Summary
Burada tek tek nanopartiküllerin zeta potansiyelini belirlemek için kullanılabilir partikül translokasyon hızlarının ölçümü ile nanopartiküller yüzey kimyası karakterize etmek için bir dirençli darbe algılama tekniği entegre bir poliüretan ayarlanabilir Nanopore kullanımı.
Abstract
Dirençli Darbe Sensörleri (RPS) olarak topluca bilinen nanopore teknolojileri, tespit ölçmek ve proteinler, moleküller ve nanopartiküller karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ayarlanabilir direnç darbe algılama (TRPS) gerçek zamanlı olarak değişmiş olabilir ayarlanabilir bir gözenek içeren RPS için nispeten yeni bir uyarlamasıdır. Bunlar DNA konsantrasyonu ve yapısının bir fonksiyonu olarak ayarlanabilir bir gözenek membran çapraz olarak burada, DNA-modifiye edilmiş nanopartiküller translokasyon kez izlemek için TRPS kullanımı (örneğin, tek sarmallı iki-şeritli DNA'ya).
TRPS uygulanan bir elektrik alanı üzerine bir sabit iyon akımı oluşturan elastomerik bir gözenekli membran ile ayrılmış, iki Ag / AgCI elektrot dayanır. Çeşitli optik tabanlı parçacık karakterizasyonu teknolojilerinin aksine, TRPS modelli örnekleri kolaylıkla analiz edilmesi için izin, bir örnek nüfusu arasında bireysel parçacıklar karakterize edilebilir. Burada, zeta potansiyel ölçümleri göstermektedirBilinen standartların parçacık translokasyon hızlar aracılığı ile ve böylece bu analitlerin zeta potansiyelini ölçmek sonuçlanan analit translokasyon kez örneklemek için bu geçerlidir.
Yanı sıra ortalama zeta potansiyeli değerleri elde olarak, numune, tüm Örneğin, örnek nüfustan vasıtası ile verilen bir örnek üzerinde daha ayrıntılı bilgi gösteren bir parçacık tarafından tanecikli perspektif kullanılarak ölçülür. Böyle ki, bu yöntem hem tıbbi ve çevresel alanlar için algılama uygulamaları içinde potansiyelini göstermektedir.
Introduction
Fonksiyonlu nanopartiküller, tıbbi ve çevresel alanlarda hem biyosensörler olarak giderek daha popüler hale gelmektedir. Kabiliyeti, örneğin, hedeflenen ilaç verme sistemleri 1 ve izleme, DNA-protein etkileşimleri 2-4 için yararlı olduğunu kanıtlamaktadır, DNA ile, bir nanopartikül yüzey kimyasını değiştirmek için. Giderek yaygınlaşan bir nanoparçacık mülkiyet biyo-deneylerde kullanılan ve terapötik teslim süperparamanyetizma 5'tir ediliyor. Süpermanyetik parçacıklar (SPSS) belirlenmesi ve karmaşık karışımlarından özel analitleri çıkarılmasında son derece yararlıdır ve tek bir mıknatıs basit kullanımı ile bunu yapabilirsiniz. Bir kez çıkarıldı analit-bağlanmış parçacıklar, özelliği ve amaca uygun olarak analiz edilebilir.
Nanopartiküllerin saptanması ve tanımlanması için kullanılan önceki metotlarda, aksi foton korelasyon spektroskopisi olarak bilinen bu dinamik ışık saçılımı (DLS) gibi optik teknikler bulunmaktadır. Bir hi rağmengh throughput tekniği, DLS bir ortalama bazlı teknik olmak ve uzman bir yazılım ilavesi olmadan multimodal numunelerin analiz ederken sınırlıdır, büyük partiküller 6,7 tamamen fark edilmeden küçük parçacıkların bazı bırakarak, çok daha baskın bir sinyal üretecek. Parçacık-by-parçacık karakterizasyon teknikleri bu nedenle çok daha olumlu nanoparçacık ve fonksiyonlaşmış nanoparçacık sistemlerini analiz etmek vardır.
