in tampone PBST e vortex per 30 sec.

3. Preparazione particelle rivestite di streptavidina

  1. Agitare le particelle per 30 sec prima sonicazione per 2 min a 80 watt per garantire monodispersity.
  2. Diluire le ricoperto streptavidina particelle 1 su 100 in PBST buffer per achieve una concentrazione risultante di 1x10 9 particelle / ml e vortex per 30 sec.
    Nota: Un volume tipico del campione è di 200 ml. Ad esempio, se indagare cinque concentrazioni di DNA preparare 1 ml di particelle rivestite con streptavidina diluiti.

4. Preparazione di oligonucleotidi

  1. Ricostituire oligonucleotidi con acqua deionizzata ad una conseguente concentrazione di 100 pM.

5. L'aggiunta di sonda DNA Capture (CP) alle particelle rivestite di streptavidina

  1. Prima di legame al DNA, vortex i rivestito streptavidina particelle (volume di 200 ml del campione) per 30 secondi seguiti da 2 minuti a ultrasuoni a 80 watt.
  2. Sulla base della capacità di legame fornito dal fornitore (4.352 pmol / mg), aggiungere la concentrazione appropriata di DNA alle particelle per risultanti concentrazioni di 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, e 210 nM DNA.
  3. Vortice i campioni per 10 sec e posto su una ruota girevole a temperatura ambienteper 30 minuti per consentire il DNA di legarsi alle superfici delle particelle tramite un'interazione streptavidina-biotina.
  4. Una volta che il DNA di cattura è stato aggiunto e incubato con le particelle rivestite di streptavidina, rimuovere l'eccesso DNA in soluzione tramite separazione magnetica ponendo i campioni su un sostegno magnetico per 30 min.
  5. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il cluster di nuova formazione di particelle più vicini al magnete, e sostituirlo con lo stesso volume di nuovo buffer PBST.

6. Ibridazione DNA complementare al CP-particelle

  1. Aggiungere la quantità di DNA bersaglio (superiori a 500 nM) per garantire la massima possibile target vincolante è stato raggiunto.
  2. Vortex i campioni per 10 sec e posto su una ruota rotante a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Dopo l'ibridazione, rimuovere il DNA bersaglio eccesso tramite separazione magnetica ponendo i campioni su un sostegno magnetico per 30 min.
  4. Rimuovere il surnatante, Facendo attenzione a non disturbare il cluster di nuova formazione di particelle più vicini al magnete, e sostituirlo con lo stesso volume di nuovo buffer PBST.
  5. Ripetere i punti da 6.1 a 6.4 per i campioni duplicati e mettere questi campioni su una ruota girevole a temperatura ambiente per 16 ore per studiare i tempi di ibridazione del DNA.

