Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

Published: December 14, 2016 doi: 10.3791/54582
Automatic Translation
1
1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

Abstract

המאפיין העיקרי של חסינות לחות הוא ליצור ASCs התפקודית, אשר לסנתז ולהפריש Abs הספציפי לאנטיגן (Ag), כגון פתוגן, ומשמש הגנה מארחת. לקביעת כמותי של המצב התפקודי של התגובה החיסונית הלחות של אדם, הן Abs בסרום ASCs במחזור נמדדים בכינויו readouts פונקציונלי. אצל בני אדם, דם היקפיים הוא מדגם הנוחה ביותר ונגיש בקלות, שניתן להשתמש בהם לצורך קביעת התגובה החיסונית הלחות שהושרו על ידי תאי B המארח. B-cell ברור תת, כולל ASCs, ניתן לבודד ישירות מדם היקפי באמצעות בחירה עם microbeads שושלת ספציפית Ab מצומדות או באמצעות מיון תא עם cytometry זרימה. יתר על כן, תאי B נאיביים וזיכרון מטוהרים יכולים להיות מופעל בדיל לתוך ASCs בתרבות. הפעילות התפקודית של ASCs לתרום הפרשת Ab ניתן לכמת על ידי ELISPOT, המהווה assay כי מתכנס אנזיםassay immunoabsorbance -linked (ELISA) וטכנולוגיות מערביות סופג כדי לאפשר הספירה של ASCs הנפרד ברמת התא הבודד. בפועל, assay ELISPOT נעשה שימוש יותר ויותר להעריך יעילות החיסון בגלל הקלות של טיפול של מספר רב של דגימות דם. שיטות לבודד תאי B האדם מן הדם ההיקפיים, את הבידול של תאי B לתוך ASCs במבחנה, ואת העסקתם של ELISPOT כימות של IgM- סך IgG-ASCs שיתואר כאן.

Introduction

תאי B למלא תפקיד מרכזי בפיתוח של חסינות לחות. בהתחלה הוא לפתח במח העצם ולהיכנס לזרם הדם כמו תאי B נאיביים, אשר ניתן להעביר לתוך הרקמות הלימפה, כמו הטחול, בלוטות הלימפה, ואת שקדים, להמשך פיתוח. לאחר מפגש Ag, כמה תאי B נאיביים לנדוד לתוך זקיקי הלימפה, שם מרכז נבטי תאי B יכולים להתמיין לתאי B זיכרון plasmablasts (PBS) / תאי פלזמה (מחשבים). בעוד שרוב PBS / מחשבי היציאה לתוך זרם הדם, כמה בסופו של דבר להתגורר במח העצם כדי לעבור התמיינות מסוף מחשבי חיים ארוכים 1. תאי B שבמחזור הם הטרוגניות, ו על מצב יציב, מחשבי PBS / הם נדירים בדם היקפי 2. כתוצאת הזמינות של סמני משטח ספציפי שושלת, cytometry זרימה הפכה שיטה פופולרית לזיהוי והאפיון של תת B-cell בדם היקפי. יישום מורחב של הזרימה cytometry הוא התוספת של פונקצית סדרן תא, המאפשרת פרדה ובידוד של תת בודדים של תאי B עם טוהר גבוה. בהתבסס על הביטוי של קולטנים משטח ספציפי בשלבים התפתחותיים שונים, תאי B במחזור האדם מסווגים בדרך כלל לשלוש תת-אוכלוסיות עיקריות: תאי B נאיבי (CD19 + CD27 - CD38 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 + CD38 -), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (איור 1). תאי B נאיביים מטבעו לא נתקלו AGS. עם זאת, הם יכולים להיות מובחנים לתוך IgM + CD27 + תאי הזיכרון B. למרות שתאי B נאיבי הם הומוגניים בהבעת הקולטן לאנטיגן B-cell (BCR) מולקולות -associated (למשל, CD19, CD20 ו CD22) הם הטרוגניים ברפרטואר אימונוגלובולינים שלהם 5. רוב תאי B זיכרון CD27 + יכול להיות מובחן לתוך CD27+ / היי CD38 + PBS / מחשבים 6. בנוסף, תאי B זיכרון PBS / מחשבים הם polyclonal ולהציג ההטרוגניות התפתחותית תפקודית 4-7. PBS / מחשבים שבמחזור הם בדרך כלל קצרי מועד מחווי CD138, אבל אלה שנעשו להתיישב במח עצם סופנים יבדילו ולהיות קבוע לטווח ארוך. סופני מחשבים הבדיל להביע CD138 ולמטה להסדיר מולקולות CD27 על פני השטח שלהן 8. מאז הוא PBS ומחשבים מסוגלים מפריש Abs, בהזדמנויות רבות הם מסומנים קולקטיביים ASCs. לעומת זאת, לא תאי B נאיביים ולא תאי B זיכרון יכול לייצר כמות ניכרת של שרירי הבטן 9-10. אף על פי כן, כאשר מבודד, הן תאי B נאיביים וזיכרון יכולים להיות מובחנים לתוך ASCs ב 3 - 10 ימים כאשר הניחו את תנאי התרבות הנכונים 6, 11-15. למעשה, ASCs נגזר ביטויי משטח דומים נתח בידול במבחנה של CD27 ו CD38 עם אלה fr ישירות המבודדדם 6 היקפי אום. בנוסף, ASCs הבדיל במבחנה להביע רמה נמוכה של CD20 השטח, בדומה לזה של מחזורי PBS / מחשבים 6. למרות ASCs נגזרת התרבות היא כל קצרת מועד, הם יכולים להפריש Abs, המציין כי הם תפקודיים מוכשרים ומסוגלים לתרום חסינויות לחות.