RPS tabanlı teknolojiler bir numuneye bir elektrik alanı uygulanması ve bir sentetik veya biyolojik nano-gözeneklere içinde parçacık taşıma mekanizması takip etrafında dayanmaktadır. RPS dayalı nispeten yeni nanoparçacık algılama ve karakterizasyonu tekniği ayarlanabilir direnç darbe algılama (TRPS) 8-16 olduğunu. TRPS bir elastomerik, ayarlanabilir bir gözenek membran ile ayrılmış, iki elektrod sistemidir. Ayarlanabilir bir gözenek yöntem, trans-ölçülebilir şekil 17 ve boyutu, bir dizi analitlerin sağlargözenek yoluyla liman mekanizmaları. Ayarlanabilir gözenekler, daha önce bu transmisyon elektron spektroskopisi (TEM), 10 gibi başka teknikler ile karşılaştırılabilir sonuçlar elde küçük parçacıkların saptanması (70-95 nm çapında) kullanılmıştır. bir elektrik alanı uygulandığında, iyonik akımı görülmektedir ve parçacıklar / molekülü gözenek geçerken, geçici olarak bir "blokaj etkinliği" olarak tanımlanabilir mevcut bir azalmaya neden gözenek bloke eder. Bir örnek içindeki her parçacık, özelliği tek tek blok büyüklüğü, ö göre böylece, her blokaj etkinliği tek bir parçacık temsili 
Ve tam genişliği yarım maksimum FWHM, hem de diğer blokaj özellikleri. bir nanopore geçerken tek tek parçacıkların analiz parçacık amon boyutları ve TRPS başarılı ve etkili bir dizi ayırt gibi multimodal numuneler için avantajlıdırTek bir örnek GST. Ayarlanabilir direnç darbe algılama boyutu 10, tek bir vadede aynı anda zeta potansiyeli 12,18 ve konsantrasyon 15 ölçümleri tamamlar ve hala benzer örnekleri ayırt nedenle eğer kendi yüzey yükü 19 tarafından değil aynı boyutta; Alternatif boyutlandırma teknikleri üzerinde bir avantaj.
Zeta potansiyeli kesme 20 düzleminde elektrostatik potansiyel olarak tanımlanır ve bir gözenek 19 çapraz olarak parçacık hızları hesaplanır. Bireysel partiküllerin zeta potansiyel ölçümleri böylece translokasyon mekanizmaları ve çözelti içinde nanoparçacık sistemleri, uygulamaları bir dizi için nanoparçacık tahlil tasarımları geleceği için değerli bilgilerin davranış içine bir fikir verir. Bu tür doğa parçacık-by-parçacık analizi de o daha fazla bilgi için izin veren bir örnek halk arasında yayıldı ve zeta potansiyeli değerlerinin dağılımı keşfedilmeyi sağlarçözelti içinde n tepkime kinetik (örneğin, iki-şeritli DNA, tek bükümlü) ve partikül stabiliteleri elde edilmesi.
Burada, algılar ve değiştirilmemiş ve DNA modifiye SPP yüzeyleri hem karakterize bir tekniği açıklar. Burada tarif edilen protokol, inorganik ve biyolojik nanopartiküllerin bir dizi için geçerli olmakla birlikte, bağlı uygulama bunların geniş bir DNA modifiye edilmiş yüzeyler kullanılarak prosedürü göstermektedir. tekniği Kullanıcı böylece partikül translokasyon bir gözenek sistemi ile hızları ve zeta potansiyeli göre bir nanopartikül yüzey üzerinde tek sarmallı ve çift sarmallı DNA hedefleri ayırt sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tween-20 (PBST) Tamponu ile fosfat tamponlu tuzlu su yapma
- 200 ml deiyonize su (18.2 cm) bir PBS tablet (0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür, 0.137 M sodyum klorür, pH 7.4) içinde çözülür.
- bir yüzey aktif madde olarak 200 ml tampon çözeltiye 100 ul (0.05 (hac / hac)%) Tween-20 ekleyin.
2. Karboksil Polistiren Parçacık Standartları Hazırlama
- parçacıkların bir tekli dağılırlık oluşturmak için 80 watt olarak 2 dakika boyunca sonike edilmeden önce 30 saniye için kalibrasyon parçacıkları vorteksleyin.
- 30 sn için PBST tamponu ve vorteks 1x10 10 parçacık / ml 'lik bir konsantrasyona kadar kalibrasyon parçacıkları 100'de 1 seyreltin.
3. Hazırlanması streptavidin kaplı partiküller
- bir tekli dağılırlık sağlamak için 80 watt olarak 2 dakika boyunca sonike edilmeden önce 30 saniye boyunca parçacıkları vorteksleyin.
