Abstract
Het kenmerk van humorale immuniteit functionele ASC, die synthetiseren en afscheiden Abs specifiek voor een antigen (Ag), zoals een pathogeen, en worden gebruikt voor afweer genereren. Voor de kwantitatieve bepaling van de functionele status van de humorale immuunrespons van het individu, zowel serum Abs en circulerende ASC worden gewoonlijk gemeten als functionele uitlezingen. Bij mensen, perifeer bloed is de meest geschikte en gemakkelijk toegankelijk monster dat kan worden gebruikt voor de bepaling van de humorale immuunrespons opgewekt door gastheer B-cellen. Afzonderlijke B-cel subsets, zoals ASC, kunnen direct worden geïsoleerd uit perifeer bloed via geselecteerde lijn-specifieke Ab-geconjugeerde microparels of via celsortering met flowcytometrie. Bovendien kunnen gezuiverde naïeve en geheugen B-cellen worden geactiveerd en gedifferentieerd in ASC in de cultuur. De functionele activiteiten van ASC bijdragen aan Ab secretie kunnen worden met ELISpot, die een test waarmee enzym convergeert-gebonden immunoabsorptiekolom assay (ELISA) en western blotting technologieën om de opsomming van individuele ASC mogelijk te maken bij de single-cell niveau. In de praktijk is de ELISPOT er steeds meer gebruik vaccineffectiviteit evalueren vanwege het gemak van het hanteren van een groot aantal bloedmonsters. De werkwijzen voor het isoleren van humane B-cellen uit perifeer bloed, zal de differentiatie van B-cellen ASC's in vitro, en de toepassing van ELISPOT voor de kwantificering van totaal IgM- en IgG-ASCs hier beschreven.
Introduction
B-cellen spelen een centrale rol bij de ontwikkeling van humorale immuniteit. Zij oorspronkelijk ontwikkeld in het beenmerg en in de bloedsomloop als naïeve B-cellen, die migreren naar lymfoïde weefsels zoals de milt, lymfeknopen, amandelen en, voor verdere ontwikkeling. Bij Ag ontmoeting, wat naïeve B-cellen migreren naar lymfoïde follikels, waar de germinal center B-cellen kunnen differentiëren in het geheugen B-cellen en plasmablasten (PBS) / plasmacellen (pc's). Terwijl de meeste PBS / PC egress in de bloedstroom, wat uiteindelijk een verblijf in het beenmerg naar terminale differentiatie ondergaan in langlevende PC 1. B-cellen in omloop zijn heterogeen, en bij steady state, PBS / pc's zijn zeldzaam in het perifere bloed 2. Door de beschikbaarheid van lijn-specifieke oppervlakte merkers, flowcytometrie is een populaire werkwijze voor de identificatie en karakterisering van de B-cel populaties in perifeer bloed. Een uitgebreide toepassing van stroom cytometry is de toevoeging van een celsorteerinrichting functie, die de scheiding en isolatie van afzonderlijke subsets van B-cellen met hoge zuiverheid mogelijk maakt. Op basis van de expressie van specifieke oppervlak receptoren in verschillende ontwikkelingsstadia, menselijke circulerende B-cellen worden in het algemeen in drie belangrijke subpopulaties ingedeeld: naïeve B-cellen (CD19 + CD27 - CD38 -), geheugen B-cellen (CD19 + CD27 + CD38 -), en PBS / pC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figuur 1). Naïeve B-cellen door de natuur nog niet tegengekomen Ags. Ze kunnen echter worden onderscheiden in IgM + CD27 + B-geheugencel. Hoewel naïeve B-cellen homogeen tot expressie B-cel antigen receptor (BCR) geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld CD19, CD20 en CD22) zij zijn heterogeen in hun immunoglobulinerepertoire 5. De meeste CD27 + B-geheugencel kan worden onderscheiden in CD27+ / hi CD38 + PBS / pc 6. Bovendien, het geheugen B-cellen en PBS / PC's zijn polyklonaal en vertonen ontwikkelings- en functionele heterogeniteit 4-7. PBS / pc's in omloop zijn meestal van korte duur en niet uitdrukken CD138, maar die maakte om zich te vestigen in het beenmerg zal terminaal differentiëren en uitgegroeid tot een lange levensduur. Terminaal gedifferentieerde pc's uitdrukken CD138 en down-reguleren van CD27-moleculen op hun oppervlak 8. Aangezien zowel PBS en computers kunnen uitscheiden Abs zijn in veel gevallen worden ze collectief aangeduid als ASC. Daarentegen kan noch naïeve B-cellen of B-geheugencel aanzienlijke hoeveelheden Abs 9-10 produceren. Niettemin, wanneer geïsoleerd, zowel naïef en memory B-cellen kunnen worden onderscheiden in ASC in 3-10 dagen wanneer geplaatst in de juiste kweekomstandigheden 6, 11-15. In feite, ASC afgeleid van in vitro differentiatie aandeel vergelijkbaar oppervlak uitingen van CD27 en CD38 met de direct geïsoleerde frOM perifere bloed 6. Bovendien, het ASC gedifferentieerd in vitro drukken een geringe oppervlakte CD20, op elkaar dat circulerende PBS / pc 6. Hoewel de kweek afgeleide ASC's zijn korte duur, kunnen ze afscheiden Abs, wat aangeeft dat ze functioneel competent en kunnen bijdragen aan de humorale immuniteit.