Setup 7. TRPS

  1. Collegare lo strumento in un sistema di computer con software a posto.
  2. Calibrare il tratto iniziale utilizzando una pinza.
    1. Misurare la distanza tra l'esterno di due ganasce parallele.
    2. Ingresso nel software digitando il tratto nel campo 'stretch' nella scheda 'Instrument Impostazioni' e cliccando su 'Calibra tratto' sotto la scheda.
  3. Lateralmente montare una membrana poliuretanica nanoporo di adeguato dimensionamento per l'analisi sulle mascelle con il numero ID nanoporo rivolto verso l'alto. Poi, allungare le ganasce per il tratto necessario per l'analisi utilizzando lamanopola di regolazione tratto sul lato dello strumento. Allungare le ganasce tra i 43 ei 48 mm.
    Nota: Il valore esatto del tratto è determinato a fianco di tensione applicata in modo che i blocchi di particelle di taratura sono almeno 0,3 nA in termini di dimensioni. Il tratto è già immesso nel software nel passo 7.2 e regola automaticamente le ganasce sono allungati.
  4. Mettere 80 ml di tampone PBST nella cella inferiore fluida, sotto il nanoporo, garantire che vi siano bolle presenti che possono influenzare la misura. Se ci sono bolle visibili, rimuovere e sostituire il buffer.
  5. Fare clic sulla cella fluido superiore in posizione e mettere 40 ml di tampone in esso, ancora una volta garantire che vi siano bolle presenti. Se le bolle sono presenti nella cellula fluido superiore, rimuoverli sostituendo il liquido.
  6. Quando una corrente di riferimento riproducibile è stato raggiunto dalla sostituzione della cella di fluido superiore con tampone, aggiungere 40 ml di campione alla cella fluido superiore e misura cliccando 'stl'arte 'in la' scheda di acquisizione dati 'sullo schermo del software.
    Nota: L'acquisizione dei dati è stata completata ad una frequenza di 50 kHz con il limite di un blocco grandezza inferiore di 0,05 nA, anche se questo può essere modificato tramite il software tramite la scheda 'Analyse dati' (sotto 'impostazioni di analisi' e 'resistivo Blocchi') .
  7. Inserire una gabbia di Faraday sopra la parte superiore del sistema cellulare di liquidi per ridurre il rumore di fondo elettrico sulle misurazioni.
  8. Utilizzare un modulo di pressione variabile (VPM) per applicare una pressione o vuoto per i campioni.
    1. Per applicare una pressione esterna collegare l'ugello alla cella di fluido superiore, poi ruotare il braccio di pressione e agganciarla (a seconda che verranno applicate una pressione positiva (PRE) o vuoto (VAC)).
    2. Applicare pressione in un 'cm' o scala 'mm' utilizzando la manopola stadio di pressione situata sulla sommità della VPM. Premere la manopola verso il basso per fare pressione sulla scala 'cm' e tirarlo verso l'alto to applicare una pressione sulla scala 'mm'.

8. preparazione dei campioni per l'analisi TRPS

  1. campioni Vortex per 30 secondi e ultrasuoni per 2 min a 80 watt prima dell'analisi TRPS.

9. Calibrazione del nanoporo per l'analisi Zeta

  1. Dopo aver posizionato 40 particelle di calibrazione microlitri (1x10 10 particelle / ml) nella cella fluido superiore, completare una misurazione TRPS (messa a punto come nella sezione 7) a 3 tensioni applicate. Modificare la tensione facendo clic sul '+' e '-' pulsanti sulla scala di tensione nella scheda 'Instrument Settings' sul software.
  2. Verificare che le 3 tensioni tornano correnti di circa 140, 110 di fondo, e 80 nA. Assicurarsi che alla tensione media delle particelle di calibrazione producono una magnitudine media blocco di almeno 0,3 nA.
  3. Applicare una pressione in modo che la media ampiezza metà massimo (FWHM) durate delle particelle di taratura sono almeno0.15 msec. Fare questo manualmente utilizzando il braccio di pressione collegato al modulo di pressione variabile. Selezionare pressione (PRE) o vuoto (VAC) ruotando il braccio fino a farlo scattare nella posizione desiderata e applicano di conseguenza seguente set up istruzioni al punto 7.8.2. Una volta che queste condizioni sono stati raggiunti, inizia la corsa facendo clic su 'Start' sul software nella scheda 'acquisizione dati'.
  4. Completa la corsa premendo il tasto 'stop' nella scheda 'Data Acquisition' quando almeno 500 particelle sono state misurate (vedi 'Conte di particelle' nella parte inferiore della schermata del software durante la misura) e la pista ha superato 30 sec (vedere ' Run Time 'anche verso la parte inferiore dello schermo).
  5. Calibrare il sistema completando una corsa di taratura come descritto ogni volta che viene introdotto un nuovo nanoporo o per ogni nuovo giorno di analisi completando passo 9,1-9,4.

