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Immunology and Infection

の測定 doi: 10.3791/54581 Published: February 22, 2017

Abstract

HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド(CA)コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素(RT)は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写(RTC)は、二本鎖DNAコピー(vDNA)へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体(PIC)は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ(IN)は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 '末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイ PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。

Introduction

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初期および後期のイベント:標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体(CCR5またはCXCR4)1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド(CA)コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA(ssRNA)と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素(RT)及びインテグラーゼ(IN)、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写(RTC)とプレインテグレーション複合体(PIC)の文脈で機能IN、3、4、5 <SUP>、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート(R)ユニークな配列の(5時U5 '末端)および(3時U3'末端)に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖(ds)DNAコピー(vDNA)へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA 7,8の両端の長い末端反復(LTR)を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR 12に係合および3 '末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 '末端の処理は、各3'末端vDNAの(CA OH)にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤としてOH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 'vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー(プロウイルス)の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン13への成熟出芽。

精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 '末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合14、15、16、17の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション(IVI)アッセイのその後の改良につながりました。

最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス(MLV)は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは、18、7、6開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは、19 5、4開発されました。

この報告書では、我々は、in vitroの方法 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室20によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA 21から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。

レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。

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Protocol

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1.ウイルス産生

注:、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓(HEK)細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。

  1. バイオセーフティレベル2(BSL2)ラボでは、シード8 10cmの皿当たり3×10 6 293T細胞mLの10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の。培養物を37℃に設定したインキュベーター中で細胞を、5%CO 2、O / N。
  2. 次の日は、各10cmの皿に細胞をトランスフェクトするために、血清および抗生物質を欠くDMEMの300μLの最終容量まで( 材料表を参照)pNL4-3プラスミドDNAの8μgのを薄めます。 、トランスフェクション試薬の80μLを加え、ピペッティングによりよく混ぜ、そして室温でインキュベート5 - トランスフェクション複合体形成のための10分。
  3. 吸引により皿から培地を除去し、血清および抗生物質を含む新鮮なDMEMのディッシュあたり7 mLを加え。
  4. 、トランスフェクション複合体に血清および抗生物質を含むDMEMの1 mLを加え、ピペッティングにより混合し、細胞に、この混合物を追加します。静かにトランスフェクション複合体の均一な分布を容易にするための皿を旋回。
  5. すぐにBSL3実験室、37℃に設定したインキュベーター内の場所および5%CO 2、および文化に48時間細胞を細胞を移します。
  6. ピペットを使用してウイルスを含む組織培養上清を回収した後、遠心分離管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および破片をペレット化し、その後、0.45μmの細孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。
  7. この無細胞ウイルス調製物中の任意のキャリーオーバーのプラスミドDNAを除去するために、1時間、37℃でDNアーゼ1(20μg/ ml)で処置します。
  8. 定量化するために、HIV-1力価、それは日常的な使用22ための迅速かつ適した方法であるように、p24の固有の酵素免疫測定法(ELISA)を使用します。
    注:p24のELISAは、物理的な力価(ウイルス粒子の数)を測定することに留意すべきです。また、ウイルス関連RT活性(外因性RTアッセイ)またはウイルス感染性(TZM-BL指標細胞ラインベース感染性アッセイ)を測定すると、感染性ウイルス粒子の排他的な読み出しを提供します。

燮-T1細胞の2.ウイルス感染(BSL3研究室)

  1. BSL2ラボでは、10%の熱不活性化FBS、ペニシリン、および1のストレプトマイシン(スプリット比を補っロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地中に1.0×10 6及び2.0×10 6細胞/ mLの間のSup-T1細胞を維持します:2毎に2から3 D)。 、培養フラスコから燮-T1細胞をプールピペットでよく混和し、血球計およびトリパンブルー排除STを使用することにより生細胞数を決定しますメソッドをaining。
    1. 50 mLのコニカル遠心管中の(ウイルス感染当たり)80×10 6細胞のアリコートの必要数を準備します。
    2. 500×gで、スイングバケットローターで細胞を遠心分離し、5分間25℃。細胞培養培地を除去することなく、さらなる処理のためBSL3実験室にペレット化した細胞を含むチューブに移します。慎重に細胞ペレットを乱すことなくチューブから細胞培養培地を吸引します。
  2. チューブ中の細胞にDNアーゼI処理したウイルス接種物の適切な量を追加し、穏やかにピペッティングによりよく混ぜます。 80×10 6細胞について、DNアーゼI処理ウイルス(P24-同等のウイルスの50μgの)の30ミリリットルを使用します。
    注:機能のPICの単離は、感染の非常に高い多重度(MOI)で標的細胞に感染する必要があります。
  3. 2 6ウェル組織培養プレートの間で均等に混合物を分配する( すなわち、12×2.5-mLのアリコートを、未感染あたり2プレートを使用イオン)。
  4. スピノキュレーションのために、2時間、480×gでスイングバケットローターを用いてプレートキャリアと遠心分離機で培養プレートに置き、25℃。
  5. 5時間spinoculated 37℃で細胞を、5%CO 2でインキュベートします。