Zowel ELISA en ELISPOT zijn veruit de meest toegepaste methoden waarmee functionele gegevens over de humorale immuunrespons te verkrijgen. ELISA is een 96-well-plaat gebaseerde bepaling, en wordt vaak gebruikt om de titers van serum Ag-specifieke Abs en andere analyten (bijvoorbeeld cytokines) te meten. Het is handig en schaalbaar. ELISA is ontworpen om een vaste fase enzym-assay om de aanwezigheid van Abs of andere stoffen, zoals serum te detecteren, in een vloeistofmonster 16. De uitlezingen uit serum ELISA's op grote schaal gebruikt om de immuunrespons van het lichaam representeren. Een hulpmiddel voor de verwerving van readouts van ELISA assays is een spectrofotometer microplaat reader. De lezer kan de optische dichtheid (OD) van de eindproducten typisch resulterend uit de reactie van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde detectie Abs en hun specifieke substraten 17 bepalen. Met betrekking tot het rapporteren van de humorale immuunrespons, serum levels Ab bepaald met ELISA duiden het collectief, maar geen individuele prestaties van ASC in het lichaam. Bovendien ELISA geen rekening gehouden met de bijdrage van geheugen B-cellen, die niet afscheiden Abs.
Zoals ELISA, ELISpot is een veel gebruikte werkwijze voor het detecteren en volgen van de immuunreactie in perifere bloedmonsters 17-18. ELISpot is een techniek soortgelijk aan een sandwich ELISA. Daarin worden cellen geplaatst in de polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan backed putjes van 96-putjes microplaten voor een korte termijn cultuur. De ELISPOT-test is analoog aan het uitvoeren van Western blotting op een microplaat en developing de vlekken op het PVDF membraan in elk putje. Een geautomatiseerde ELISPOT reader systeem of een stereomicroscoop voor handmatige telling vereist. Het belangrijkste voordeel van ELISPOT in het detecteren van een immuunreactie zijn uitstekende gevoeligheid in de kwantificering van ASC en cytokine-afscheidende cellen. Rapporteert de functionele activiteiten in humorale en cellulaire immuniteit, respectievelijk. In de meting van humorale immuunsysteem, zijn serum Ab niveau bepaald door ELISA en het aantal ASC erin genoemde ELISpot vaak gecorreleerd, maar de data uitlezingen uit deze twee assays hebben enkele verschillen in functionele implicaties 19-20. Het belangrijkste voordeel van ELISpot is de gevoeligheid van de methode. De serum Ab titers gerapporteerd door ELISA wordt voorgesteld semi-kwantitatief OD uitlezingen, duidt de relatieve Ab niveau of meer kwantitatief, zoals concentreren uitlezingen bij een bekende hoeveelheid van de juiste isotypen van Abs is opgenomen ter referentie. Daarentegen zijn de resultaten van ELISpot zijn presented de absolute aantal ASC in een cel pool van belang (bijvoorbeeld gefractioneerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en gezuiverde B-cellen uit PBMC). ELISpot kan een enkele ASC te detecteren, maar ELISA vereist Ab bedragen van ASC geoptimaliseerde test-afhankelijke concentraties voorafgaand aan de meting te bereiken. Daarom ELISpot is duidelijk superieur aan ELISA gevoeligheid van kwantificering. Bovendien ELISpot is ook geschikt voor het kwantificeren van de in vitro gedifferentieerde ASC van geactiveerde B-geheugencel. Geheugen B-cellen niet scheiden Abs, maar kunnen differentiëren naar ASC bij activering; ze hebben dus geen bijdrage aan serum Abs gedetecteerd door ELISA. Aldus ELISpot is de voorkeursmethode bij het meten van de immuunrespons van circulerende geheugen B-cellen na activering in kweek. Het zorgt voor de controle op de handhaving van langdurige humorale immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humaan perifeer bloed moet worden verkregen van gezonde donoren in het kader van informed consent, en het gebruik van bloedmonsters moeten voldoen aan de door de individuele institutionele review boards erkende richtlijnen. In deze studie, het protocol om menselijk bloed te gebruiken in een demonstratie van de resultaten van flowcytometrie (Figuur 1) en ELISpot assays (figuur 3) werd goedgekeurd door de interne Review Board van de National Taiwan University Hospital (protocol nummer 201307019RINB).
1. isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen
- Teken ~ 10 ml bloed uit de mediaan cubitaal ader (in de cubital fossa anterior aan de elleboog) in een 15-mL buis met K 2 EDTA (1,5 tot 2,0 mg / ml bloed) en onmiddellijk de buis omkeren meerdere malen te stollen te voorkomen vorming.
- Voeg 35 mL autoclaaf (121 ° C, 15 min) rode bloedcellen (RBC) lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 en 1 mM EDTA; pH 7,4) naar de buis die vers bloedmonster (≥ 3: 1 vol / vol) en incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende maximaal 5 minuten.
Opmerking: Het uiterlijk van lichttransmissie door de buis geeft de beeindiging van RBC lysis. - Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat de pellet is wit van kleur.
- Resuspendeer de pellet met 10 ml autoclaaf fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4 en 1,47 mM KH 2PO 4, pH 7,4) en gecentrifugeerd zoals in stap 1,3.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 10 ml RPMI 1640 medium (supplementen: 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 0,25 ug / ml amfotericine B, en 2 mM L-glutamine) en plaat de cellen in een 10-cm cultuur schotel (10 ml bloed per gerecht). Plaats de schotel in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Zwenk de cultuur schotel een paar keer en plaats dekweekmedium (schorsing cellen) in 15 ml plastic conische buizen. Gooi de hechtende cellen (voornamelijk macrofagen) op kweekschalen.
- Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet met 1 ml RPMI 1640 medium. Tel het aantal cellen met een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van de geïsoleerde leukocyten gewoonlijk meer dan 90% door trypan blauw exclusie. - Centrifuge in stap 1,7 en resuspendeer de cellen in ~ 200 pi koude PBS buffer (0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 5-10 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg 5 ul gebiotinyleerd anti-humaan Ab cocktail specifieke bloedcellen (voor negatieve selectie van B-cellen) per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min 21.
OPMERKING: De anti-humaan Ab cocktail moet tenminste Abs specifiek CD2 (of CD3), CD14 en CD16. - Voeg een 10-voudige overmaat volumesteriel PBS aan de cellen gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 5 min en gooi het supernatant.
- Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine-geconjugeerd microbolletjes (5 ul per 10 6 cellen) aan de pellet en meng.
- Incubeer op ijs gedurende 30 min in een 15 ml plastic conische buis.
- Voeg 2 mL PBS buffer in de buis.
- Breng de buis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 min. De bruine microkorrels geleidelijk hechten aan de buiswand naast de magneet 22.
- De overige in de magnetische stand buis voorzichtig overdracht van de supernatant in een nieuwe steriele 15 ml buis 22.
- Herhaal stap 1,14-1,16, en combineren de twee supernatanten die de ongerepte B-cellen bevatten. Gooi de microbolletjes.
- Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in RPMI 1640 medium voor downstream experimenten.
LET OP: Typisch, 1-5 x 10 5 B-cellen witha zuiverheid van meer dan 95% van 10 ml perifeer bloed kunnen worden geïsoleerd 23.
2. Zuivering en scheiding van Herdenking en Naïve B Cellen van Geïsoleerde B-cellen
- Gebruik cellen gezuiverd van stap 1 en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
- Resuspendeer de cellen in 100 ul koud PBS buffer na centrifugatie bij 600 x g en kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 1-2 ug gebiotinyleerd CD27 mAb per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Voeg 10 mL van PBS buffer aan de buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 ui PBS buffer.
- Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine magnetische microkralen (1-2 ug / 10 6 cellen) aan cellen in een 15 ml plastic conische buis.
- Voorzichtig goed mengen en incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Voeg 2-3 ml PBS-buffer aan de buis.
- Plaats debuis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de bruine microkralen te hechten aan de zijde het dichtst bij de magneet.
- De buis in de magnetische stand voorzichtig breng de vloeistoffractie in een nieuwe steriele buis. Deze fractie bevat de verrijkte CD27 - naïeve B-cellen.
- Voeg 5 ml tot de buis met de microbolletjes en voorzichtig resuspendeer de microbolletjes (dat wil zeggen, de verrijkte fractie van CD27 + memory B-cellen) 24-25.
- Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellets met RPMI 1640 medium voor de stroomafwaartse experimenten.
OPMERKING: Gewoonlijk ~ 30-60% van B-cellen kan worden gezuiverd zoals CD27 + geheugencellen van de PBMC van een gezonde donor 7, 25-26.
3. Cell Sorting voor de inzameling van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc's
- Met de cellen gezuiverd uit stap 1 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische cel teller.
- Resuspendeer de cellen in koude PBS buffer bij een concentratie van 10 7 per ml in 5 ml polystyreen buis.
- Voeg 1-2 ug humaan IgG per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 10 min voor het Fc blok.
- Voeg 1 ug elk van anti-CD19-APC (kloon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (kloon: O323) en anti-CD38-PE (kloon: HIT2) per 10 6 cellen; Meng goed en incubeer op ijs gedurende 30 min 4, 27.
- In de laatste 5 min in stap 3.4, voeg 5 pi van de commerciële 7-amino-actinomycine D (7-AAD).
- Voeg 2 ml PBS aan de buis, vortex en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen in sortering buffer (steriel PBS met 2% BSA en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 1-5 x 10 7 cellen per ml in een 15 ml buis.
- Filter de cellen door een nylon mesh cel zeef (40 um poriegrootte) naar cel klonten te elimineren.
- Scheid de cellen met een flowcytometrische sorterener uitgerust met drie lasers: violet (405 nm), blauw (488 nm) en rode (640 nm).
LET OP: De blauwe laser alleen al is voldoende voor 3-kleur cytometry 27-28 stromen. - Sorteren van de cellen in drie 15-ml buisjes (die 5 ml RPMI medium) voor het gelijktijdig verzamelen van naïeve B-cellen (CD19 + CD27 -), geheugen B-cellen (CD19 + CD27 +) en PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
OPMERKING: Gesorteerd naïeve en memory B cellen kunnen worden gekweekt zoals beschreven in stap 4.
4. In vitro differentiatie van de geïsoleerde menselijke CD19 + B-cellen, CD19 + CD27 + B-geheugencel, en CD19 + CD27 - Naïve B-cellen
- Met de cellen gezuiverd stappen 1,19, 2,10, 2,11 en 3,10 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische celteller.
- Resuspendeer de cellen met RPMI 1640 mediumbij een concentratie van 1 - 10 x 10 per 5 ml aliquot en deze in de putjes van een 12-wells plaat.
- Voeg CpG (ODN 2006) bij 5 ug / 10 6 cellen / ml 18, 29.
- Cultuur van de cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 5 dagen.
- Oogst de cellen uit elk putje, plaats ze afzonderlijk in 15 ml buizen, voeg 5 ml PBS aan elke buis en centrifugeer ze op 600 xg en KT gedurende 5 min.
- Tel de cellen met een hemocytometer of een automatische celteller. Resuspendeer de cellen in een concentratie van 1-10 x 10 5 per ml met RPMI 1640 medium.