שניהם ELISA ו ELISPOT הוא ללא ספק השיטות ביותר מיושם כלל עם אשר להשיג מידע פונקציונלי על תגובת הלחות החיסונית. ELISA הוא assay 96-היטב מבוססי צלחת, והוא משמש לעתים קרובות כדי למדוד את טיטר של שרירי הבטן בסרום Ag ספציפיים analytes אחרים (למשל, ציטוקינים). זה נוח, וניתן להרחבה. ELISA נועד להשתמש assay אנזים מוצק שלב כדי לזהות הנוכחות של שרירי בטן או חומרים אחרים, כגון סרום, במדגם נוזל 16. המצגים מ ELISAs בסרום היו בשימוש נרחב לייצג את התגובה החיסונית של הגוף. כלי הכרחי לרכישה מחדשadouts מבחני ELISA הוא קורא microplate spectrophotometric. הקורא יכול לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של מוצרי הקצה בדרך כלל בעקבות התגובה של peroxidase חזרת (HRP) Abs זיהוי מצומדות ו -17 מצעים הספציפיים שלהם. באשר לדיווח תגובת הלחות החיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA לציין הקולקטיב, אבל לא אישית, ההישגים של ASCs בגוף. בנוסף, ELISA אינה מביאה בחשבון את ההשתתפות ידי תאי B זיכרון, אשר לא מפרישים Abs.

כמו ELISA, ELISPOT היא שיטה בשימוש נרחב לאיתור וניטור התגובה החיסונית בדגימות דם היקפיים 17-18. ELISPOT היא טכניקה הקשורים כריך ELISA. בכל זאת, התאים ממוקמים לתוך difluoride polyvinylidene (PVDF) בארות מגובי הממברנה של 96 גם microplates לתרבות לטווח קצר. את assay ELISPOT משול ביצוע המערבי סופג על microplate ואת developing הכתם על הממברנה PVDF בכל טוב. מערכת קורא אוטומטית ELISPOT או סטראו עבור ספירה ידנית נדרשת. היתרון העיקרי של ELISPOT באיתור תגובה חיסונית הוא הרגישות המעולה שלה כימות של ASCs ותאי ציטוקינים, מפריש. הוא מדווח פעילויות הפעילות שלהן חסינות הלחות ואת הסלולר, בהתאמה. במדידת תפקוד הלחות חיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA ומספר ASCs שמפרטת ELISPOT מתואמות לעתים קרובות, אבל readouts הנתונים משני מבחנים אלה יש כמה בדלי השלכות פונקציונליות 19-20. היתרון העיקרי של ELISPOT הוא רגישותו של השיטה. רמת טיטר בסרום Ab כפי שדווחה על ידי ELISA מוצגת חצי כמותית כמו readouts OD, המציינת את רמת Ab יחסית, או יותר באופן כמותי, כפי readouts ריכוז כאשר כמות ידועה של isotypes התקין של שרירי הבטן נכללה לעיון. לעומת זאת, התוצאות של ELISPOT הם presenteד כמספר מוחלט של ASCs בתוך שלולית התא של עניין (למשל, תאי דם היקפיים mononuclear unfractionated (PBMCs) ותאי B מטוהרים מן PBMCs). ELISPOT יכול לזהות ASC יחיד, אבל ELISA דורש כמויות Ab מ ASCs להגיע ריכוזי assay התלוי אופטימיזציה לפני המדידה. לפיכך, ELISPOT הוא ללא ספק עדיף על ELISA ברגישות של כימות. יתר על כן, ELISPOT מתאים גם לכימות במבחנה ASCs הבדיל מתאי B זיכרון מופעל. תאי B זיכרון לא מפרישים Abs אבל יכול להתמיין ASCs באקטיבציה; הם ולכן אין תרומה Abs בסרום זוהה על ידי ELISA. לפיכך, ELISPOT היא השיטה של ​​בחירה במדידה של התגובה החיסונית של תאי B זיכרון לאחר ההפעלה בתרבות. היא מאפשרת ניטור של החזקת חסינות הלחות לטווח ארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דם היקפי אדם יש לקבל מתורמים בריאים תחת הסכמה מדעת, ושימוש דגימות דם חייב לעמוד בהנחיות שאשרו שהקימו לוחות סקירה מוסדיים בודדים. במחקר זה, כי הפרוטוקול משתמשים בדם אדם בהפגנה של תוצאות cytometry זרימה (איור 1) מבחני ELISPOT (איור 3) אושרה על ידי המועצה לביקורת פנימית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי בטייוואן (מספר פרוטוקול 201307019RINB).