10. L'esecuzione di un campione

  1. Eseguire i campioni al più alto osecondo più alto a tensione di campioni di calibrazione a garantire un simile (± 10 nA), se non la stessa corrente di base.
    1. Una volta che la corrente di base del caso si ottiene, sostituire l'elettrolita nella cella di fluido superiore con 40 ml di campione. Quando viene introdotto un campione, i blocchi saranno visibili sulla traccia del segnale. Avviare il campione di eseguire cliccando su 'Start' nella scheda 'acquisizione dati' e registrare un minimo di 500 particelle (controllare 'Conte di particelle' situata sotto la traccia del segnale) e di garantire il tempo di esecuzione è un minimo di 30 secondi (vedere 'Run tempo 'situato anche sotto la traccia del segnale).
    2. Per completare la misurazione, cliccare su 'stop' in la 'scheda di acquisizione dati' e salvare il file di dati.
  2. Per salvare il file, inserire le informazioni sul file nel seguente formato; 'Indagine' è la cartella il file verrà salvato in, 'Nanopore ID' è il numero di serie del poro in uso, 'Parte #' is il tipo di pori (cioè, NP150 / NP200), 'ID campione' è il nome del campione, 'calibrazione o campione' dettagli se si tratta di una misura di calibrazione o campione, viene utilizzato 'diluizione' se il campione è stato diluito ( digitare 100 se il campione è stato diluito 100 volte), 'Pressure' è la pressione applicata al campione (in cm - vedere paragrafo 7.8), 'elettrolito ID' è il nome del tampone campione è costituito, e ' Note 'sono delle note personali sul campione o correre.
  3. Tra ogni corsa del campione, lavare il sistema, ponendo 40 ml di PBST tampone nella cella fluido superiore diverse volte e l'applicazione di varie pressioni (di solito a -10, -5 cm (a vuoto), e 5 e 10 cm (pressione positiva)) fino a altri eventi del blocco sono presenti, garantendo l'assenza di particelle residue rimangono nel sistema e quindi nessuna contaminazione incrociata tra i campioni. campioni analizzato in triplicato con questa fase di lavaggio completato tra ogni campione di ripetizione corrono come well come tra i diversi campioni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione schematica dei processi di purificazione magnetica e una misurazione TRPS. A) Esempio di purificazione magnetica del campione a partire da un campione contenente eccesso, non legato DNA sonda di cattura. B) TrPs esempio di misura i) di particelle che passa attraverso il nanoporo e ii) evento blocco prodotta da particelle occlusione temporanea ioni nel poro causando una diminuzione temporanea in corrente; Informazioni da cui viene utilizzato per calcolare le velocità di traslocazione delle particelle. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La rimozione di qualsiasi DNA in eccesso che non è legata alla superficie delle particelle dai campioni è importante prima dell'analisi TRPS, per non segnalare eventualirisultati "falsi positivi". La possibilità di utilizzare un magnete per estrarre e lavare i SPP è un enorme vantaggio per TRPS (Figura 1A). Figura 1B descrive un esempio di base di una misurazione TRPS e un esempio 'evento blocco' realizzato come una particella attraversa il poro. In primo luogo, abbiamo dimostrato che TRPS è una tecnica ad alto rendimento in grado di distinguere tra i campioni di dimensioni simili, ma di una carica notevolmente diverso. La sua capacità di completare dimensioni e carica analisi simultaneamente in una singola misurazione può essere visto in Figura 2. Figura 2 è un esempio di a) dimensioni e b) Analisi potenziale zeta di streptavidina particelle rivestite senza modifiche (luce data set rosa) e rivestito streptavidina particelle saturi con il DNA a singolo filamento in superficie (blu Data set). Anche se entrambi i campioni erano di dimensioni simili, il potenziale zeta era significativamente differente e molto più grande quando il DNA era functionalized sulla superficie della particella.

figura 2
Figura 2. Dimensioni e Zeta analisi potenziale delle nanoparticelle di DNA modificato e streptavidina non modificata rivestito. Le barre rosa chiaro rappresentano non modificati streptavidina particelle rivestite e le barre blu rappresentano le particelle di DNA modificato. A Frequenza) (%) vs diametro delle particelle (nm). B) Frequenza (%) vs potenziale zeta (mV). Figura adattato da dati supplementari in Blundell et al. 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Non solo la tecnica distinguere tra particelle non modificati e modificati con il DNA, TRPS può distinguere tra campioni con diverse concentrazioni di DNA ibridato al particolo superficie. La figura 3 mostra la dimensione e potenziale zeta dati esposti per i campioni con il più basso (10 nm, la luce verde set di dati) e più alta (210 nM, blu Data Set) concentrazioni di DNA ibridato alle particelle legate streptavidina. Una più grande valore potenziale zeta viene registrato per particelle ibridizzati con una maggiore concentrazione di DNA.