5. Assay ELISpot
- Voeg 30 ul van 35% ethanol in gedestilleerd water aan elk putje van de ELISPOT platen gedurende 30 s.
OPMERKING: Bij pipetteren, raak het membraan in de putjes te allen tijde. - Keren de ELISpot platen om de ethanol te verwijderen.
- Zet 150 ul van geautoclaveerd DDH 2 O in elk putje en incubeerze op kamertemperatuur 5 minuten doorspoelen van de resterende ethanol; volg met een wassen steriel PBS bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
OPMERKING: Stappen 5,1-5,3 is optioneel, afhankelijk van de vervaardiging van de platen. - Put 50 ui 5 ug / ml polyklonaal F (ab ') 2-fragment van anti-humaan Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in elk putje van de ELISPOT platen en incubeer ze bij 4 ° C overnacht (voorkeur) of 37 ° C gedurende 2 uur 11.
OPMERKING: Dicht de randen van platen met Parafilm tot gebruik. - Inverteer de platen om ongebonden Abs tweemaal verwijderen, voeg 200 ul van PBS aan elk putje en incubeer ze op kamertemperatuur 3 minuten per keer.
- Voeg 200 ul PBS met 5% BSA (of RPMI 1640 medium) aan elk putje voor het blokkeren en incubeer ze op kamertemperatuur 2 uur.
- De platen om de blokkerende buffer te verwijderen. Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5.
- Voeg 100 ul RPMI 1640 medium aan elk putje en incubeer ze op 37 ° C.
- Als u klaar bent om de cellen te zaaien, keren de platen aan de RPMI 1640 medium te verwijderen.
- Zaad 100 pl (5 x 10 4), 50 gl (2,5 x 10 4), en 25 pl (1,25 x 10 4) van de cellen (van stap 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 en 4,6) in de putjes van een ELISpot plaat. Met RPMI 1640 medium, breng het volume op 150 ul / putje.
Opmerking: Een minimum van één of twee 2-voudige seriële verdunningen van de cellen plateren wordt aanbevolen. - Incubeer de platen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 8-14 uur 18. Vermijd het verplaatsen van de platen tijdens de incubatie.
- Inverteer de platen en de cellen RPMI 1640 medium te verwijderen.
- Voeg 200 ul / putje PBS-T (PBS met 0,05% Tween 20) en incubeer ze 5 maal bij kamertemperatuur, elke keer gedurende 3 min. Keer de plaat om de wasbuffer tussen elk van de 5 wasbeurten verwijderen.
- Voeg hetzij geit anti-menselijk IgG-alkalisch fosfatase (AP), Fcy-specifieke Abs (IgG detectie, 1: 5000 in PBS-T) Of geit anti-humaan IgM-AP, Fcμ fragment-specifieke Abs (voor IgM detectie, 1: 5000 in PBS-T) in de aangegeven putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker.
- Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5.
- Voeg 50 ul / putje bromochloroindolyl fosfaat-nitro blauw tetrazolium (BCIP / NBT) substraatoplossing. Paars-gekleurde vlekken normaal verschijnen in 5 - 15 min.
- Voeg 100 ul / putje van DDH 2 O om de over-ontwikkeling van vlekken te voorkomen.
- Spoel de platen met stromend leidingwater na de volledige ontwikkeling van alle spots.
- Verwijder de underdrain van de platen en laat ze aan de lucht drogen in het donker.
- Tel de spots toepassing van een geautomatiseerde plaatlezer een beeldacquisitie / analyse-eenheid (bijvoorbeeld een automatische scanner of handmatig via een dissectie microscoop).
OPMERKING: De platen kunnen worden bij kamertemperatuur in het donker bewaard en later geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBMC werden ontdaan van erytrocyten en hechtende cellen (stappen 1,2-1,7). Een monster (2 x 10 6) cellen werden onderworpen aan een flowcytometrische analyse om de populaties van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc's in perifeer bloed (figuur 1) tonen. In PBMC van deze donor, ongeveer 10% van de lymfocyten waren CD19 + B-cellen. In de B-cel compartiment, het percentage van CD19 + CD27 - naïeve B-cellen was ongeveer 50%. Anderzijds, ongeveer 50% van de CD19 + B-cellen waren CD27 + B-geheugencel 7, 25-26. Van de nota, kan CD27 + memory B-cellen verder worden gescheiden met de opname van IgD 4. Het fenotype van circulerende PBs beter worden gedefinieerd met weinig of geen oppervlakte-expressie van CD20 (CD19 + CD27 + / CD38 + CD20 hi lo / -) 2, 30-31. Om de dode cellen te sluiten, de 7-AADkunnen in cel kleuring (stap 3,5), en een plot van FSC versus 7-AAD maakt het poorten van de populatie van levende cellen (7-AAD -).
De belangrijkste stappen van de ELISPOT-test zijn weergegeven in figuur 2. Beide gezuiverde humane B-cellen en CD19 + CD27 + geheugen B-cellen werden gekweekt in aanwezigheid van CpG met RPMI 1640 medium gedurende 5 dagen. De cellen werden geoogst voor de ELISPOT-test voor het kwantificeren van de nieuw opgedoken ASC. Indien aanwezig, de reeds bestaande PBs geïsoleerd uit het perifere bloed uitdoven 48 h 11. De ELISPOT-test werd uitgevoerd, en de plek beelden die door een automatische plaat scanner worden gedemonstreerd in figuur 3. 200 IgM-ASC van 10 4 B-cellen die met CpG gedurende 5 dagen, terwijl het aantal IgG-ASC is 10 - - De resultaten van ELISPOT zal gewoonlijk 50 tonen in 50 10 4 11 cellen.
Figuur 1. Illustratie van de Gating strategie om de naïeve B-cellen, B-geheugencel Scheid, en PBS in de PBMCs. (A) Cellen (2 x 10 6) werden gekleurd met 2 ug elk van CD19-APC, CD27-eFluor450 en CD38-PE mAb (stap 3,4). De lymfocyten compartiment werd afgesloten (G1) op de stip plot voor voorwaartse verstrooiing (FSC) versus kant verstrooiing (SSC). (B) Cel doubletten, die gevormd worden door twee cellen elkaar geplakt, werden uitgesloten (die buiten G2) op perceel FSC-W (breedte) versus FSC-H (hoogte). (C) CD19 + B-cellen werden gated als G3 op het perceel voor SSC-A (gebied) en CD19-APC. (D) van de CD19 + cellen, de dot plot van CD27 en CD38 parameters vertoonden naïeve B-cellen (CD19 + CD27 -, Q1 en Q4), het geheugen B-cellen (CD19 + CD27 +;Q2 en Q3) en PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 +, G4, 0,6% van de Q2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Illustraties van de belangrijkste stappen van de ELISPOT-test. (A) Plaats 50 gl / well (5 ug / ml) of F (ab ') 2-fragment van anti-humaan Ig (IgG + IgM + IgA) in een ELISPOT dienblad 2 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C (bij voorkeur) (stap 5,4). Zaad de cellen in de putjes van de plaat ELISpot. Laat de ASC te hechten aan de PVDF membraan en te scheiden Abs voor 8-14 uur (stap 5.11). (B) wassen van de cellen met PBS (met 0,05% Tween 20). (C) Voeg de AP of HRP-conjugated detectie Abs specifiek voor ofwel IgG of IgM. (D) afwassen detectie Abs die ongebonden zijn. (E) Het ontwikkelen van de vlekken met een substraat oplossing van AP of HRP voor het opsporen Abs wedstrijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. ELISpot Resultaten van een vertegenwoordiger van de Plaat. (A) Gezuiverde CD19 + B-cellen werden in drie aangrenzende putjes (50.000 cellen in well 1, 25.000 cellen in well 2, en 12.500 cellen in well 3, respectievelijk) van de ELISpot plaat. Vervolgens werden cellen gekweekt in RPMI 1640 medium nacht (~ 14 h). De ELISPOT-test werd uitgevoerd na het voltooien van de cultuur (stappen 5,12-5,18). om Analyze de resultaten, werd de ELISpot plaat gescand om beelden te verwerven via een automatische analyzer uitgerust met de scanner en software. (B) Gezuiverde CD19 + CD27 + geheugencellen (10 6 / ml) werden gekweekt in de aanwezigheid van 5 ug / ml CpG gedurende 5 dagen. De cellen werden behandeld zoals in (A) voor de ELISPOT-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen
Normaal gesproken kan RBC efficiënt worden verbroken en gewist door lysisbuffer (stap 1.2). Het is belangrijk om PBMC's met de RBC lysisbuffer langer dan 5 min incuberen, zoals levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed door het ammoniumchloride. Als alternatief kunnen RBC en bloedplaatjes gelijktijdig worden verwijderd door het volgende protocol.
Meng vers volbloed met zuur-citraat-dextrose (ACD) buffer (39 mM citroenzuur, 75 mM natriumcitraat en 135 mM dextrose, pH 7,4) in een volumeverhouding van 9: 1, bloed-to-buffer. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Let op de vorming van lagen, indicatief scheiding. Zuig en gooi de bovenste laag, die bloedplaatjes en bloedplaatjes-rijk plasma (gele kleur) bevat. Verwijder de dunne middelste laag bij het grensvlak, die PBMCs bevat (i .e., De buffy coat). Vermijd de verontreiniging van RBC in de onderste laag (dark rode kleur). Voeg lysisbuffer aan de PBMC om de resterende RBC's te verwijderen, en volg stappen 1,2-1,19.
Twee benaderingen kunnen worden gebruikt om B-cellen te isoleren uit PBMC: positieve en negatieve selectie 21. De werkwijze van negatieve selectie (stap 1,1-1,19) gebruikt om onaangeroerd, functionele B-cellen te verkrijgen, zonder gebonden Abs of microkralen voor downstream experimenten. Het is van cruciaal belang om hier rekening mee te houden bij de activering en / of differentiatie van gezuiverde B-cellen treedt op in de cultuur. De zorg is dat cellen gezuiverd door positieve selectie onbedoeld worden beïnvloed doordat de mAb geconjugeerde microkralen (0,2-5 urn in diameter). mAbs binden aan specifieke receptoren op B-cellen en dus kan verknopen receptoren voor activering. Bovendien kan microkralen worden endocytose door B-cellen met gebonden receptoren. Ofschoon zij biologisch afbreekbaar, kan de microbolletjes blijven in de cellen langer dan een week. Of het behoud van microbolletjes zullen beïnvloeden experimentale resultaten moet empirisch worden bepaald. Bij de zuivering van humane B-cellen via positieve selectie, anti-CD19 (klonen: 4G7 of HIB19) microparels worden vaak gebruikt omdat CD19 is algemeen uitgedrukt gehele ontwikkelingsstadia van B-cellen. De zuiverheid van B-cellen na scheiding kan worden bepaald met flow cytometrie met anti-CD19 mAb (klonen: SJ25C1 of LT19), die verschillen epitopen uit anti-CD19 microbolletjes herkennen.
Zuivering en scheiding van Herdenking en Naïve B Cellen van Geïsoleerde B-cellen
CD27 is een algemeen aanvaarde oppervlakte marker voor het menselijk geheugen en naïeve B-cel onderscheid 24. De CD27 molecule behoort tot de tumor necrosis factor receptor (TNFR) familie. Omdat CD27 wordt tot expressie gebracht op de meeste humane B-geheugencel, wordt vaak gebruikt om te onderscheiden van CD27 - naïeve B-cellen. Omdat CD27 wordt ook tot expressie gebracht op T-cellen en NK-cellen, het gebruik van anti-CD27 microbeads (kloon: O323) in een positieve selectie van het geheugen B-cellen vereist de voorafgaande zuivering van B-cellen (stappen 1,1-1,19). Voor een zuiverheid controle na de scheiding, mAb's die specifiek zijn voor de menselijke CD27: zijn (klonen L128 of LG.3A10) aanbevolen (stap 2.12). Omdat CD27 + B-geheugencel heterogene, bijkomende oppervlakte markers, zoals IgD en FCRL4, kan worden beschouwd voor verdere scheiding celsortering 4, 7.
Celsortering om Naïve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / PC verkrijgen
Omdat B-cellen tot expressie FcyRIIB, wordt een Fc blok (stap 3,3) aanbevolen voordat de cellen te kleuren met mAbs voor flowcytometrie. Het Fc-fragmenten van de menselijke IgG alleen kan evengoed blokkeren de hele menselijke IgG bij 1 ug / 10 6 cellen. Anti-humaan CD32 mAb (klonen: 3D3 of AT10) is een andere optie voor de Fc blok. Van de nota, indien FcyRIIB is een oppervlak marker te worden gemerkt in gezuiverde B-cellen, de fluorofoor-geconjugeerde anti-CD32 mAb shOuld worden toegevoegd aan afzien van de Fc blok, gevolgd door kleuring met andere mAb's zonder PBS wassen.
Voor drie-kleuren flowcytometrie, CD38-FITC (fluoresceïne), CD27-PE (fycoerythrine) en CD19-APC (allofycocyanine) zijn een typische combinatie van fluoroforen. Indien evenwel de flowcytometrische sorter is uitgerust met drie lasers, zoals die van 405 nm, 488 nm en 640 nm, de onderzoekers dan de luxe om fluoroforen opgewekt door verschillende lasers voor celsortering kiezen. Zoals geïllustreerd in figuur 1, werden cellen gekleurd met CD19-APC (kloon: HIB19), CD27-eFluor450 (equivalent aan Pacific Blue, kloon: O323) en CD38-PE (kloon: HB7) aan de naïeve B-cellen scheiden geheugen B-cellen, en PBS. Van de nota, sommige onderzoekers de voorkeur aan de opneming van CD45 (kloon: HI30) als een leukocyten lineage marker en poort B-cellen als een CD45 + CD19 + populatie. Omdat de detectie PBS in omloop bij steady-state is een zeldzame vooravondnt bij gezonde personen, lage of zelfs geen oppervlakte-expressie van CD20 op PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) bevestigt hun bonafide bestaan 2, 30-31. Dit is handig wanneer de kwantificering resultaten PBS door oppervlakte fenotypes en ASC door ELISPOT-tests worden vergeleken. Gedurende de periode voor cel-sortering wordt 7-AAD voorkeur propidiumjodide voor het uitsluiten van dode cellen, vanwege de smallere emissiespectrum en onderste overloop in meerkleuren flowcytometrie.
In vitro stimulatie en differentiatie van geïsoleerde menselijke B-cellen
Het type B CpG (ODN 2006) kan alleen beperkte differentiatie van zowel IgM- en IgG-ASC van geheugen B-cellen. Bovendien naïeve B-cellen zijn slechts zwak reageren op CpG en vooral leiden tot IgM-ASC 6, 11. De concentratie van CpG in kweek in het traject van 2,5-5 ug / ml per 10 6 B-cellenof PBMCs 11, 18. Anders dan CpG kunnen gezuiverde B-cellen en PBMC's worden gekweekt in aanwezigheid van combinaties van CpG met mitogenen, cytokinen en BCR agonisten, menselijke B-cellen differentiëren in ASC in kweek (stap 4,3). Bijvoorbeeld gebruikelijke recepten 10 6 cellen per ml bevatten (a) CpG (5 ug / ml), recombinant humaan IL-2 (10 ng / ml) en recombinant humaan IL-10 (10 ng / ml) 15, 34; (b) CpG (5 ug / ml) en F (ab ') 2-fragmenten van anti-humaan Ig (IgG + IgM + IgA) (20 ug / ml) 11; (c) CpG (5 ug / ml), proteïne A van S. aureus Cowan (SAC) (1: 10.000 verdunning) en karmozijnbes mitogeen (PWM) (1: 100.000 verdunning) 18; (d) recombinant humaan IL-21 (100 ng / ml) en recombinant sCD40L (1 ug / ml) 12, 15, 33; en (e) recombinant humaan IL-2 (10 ng / ml) en R848 (1 ug / ml), een TLR7 agonist 33-34. Hoewel B-cellen in ASC kunnen worden onderscheiden in drie dagen 11, cellen zijn over het algemeen pre-stimulated gedurende 5-6 dagen alvorens te worden toegevoegd aan de ELISpot dienblad de kwantificering van ASC 11, 18. Gedurende de kweekperiode er meestal geen aanvulling van het uitgangsmateriaal differentiatie middelen.
De toevoeging van IL-2 en IL-10 aan CpG-bevattende kweken kan een aanzienlijke verhoging van het aantal gedifferentieerde IgM- en IgG-ASC 15, 35. De aanwezigheid van IL-2 in kweek kunnen mitogene stimulatie van de groei van gedifferentieerde B-cellen door CpG vergemakkelijken. IL-10 in het gebied van 10-25 ng / ml kan sterk in aanwezigheid van CpG 35 verhogen de productie van ASC (~ 3- tot 10-voudig). BCR agonisten, waaronder anti-BCR en SAC en PWM kunnen ook proliferatie van primaire humane B-cellen 18 stimuleren. Incuberen van geheugen B-cellen met CpG en polyklonale anti-BCR voornamelijk leidt tot een verhoging van IgM-ASCs maar niet in IgG-ASC 28. Ter voorkoming van de inhibitie van signalering door BCR door FcyRIIB, een F (ab# 39;) 2-fragment van anti-Ig (10 - 20 ug / ml per 10 6 cellen) wordt aanbevolen wanneer verknopende BCR 11. In plaats van polyklonale anti-Ig, moet anti-BCR mAbs specifiek voor ofwel IgM + IgG + of B-cellen worden beschouwd als isotype-specifieke B-cel subsets differentiatie targeten ASC's. Een combinatie van CpG, SAC (1: 10.000 verdunning), en PWM (1: 100.000 verdunning) efficiënt activeren geheugen B-cellen differentiëren in IgM- en IgG-ASC 18, 24. Bovendien kunnen CpG matig induceren omschakeling van klasse van Ig in vitro 28-29. Daarentegen IL-21 (100 ng / ml) en sCD40L (1 ug / ml) effectief induceren geheugen B-celdifferentiatie uitsluitend geschakelde IgG-ASC 12, 30. SCD40L De B-cellen kunnen activeren door het nabootsen van T-cel hulp door middel van CD40 op B-cellen, beïnvloeden hun differentiatie in PC's in vivo. Van de nota, anti-CD40 (klonen: 89 of G28.5) kan vervangen sCD40L in de cultuur 15. However noch sCD40L of anti-CD40 alleen in staat de differentiatie van memory B cellen. Aldus wordt de CD40 activering van gekweekte B-cellen vaak gecombineerd met een differentiatie middel, zoals IL-4, CpG, R848, of IL-21, waarvan elk kan Ig omschakeling van klasse promoten. IL-4 speelt een belangrijke rol bij de differentiatie van CD4 Th2-cellen, waardoor de inductie van de meeste IgM + B-cellen omschakelen naar IgG1 + B-cellen in kweek. Evenzo, in de aanwezigheid van IL-21, zowel geheugen B-cellen en naïeve B-cellen differentiëren uitsluitend naar klasse geschakelde ASC 12, 32. Net als CpG, kan R848 een marginale klasse switch van B-cellen 34 induceren. Ten slotte is het vermelden waard dat, hoewel lipopolysaccharide (LPS) effectief differentiatie van muis B-cellen kan induceren in ASC, menselijke B-cellen brengen lage niveaus van TLR4 en CD14 29. Vanwege de toevoeging van een differentiatie middel in cultuur bevordert de vorming van geschakelde B-cellen, moet deze toevoeging worden vermedenwanneer vooraf bestaande PBS / PC of geschakelde memory B-cellen te meten.
ELISPOT-test
De ELISPOT assay combineert plaat gebaseerde ELISA's met een membraan western blotting technieken, waardoor de detectie van Abs uitgescheiden door een B-cel 18. De ELISPOT is ook aangepast voor Ag specifieke T-cellen die cytokinen 17, 36 scheiden kwantificeren. In een ELISPOT-test, kan zowel gezuiverde cellen of niet-gefractioneerde PBMCs (vrij van RBC's) worden gebruikt. Echter, ~ 10-voudig PBMC vereist dan gezuiverde cellen constante resultaten opgeleverd ELISPOT-tests verkrijgen. Een goed startpunt is 1-2 x 10 5 cellen per putje voor het detecteren van de circulerende ASC in PBMCs. Bij de detectie van Ag-specifieke ASC, anti-Ig wordt meestal vervangen door Ag (5-10 ug / ml in PBS) aan Ag-specifieke ACSS (stap 5,4) vastleggen. De toepassing van isotype-specifieke detectie Abs kan onderscheid worden gemaakt tussen Ag-specifieke IgM-en IgG isotype ASC ASC-(stap 5,14). Opmerkelijk, ongeacht of anti-Ig of Ag gebruikt om ASC vangen, de detectie Abs voor ELISA niet altijd geschikt voor ELISpot zijn. Ook niet alle kleuren substraten voor ELISA goed functioneren in ELISpot. AP- en HRP-geconjugeerde Abs worden meestal gebruikt voor spot detectie in ELISpot. De BCIP / NBT substraatoplossing is een populaire keuze voor AP-gebaseerde detectie, dat 3,3 ', 5,5'-tetramethyl-benzidine (TMB) en 3-amino-9-ethylcarbazool (AEC) oplossingen vaak substraten voor HRP in ELISpot. Als de AP of HRP geconjugeerd direct op de detectie Abs, is slechts een stap nodig voor detectie, zoals beschreven in het protocol (stap 5.14). Daarentegen worden de detectie Abs gebiotinyleerd en vereisen daaropvolgende incubatie met AP of HRP-geconjugeerd streptavidine vóór reageren met het substraat in een twee-staps werkwijze. Zowel eenstaps en tweestaps methoden werken efficiënt spots in ELISpot detecteren.
De ELISPOT-test kan niet alleen circulat kwantificerening maar ook gedifferentieerd ASC in de cultuur (stap 1,19 versus 4,6). Indien aanwezig circulerende ASC, die normaliter niet langer dan twee dagen in kweek wonen, kan direct worden gekweekt in de ELISpot plaat zijn, met of zonder zuivering uit PBMC 11. In tegenstelling, de differentiatie van B-geheugencel vereist 5 dagen. Daarom is direct kweken in ELISpot platen na cel isolatie (stap 1.19) niet aan te raden; de dode cel puin als gevolg van de verlengde kweekperiode kan de achtergrond in plaats detectie te vergroten. In plaats daarvan, zowel gezuiverde B-cellen en de totale PBMC's kunnen eerst worden gekweekt in een 6-well of 12-well platen in de aanwezigheid van mitogenen en differentiatie middelen (stap 4,3). Tijdens het kweekproces, de herhaalde toevoeging van stimulatie middelen behoeft (stap 4,3). Terwijl de platen in de incubator, moet de deur van de incubator voorzichtig worden geopend en gesloten om te voorkomen gezaaid ASC bewegen, want zij kunnen uitgescheiden Abs diffunderen langs de sporen bewegen, genereren spotsmet staarten (de zogeheten "comet-achtige" spots) (stap 5.11). De incubatieperiode ELISpot platen wordt bepaald door de tijd die nodig is voor de cellen om detecteerbare hoeveelheden Abs scheiden zonder dat de cellen te verdelen, die moeilijk spottelling zou leiden. Aldus worden cellen gewoonlijk gekweekt in het traject van 8 uur tot overnacht (stap 5.11).
De ELISPOT-test is de meest gebruikte methode voor het kwantificeren van geheugen B-celresponsen. Het is uitgegroeid tot een populaire, onafhankelijk uitlezen van humorale immuunrespons en immunologisch geheugen. In de praktijk wordt de voorgaande mitogene kweek nodig om geheugen B-cellen voor differentiatie geactiveerd ASC's (stap 4,3). De frequentie waarop B-geheugencel uitbreiden en differentiëren ASC's verschilt per cultuur milieu, zoals hierboven beschreven. Echter zonder consensus meeste onderzoekers nemen de inductie voorwaarde dat de productie van ASC maximaliseren. In termen van het middel dat wordt gebruikt voor spot detection, kan een oplosbare gebiotinyleerde Ag de onbevredigende detectie Ab vervangen, zonder afbreuk te doen aan de gevoeligheid 37. Dit is van bijzonder belang wanneer de beschikbaarheid van Ag beperkt is door een veel kleinere hoeveelheid Ag is nodig voor de detectie dan het bekleden van de platen. Ten slotte heeft ELISpot niet fenotypische analyse van de cellulaire heterogeniteit toe te staan, en daardoor is voorafgaande fractionering van cel subpopulaties. Onlangs heeft een veelkleurig ELISpot assay, waarbij detectie Abs zijn gelabeld met verschillende fluoroforen, is ontwikkeld om meerdere soorten cytokine-afscheidende cellen te detecteren in een enkel putje 38-39. Deze verbetering zullen met name betrekking op de detectie van laagfrequente cellen in PBMC's en een grootschalige analyse van door vaccin geïnduceerde B-cel responsen zijn.
Omdat de ELISpot test is snel en efficiënt kwantificeren ASCs en cytokine-afscheidende cellen, is uitgebreid tot de functionaliteit van niet alleen circu metenlating lymfocyten, maar ook weefsel immuuncellen zoals intrahepatische leukocyten 40. Vanwege de gevoeligheid bereiken van het niveau van het detecteren zelfs één ASC, is de ELISPOT steeds vaker toegepast om menselijke immuunreacties vaccin efficacies tegen bestaande en opkomende ziekteverwekkers te meten. Hoewel de hoge-prestatie en de robuustheid van ELISPOT-test zijn uitstekend voor grootschalige evaluaties van immuunresponsen gebruik PBMC's, kunnen de resultaten van de testen worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals de verwerkingsvertraging monsters, of cellen vers of bevroren , serumcomponenten in het kweekmedium, en het aantal cellen toegevoegd aan de plaat 41 ELISpot. Daarom moet normalisatie procedures in de ELISpot protocol worden opgenomen om intra- en inter-assay variatie in grootschalige en longitudinale follow-up onderzoeken (bijv vaccinproeven) te verminderen. De normalisatie methode van de plaat lezen is ook van cruciaal belang voor lineariteit, nauwkeurigheid en tegensistency in de test resultaten 41-42. Een manier om plaat lezen normalisatie uit te voeren is de werkwijze van de seriële verdunning van cellen gezaaid op platen ELISpot (stap 5.10) uitstrekken. Door een referentieplaat moet meer seriële verdunningen een lineair verband tussen het aantal cellen per putje en ter plaatse tellingen per putje tonen. Herhaalde scans van de ELISpot plaat kan worden gebruikt om het model van spottelling valideren, zowel automatisch als handmatig. Minimal intra-well variabiliteit in spot tellingen wordt verwacht na deze normalisatie procedures 43. Ten slotte kan de toepassing van ELISPOT uitgebreid op vele manieren, zoals de controle van de behandeling responsen van patiënten met infecties en rekening kanker immuuntherapie, en de evaluatie van immunotoxiciteit (bijvoorbeeld immunosuppressie en door geneesmiddel geïnduceerde auto-immuniteit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