- AC PBST tamponu içinde 100 streptavidin kaplı partiküller 1 seyreltin30 saniye boyunca bir elde 1x10 9 parçacık / ml konsantrasyon ve girdap hieve.
Not: Tipik bir örnek hacmi 200 ul. Örneğin, soruşturma varsa beş DNA konsantrasyonları seyreltilmiş streptavidin kaplı partiküllerin 1 ml hazırlamak.
Oligonükleotid 4. hazırlanması
- 100 uM'lik bir elde edilen konsantrasyona kadar deiyonize su ile oligonükleotitleri sulandırın.
Streptavidin kaplı partiküller Yakalama Prob (SP) DNA 5'tir
- DNA bağlama önce, girdap 80 watt bir 2 dakika sonikasyon ile, ardından 30 saniye boyunca streptavidin ile kaplı parçacıklar (200 ul numune hacmi).
- satıcılar (4.352 pmol / mg) tarafından sağlanan bir bağlanma kapasitesine dayanarak, 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 ve 210 nm elde edilen DNA konsantrasyonları için partiküllerin DNA'nın uygun bir konsantrasyon ilave edin.
- Oda sıcaklığında bir döner tekerlek üzerinde 10 saniye ve yer Numuneler vorteksleDNA, bir streptavidin-biyotin etkileşimi yoluyla partikül yüzeylerine bağlanma için 30 dakika izin vermesi.
- Yakalama DNA eklenmiş ve streptavidin kaplı partiküller ile inkübe edildikten sonra, 30 dakika için bir manyetik raf üzerine numuneler yerleştirilerek manyetik ayırma ile çözelti içinde fazla DNA çıkarın.
- mıknatısa yakın parçacıkların yeni kurulan küme rahatsız etmemek için özen Süpernatantı ve yeni PBST aynı hacimde tampon ile değiştirin.
6. CP-partiküllerine tamamlayıcı DNA Hibridize
- ulaşıldı bağlanma mümkün olan en yüksek hedef sağlamak için (500 nM'de fazla) hedef DNA gerekli miktarda ekleyin.
- Girdap, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir döner tekerlek üzerinde 10 saniye ve yer örnekleri.
- melezleştirme işlemi tamamlandıktan sonra, 30 dakika için bir manyetik raf üzerine numuneler yerleştirilerek manyetik ayırma ile fazla hedef DNA çıkarın.
- süpernatantı, Özen mıknatıs yakın parçacıkların yeni kurulan küme rahatsız ve yeni PBST aynı hacimde tampon ile değiştirmek için değil.
- Tekrar 6.1 Kopya örnekler için 6.4 adım ve bunların DNA hibridizasyon kez araştırmak için 16 saat boyunca oda sıcaklığında bir döner tekerlek üzerine, bu örnekleri yer.
7. TRPS Kurulumu
- yerinde yazılımı ile bilgisayar sistemine enstrüman takın.
- Bir kumpas kullanarak ilk streç kalibre edin.
- iki paralel çenelerin dış arasındaki mesafeyi ölçün.
- 'Çalgı Ayarları' sekmesinde 'streç' alanına streç yazıp sekme altındaki 'streç kalibre' tıklayarak yazılımı içine girdi.
- Yanal nanopore kimlik numarası yukarı bakacak şekilde çeneleri üzerine analiz için uygun boyutlandırma bir poliüretan nanopore membran uygun. Daha sonra, analiz kullanmak için gereken esneme çeneleri streçCihazın yan streç ayar kolu. 43 ve 48 mm arasında çeneleri gerin.
Not: streç tam değer uygulanan voltaja yanında kararlı olduğunu kalibrasyon parçacık blokajları boyutu en az 0.3 nA böylece. streç zaten adım 7.2 yazılımı içine girilen ve çeneler gergin olarak otomatik olarak ayarlanır. - sağlanması, nanopore altında, alt sıvı hücrede PBST tamponu 80 ul yerleştirin ölçümü etkileyebilecek mevcut hava kabarcığı vardır. kabarcıklar görülür varsa, kaldırmak ve tampon değiştirin.
- yerine üst sıvı hücreyi tıklatın ve içine tampon 40 ul koyun, tekrar sağlanması hava kabarcığı mevcut bulunmamaktadır. kabarcıklar üst sıvı hücrede varsa, sıvı değiştirerek bunları kaldırın.