בידוד וטיהור 1. של אדם תאי הדם ההיקפי B

  1. צייר ~ 10 מ"ל של דם מהעורק cubital החציוני (ב הקדמי fossa cubital עד המרפק) לתוך צינור 15 מ"ל המכיל EDTA K 2 (1.5 עד 2.0 מ"ג / מ"ל דם) ומיד להפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע קריש היווצרות.
  2. להוסיף 35 מ"ל של autoclaved (121 ° C, 15 דקות) תאי דם אדומים (RBC) תמוגה חיץ (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ 3 KHCO, ו 1 mM EDTA; pH 7.4) כדי צינור המכיל את דגימת הדם טרי (≥ 3: 1 כרך / כרך) ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך לא יותר מ -5 דקות.
    הערה: המראה של העברת אור דרך הצינור מציין את השלמת תמוגה RBC.
  3. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. ודא כי הגלולה היא בצבע לבנה.
  4. Resuspend גלולה עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו autoclaved (PBS, 137 מ"מ NaCl, KCl 2.7 מ"מ, 4.3 מ"מ Na 2 4 HPO, ו 1.47 מ"מ KH 2 PO 4; pH 7.4) ו צנטריפוגות כמו בשלב 1.3.
  5. בטל supernatant, resuspend גלולה עם 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני (תוספי: נסיוב עגל עוברית 10%, 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, ו -2 מ"מ L- גלוטמין), ולאחר מכן צלחת תאים לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ (10 מ"ל של דם לכל צלחת). מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  6. מערבולת בעדינות את מנת התרבות כמה פעמים ומקוםמדיום תרבות (תאי השעיה) לתוך צינורות חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר. מחק את התאים החסידים (בעיקר מקרופאגים) על תרבות המנות.
  7. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant.
  8. Resuspend גלולה עם 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640. ספירת התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
    הערה: הכדאיות של לויקוציטים מבודד היא בדרך כלל יותר מ -90% על ידי הרחקה הכחולה trypan.
  9. צנטריפוגה כמו בשלב 1.7 ו resuspend התאים ~ 200 μL של חיץ קר PBS (אלבומין 0.5% שור (BSA) ו 2 מ"מ EDTA) בריכוז של 5 - 10 x 10 6 תאים / מ"ל.
  10. הוסף 5 μL של קוקטייל Ab אנטי אנושי biotinylated ספציפי לתאי דם (עבור הסלקציה השלילית של תאי B) לכל 10 6 תאי דגירה על קרח למשך 30 דקות 21.
    הערה: קוקטייל Ab אנטי אנושי צריך לפחות כוללים Abs ספציפי CD2 (או CD3), CD14, CD16 ו.
  11. הוספת נפח עודף של פי 10של PBS סטרילי אל התאים, צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות, וזורקים supernatant.
  12. להוסיף כמויות שווות של microbeads streptavidin מצומדות (5 μL לכל 10 6 תאים) על הגלולה ומערבבת היטב.
  13. דגירה על קרח למשך 30 דקות בתוך צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל.
  14. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS לתוך הצינור.
  15. מניחים את הצינור לתוך מעמד מגנטי דגירה ב RT עבור 8 דקות. Microbeads חום יצרף בהדרגה אל הקיר צינור ליד המגנט 22.
  16. עם הצינור שנותרו לעמוד מגנטי, ובזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי חדש 22.
  17. חזור על שלבים 1.14 כדי 1.16, ולשלב את שני supernatants המכילים את תאי B פגע. מחק את microbeads.
  18. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant.
  19. Resuspend גלולה במדיום RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם.
    הערה: בדרך כלל, 1 - 5 x 10 5 B תאים שנינותחה טוהר יותר מ 95% מ -10 מ"ל של דם היקפיים ניתן לבודד 23.