Figura 3
Figura 3. dimensione simultanea e dati potenziale zeta catturati da una singola misurazione TRPS. Il Blue bar / punti di dati sono rappresentativi di rivestiti streptavidina particelle ibridati con 210 nM CP DNA e le barre di verde chiaro / punti dati rappresentano rivestito streptavidina particelle ibridati con 10 nM DNA CP. Figura adattato da Blundell et al. 19. Cliccate qui per vedereuna versione più grande di questa figura.

E 'utile notare che ogni punto di dati nel grafico a dispersione rappresenta una singola particella tra un campione di popolazione, permettendo un'analisi approfondita delle particelle-by-particella con ogni campione. Figura 4 supporta l'efficacia della tecnica nel determinare cambiamenti minori nella struttura del DNA ( target a singolo filamento e doppia elica del DNA), nonché individuare le differenze di campioni con DNA bersaglio delle stesse dimensioni, ma legata ad una diversa area della sonda di cattura dimostrare un elevato livello di sensibilità (cioè, vincolanti metà e fine vincolanti visualizzati in figura 4). Le particelle mostrati in figura 4 sono quelli con le seguenti modificazioni superficiali, da sinistra a destra; sonda di cattura (CP) del DNA solo, CP e un target DNA pienamente complementare, CP e un obiettivo legame al DNA di mezzo, CP e un target legame al DNA fine, CP e un target DNA sovrastante.


. Figura 4. Variazione relativa a potenziale zeta misurato per le particelle di DNA modificato con una gamma di obiettivi DNA Variazione potenziale zeta, mV, da i) CP funzionalizzato di particelle ad una serie di obiettivi di DNA; ii) completamente complementare, iii) vincolante Medio, iv) end vincolante, destinazione v) a strapiombo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard, dove n = 3. Figura adattato da Blundell et al. 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il calcolo per il potenziale zeta ha utilizzato un metodo basato calibrazione relativi al lavoro in Arjmandi et al. 21. La durata della traslocazione di particelle, e attraversa un nanoporo viene misurata in funzione della tensione applicata, utilizzando un campo e particella media velocità elettrici sulla totalità di un poro conica regolare. La mobilità elettroforetica è la derivata di 1 / T (dove T è la durata blocco) rispetto alla tensione, moltiplicata per il quadrato della lunghezza della zona di rilevamento, l. velocità media a più punti di riferimento attraverso la zona di rilevamento sono misurati per consentire minimi errori nel calcolo potenziale zeta con questo metodo.

La taratura del poro è basato sulla linearità 1 / T vs tensione, V, in ciascun punto di riferimento nella zona di rilevamento. Le velocità delle particelle elettrocinetiche di particelle di calibrazione e di campione,upload / 54577 / 54577eq2.jpg "/> e Equazione 3 rispettivamente, sono legati ai loro potenziali zeta, Equazione 4 e Equazione 5 , Come mostrato nell'equazione 1, ipotizzando una relazione lineare tra i due come indicato nel ravvicinamento Smoluchowski 12,20. I valori di potenziale zeta netti sia per la calibrazione e del campione sono le differenze di potenziale zeta di particelle e il potenziale zeta di membrana, equazione 6 . Il potenziale zeta del poro poliuretano è stata misurata usando lo streaming potenziali tecniche 12,18 come -11 mV in PBS per questo studio.

equazione 7 (1)