感染細胞の3収穫や溶解(BSL3ラボ)

  1. 細胞は50 mLのコニカル遠心チューブ(〜30 mLの合計)に培養プレートから各感染症に対応するプール。
  2. 10分間、300×gで、25℃での遠心分離により細胞を回収。慎重に(あるいは、ピペットを使用)チューブから上清を吸引除去します。
  3. - / - (150ミリモルのKCl、20mMのHEPES、pH7.6の、5mMのMgCl 2)、300×gで、25°Cのためにサンプルを遠心分離し、残留ウイルス粒子を除去するために、緩衝液Kの2ミリリットルを添加することにより、各細胞ペレットを洗浄10分。その後、ペレットを乱すことなく、慎重に吸引またはピペットを使用して、上清を除去します。
  4. Repeaトンのステップ3.3。
  5. 慎重にマイクロピペットを使用して、任意の残った液を取り除き。氷冷溶解バッファーのK + / +( - / -バッファK 0.025%ジギトニン、1 mMのDTT、20μgの/ mLのアプロチニンを補充した)2mL中に再懸濁各細胞ペレットを、穏やかなピペッティングによって内容物を混合し、への転送2mLのマイクロチューブ。

細胞質のPICの4準備(BSL3ラボ)

  1. 10分間室温でロータリーシェーカー上でサンプルをロック。
  2. 1,500×gで、4℃に予備冷却回転子を、サンプルを遠心分離し、4分間、4°C。
  3. ペレットを乱すことなく、慎重に1分間16,000×gで4℃で新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機に上清を移します。
  4. 慎重に新しいマイクロ遠心チューブに上清を移します。 30分(なし揺動)をRTで内容を20μgの/ mLの(PICを2mLのための2μL)の最終濃度までのRNase A(20 mg / mlで)を追加し、インキュベートします。</李>
  5. 7%の最終濃度にし、穏やかにピペッティングによりよく混ぜ( - - /バッファKにワット60%/ v)のスクロースを追加します。長期保存のために-80℃の冷凍庫に微量遠心管、液体窒素中でフラッシュ凍結し、場所でのPICのアリコート( 例えば、200μL)を準備します。

インビトロの統合5. HIV-1のPICを使う(IVI)アッセイ

  1. カスタムメイドのプライマー、phiX174-FとphiX174-Rを用いたPCRでphiX174プラスミドDNAから2.0キロバイトの領域を増幅することにより、IVIアッセイで使用した標的DNAを準備します。
    1. 表1に記載されているようにPCR混合物を組み立てます。 表2に推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 (メーカー推奨のプロトコルに従って)ゲル精製キットを用いて、PCR産物をゲル精製し、そして使用するまで-80℃でアリコートとして精製された標的DNAを保存します。
  2. 200に標的DNAの600 ngの追加 - &#181;のPICのLアリコートを、よく混ぜ、45分間37℃でインキュベートします。
    注:インテグラーゼ阻害剤( 例えば、ラルテグラビル)を標的DNAを省略したりなど、IVIの反応はコントロール反応を推奨しています。
  3. 0.5%、8 mMの、それぞれ0.5 mg / mlでの最終濃度までSDS、EDTA、及びプロテイナーゼKを添加することにより、IVI反応を停止させます。反応内容物を完全に混合し、56℃で一晩インキュベートします。
  4. 翌日、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりIVI反応からの全DNAを精製します。 16,000×gで、室温ですべての遠心操作を実行します。
  5. 2分間、脱タンパクサンプルに等量のフェノールを加え、ボルテックスで激しく混合し、遠心。慎重に上部の水相を除去し、新しいチューブに移します。
  6. 繰り返し手順5.5。新しいチューブに上部の水相を転送します。
  7. 、クロロホルム混合物ボルテックスで激しく混合し、遠心分離器のfo:1フェノール:1等量の追加R 2分間。新しいチューブに上部の水相を転送します。
  8. 、等量のクロロホルムを加え、ボルテックスで激しく混合し、2分間遠心します。新しいチューブに上部の水相を転送します。
  9. DNAを沈殿させ、最終0.3 Mの濃度、および100%エタノール(氷冷)の2.5倍量には0.1μg/μL、酢酸ナトリウムの3 Mの最終濃度にグリコーゲンを追加します。コンテンツを収集し、-80°CO / Nでチューブを配置するために、短時間遠心分離を混合する渦。
  10. 次の日は、16,000×gで30分間サンプルを遠心分離し、30分間、4°C。ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。
  11. 16,000×gでペレットや遠心分離機に80%エタノール(氷冷)の500μLを加え、4℃で10分間。 RTでDNAペレットを空気乾燥し、完全にヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁します。 -20℃でDNAサンプルを保管してください。

定量化PIC活動6. PCRアッセイ

  1. 統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅するために(それぞれ、LTRとphiX174プライマー)ウイルスのLTRおよびphiX174 DNAを標的とするプライマーを用いて、第1ラウンド従来のPCRを行います。
    1. 表3に記載されているように第一ラウンドPCR混合物を組み立てます。鋳型DNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、別々のPCRチューブに45-μLアリコートを分配し、鋳型DNAまたはヌクレアーゼフリー水(コントロール)の5μLを追加します。
    2. 表4に、推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。
  2. 選択的に第一-ROから統合vDNA配列を増幅するために、ウイルスLTR(LTR-RおよびLTR-Uプライマー)の短い領域に隣接するプライマーを用いて、第2ラウンドのqPCRを実行しますウントPCR産物。統合vDNAコピー数を決定するために、既知のコピー数の10倍連続希釈液を使用して標準曲線を生成する( 例えば、10 0から10まで 8)HIV-1分子クローンの。
    1. 表5に説明したように、第2ラウンドのqPCR混合物を組み立てます。 96ウェルPCR反応プレート中のウェルの適切な数に25μLのアリコートを分配慎重に、テンプレートDNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、その後、未精製の第一ラウンドのPCR産物またはヌクレアーゼフリー水を5μLを追加(コントロール)。三重ですべてのqPCR反応を実行します。
    2. リアルタイムPCR装置にPCRプレートをロードし、 表6に推奨サイクリング条件を用いて定量PCRを行います。
    3. 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。

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Representative Results

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HIV-1のPICの単離

急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンによって記載された方法に由来します。 19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てられ、逆転写vDNAで構成されている核タンパク質複合体、ウイルスタンパク質、および細胞性因子19、20です。このレポートに記載された方法は、PIC-関連統合活動の源としてのHIV-1感染細胞の細胞質抽出物を使用しています。

HIV-1のPICの in vitro での統合アクティビティ

図2に示されています。この方法は、PIC-関連IVI活性を測定するためのネストされた定量PCRベースの戦略を利用して、手順はエンゲルマン室19、20、21によって発行されたプロトコルから、変形して、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、異種の線状ターゲットDNA 21を設けることにより開始され、この統合反応から得られたDNA産物を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。プロトコルのを参照してください。この方法の詳細についてはection。

IVIアッセイの代表的な結果は、HIV-1のPICは、 図3に示されている使用して行きました。燮-T1細胞(80×10 6細胞/感染症)は480で阻害剤ラルテグラビルが1μmHIV-1の非存在下または存在下でのDNase 1で処理されたHIV-1(P24相当の〜50μgの)30mLでspinoculatedましたXGと2時間25°C。細胞を37℃で5時間、5%CO 2のために続いて培養しました。プロトコルセクションに記載されているようのPICを単離しました。 IVI反応を45分間37℃で、各々用いて写真の200μLと標的DNAの600 ngの(PCRによってphiX174 DNAから増幅された2kbのDNA断片)を行いました。反応は、56℃のCO / NでSDSおよびEDTAの存在下でプロテイナーゼK処理により除蛋白しました。クロロホルム(1:1)反応生成物を一旦フェノールで、二回フェノール抽出された混合物を、一旦クロロホルムで。その後、DNAをエタノール沈殿した塩と共沈殿グリコーゲンの存在であった、そしてDNAペレットを80%エタノールで1回洗浄しました。精製されたDNAは、ヌクレアーゼを含まない水50μLに再懸濁しました。ネストされた定量PCR戦略はphiX174 DNAに組み込まvDNAの数を決定するために使用しました。第一ラウンドの従来のPCRにおいて、phiX174標的DNAとウイルスのLTR領域の配列に相補的なプライマーは、統合反応のDNA産物の5μLから統合されたウイルス標的DNA接合を増幅しました。第二ラウンドのqPCRにおいては、LTR-またがるプライマーはもっぱら第一ラウンドのアンプリコン産物の5μLから、既知のコピー数(10 8 -10)の10倍連続希釈物からHIV特異的DNA配列を増幅するために使用されましたHIV-1分子クローンの(基準)。

すべてのqPCR反応は、三重、データWERで行いましたeは商用ソフトウェアを用いて分析しました。標準から得られた値を積分vDNAコピー数を補間し、そこから標準曲線を生成するためにプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。 図3に示すよう 、HIV-1のPICは、ロバスト標的DNA(レーン5)に関連vDNAを統合します。重要なことには、写真のIVI効率を大幅IN阻害剤ラルテグラビル(レーン6)を補充した反応で低下しました。これは強く、HIV-1 INにこのアッセイで測定された統合アクティビティ属性。また、非感染細胞(レーン1)、単独でのPIC(レーン2)から細胞質溶解物を含有するコ​​ントロール反応は、単独(レーン3)DNAを標的にし、緩衝液のみ(レーン4)任意の統合活性を示しませんでした。また、第一回目のPCRにおけるTaqポリメラーゼを除外コントロール(レーン7)は、統合製品を増幅しませんでした。注目すべきは、PICの単独の対照(レーン2)からのデータは、ネストされた定量PCR戦略の仕ことが示されました的に統合されたvDNAではなくPIC-関連vDNAを測定します。まとめると、これらのデータは、PIC-関連積分活性の測定を示します。

図1
図1:HIV-1のPICの調製のためのプロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PICを含む細胞質抽出物は、HIV-1感染燮-T1細胞から単離されています。これらのPICは、インビトロ統合アッセイにおける積分活性の供給源として使用されます。

図2
2:in vitroでの略図 HIV-1のPICのメートル>統合アッセイ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

統合アッセイは、HIV-1のPICおよび異種標的phiX174 DNAを用いてインビトロで実施しました。集積HIV-1 DNAは、第一ラウンドの従来のPCRはvDNA特異的配列を優先的に第二ラウンド定量PCRで増幅されてから統合接合を増幅し、前記ネステッドPCR戦略によって測定しました。

図3
図3:HIV-1 PIC-関連vDNA統合活動。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

「FOする:キープtogether.within-ページを= "1">統合vDNAはの10倍段階希釈液を使用して作成した標準曲線から導出された値をプロットすることにより決定された番号をコピーし、HIV-1 PIC-関連統合活性アッセイの代表的な結果。 HIV-1分子クローンの既知のコピー数は、すべての反応は三連で実施し、データは、市販のソフトウエアを用いて分析した。エラーバーは標準偏差を表します。

成分 株式 50μLの反応のための最終的なボリューム
phiX174プラスミドDNA 10 ngの/μL 5.0μL
GoTaq反応バッファー 5倍 10.0μL
dNTPヌクレオチドミックス 10mMの各 1.0μL
phiX174-Fプライマー 10μM 2.5μL
phiX174-Rプライマー 10μM 2.5μL
GoTaq DNAポリメラーゼ (5 U /μL) 0.25μL
ヌクレアーゼフリー蒸留水 - 28.75μL

表1。

= 2分95℃
サイクルの34回の繰り返し:
95°C = 30秒
53°C = 30秒
72°C = 2分
72°C = 10分
4°C =ホールド

表2。

成分 株式 50μLの反応のための最終的なボリューム IVI反応DNA産物 - 5.0μL GoTaq反応バッファー 5倍 10.0μL dNTPヌクレオチドミックス 10mMの各 1.0μL LTRプライマー 10μM 2.5μL phiX174プライマー 10μM 2.5μL GoTaq DNAポリメラーゼ (5 U /μL) 0.25μL ヌクレアーゼフリー蒸留水 - 28.75μL

表3。

95°C = 5分
サイクルの23回の繰り返し:
94°C = 30秒
55°C = 30秒
72°C = 4分
72°C = 10分
4°C =ホールド

表4。

<TD> TaqManプローブ
成分 株式 30μLの反応のための最終的なボリューム
1ラウンドのPCR産物 - 5.0μL
LTR-Rプライマー 10μM 0.9μL
LTR-Uプライマー 10μM 0.9μL
10μM 0.3μL
iQのスーパーミックス 2倍 15.0μL
ヌクレアーゼフリー蒸留水 - 7.9μL

表5。

95°C = 3分
サイクルの39回の繰り返し:
94°C = 15秒
58°C = 30秒
72°C = 30秒
プレート読みます

表6。

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Discussion

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レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18測定するため間接的な方法を利用しています。サザンブロットベースアッセイ対策統合は、直接が、PICの6、7、18の比較的高い量を必要とします。

このレポートでは、in vitroで HIV-1 PIC-関連統合活性を測定するためのネストされた定量PCR戦略を詳しく説明します。この方法の主な利点と重要性は、反応あたりPICの準備の比較的少量の要件である4、5、19。この方法の最も重要なステップは、感染のための高力価のウイルスの発生やPIC製剤の取り扱いです。 PCRの最初のラウンドは、統合接合部の指数関数的増幅を含むことに留意すべきです。これにより、第2ラウンドの定量PCRで決定集積vDNAのコピー数は、従って、PIC関連vDNAコピーの尺度を与えないという制限している半定量的であり。しかし、PIC-関連vDNAはLTR特異的プライマーとのPICから精製されたDNAの定量PCRによって決定することができます。統合vDNAの比率は、in vitroでの統合反応の統合効率に関する情報を提供することができ、対応するPIC-関連vDNAに番号をコピーします。この方法では、両方の方向での統合を検出するように選択し、他のプライマーの他の異種標的DNAを組み込むことによって改変することができます。要約すると、方法ここで説明する定量的HIV-1のPICの統合活性を測定し、レトロウイルス組み込みの生化学的な詳細の理解を開発する研究のために採用することができます。

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Disclosures

著者には、競合する金融・非金融利益を宣言しません。

Acknowledgments

この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター(MeTRC)CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Fetal Bovine Serum (FBS)

GIBCO/Invitrogen

10437-028

Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (Hi-FBS)

GIBCO/Invitrogen

10438-026

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

GIBCO/Invitrogen

11995-065

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium

GIBCO/Invitrogen

11875-093

Phosphate-buffered Saline (PBS) (1x)

GIBCO/Invitrogen

20012-027

Trypsin-EDTA (0.25%)

GIBCO/Invitrogen

25200-056

Penicillin-Streptomycin solution (100x)

Cellgro/Mediatech

30-002-CI

HEK293T cells (293T)

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-3216

HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

114

PolyFect transfection reagent

Qiagen

301107

DNase 1

Calbiochem/Merckmillipore

260913

Sup-T1 cells

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-1942

HEPES pH 7.2 - 7.5

(ready-to-use solution)

GIBCO/Invitrogen

15630-080

Potassium chloride (KCl) solution

Sigma-Aldrich

60142

Magnesium chloride (MgCl2) solution

Sigma-Aldrich

M1028

Dithiothreitol (DTT)

Sigma-Aldrich

43815

Aprotinin

Sigma-Aldrich

A6106

Digitonin

Sigma-Aldrich

D141

RNase A

Invitrogen

12091-021

Sucrose

Sigma-Aldrich

S0389

phiX174 Replicative Form 1 DNA

Promega

D1531

PhiX174-F primer:

5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’

PhiX174-R primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

dNTP mix

Promega

U1515

Go Taq DNA Polymerase

Promega

M3005

Qiaquick gel extraction kit

Qiagen

28706

Ultrapure distilled water

Invitrogen

10977-015

Tris-EDTA (TE) buffer (100x)

Sigma-Aldrich

T9285

Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)

Sigma-Aldrich

L3771

Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0

Sigma-Aldrich

E7889

Proteinase K (20 mg/mL ready-to-use solution)

Qiagen

19131

Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)

Sigma-Aldrich

P4557

Chloroform

Sigma-Aldrich

288306

Glycogen (5 mg/mL solution)

Ambion/Invitrogen

AM9510

Sodium acetate (3 M, pH 5.2)

Sigma-Aldrich

S7899

Ethanol

Sigma-Aldrich

E7023

First round LTR primer:

5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’

First round phiX174 primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

---

Second round LTR-R primer:

5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’

Second round LTR-U primer:

5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’

Second round Taqman probe:

 5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC

CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

---

iQ Supermix

Bio-Rad

170-8862

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References

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の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動
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Balasubramaniam, M., Davids, B., Addai, A. B., Pandhare, J., Dash, C. Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes. J. Vis. Exp. (120), e54581, doi:10.3791/54581 (2017).More

Balasubramaniam, M., Davids, B., Addai, A. B., Pandhare, J., Dash, C. Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes. J. Vis. Exp. (120), e54581, doi:10.3791/54581 (2017).

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