2. טיהור והפרדה של זיכרון והתמים B תאי מתאי B מבודדים

  1. השתמש בתאים מטוהרים משלב 1 ולקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים 100 μL של חיץ PBS קר לאחר צנטריפוגה ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות.
  3. להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של מב CD27 biotinylated לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  4. הוסף 10 מ"ל של חיץ PBS אל הצינור צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות.
  5. בטל supernatant ו resuspend התאים 50 μL של חיץ PBS.
  6. להוסיף כמויות שוות של microbeads מגנטי streptavidin (1 - 2 מיקרוגרם / 10 6 תאים) לתאים צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל.
  7. בעדינות מערבבים היטב דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  8. להוסיף 2 - 3 מ"ל של חיץ PBS אל הצינור.
  9. מניחים אתצינור לתוך עמדת מגנטי הדגירה ב RT עבור 8 דקות כדי לאפשר microbeads החום לצרף את הצד הקרוב המגנט.
  10. עם הצינורית לעמוד המגנטי, ובזהירות להעביר את החלק היחסי supernatant לתוך צינור סטרילי חדשה. חלק זה מכיל את CD27 המועשר - תאי B נאיבי.
  11. הוסף 5 מ"ל שפופרת המכילה את microbeads בעדינות resuspend microbeads (כלומר, את החלק היחסי מועשר של תאי זיכרון B CD27 +) 24-25.
  12. צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI 1640 עבור הניסויים במורד הזרם.
    הערה: בדרך כלל, ~ 30 - 60% של תאי B יכולים להיטהר כתאי זיכרון CD27 + מן PBMCs של מתורם בריא 7, 25-26.

3. מיון תאים עבור האוסף של תאי B הנאיבי, תאי B הזיכרון, ו- PBS / מחשבים

  1. באמצעות תאים מטוהרים משלב 1, לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים חיץ PBS קר בריכוז של 10 7 לכל מ"ל בתוך שפופרת קלקר 5 מ"ל.
  3. להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של IgG אדם לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 10 דקות עבור בלוק Fc.
  4. הוסף 1 מיקרוגרם אחד נגד CD19-APC (שיבוט: HIB19), אנטי CD27-eFluor450 (שיבוט: O323), ואנטי-CD38-PE (שיבוט: HIT2) לכל 10 6 תאים; מערבבים היטב לדגור על קרח למשך 30 דקות 4, 27.
  5. ב -5 הדקות האחרונות בשלב 3.4, להוסיף 5 μL של D 7-aminoactinomycin המסחרי (7-AAD).
  6. הוסף 2 מ"ל של PBS על הצינור, מערבולת, ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות.
  7. Resuspend התאים מיון חיץ (PBS סטרילי עם BSA 2% ו 2 מ"מ EDTA) בריכוז של 1 - 5 x 10 7 תאים לכל מ"ל בתוך שפופרת 15 מ"ל.
  8. סנן את התאים דרך מסננת תא רשת ניילון (40 מיקרומטר גודל נקבובי) לחסל גושי תאים.
  9. הפרד את התאים עם מעין תזרים cytometricאה מצויד בשלושה לייזרים: סגול (405 ננומטר), כחול (488 ננומטר), ואדום (640 ננומטר).
    הערה: לייזר כחול בלבד מספיקה עבור 3-צבע cytometry זרימה 27-28.
  10. מיין התאים לשלושה צינורות 15 מ"ל (המכיל 5 מ"ל של מדיום RPMI) לאיסוף סימולטני של תאי B נאיבי (CD19 + CD27 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 +), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + / היי CD38 +) 3-4, 28.
    הערה: ממוין נאיבי וזיכרון B תאים יכולים להיות מתורבתים כמתואר בשלב 4.

4. במבחנת הבידול של CD19 האדם מבודד תאים + B, תאי CD19 + CD27 + זיכרון B ו- CD19 + CD27 - תאי B הנאיבי

  1. באמצעות התאים מטוהרים בצעדים 1.19, 2.10, 2.11 ו -3.10, לקבוע את המספר הסלולרי עם hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
  2. Resuspend התאים עם המדיום RPMI 1640בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ"ל ו aliquot אותם לתוך הבארות של צלחת 12-היטב.
  3. להוסיף CPG (ODN 2006) בשעה 5 מיקרוגרם / 10 6 תאים / מ"ל 18, 29.
  4. התרבות התאים בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 5 ימים.
  5. קציר התאים מכל טוב, למקם אותם בתוך צינוריות 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של PBS על צינור אחד, צנטריפוגות אותם ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות.
  6. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. Resuspend התאים בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ"ל עם RPMI 1640 בינוני.