Il potenziale zeta di ogni singola particella, i, equazione 8 è la posizione della particella all'interno del poro dopo il tempo t = T x, e equazione 10 è la velocità delle particelle del singolo campione di particelle ho in posizioni relative L x; equazione 12 , equazione 14 , P e V sono velocity electrokinetic per tensione dell'unità, velocità convettiva a pressione unità, pressione applicata e la tensione per il campione corre rispettivamente una derivazione completa di questa equazione può essere trovato nel lavoro di Blundell et al. 19.

equazione 16

Quando si associa il DNA sonda di cattura per le nanoparticelle rivestite streptavidina, è fondamentale che il ricercatore rimuove l'eccesso, non legato DNA sonda di cattura lasciato in soluzione. Questo viene fatto facilmente usando il SPP e una semplice magnete consentendo la sostituzione rapida e semplice del surnatante con nuovo buffer PBST. Se il DNA di cattura in eccesso viene lasciato in soluzione e bersaglio DNA aggiunto, il DNA bersaglio può legarsi al DNA cattura libero in soluzione, piuttosto che sulla superficie SPP. Un cambiamento nella velocità delle particelle e il potenziale zeta sarà osservato solo se il DNA bersaglio si lega alla sonda di cattura presente sulla superficie della particella.

Analisi e confronto di un gran numero di campioni in molti giorni usando TRPS può richiedere l'uso di più di una membrana pori. Alcuni pori possono avere alcune piccole differenze nella loro dimensione a causa del processo di fabbricazione e in questi casi, l'utente deve garantire l'attuale linea di base rimane identico in tutti runs. Se si osserva la stessa corrente di base, i risultati ottenuti sono comparabili tra pori. Una volta che la linea di base è la stessa di esecuzioni precedenti, è imperativo che l'utente mantiene il tratto invariato tra calibrazione e campione corre per consentire l'accurata determinazione delle velocità di traslocazione particelle come attraversare il poro.

La tecnologia TRPS è relativamente semplice configurazione, che può essere smontata facilmente e rapidamente durante un esperimento. Se la risoluzione dei problemi, questo può rendere il processo molto più facile. Ad esempio, è importante non permettere eventuali bolle nella cella inferiore fluido o cella fluido superiore quando si intraprendono analisi. Questo porterà ad una corrente di base instabile. Se le bolle sono presenti nella cella di fluido superiore, il campione può essere rimosso e sostituito. Se le bolle appaiono nella cella fluido inferiore, il buffer deve essere rimossa e sostituita con tampone fresco. Se le bolle sono un problema persistente, allora potrebbe essere troppo tensioattivonella soluzione quindi questo potrebbe essere necessario ridurre 16 (usiamo solo lo 0,05% di Tween-20). Alcuni campioni possono bloccare il poro se la loro dimensione supera la dimensione dei pori o se la concentrazione del campione è troppo alta. Per ovviare a questo, la dimensione dei pori può essere aumentata aumentando il tratto o il campione può essere diluito ad una concentrazione di particelle inferiore 16. Per l'analisi singola particella, il campione può anche bloccare il poro se ci sono un sacco di grandi aggregati presenti, è importante vortice e Sonicare il campione prima dell'esecuzione attraverso TRPS.