- tekrarlanabilir bazal akım tamponu ile üst sıvı hücre yerine gelen ulaşıldığında, 'st tıklayarak üst sıvı hücre ve ölçüye örnek 40 ulyazılım ekranda veri toplama 'sekmesinde' in 'sanat.
Not: Bu 'Analiz Data' sekmesinden yazılımı kullanılarak değiştirilebilir, ancak veri toplama ( 'Analiz Ayarları' ve 'Dirençli blokajları' altında), 0.05 nA bir abluka büyüklüğü alt sınırı ile 50 kHz frekansta tamamlandı . - ölçümlere elektrik arka plan gürültüsünü azaltmak için sıvı hücre sisteminin üstünden bir Faraday kafesi yerleştirin.
- örnekler bir basınç veya vakum uygulamak için bir değişken basınç modülü (VPM) kullanın.
- harici bir basınç üst sıvı hücreye memesini bağlamak uygulamak için, daha sonra basınç kolu döndürün ve (bir pozitif basınç (PRE) ya da bir vakum (VAC) uygulanacaktır bağlı olarak) yerine tıklayın.
- VPM üstünde yer alan basınç sahne düğmesini kullanarak bir 'cm' veya 'mm' ölçekte basınç uygulayın. 't cm ölçekte baskı uygulamak ve yukarı çekin aşağı düğmesine basınızo 'mm' ölçekte basınç uygulayın.
TRPS Analizi 8. Hazırlama Örnekleri
- önceden TRPS analizi 80 watt, 2 dakika için 30 saniye ve sonikasyon vorteksleyin örnekleri.
9. Zeta Analizi için nanopore Kalibre
- Üst sıvı hücreye 40 ul kalibrasyon parçacıkları (1x10 10 parçacıklar / ml) yerleştirdikten sonra, 3 gerilimler uygulanan en (bölüm 7 gibi kurulum) bir TRPS ölçümünü tamamlamak. '-' Tuşları gerilim ölçekte yazılım üzerinde 'Enstrüman Ayarları' sekmesinde '+' ve tıklayarak gerilimi Alter.
- nA 3 gerilimler yaklaşık 140, 110 arka plan akımlarını dönmek olduğunu kontrol edin ve 80. orta gerilim kalibrasyon partikülleri en az 0.3 nA ortalama abluka büyüklüğü üretmek emin olun.
- Kalibrasyon parçacıkların ortalama tam genişlikte yarım maksimum (FWHM) süreleri en az böylece bir basınç uygulayın0.15 ms. elle değişken basınç modülüne bağlı basınç kolu kullanarak bunu. istenilen konumda tıklar ve buna göre adım 7.8.2 talimatları kurmak aşağıdaki uygulamak kadar kol çevirerek seçiniz basıncı (PRE) veya vakum (VAC). Bu koşullar elde edildikten sonra, 'Veri Toplama' sekmesinde yazılıma 'başlangıç' tıklayarak çalışma başlatmak.
- En az 500 partiküller (Ölçüm sırasında yazılım ekranın alt kısmında 'Partikül Sayısı' bölümüne bakınız) ölçülmüştür ve çalıştırma 30 saniye aştı zaman '(bkz' Veri Toplama 'sekmesinde' dur 'tuşuna basarak çalıştırmak tamamlayın Ayrıca ekranın alt kısmına doğru Run Time ').
- Yeni Nanopore tanıtıldı her zaman tarif edilen veya adım 9,1-9,4 tamamlayarak analiz her yeni gün için bir kalibrasyon çalışmasını tamamlayarak sistemi kalibre edin.
10. Bir örnek çalışan
- en yüksek örnekleri çalıştırmak veyaBenzer bir (± 10 nA) sağlanması kalibrasyon örnekleri olarak ikinci en yüksek voltaj, değilse aynı bazal akım.
- Uygun baz akımı elde edilir, örnek 40 ul üst sıvı hücreye elektrolit değiştirin. Bir örnek verildiğinde, abluka sinyal iz üzerinde görülecektir. 'Veri Toplama' sekmesinde 'başlangıç' tıklayarak çalıştırın örnek başlatın ve 500 parçacıkların en az kayıt (sinyal iz altında yer alan 'Parçacık Sayısı' kontrol edin) ve çalışma süresi sağlamak 30 sn minimum ( 'Çalıştır bkz Ayrıca, sinyal izleme altında yer zamanı ').