5. Assay ELISPOT

  1. הוסף 30 μL של אתנול 35% במים מזוקקים היטב כל הצלחות ELISPOT למשך 30 שניות.
    הערה: כאשר pipetting, להימנע מלגעת קרום בבארות בכל עת.
  2. הפוך את צלחות ELISPOT להסיר את אתנול.
  3. שים 150 μL של DDH autoclaved 2 O לתוך זה היטב דגירהאותם ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את אתנול שיורית; בצע עם לשטוף של PBS סטרילי ב RT במשך 3 דקות.
    הערה: שלבי 5.1 כדי 5.3 עשויים להיות אופציונליים, תלוי בייצור של הצלחות.
  4. שים 50 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל polyclonal F (ab ') 2 שבר (IgA IgG + IgM +) אנטי אנושי איג (PBS) לבאר כל הצלחות ELISPOT דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (המועדפת) או 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות 11.
    הערה: לאטום את הקצוות של הצלחות עם Parafilm עד השימוש.
  5. הפוך את הצלחות להסיר Abs המאוגד, להוסיף 200 μL של PBS על כל היטב, דגירה אותם פעמים ב RT במשך 3 דקות בכל פעם.
  6. הוספת 200 μL של PBS עם 5% BSA (או RPMI 1640 בינוני) זה טוב עבור חסימה, דגירה אותם ב RT עבור 2 שעות.
  7. הפוך את הצלחות להסיר למאגר החסימה. לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
  8. הוספת 100 μL של RPMI 1640 בינוני היטב כל דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. כאשר מוכן זרע התאים, להפוך את הצלחות להסיר את מדיום RPMI 1640.
  10. זרע 100 μL (5 x 10 4), 50 μL (2.5 x 10 4), ו -25 μL (1.25 x 10 4) של התאים (מן הצעדים 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, ו -4.6) לתוך הבארות של צלחת ELISPOT. עם המדיום RPMI 1640, ולהביא את נפח 150 μL / טוב.
    הערה: מינימום של אחד או שניים דילולים סדרו פי 2 עבור ציפוי התא מומלץ.
  11. דגירה צלחות 37 ° C חממה עם 5% CO 2 עבור 8 - 14 שעות 18. הימנע הזזת הצלחות במהלך דגירה.
  12. הפוך את הצלחות כדי להסיר את התאים ובינוניים RPMI 1640.
  13. הוספת 200 μL / טוב של PBS-T (PBS עם 0.05% Tween 20) דגירה אותם 5 פעמים ב RT, בכל פעם למשך 3 דקות. הפוך את הצלחת להסיר את החיץ לשטוף בין כל 5 הכביסות.
  14. להוסיף או עז נגד אדם phosphatase IgG-אלקליין (AP), שרירי הבטן ספציפי Fcγ (לגילוי IgG, 1: 5,000 ב PBS-T) או עז נגד אדם IgM-AP, Fcμ שבר ספציפי Abs (לגילוי IgM, 1: 5,000 ב PBS-T) לתוך הבארות המיועדות לדגור על RT עבור 2 שעות בחושך.
  15. לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
  16. הוסף 50 μL / היטב tetrazolium כחול פוספט-ניטרו bromochloroindolyl פתרון המצע (BCIP / NBT). כתמים סגולים בצבע בדרך כלל מופיעים 5 - 15 דקות.
  17. הוספת 100 μL / טוב של DDH 2 O כדי למנוע כתמים התפתחות יתר.
  18. יש לשטוף את הצלחות עם ריצה ברז מים לאחר הפיתוח המלא של כל הכתמים.
  19. הסר את underdrain של הצלחות ולאפשר להם אוויר יבש בחושך.
  20. לספור את הנקודות באמצעות קורא צלחת אוטומטית עם יחידת רכישת תמונה / ניתוח (לדוגמא, סורק אוטומטי או ידני באמצעות מיקרוסקופ לנתח).
    הערה: ניתן לאחסן את הצלחות ב RT בחושך ונותחו לאחר מכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PBMCs היו מתרוקנים של RBCs ותאי חסיד (שלבים 1.2 כדי 1.7). דוגמא מתמיסה בסיסית (2 x 10 6) של תאים היו נתוני ניתוח התזרים cytometric כדי להמחיש את האוכלוסיות של תאי B נאיביים, תאי B הזיכרון, PBS / מחשבים בדם היקפי (איור 1). בשנת PBMCs של תורם זה, כ -10% של לימפוציטים היו תאי CD19 + B. בתא B-cell, אחוז CD19 + CD27 - תאי B נאיבי היה בסביבות 50%. מצד השני, כ -50% מכלל תאי CD19 + B היו תאי CD27 + זיכרון B 7, 25-26. מן הראוי לציין כי תאי זיכרון B CD27 + ניתן להפריד עוד יותר עם הצטרפותם של IGD 4. פנוטיפ של מחזורי PBS ניתן להגדיר טוב יותר עם נמוך או ללא ביטוי השטח של CD20 (CD19 + CD27 + / היי CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. כדי לא לכלול את התאים המתים, 7-AAD ניתן לכלול מכתים התא (שלב 3.5), ו או מגרש FSC לעומת 7-AAD מאפשר gating אוכלוסיית תאים חיים (7-AAD -).

השלבים העיקריים של assay ELISPOT מתוארים באיור 2. שני תאי B האדם מטוהרים CD19 + CD27 + תאי זיכרון B היו בתרבית בנוכחות CPG עם RPMI 1640 בינוני במשך 5 ימים. התאים נקצרו עבור assay ELISPOT לכימות ASCs החדש יצא. אם כיום, PBS קיימים מבודדים מהדם ההיקפי תגווע ב 48 שעות 11. את assay ELISPOT בוצע, ואת התמונות במקום נרכשו על ידי סורק צלחת אוטומטית מודגמות באיור 3. תוצאות ELISPOT יהיו בדרך כלל: הצגת 50 - 200 IgM-ASCs מ -10 4 B תאים שטופלו CPG במשך 5 ימים, וזאת בעוד מספר IgG-ASCs הוא 10 - 50 10 4 תאים 11.

EP-together.within-page = "1"> איור 1
איור איור 1. אסטרטגית Gating להפריד את תאי B הנאיבי, תאי הזיכרון B ו- PBS ב PBMCs. (א) תאים (2 x 10 6) הוכתמו 2 מיקרוגרם כל אחת CD19-APC, CD27-eFluor450, ו CD38-PE מבז (שלב 3.4). תא הלימפוציטים היה מגודר (G1) על מגרש הנקודה עבור פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור בצד (SSC). (ב) כפילויות Cell, אשר נוצרות על ידי שני תאים דבוקות זו לזו, לא נכללו במחקר (מחוץ לאלה G2) על מגרש FSC-W (רוחב) לעומת FSC-H (גובה). (ג) תאי CD19 + B נקבעו מגודרים כמו G3 על המגרש-A SSC (אזור) ו CD19-APC. (ד) לתקנות CD19 + התאים, עלילת נקודת פרמטרי CD27 ו CD38 הראה תאי B נאיביים (CD19 + CD27 -; Q1 ו Q4), תאי הזיכרון B (CD19 + CD27 +;Q2 ו Q3), ו- PBS (CD19 + CD27 + / היי CD38 +; G4, 0.6% של Q2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. איורים של השלבים העיקריים של Assay ELISPOT. (א) שים 50 μL / טוב (5 מיקרוגרם / מ"ל) של F (ab ') 2 שבר (IgA IgG + IgM +) אנטי אנושי איג לתוך צלחת ELISPOT עבור 2 שעות ב 37 ° C או לילה ב 4 ° C (מועדף) (שלב 5.4). זרע את התאים לתוך בארות צלחת ELISPOT. אפשר ASCs לצרף הממברנה PVDF ו להפריש Abs עבור 8 - 14 שעות (שלב 5.11). (ב) לשטוף את התאים עם PBS (עם 0.05% Tween 20). (C) מוסיפים את AP- או HRP-conjזיהוי ugated ABS ספציפי או IgG או IgM. (ד) לשטוף את שרירי הבטן זיהוי כי הם לא כרוכים. (ה) לפתח את הנקודות עם פתרון מצע של AP או HRP כדי להתאים את שרירי בטן זיהוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תוצאות ELISPOT מצלחת נציג. (א) תאי המטוהרים CD19 + B הונחו לשלוש בארות סמוכות (50,000 תאים היטב 1 #, 25,000 תאים היטב 2 #, ו 12,500 תאים היטב 3 #, בהתאמה) של צלחת ELISPOT. תאים היו אז בתרבית RPMI 1640 לילה בינוני (~ 14 שעות). את assay ELISPOT בוצע לאחר השלמת תרבות (שלבים 5.12 כדי 5.18). כדי analyzדואר התוצאות, צלחת ELISPOT נסרקה לרכוש תמונות באמצעות מנתח אוטומטית מצויד הסורק ותוכנה. (ב) מטוהרים CD19 + CD27 + תאי זיכרון (10 6 / מ"ל) היו בתרבית בנוכחות של 5 מיקרוגרם / מ"ל של CPG במשך 5 ימים. התאים טופלו כמו ב (א) עבור assay ELISPOT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בידוד וטיהור של אדם תאי הדם ההיקפי B

בדרך כלל, RBCs ניתן מקרע ביעילות מסומן על ידי חיץ תמוגה (שלב 1.2). חשוב לא כדי לדגור PBMCs עם למאגר תמוגה RBC יותר מ -5 דקות, כפי כדאיות התא עלול להיות מושפע אמוניום כלוריד. לחלופין, RBCs וטסיות ניתן להסיר זמנית על ידי הפרוטוקול הבא.

מערבבים טריים דם שלם עם ציטרט חומצה דקסטרוז (ACD) חיץ (חומצת לימון 39 מ"מ, נתרן ציטרט 75 מ"מ, ו -135 מ"מ דקסטרוז; pH 7.4) ב יחס נפח של 9: 1, דם אל המאגר. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 10 דקות ב RT. שים לב ההיווצרות של שכבות, מעידות על הפרדה. לשאוב ולזרוק את השכבה העליונה, אשר מכיל טסיות ופלסמה (צבע צהוב) עשיר-טסיות. הסר את השכבה האמצעית דק על הממשק, אשר מכיל PBMCs (כלומר על., המעיל באפי). הימנע זיהום של RBCs בשכבה התחתונה (דארון צבע אדום). הוסף חוצץ תמוגה אל PBMCs להסיר את RBCs שיורית, ולאחר מכן בצע את השלבים 1.2 ל 1.19.

שתי גישות שניתן להשתמש בם כדי לבודד תאי B מ PBMCs: מבחר חיובי ושלילי 21. השיטה של ​​סלקציה שלילית (שלבים 1.1 עד 1.19) משמש להשגת נגעה, תאי B פונקציונלי, ללא ABS או microbeads כבול, לניסויים במורד הזרם. זה חיוני כדי לקחת זאת בחשבון בעת ​​ההפעלה ו / או בידול של תאי B מטוהרים מתרחשת בתרבות. החשש הוא כי תאים מטוהר על ידי סלקציה חיובית עשויים להיות מושפעים בשוגג על ידי microbeads מב מצומדות (0.2 כדי 5 מיקרומטר קוטר). מבז יכול להיקשר לקולטנים מסוימים בתאי B, ולכן ייתכן כי crosslink קולטנים ההפעלה. יתר על כן, microbeads ניתן endocytosed ידי תאי B באמצעות קולטנים כבול. למרות מתכלה, microbeads יכול להישאר בתוך התאים למשך זמן ארוך יותר משבוע. אם השמירה של microbeads ישפיע התנסותתוצאות נפשיות צריכות להיקבע באופן אמפירי. בטיהור תאי B אדם באמצעות סלקציה חיובית, אנטי CD19 (שיבוטים: 4G7 או HIB19) microbeads משמשת בגלל CD19 מתבטא באופן נרחב ברחבי השלבים ההתפתחותיים של תאי B. טוהר תאי B לאחר ההפרדה ניתן לקבוע על ידי זרימת cytometry עם מבז אנטי CD19 (שיבוטים: SJ25C1 או LT19), אשר מכיר אפיטופים נבדלים microbeads אנטי CD19.

טיהור והפרדה של זיכרון והתמים B תאי מתאי B מבודדים

CD27 הוא סמן משטח מקובל עבור זיכרון אנושי והבחנת תא B הנאיבי 24. מולקולת CD27 שייך הקולטן tumor necrosis factor (TNFR) המשפחה. בגלל CD27 מתבטא ברוב תאים אנושיים זיכרון B, זה משמש בדרך כלל כדי להפלות אותם CD27 - תאי B נאיבי. עם זאת, בגלל CD27 מתבטא גם על תאי T ותאי NK, השימוש microbea אנטי CD27DS (שיבוט: O323) בבחירת זיכרון B תאים חיובי דורש טיהור מראש של תאי B (שלבים 1.1 כדי 1.19). לבדיקה טוהרת לאחר הפרדה, מבז ספציפי עבור CD27 אדם (שיבוטים: L128 או LG.3A10) מומלץ (שלב 2.12). מכיוון שתאי CD27 + זיכרון B הם הטרוגניים, סמני משטח נוספים, כגון IGD ו FCRL4, יכולים להיחשב עבור הפרדה נוספת בתא מיון 4, 7.