Tra gli altri metodi, TRPS presenta diversi vantaggi tra cui la possibilità di completare dimensione e carica misurazioni di singole particelle simultaneamente; consentendo campioni multimodali da analizzare efficacemente con questo metodo. Un vantaggio è il segnale / blocchi prodotti possono essere ottimizzate in minuti per un dato campione semplicemente cambiando il tratto e tensione per ottenere una grandezza blocco, Δ </ Em> Equazione 1 , Significativamente superiore al rumore di fondo (blocchi sono di scala nA in confronto al rumore di fondo <10 pA). Essendo in grado di alterare il tratto del poro rende il metodo più versatile rispetto alle tecniche pori stato solido come la dimensione dei pori può essere regolata rispetto alla dimensione del analita in questione; particolarmente utile nell'ambito delle indagini effetti come aggregazione e vincolante che può comportare misure di analiti che superano la gamma originale dimensione dei pori a stato solido DNA-proteina. Un altro aspetto vantaggioso del TRPS è il livello di sensibilità dalla tecnica. La capacità di rilevare sottili differenze di legame al DNA (in cui è stata aggiunta la stessa quantità di DNA (stessa quantità di carica aggiunta) ei campioni sono della stessa dimensione) sulla base della posizione di DNA bersaglio di legame è abbastanza profonda in questa zona analisi e sarà di grande utilità per le future piattaforme di progettazione di nanoparticelle-test. Ogni sottile differisconoza può essere rilevato e isolato utilizzando un carattere di particelle-by-particella della tecnologia TRPS. Questa analisi supera quella delle tecniche ensemble come dynamic light scattering o di fotoni correlazione spettroscopia che limita gage una media della popolazione campione analizzato e non può differenziare in casi di campioni multimodali 6,7.

Piccoli nanopori a stato solido (100-200 nm) sono stati utilizzati anche per monitorare dinamica delle particelle ed hanno trovato che la mobilità delle particelle può essere influenzata come il diametro della particella comincia ad avvicinarsi quella del nanoporo 22,23. Nanopori molto più grandi rispetto alle particelle essendo analizzati (come utilizzato in questo studio) hanno meno di un effetto sulla mobilità delle particelle e quindi le dinamiche di traslocazione all'interno del poro. I pori utilizzati in questo studio sono tuttavia limitati a loro intervalli di dimensioni analiti, un NP150 per esempio ha una gamma di dimensioni di 60-480 nm quindi se un campione multimodale costituito da particelle entro ed oltre questolimite, che non può essere analizzato sullo stesso pori come il poro può quindi diventare bloccato. E 'anche importante notare che misurare un campione bimodale contenente 60 e 480 particelle nm (quelle ai assoluti limiti inferiore e superiore del poro), ad esempio, richiede diverse condizioni stirata e tensione, anche se entrambi sono all'interno della gamma analisi granulometrica del poro. Questo perché il tratto richiesto per le particelle più grandi si tradurrà in particelle più piccole aventi particolarmente piccola entità blocco (basata sulla resistenza ridotta) che potrebbero essere considerati come rumore di fondo e quindi non necessariamente misurati durante un ciclo di campionamento.

Bolle possono essere un problema con le misurazioni di campioni come bolle nella cella fluido inferiore o superiore creerà una corrente di base instabile, a cui corre campione non può essere completata. Elettroliti di natura effervescente (alcuni media biologici altamente concentrati, per esempio) possono essere difficili da eseguire e quindi campioni requiring sospensione in questi mezzi specifici può risultare problematico. La maggior parte dei campioni tuttavia, può essere notevolmente diluito o sospeso in buffer alternative prima dell'analisi TRPS.

Il metodo è adattabile e può essere utilizzato per analizzare una gamma di analiti a base di nanoparticelle, compresa l'analisi delle proteine, DNA, piccole molecole, saggi aggregazione 17,24 e particelle biologicamente rilevanti. La versatilità del TRPS in caratterizzare una vasta gamma di analiti mostra le tecniche possibili in una vasta gamma di settori come la somministrazione di farmaci 1,25, biosensori 26-28, e test ambientali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ELCJB è supportato da Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Izon Science Ltd per il loro sostegno. Il lavoro è stato sostenuto dalla Commissione Europea per la Ricerca (PCIG11-GA-2012-321.836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
  2. Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
  3. Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
  4. Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
  5. Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
  6. Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
  7. Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
  8. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
  9. Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
  10. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
  11. Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
  12. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
  13. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
  14. Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
  15. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
  16. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
  17. Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
  18. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
  19. Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
  20. Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
  21. Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
  22. Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
  23. Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
  24. Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
  25. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
  26. Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
  27. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  28. Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).

Tags

Bioingegneria biosensori TRPS nanoporo potenziale zeta DNA particelle superparamagnetiche
Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R.,… More

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example. J. Vis. Exp. (116), e54577, doi:10.3791/54577 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter