Summary
여기에서는 개개의 나노 입자의 제타 포텐셜을 결정하는데 사용될 수있다 입자 전위 속도의 측정을 통해 나노 입자의 표면 화학을 특징 저항 펄스 감지 기술에 통합 된 폴리 우레탄 동조 나노 기공을 사용한다.
Abstract
저항 펄스 센서 (RPS)로 총칭 알려진 나노 기공 기술, 탐지, 정량화 및 단백질 분자와 나노 입자의 특성을 사용하고있다. 조정 가능한 저항 펄스 센서 (TRPS)는 실시간으로 변경 될 수있는 조정 가능한 공극을 포함 RPS 비교적 최근에 적응된다. 그들은 DNA 농도 및 구조의 함수로서 가변 기공 멤브레인을 통과 여기 우리 DNA 변성 나노 입자의 전위의 시간을 모니터링하는 TRPS를 사용하여 (즉, 단일 쇄 이중 가닥 DNA)이다.
TRPS는 전계인가시 안정한 이온 전류를 설정 엘라스토머 기공 막에 의해 분리 된 두개의 Ag / AgCl을 전극에 기초한다. 각종 광학 기반 입자 특성 기술과 달리, TRPS는 복합 샘플 용이하게 분석 할 수 있도록하는 샘플 모집단 중에서 개개의 입자를 특성화 할 수있다. 여기, 우리는 제타 전위 측정을 보여공지 된 표준 입자 전위 속도 통해 따라서 이러한 분석의 제타 전위 측정 결과 피검 전좌 회 샘플링이 적용.
뿐만 아니라 평균 제타 전위 값을 획득하는 등, 샘플은 모든 예를 들어, 샘플 인구 분포를 통해 주어진 샘플에 대한 자세한 정보를 나타내는 입자에 의해 입자의 관점을 사용하여 측정하고 있습니다. 이러한 가운데,이 방법은 모두 의료 및 환경 분야에 대한 감지 애플리케이션 내에서 가능성을 보여줍니다.
Introduction
기능화 나노 입자는 의료 및 환경 분야 모두에서 바이오 센서로 점점 더 인기를 끌고있다. 능력은 예를 들어 표적 약물 전달 시스템 (1) 및 감시 DNA 단백질 상호 작용 2-4 유용 증명, DNA와 나노 입자의 표면 화학을 변경한다. 점점 일반적인 나노 입자의 특성은 생물 검정에서 활용 및 치료제의 전달에 초상 자성 5된다. 초상 자성 입자 (SPPS)를 식별하고 복잡한 혼합물에서 특정 분석을 제거하는데 매우 유용하며, 하나의 자석의 간단한 사용하여 수행 할 수 있습니다. 일단 제거 된 분석 결합 된 입자는 특징과 목적에 맞는 분석 할 수 있습니다.
나노 입자의 검출 및 특성화에 사용되는 이전의 방법은 달리 광자 상관 분광법으로 알려진 동적 광산란 (DLS) 등의 광학 기법을 포함한다. 안녕하세요 있지만GH 처리량 기술, DLS이 평균을 기반으로 기술되고 그리고 전문 소프트웨어의 추가없이 복합 시료를 분석하는 경우에 한정되어, 더 큰 입자는 -6,7- 완전히 알려지지 작은 입자의 일부를 남겨, 훨씬 더 우세 신호를 생성한다. 입자가 입자의 특성화 기술은 따라서 더욱 바람직한 나노 입자 및 나노 입자의 작용 화 시스템을 분석한다.
RPS 기반 기술은 시료에 전기장을인가하고, 합성 또는 생물학적 나노 기공을 통해 입자의 반송기구를 감시를 기반으로한다. RPS에 기초한 비교적 최근 나노 검출 및 특성화 기법은 가변 저항 펄스 센서 (TRPS) 8-16이다. TRPS는 엘라스토머, 가변 기공 막에 의해 분리 된 두 개의 전극 시스템이다. 파장 가변 세공 방법은 트랜스를 통해 측정되는 도형 (17)의 크기의 범위의 분석을 허용기공을 통해 포트 메커니즘. 동조 기공 종전에는 투과형 전자 분광법 (TEM) (10)과 같은 다른 기술들에 비교 결과를 생성하는 작은 입자의 검출 (70 내지 95 nm의 직경)에 사용되어왔다. 전기장이인가되면, 이온 전류가 관찰되는 입자 / 분자가 공극을 통과 할 때, 이들은 일시적 '봉쇄 이벤트'로 정의 될 수있는 전류의 감소를 일으키는 원인이되는 기공을 차단. 샘플 내의 각각의 입자 특성을 개별적으로 봉쇄 진폭, Δ에 기초 할 수 있도록 각 차단 이벤트는 하나의 입자의 대표 
및 반값 폭, FWHM뿐만 아니라 다른 차단 특성. 그들은 나노 기공을 통과 할 때 개개의 입자를 분석하는 것은 입자 아몬 크기의 TRPS가 성공적으로 효과적으로 범위를 구별 할 수있는 복합 샘플에 유리하다하나의 샘플을 GST. 조정 저항 펄스 감지 크기 10, 단일 실행에서 동시에 제타 전위 12, 18, 20, 22 및 농도 (15) 측정을 완료하고 여전히 비슷한 샘플을 차별화 따라서 할 수있는 경우에 그 표면 전하 (19)에 의해하지 같은 크기; 대안 사이징 기술을 통해 장점.
제타 전위는 전단 (20)의면에 정전 전위로 정의되며, 그들은 기공 (19)로 이동할 때 입자 속도로부터 계산된다. 개별 입자의 제타 전위 측정 따라서 전위기구 및 솔루션의 나노 입자 시스템, 응용 프로그램의 범위에 대한 나노 입자 분석 디자인의 미래를위한 가치있는 정보의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 자연의 입자에 의해 입자 분석은 또한 오 자세한 내용은 허용 표본 집단 사이에 확산 및 제타 전위 값의 분포를 탐험 할 수 있습니다용액 N의 반응 속도 (예를 들어, 이중 가닥 DNA를 단일 가닥) 및 입자 안정성이 달성된다.
여기서 우리는 감지하고 수정되지 않은 및 DNA 변성 SPP 표면 모두를 특징 짓는 기술을 설명합니다. 여기에 기술 된 프로토콜은 무기 나노 입자와 생체의 범위에 적용 할 수 있지만,이 때문에 애플리케이션들은 광범위한 DNA 변성 표면을 사용하는 절차를 보여준다. 이 기술은 사용자에 따라서 입자 전좌 기공 시스템을 통해 속도 및 제타 전위에 기초하여, 나노 입자 표면 상에 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 표적을 구별 할 수있다.
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Protocol
1. 트윈 20 (PBST) 완충액으로 포스페이트 완충 염수 만들기
- 200 ml의 탈 이온수 (18.2 MΩ cm)을 하나의 정제 PBS (0.01 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨, 0.137 M 염화나트륨, pH 7.4의)을 녹인다.
- 계면 활성제로 200 ㎖의 완충 용액 100 μL (0.05 (v / v)의 %) 트윈 (20)를 추가합니다.
2. 카르 복실 폴리스티렌 입자 표준을 준비
- 단 분산 입자를 만들 80w에서 2 분 동안 초음파 처리 전 30 초 동안 교정 입자 소용돌이.
- 30 초 동안 PBST 버퍼 소용돌이에 1 × 10 입자 / ml의 농도로 조정 입자 (100)에 제 1 희석.
3. 준비 스트렙 타비 딘 코팅 입자
- 단 분산을 보장하기 위해 80w에서 2 분간 초음파 전에 30 초 동안 입자를 소용돌이.
- AC에 PBST 버퍼 (100)에서 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 1 희석30 초에 대한 결과 1 × 9 입자 / ml의 농도와 소용돌이를 hieve.
참고 : 일반적인 샘플 볼륨이 200 μL입니다. 예를 들면, 조사하는 경우 다섯 DNA 농도는 희석 된 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 1 ㎖를 준비한다.
올리고 뉴클레오티드 4. 제조
- 100 μM의 결과 농도로 탈 이온수로 올리고 뉴클레오티드를 복원합니다.
스트렙 타비 딘 코팅 입자에 캡처 프로브 (CP) DNA 5. 추가
- DNA 결합 이전에, 와류 80w에서 2 분간 초음파 처리 한 다음 30 초 동안 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자 (200 μL 샘플 량).
- 보조 장비 (4352 pmol의 ㎎ /)에 의해 제공되는 결합 용량에 기초하여, 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, 210 나노 DNA의 얻어진 농도에 대한 입자에 DNA의 적절한 농도를 추가한다.
- 실온에서 회전 바퀴에 10 초와 장소에 대한 샘플을 와동DNA를가 스트렙 타비 딘 - 바이오틴 상호 작용을 통해 입자 표면에 결합하는 30 분을 허용하기 위해.
- 캡처 DNA를 첨가하고, 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자와 함께 배양 한 후, 30 분 동안 자기 랙 상에 샘플을 배치하여 자기 분리를 통해 용액에 과량의 DNA를 제거한다.
- 자석에 가장 가까운 입자의 새로 형성된 클러스터를 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 제거하고 새로운 PBST 버퍼의 동일한 볼륨으로 교체합니다.
6. CP 입자 상보 DNA 혼성화
- 도달 한 결합 가능한 최대 목표를 위해 (500 nm에서 초과) 대상 DNA의 필요한 양을 추가합니다.
- 볼텍스 30 분 동안 실온에서 회전 바퀴 10 초 및 장소 샘플.
- 혼성화가 완료된 후 30 분 동안 자기 랙 상에 샘플을 배치하여 자기 분리를 통해 과량의 표적 DNA를 제거한다.
- 상층 액을 제거주의하면서 자석에 가장 가까운 입자의 새로 형성된 클러스터를 방해하고, 새로운 PBST 버퍼의 동일한 볼륨으로 대체 할 수 없습니다.
- 반복 중복 샘플 6.1 6.4 단계 및 DNA 혼성화 회 조사 실온에서 16 시간 동안 회전 휠이 샘플을 놓는다.
7. TRPS 설치
- 대신에 소프트웨어를 컴퓨터 시스템에 기기를 연결합니다.
- 캘리퍼스를 사용하여 초기 스트레칭을 보정합니다.
- 두 개의 평행 한 턱의 외측 사이의 거리를 측정한다.
- '장비 설정'탭에서 '스트레칭'필드에서 스트레칭을 입력하고 탭 아래 '스트레칭 교정'을 클릭하여 소프트웨어에 입력.
- 옆으로 나노 기공의 ID 번호가 위로 향하게하여 턱에 분석을 위해 적절한 크기의 폴리 우레탄 나노 기공 막에 맞게. 그 후, 분석은 사용에 필요한 신장에 조우 스트레칭악기의 측면에 스트레치 조정 핸들입니다. (43)와 48mm 사이의 턱을 스트레칭.
참고 : 스트레칭의 정확한 값은인가 전압과 함께 결정된다 교정 입자 봉쇄의 크기가 적어도 0.3 nA의를 그래서. 스트레칭은 이미 단계 7.2 소프트웨어에 입력하고 턱이 신장 될 때 자동으로 조정됩니다. - 보장, 나노 기공 아래, 낮은 유체 셀에 PBST 버퍼의 80 μl를 놓고 측정에 영향을 미칠 수있는 기포가 없습니다. 거품이 볼 수있는 경우 제거하고 버퍼를 교체합니다.
- 제자리에 상부 유체 셀을 클릭하고 그것으로 버퍼의 40 μl를 놓고 다시 보장 기포가 존재가 없습니다. 기포가 상부 유체 세포에 존재하는 경우, 액체를 교체하여이를 제거한다.
- 재현성 기준 전류 버퍼 상부 유체 셀 교체로부터 도달하면, ST '를 클릭하여 상부 유체 셀 측정하는 시료의 40 μL를 추가소프트웨어 화면에서 데이터 수집 '탭'에 '예술.
참고 :이이 '분석한다 데이터'탭을 통해 소프트웨어를 사용하여 변경 될 수 있지만 데이터 수집이 ( '분석 설정'과 '저항 봉쇄'아래), 0.05 nA의의 봉쇄 크기 하한 50 kHz의 주파수에서 완료 . - 측정에 전기적 배경 잡음을 줄이기 위해 상기 유체 전지 시스템의 맨 위에 패러데이 케이지를 놓는다.
- 샘플에 압력 또는 진공을 적용 할 변수 압력 모듈 (VPM)를 사용합니다.
- 외부 압력이 상부 유체 셀에 노즐을 연결 적용하려면 다음 압력 팔을 회전 (양압 (PRE) 또는 진공 (VAC)이 적용됩니다 여부에 따라) 위치에 클릭합니다.
- VPM의 상단에 위치한 압력 단계 노브를 사용하여 'cm'또는 'mm'규모에 압력을 적용합니다. t 'cm'규모에 압력을 위쪽으로 당겨 아래로 노브를 누르면O를 'mm'규모에 압력을 적용합니다.
TRPS 분석 8. 준비 샘플
- 이전 TRPS 분석에 80w에서 2 분 30 초와 초음파 처리를위한 소용돌이 샘플.
9. 제타 분석을위한 나노 기공 보정
- 상부 유체 세포 내로 40 μL 교정 입자 (1 × 10 입자 / ㎖)를 배치 한 후, (3)이인가 전압에 (7에서와 같이 셋업)을 TRPS 측정을 완료. '-'버튼을 전압 규모에 소프트웨어의 '장비 설정'탭에서 '+'를 클릭하여 전압을 변경합니다.
- nA의를 3 전압이 약 (140), (110)의 배경 전류를 반환 할 것을 확인하고 80. 중간 전압 교정 입자가 적어도 0.3은 Na 평균 봉쇄 크기를 생산하고 있는지 확인합니다.
- 교정 입자의 평균 전체 폭 절반 최대 값 (FWHM) 기간 적어도 그래서 압력을 적용0.15 밀리 초. 수동 변압 모듈에 연결된 압력 아암을 이용하여 이렇게. 가 원하는 위치에 클릭하고 그에 따라 단계 7.8.2에서 지침을 설정, 다음이 적용됩니다 때까지 팔을 회전하여 선택 압력 (PRE) 또는 진공 (VAC). 이러한 조건이 달성 된 후에는 '정보 수집'탭에서 소프트웨어의 '시작'을 클릭하여 실행을 시작합니다.
- 최소 500 입자 (측정하는 동안 소프트웨어 화면 하단의 '입자 수를'참조)로 측정되었으며 실행이 30 초를 초과 할 때 '(참조'데이터 수집 '탭에서'정지 '를 눌러 실행을 완료 또한 화면의 아래쪽으로 실행 시간 ').
- 새로운 나노 기공이 도입 될 때마다 설명 또는 단계 9.1-9.4를 완료하여 분석의 각각의 새로운 하루로 보정 실행을 완료하여 시스템을 보정합니다.
(10) 샘플을 실행
- 최고에서 샘플을 실행하거나비슷한 (± 10 nA의)를 보장에서 교정 샘플로 두 번째로 높은 전압, 그렇지 않은 경우 동일 기준 전류.
- 적절한 기준 전류가 달성되면, 시료 40 μL와 상부 유체 셀에 전해질을 대체. 시료가 도입되는 경우, 봉쇄는 신호 트레이스 알 수있을 것이다. '데이터 수집'탭에서 '시작'을 클릭하여 실행 샘플을 시작하고 500 입자의 최소 기록 (신호 트레이스 아래에 위치한 '입자 개수'를 점검) 및 동작 시간을 보장하는 30 초 최소이다 ( '실행을 참조하십시오 또한 신호 트레이스 아래에 위치 시간 ').
- 측정을 완료하려면 '데이터 수집 탭'에서 '정지'를 클릭하고 데이터 파일을 저장합니다.
- 파일, 입력 다음과 같은 형식의 파일 정보를 저장하려면; '조사'는 파일에 저장 될 폴더, '나노 기공 ID'는 기공의 일련 번호가 나는, '부품 번호'를 사용하고있다샘플을 희석 한 경우 '희석'사용이 교정 또는 샘플 측정,인지 '교정 또는 샘플'세부 기공의 유형 (즉, NP150 / NP200)은, "샘플 ID '는 샘플의 이름 S ( 샘플을 희석 한 경우 (100)를 입력 100 배) '압력'는 cm의 샘플에 가해진 압력 (인 - 섹션 7.8 참조), '전해질 ID'는 상기 샘플에서 만든 버퍼의 이름이고, 그리고 ' 참고 '샘플 또는 실행에 대한 개인 노트입니다.
- 각 샘플의 실행 사이까지 (-5 cm (진공), 5, 10 cm (양압) -10- 통상) 상부 유체 세포로 수회 PBST 40 ㎕의 버퍼를 배치하고 다양한 압력을 적용하여 시스템을 씻어 더 이상 봉쇄 이벤트가 시스템에 남아있는 잔여 입자와 샘플 사이 따라서없이 교차 오염이 없을 보장 존재한다. 각각의 반복 샘플 사이에 완성 된이 세척 단계와 세중의 실행 샘플을 아로 실행다른 샘플 사이와 같은 리터.
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Representative Results
자기 정화 및 TRPS 측정 공정의 도식 표현도. 샘플을 함유하는 과량의 비 결합 캡쳐 프로브 DNA. B)로 시작 샘플 자기 정제) 실시 예는 측정 예를 TRPS I) 입자 일시적인 감소를 일으키는 나노 기공을 통과 II) 봉쇄 이벤트 세공의 입자를 일시적으로 폐색 이온으로부터 제조 전류; 입자 전위의 속도를 계산하는 데 사용되는 정보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모든보고하지 같이 샘플로부터 입자의 표면에 결합되지 않은 과잉 DNA의 제거는, TRPS 분석에 중요하다 이전'거짓 양성'결과. SPPS를 추출하고 씻어 자석을 사용하는 능력은 TRPS (그림 1A)에 대한 큰 이점이다.도 1b는 기공을 가로 지르는 TRPS 측정 및 입자로 달성 예를 들어 '봉쇄 이벤트'의 기본적인 예를 설명합니다. 첫째, 우리는 TRPS 비슷한 크기의 샘플 사이에 있지만 상당히 다른 혐의 구별 할 수있는 높은 처리량 기술이 있음을 증명하고있다. 단일 측정에 동시에 크기와 비용 분석을 완료 할 수있는 능력은 그림 2에서 볼 수 있습니다. 더 수정 (라이트 핑크 데이터 세트) 및 코팅 입자를 2는) 크기의 예입니다 그림과 스트렙 타비 딘의 b)는 제타 전위 분석 표면에 단일 가닥 DNA (청색 데이터 세트)로 포화 된 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 포함한다. 두 샘플은 크기가 비슷했지만 DNA 방지 동작이되었을 때, 제타 전위가 훨씬 더 크게 달랐다입자의 표면에 onalized.
그림 2. 크기와 DNA 수정 및 수정되지 않은 스트렙 타비 딘 코팅 된 나노 입자의 제타 전위 분석. 빛 핑크 바는 수정되지 않은 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자를 대표하고 파란색 막대는 DNA 변성 입자를 나타냅니다. 입경 (㎚) 대 A) 빈도 (%)를. 제타 전위 (MV) VS B) 빈도 (%). Blundell은 등. (19)에 보충 데이터에서 적응 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
뿐만 아니라이 기술은 입자 변성 및 변성 DNA를 구분할 수있는 것은, TRPS 또한 파 DNA 혼성화 상이한 농도로 시료를 구별 할ticle면. 그림 3 (210 nm의 청색 데이터 세트)를 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자에 하이브리드 DNA의 농도를 크기와 제타 전위 가장 낮은과 샘플 전시 된 데이터 (10 nM의, 밝은 녹색 데이터 세트) 및 최고를 보여줍니다. 더 큰 제타 전위 값은 DNA의 높은 농도와 하이브리드 입자에 대해 기록된다.
그림 3. 동시 크기와 단일 TRPS 측정에서 캡처 한 제타 전위 데이터. 푸른 색 막대 / 데이터 포인트는 210 나노 CP의 DNA 광 녹색 막대와 하이브리드 스트렙 타비 딘 코팅 입자의 대표 / 데이터 포인트는 10 나노 CP의 DNA 혼성화 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 나타낸다. Blundell은 등. (19)에서 적응 그림. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
산점도의 각 데이터 포인트는 모든 샘플 깊이가 입자에 의해 입자 분석을 허용하는 샘플 모집단 중에서 하나의 입자를 나타낸다는 것을 주목하는 것이 유용하다. (4 DNA 구조의 작은 변경을 결정하는 기법의 효율성을 지원 도표 단일 가닥 및) DNA 이중 가닥뿐 아니라 감도의 높은 수준을 보여주는 포획 프로브의 다른 영역으로 타겟 동일한 크기의 DNA하지만 결합과 샘플의 차이를 식별하는 (즉, 중간 결합 최종 결합 대상 도시 그림 4). 왼쪽에서 오른쪽으로,도 4에 도시 된 입자는 다음과 같은 표면 변형을 가진 것들이다; 포획 프로브 (CP)에만 DNA, CP와 완벽하게 보완 DNA 대상, CP와 중간 결합 DNA 대상, CP 및 종료 바인딩 DNA 대상, CP 및 돌출 DNA 대상입니다.
. DNA 대상의 범위와 DNA 변성 입자를 측정 제타 전위 그림 4. 상대 변경 전에서, 제타 전위에 MV 변경) CP는 DNA 대상의 범위에 입자를 작용; ⅱ) 완전 보완, ⅲ) 중간 바인딩, ⅳ) 바인딩, v)의 돌출 목표를 종료합니다. 오차 막대는 표준 편차를 N = 3을 나타낸다. Blundell은 등. (19)에서 적응 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제타 전위의 계산 Arjmandi 외. 21 일에 관련된 보정 기반 방법을 사용 하였다. 입자의 전위의 길이가 나노 기공이 규칙적 원추형 구멍의 전체에 걸쳐 평균 전계 입자의 속도를 이용하여,인가 전압의 함수로서 측정된다 이송있다. 전기 영동 이동성 감지 영역 길이의 제곱 L 곱한 전압에 대한 (T는 봉쇄 기간 임) 1 / T의 유도체이다. 감지 영역을 통해 다수의 기준 포인트의 평균 속도는이 방법을 사용하여 제타 전위를 계산하는데 최소한의 에러를 허용하도록 측정된다.
기공의 보정은 감지 지역에서 각 기준점에서의 전압, V, 대 1 / T의 선형성에 기초한다. 교정 및 샘플 입자들의 동전 기적 입자 속도,업로드 / 54577 / 54577eq2.jpg "/>와 
각각 자신의 제타 전위와 관련된, 
과 
로는 12, 20 또는 Smoluchowski 근사에 주어진 둘 사이의 선형 관계를 가정하면, 수학 식 1에 도시. 모두 교정 및 샘플의 순 제타 전위 값은 입자의 제타 전위 막 제타 전위의 차이이다 
. 폴리 우레탄 세공의 제타 전위는 전위 기법이 연구 PBS에서 -11 MV 12, 18 등을 스트리밍하여 측정 하였다.