- Ölçümü tamamlamak için 'Veri Toplama sekmesinde "' dur 'tıklayın ve veri dosyası kaydedin.
- Dosyayı, giriş aşağıdaki biçimde dosya bilgileri kaydetmek için; 'Soruşturma' dosyasında kaydedilir klasör, 'Nanopore kimliği' gözenek seri numarası i, 'Parça' kullanılmakta olanNumune seyreltilmiş ise 'seyreltme' kullanılan bir kalibrasyon veya numune ölçüm, olup olmadığını 'Kalibrasyon ya da örnek bilgilerini, gözenek tipi (yani, NP150 / NP200),' Numune No 'örnek adıdır s ( numune seyreltilmiş ise 100 tip 100 kat), 'basınç' cm numuneye uygulanan basınç (bir - bölüm 7.8 bakınız), 'Elektrolit kimliği' örnek olarak oluşur tampon adıdır ve ' Notlar 'numune ya da kaçak hakkında herhangi bir kişisel notlar vardır.
- Her bir numune çalışması arasındaki kadar (-5 cm (vakum) ve 5 ve 10 cm (pozitif basınç) -10 ° C'de, genellikle) üst sıvı hücreye birkaç kez PBST 40 ul tampon yerleştirilmesi ve çeşitli basınçlar uygulanarak sistemi yıkama artık abluka olayları sistemde kalan hiçbir kalıntı parçacıklar ve numuneler arasında bu nedenle hiçbir çapraz kontaminasyon vardır sağlanması, mevcut bulunmaktadır. Her tekrar numune arasına tamamlanan bu yıkama aşamasında olan üç nüsha olarak çalıştırın numuneler wel olarak çalıştırmakFarklı örnekler arasında olduğu l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manyetik saflaştırma ve TRPS ölçüm süreçlerinin 1. şematik gösterimi Şekil. Bir numune içeren fazlalığı, ilişkisiz yakalama prob DNA. B) ile başlayan numunenin manyetik arınma A) Örnek ölçüm örnek TRPS i) Parçacık geçici bir azalmaya neden nanopore geçerek ve ii) Blokaj olay gözenek parçacık geçici olarak kapatılmasıy iyonlar üretilen akım; Parçacık translokasyon hızları hesaplamak için kullanılır hangi bilgiler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
herhangi bir rapor olarak örneklerinden parçacıkların yüzeyine bağlanmış olan herhangi bir fazlalık DNA kaldırılması, TRPS analizi için önemlidir öncedir'Yalancı pozitif' sonuç. SPPS'si ayıklamak ve yıkamak için bir mıknatıs kullanma yeteneği TRPS (Şekil 1A) için büyük bir yarar vardır. Şekil 1B gözenek erişir bir TRPS ölçümü ve bir parçacık olarak elde bir örnek 'abluka olay' temel bir örneği açıklanmaktadır. İlk olarak, TRPS benzer boyutta numuneler arasında, ancak önemli ölçüde farklı bir şarj ayırt bir yüksek kapasiteli bir teknik olduğunu göstermiştir. Tek bir ölçüm aynı anda, her boyut ve şarj analizini kabiliyeti Şekil 2'de görülebilir. Herhangi bir değişiklik (açık pembe veri seti) ile kaplı partiküllerin 2) boyutu bir örneğidir, Şekil ve streptavidin b) zeta potansiyeli analizi yüzey üzerinde tek-şeritli DNA (mavi veri seti) ile doyurulmuş streptavidin kaplı parçacıklar. Her iki numuneler benzer bir boyutu olmasına rağmen DNA fonksiyonel iken, zeta potansiyeli çok daha büyük ölçüde farklı olduğu veparçacığın yüzeyine onalized.
Şekil 2. Boyutu ve DNA-modifiye edilmiş ve edilmemiş streptavidin kaplı nanopartiküllerin Zeta potansiyeli analizi. Açık pembe çubuklar değiştirilmemiş streptavidin kaplanmış parçacıklar temsil ve mavi çubuklar DNA modifiye parçacıklar temsil etmektedir. Parçacık çapı (nm) vs A) Frekans (%). zeta potansiyeli (mV) vs B) Frekans (%). Blundell ve ark., 19 ek verilerden adapte Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sadece tekniğin parçacıkları değişikliğe uğratılmamış ve DNA ile değiştirilmiş arasında ayrım, TRPS ayrıca eşit hibridize DNA farklı konsantrasyonları ile örnekleri arasında ayrımTICLE yüzey. Şekil 3 (210 nM, mavi veri seti) streptavidin kaplı parçacıklar hibridize DNA konsantrasyonları büyüklüğü ve zeta potansiyeli düşük olan numuneler için sergilenen verileri (10 nM, açık yeşil veri seti) ve en yüksek gösterir. Daha büyük bir zeta potansiyeli değeri DNA daha yüksek bir konsantrasyon ile hibridize partiküller için kaydedilir.
Şekil 3. Eşzamanlı boyut ve tek TRPS ölçümü yakalanan zeta potansiyel veri. mavi çubuk / veri noktaları 210 nM CP DNA ve açık yeşil çubuklar ile hibridize streptavidin kaplı partiküllerin temsilcisi / veri noktaları 10 nM CP DNA ile hibridize streptavidin kaplanmış parçacıklar temsil etmektedir. Blundell ve ark., 19 uyarlanmıştır Şekil. Görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Dağılım arsa içinde her bir veri noktası her numune ile derinlemesine parçacık-by-parçacık analizi için izin veren bir örnek nüfus arasında tek bir parçacık temsil ettiğini not etmek yararlıdır. (4 DNA yapısında küçük değişiklikler belirlenmesinde tekniğin etkinliğini destekler Şekil tek iplikli) sarmal kollu DNA, çift, hem de hassasiyeti yüksek seviyede gösteren yakalama probunun farklı bir alana hedefi, aynı büyüklükte DNA ancak bağlı olan örneklerde farklılıkların belirlenmesi (yani, orta bağlanması ve End bağlayıcı hedefler gösterilen Şekil 4'te). Soldan sağa doğru, Şekil 4'te gösterilen parçacıkları, aşağıdaki yüzey modifikasyonları olan; Yakalama sondası (SP) hem DNA, CP ve tam tamamlayıcı DNA, hedef CP ve bir orta bağlayıcı DNA hedef CP ve bir son DNA bağlama hedefi, CP ve sarkan DNA hedef.
. DNA hedefleri bir dizi DNA modifiye parçacıklar için ölçülen zeta potansiyeli Şekil 4. Bağıl değişiklik i dan, zeta potansiyeli mV değiştirin) CP DNA hedefleri bir dizi parçacık fonksiyonlaşmış; ii) Tam tamamlayıcı, iii) Orta bağlama, iv) bağlayıcı, v) taşkın hedef End. Hata çubukları, standart sapmayı n = 3 temsil eder. Blundell ve ark., 19 uyarlanmıştır Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zeta potansiyeli için hesaplama Arjmandi ve ark., 21 işe ilişkin bir kalibrasyon tabanlı yöntem kullanılır. parçacıkların translokasyonu süresi bir nanopore düzenli konik gözenek tümü boyunca bir ortalama elektrik alanı ve parçacık hızları kullanılarak, uygulanan voltajın bir fonksiyonu olarak ölçülür çapraz olarak. Elektroforetik mobilite algılama bölgesi uzunluğunun karesine, l ile çarpılan gerilime göre (T blokajı süresi) 1 / T türevidir. algılama bölgesi üzerinden birden fazla referans noktaları ortalama hızları bu yöntemi kullanarak zeta potansiyelinin hesaplanmasında asgari hatalar izin vermek için ölçülür.
Gözenek kalibrasyon algılama bölgesi, her bir referans noktasındaki gerilim, V, vs 1 / T doğrusal dayanır. Kalibrasyon ve örnek parçacıkların elektrokinetik parçacık hızları,upload / 54577 / 54577eq2.jpg "/> ve 
sırasıyla, onların zeta potansiyelleri ile ilgili, 
ve 
Gibi Smoluchowski yaklaşım 12,20 'de verilen bu ikisi arasında doğrusal bir ilişki varsayılarak, Denklem 1' de gösterilmiştir. Her iki kalibrasyon ve numune için net zeta potansiyeli değerleri parçacık zeta potansiyeli ve membran zeta potansiyeli farklılıklar vardır 
. Poliüretan gözenek zeta potansiyeli, potansiyel teknikler bu çalışma için PBS içinde -11 mV olarak 12,18 akışı kullanılarak ölçülmüştür.
(1)
Her bir parçacığın zeta potansiyeli, I, ![Denklem 8]("/files/ftp_upload/54577/54577eq8.jpg")
bir süre sonra gözenek içinde parçacığın konumudur t T x = ve 
göreli pozisyonları l x tek bir örnek parçacık i partikül hızı; 
, 
P, ve V, bir örnek için elektrokinetik ünitesi voltaj ortalama hızı, birim basınç başına konvektif hızı, uygulanan basınç ve gerilim bu denklemin bir türetme Blundell ve ark., 19 çalışmalarının bulunabilir sırasıyla çalışır bulunmaktadır.
streptavidin kaplı nanopartiküller için yakalama prob DNA bağlayıcı zaman, araştırmacı çözeltisi içinde sol fazlalığı, ilişkisiz yakalama prob DNA kaldırır hayati önem taşımaktadır. Bu SPSS ve yeni PBST tamponu ile süpernatant hızlı ve kolay değiştirilmesine olanak tanır basit bir mıknatıs kullanarak kolayca yapılır. aşırı yakalama, DNA çözeltisi içinde sol ve eğer hedef DNA, hedef DNA yerine SPP yüzeyi üzerinde fazla, çözelti içinde serbest yakalama DNA'ya bağlanabilir, ilave edildi. hedef DNA parçacığın yüzeyi üzerinde yakalama sondası mevcut bağlanırsa partikül hızı ve zeta potansiyeli bir değişiklik yalnızca gözlemlenecektir.
Analiz ve birden fazla gözenekli membranın kullanılmasını gerektirebilir TRPS kullanarak birçok gün boyunca numune çok sayıda karşılaştırması. Bazı gözenekler nedeniyle üretim süreci ve bu gibi durumlarda kendi boyutunda bazı küçük farklılıklar olabilir, baz akımı sağlamak zorundadır kullanıcı tüm ru genelinde aynı kalırns. Aynı temel akım görülürse, elde edilen sonuçlar gözenekler arasında karşılaştırılabilir. Bazal önceki çalışır aynıdır sonra, kullanıcı, gözenek geçerken parçacık translokasyon hızlarının doğru tespitine imkan vermek kalibrasyon ve örnek çalışmalar arasında değişmeden streç tutar zorunludur.
TRPS teknolojisi deney sırasında kolayca ve hızlı bir şekilde demonte edilebilir nispeten basit bir set up sahiptir. sorunlarını giderirken, bu işlem çok daha kolay yapabilirsiniz. Örneğin, analiz yapılırken alt sıvı hücre ya da üst sıvı hücreye kabarcıkları sağlamak için önemlidir. Bu dengesiz bir başlangıç akımına yol açacaktır. kabarcıklar üst sıvı hücresinde mevcut ise, numune çıkarılır ve değiştirilebilir. kabarcıklar alt sıvı hücresinde görünüyorsa, tampon çıkarılır ve taze tampon ile değiştirilmesi gerekir. kabarcıklar kalıcı bir sorun ise, o zaman çok fazla yüzey aktif madde olabilirçözelti içinde bu yüzden 16 azaltılabilir gerekebilir (sadece% 0.05 Tween-20 kullanımı). boyutları gözenek boyutuna aşarsa ya da numune konsantrasyonu çok yüksek ise, bazı örnekler gözenek engelleyebilir. Bunu düzeltmek için, gözenek boyutu streç arttırılmasıyla arttırılabilir ya da örnek daha düşük bir parçacık konsantrasyonu 16 seyreltilebilir. Büyük agrega bir sürü mevcut varsa tek parçacık analizi için numune de girdaba için önemlidir, gözenek engelleyebilir ve TRPS aracılığıyla çalıştırmadan önce örnek sonikasyon.
Diğer yöntemler arasında, TRPS aynı zamanda tek tek parçacıkların büyüklüğü ve yük ölçümleri tamamlamak yeteneği de dahil olmak üzere, çeşitli avantajlara sahiptir; Multimodal örnekleri sağlayan bu yöntem kullanılarak etkin bir şekilde analiz edilmesi. Bir avantajı basit bir blokaj büyüklüğü, Δ <elde edilmesi için yumuşaklık ve gerilim değiştirerek belirli bir numune için dakikada optimize edilebilir üretilen sinyal / blokajlar olduğu/ Em> , Arka plan gürültüsü önemli ölçüde daha büyük (abluka arka plan gürültüsü <10 pA göre nA ölçek vardır). gözenek boyutu söz konusu analitin büyüklüğüne göre ayarlanabilir olarak katı-hal gözenek teknikleri üzerinde çok yönlü bir yöntem gözenek streç değiştirmek mümkün kılan olmak; Böyle toplama ve orijinal katı-hal gözenek boyut aralığı aşan analit boyutları neden olabilir bağlayıcı DNA protein gibi etkileri araştırılırken özellikle yararlıdır. TRPS diğer bir avantajlı yönü tekniği duyarlılık seviyesidir. bağlanma, hedef DNA pozisyonuna göre (DNA aynı miktarda ilave edilmiştir (ilave ücret aynı miktarda) ve numuneler aynı boyutta) DNA bağlama ince farklar tespit becerisi bu alanda oldukça büyüktür analiz ve gelecekteki nanoparçacık-tahlil tasarım platformları için büyük kullanım olacaktır. Her ince farklılıklarence algılanabilir ve TRPS teknolojisinin bir parçacık-by-parçacık doğası kullanılarak izole edilebilir. Bu analiz aşan Dinamik ışık saçılımı ya da sadece örnek nüfusun ortalama analiz gage ve modelli örnekleri 6,7 durumlarında ayırt edemez foton korelasyon spektroskopisi gibi grup teknikleri.
Küçük katı-hal nanopores (100-200 nm), aynı zamanda partikül dinamiklerini izlemek için kullanılmıştır ve parçacık çapı nano-gözeneklere 22,23 bu yaklaşmaya başlayana parçacık hareket etkilenebilir bulmuşlardır. (Bu çalışmada kullanılan gibi) analiz edilen parçacıkların daha büyük Nanopores gözenek içindeki partikül hareketliliğine bir etki ve böylece translokasyon dinamiklerini daha az olması. multimodal numune içinde bu aşan parçacıklardan oluşur, bu yüzden, bu çalışmada kullanılan gözenekler ancak kendi analit boyutu aralıkları ile sınırlıdır, örneğin, bir NP150 60-480 nm arasında bir boyut yelpazesine sahiptirLimit, daha sonra bloke hale gelebilir gözenek aynı gözenek üzerinde analiz edilemez. Her iki boyut analizi aralığında olmasına rağmen O, 60 ve 480 nm parçacıkları (gözenek mutlak alt ve üst limitlerde olanlar) içeren bir iki modlu numuneyi ölçme, örneğin, farklı streç ve gerilim koşullarını gerektirir dikkat etmek de önemlidir gözenek. büyük parçacıklar için gerekli olan germe bir örnek akımı boyunca arka plan gürültü olarak kabul edilir ve bu şekilde mutlaka ölçülmemiş olabilir (düşük direnç göre), özellikle küçük bir blok büyüklüğü olan küçük parçacıklar ile sonuçlanacaktır olmasıdır.
Bubbles örnek çalışır tamamlanmış olamaz hangi istikrarsız bir temel akımı yaratacak alt veya üst sıvı hücresinde kabarcıklar olarak örnek ölçümler ile ilgili bir sorun olabilir. efervesan nitelikte elektrolitler (örneğin, bazı yüksek düzeyde konsantre biyolojik ortamı,) Istenen Buna göre örnek çalıştırmak için zor olabilirBu özel ortamlarda süspansiyon uiring sorunlu ispat edebilir. En örnekleri, ancak büyük ölçüde seyreltilir ve TRPS analizden önce alternatif tampon içinde süspansiyon haline edilebilir.
Yöntem adapte edilebilir ve protein, DNA, küçük moleküller, agregasyon analizleri 17,24 ve biyolojik olarak uygun parçacıkların analiz edilmesi de dahil nanopartikül bazlı analitlerin bir dizi analiz etmek için kullanılabilir. Analit geniş bir yelpazede karakterize TRPS çok yönlülüğü gibi ilaç dağıtım 1,25, 26-28 biyoalgı ve çevre testi gibi alanlarda bir dizi potansiyel teknikleri gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ELCJB Izon Science Ltd. tarafından desteklenen
Acknowledgments
Yazarlar, desteklerinden dolayı Izon Bilim Ltd teşekkür ederim. iş Research (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio) için Avrupa Komisyonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
| Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
| Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
| Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
| Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
| Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
| Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
| Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
References
- Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
- Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
- Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
- Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
- Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
- Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
- Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
- Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
- Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
- Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
- Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
- Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
- Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
- Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
- Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
- Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
- Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
- Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).