(1)
각 입자의 제타 전위, I, ![식 (8)]("/files/ftp_upload/54577/54577eq8.jpg"/>)
시간 후의 세공 내의 입자의 위치이며, t는 T의 X를 = 및 
상대 위치 리터 X에서 단일 샘플 입자 I의 입자 속도이고; 
, 
, P 및 V는 샘플 기적 단위 전압 당 속도, 단위 압력 당 대류 속도,인가 압력 및 전압이 식의 전체 도출은 Blundell은 외. (19)에 의해 작업에서 발견 될 수 있고, 각각 그로써.
스트렙 타비 딘 코팅 나노 입자 포획 탐침 DNA를 결합하면 연구자가 용액에 남아있는 과량의 비 결합 캡쳐 프로브 DNA를 제거하는 것이 중요하다. 이것은 SPPS 새로운 PBST 버퍼로 상청액의 신속하고 간편한 교체를 허용하는 간단한 자석을 이용하여 용이하게 수행된다. 과량의 캡쳐 DNA가 용액 내에 좌측 및 타겟팅되는 경우 DNA는 타겟 DNA 오히려 SPP 표면보다도, 용액 중의 유리 캡쳐 DNA에 결합 할 수있다 첨가. 타겟 DNA가 입자의 표면 상에 포획 프로브에 결합하면, 본 입자 속도와 제타 전위의 변화 만이 관찰된다.
분석 및 하나 이상의 기공 멤브레인의 사용을 필요 TRPS를 사용하여 여러 날에 걸쳐 많은 수의 샘플의 비교. 일부 기공으로 인해 제조 공정 및 이러한 경우의 크기에 약간의 차이가있을 수 있고, 기준 전류를 보장해야하는 사용자의 모든 RU 걸쳐 동일하게 유지NS. 동일한 기준 전류가 관찰되는 경우, 얻어진 결과는 기공 사이의 비교이다. 기준선 이전 실행과 동일하면, 사용자들이 기공을 통과 같은 입자 전위 속도의 정확한 결정을 허용하도록 교정과 시료 사이 실행 변하지 신축성을 유지하는 것이 필수적이다.
TRPS 기술 실험 중 쉽고 빠르게 분해 할 수있는 비교적 간단한 셋업을 갖는다. 문제를 해결하는 경우,이 프로세스가 훨씬 쉽게 만들 수 있습니다. 예를 들어, 분석을 착수 할 때, 하부 유체 세포 또는 상부 유체 셀 내에 기포를 허용하지 않는 것이 중요하다. 이 불안정한 기준 전류로 이어질 것입니다. 기포가 상부 유체 세포에 존재하는 경우, 샘플을 제거하고 교체 할 수있다. 기포가 낮은 유체가 셀에 표시하는 경우, 완충액을 제거하고 신선한 완충액으로 대체되어야한다. 거품이 지속적인 문제이라면, 너무 많은 활성제가있다용액에 16 그래서 감소 될 수있다 (우리는 단지 0.05 % 트윈 20을 사용한다). 크기의 기공 크기를 초과하는 경우 또는 시료의 농도가 너무 높으면, 일부 샘플은 세공을 차단할 수있다. 이 문제를 해결하여, 기공 크기는 신축성을 증가시킴으로써 증가 될 수 있거나 샘플은 낮은 입자 농도 16로 희석 될 수있다. 큰 응집물이 많이 존재하는 경우가 단일 입자 분석을 위해, 샘플은 또한 와류에 중요 세공을 차단할 수 있고 TRPS을 실행하기 전에 샘플을 초음파 처리.
다른 방법의 사이에, TRPS 동시에 개별 입자의 크기와 비용 측정을 완료 할 수있는 기능 등 다양한 장점을 가지고; 복합 샘플 수는이 방법을 사용하여 효과적으로 분석 할 수 있습니다. 하나의 장점은 간단히 봉쇄 진폭, Δ를 <수득 스트레치와 전압을 변화시킴으로써, 특정 샘플 분으로 최적화 할 수있는 신호 생성 / 봉쇄이고/ EM> 백그라운드 잡음보다 상당히 크다 (봉쇄 배경 잡음 <10 pA를 비교 나트륨 척도이다). 기공 크기는 해당 검체의 크기에 대해 조절 될 수있는 고체 세공 기술이보다 다양한 기능에있어서, 상기 기공의 신축성을 변경할 수하게되며; 이러한 응집이 원래 고체 세공 크기 범위를 초과하는 크기 분석 될 수 DNA 결합 단백질 등의 효과를 조사 할 때 특히 유용하다. TRPS의 또 다른 바람직한 태양은 방법의 민감도 수준이다. 결합 대상 DNA의 위치에 기초하여 (DNA의 동일 양이 첨가되어있다 (추가 충전 동량) 및 샘플 크기가 같고) 결합 DNA에 미묘한 차이를 탐지하는 능력은이 분야에서 아주 심오 분석 및 향후 나노 입자 분석 디자인 플랫폼을위한 훌륭한 사용 될 것입니다. 각각의 미묘한 다를줬어 검출 및 TRPS 기술의 입자에 의한 입자의 성질을 이용하여 분리 될 수있다. 이 분석을 초과하는 동적 광산란 또는 단순히 샘플 모집단의 평균 분석 게이지하고 복합 샘플 6,7의 경우 구별 할 수 광자 상관 분광법 등의 앙상블 기법.
소형 고체 나노 기공 (100-200 나노 미터)도 입자 역학을 모니터링하는 데 사용되었으며, 입자의 직경이 나노 기공 (22, 23)의 접근하기 시작 입자 이동도 영향을받을 수 있음을 발견 하였다. (본 연구에서 사용 된 바와 같은)를 분석하고있는 입자보다 훨씬 큰 나노 세공은 세공 내 입자의 이동에 영향 따라서 전위 역학 이하있다. 멀티 모달 샘플에서이 초과 된 입자로 구성되는 경우, 그래서 본 연구에 사용 된 세공 그러나 이들 분석 크기 범위에 한정되며, 예를 들면 NP150는 60-480 nm의 크기 범위를 갖는다제한들은 다음 막힐 수 기공 같은 세공에서 분석 될 수 없다. 모두 크기 분석 범위 내에 비록 60 및 480 nm의 입자 (기공의 절대 낮고 높은 한계에 해당)를 포함하는 바이 모달 샘플을 측정하면, 예를 들어, 다른 신축성 및 전압 조건을 필요 유의하는 것이 중요 기공의. 큰 입자에 요구되는 신축성은 샘플 동작 동안 배경 잡음으로 간주되므로, 반드시 측정되지 수 (감소 된 저항 기준)은 특히 작은 봉쇄 크기를 갖는 작은 입자를 야기하기 때문이다.
거품은 샘플이 실행을 완료 할 수 없습니다되는 불안정한 기준 전류를 생성합니다 하부 또는 상부 유체 셀에 거품으로 샘플 측정에 문제가 될 수 있습니다. 비등 자연의 전해질 (예를 들어 일부 고농도의 생물학적 매체는) REQ 따라서 샘플을 실행하고 어려울 수 있습니다이러한 특정 매체에 정지를 uiring하는 것은 문제가 될 수 있습니다. 대부분의 샘플하지만, 크게 희석 또는 TRPS 분석하기 전에 다른 버퍼에 일시 중지 할 수 있습니다.
상기 방법은 적응하며 단백질, DNA, 소분자, 응집 분석 17,24 중요한 생물학적 입자들의 분석을 포함하여, 나노 입자 - 기반 분석의 범위를 분석 할 수있다. 분석의 광대 한 범위의 특성에 TRPS의 다양성은 약물 전달 1,25, 26 ~ 28을 바이오 센싱, 환경 시험 등의 분야의 범위 내에서 잠재적 인 기술을 보여줍니다.
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Disclosures
ELCJB는 Izon 과학 (주)에 의해 지원됩니다
Acknowledgments
저자는 그들의 지원을 위해 Izon 과학 (주) 감사합니다. 이 연구는 연구 (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio)에 대한 유럽위원회 (European Commission)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
| Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
| Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
| Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
| Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
| Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
| Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
| Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
References
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