מיון תאים להשיג תאי B הנאיבי, תאי הזיכרון B ו- PBS / מחשבים

מכיוון שתאי B להביע FcγRIIB, בלוק Fc (שלב 3.3) מומלץ לפני מכתים את התאים עם מבז עבור cytometry הזרימה. שברי Fc של IgG האדם לבדו יכול לחסום באותה מידה גם את IgG האנושי כולו ב 1 מיקרוגרם / 10 6 תאים. אנטי אנושי CD32 מב (שיבוטים: 3D3 או AT10) הוא אופציה נוספת עבור בלוק Fc. מן הראוי לציין כי אם FcγRIIB הוא סמן משטח להיצבע בתאי B מטוהרים, את sh מב אנטי CD32 מצומדות-fluorophoreולד יתווסף לוותר על בלוק Fc, ואחריו מכתים עם מבז אחר בלי לשטוף PBS.

במשך שלושה צבעים cytometry זרימה, CD38-FITC (והעמסת), CD27-PE (Phycoerythrin), ו CD19-APC (Allophycocyanin) הם שילוב אופייני של fluorophores. אף על פי כן, אם סדרן תזרים cytometric מצויד בשלושה לייזרים, כמו אלה של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו 640 ננומטר, החוקרים אז יש את הלוקסוס לבחור fluorophores נרגש לייזרים שונים עבור מיון התא. כמו באיור 1, התאים היו מוכתמות CD19-APC (שיבוט: HIB19), CD27-eFluor450 (שווה ערך ל, שיבוט פסיפיק בלו: O323), ו CD38-PE (שיבוט: HB7) להפריד את תאי B נאיבי, זיכרון תאי B, ו- PBS. מן הראוי לציין כי חלק מהחוקרים מעדיפים הכללת CD45 (שיבוט: HI30) כסמן השושלת לויקוציטים ותאי B השער כמו CD45 + CD19 + האוכלוסייה. בגלל זיהוי של PBS שבמחזור על מצב יציב הוא ערב נדירNT אצל אנשים בריאים, נמוכים או אפילו אין ביטוי שטח של CD20 על PBS (CD19 + CD27 + / היי CD38 + CD20 lo / -) ממחיש הקיום בתום הלב שלהם 2, 30-31. אפשרות זו שימושית כאשר תוצאות כימות של PBS על ידי פנוטיפים השטח ASCs ידי מבחני ELISPOT הם המושווים. במהלך התקופה שלפני תא-מיון, 7-AAD הוא העדיף יודיד propidium עבור ההרחקה של תאים מתים, בשל ספקטרום הפליטה הצר שלה גלישה נמוכה ב ססגוניות cytometry זרימה.

במבחנת גירוי והתמיינות של תאי B האדם מבודדים

סוג B CPG (ODN 2006) לבדו יכול להשרות התמיינות מוגבלות הן IgM- ו IgG-ASCs מתאי B זיכרון. יתר על כן, תאי B נאיביים הם רק מגיבים בחולשה כדי CPG ובעיקר להצמיח IgM-ASCs 6, 11. ריכוז CPG בתרבות הוא בטווח של 2.5 - 5 מיקרוגרם / מ"ל לכל 10 6 B תאיםאו PBMCs 11, 18. מלבד CPG, תאי PBMCs B מטוהר יכולים להיות מתורבתים בנוכחות שילובים של CPG עם mitogens, ציטוקינים, ו אגוניסטים BCR, להבדיל תאי B אדם לתוך ASCs בתרבות (שלב 4.3). למשל, בשימוש מתכונים נפוץ במשך 10 6 תאים לכל מ"ל לכלול (א) CPG (5 מיקרוגרם / מ"ל), אנושי רקומביננטי IL-2 (10 ng / mL), ו- IL-10 רקומביננטי אנושי (10 ng / mL) 15, 34; (ב) CPG (5 מיקרוגרם / מ"ל) ו F (ab ') 2 שברי איג אנטי אנושי (IgG + IgM + IgA) (20 מיקרוגרם / מ"ל) 11; (ג) CPG (5 מיקרוגרם / מ"ל), חלבון מן S. aureus קוואן (SAC) (1: 10,000 דילול), ו mitogen Pokeweed (PWM) (1: 100,000 דילול) 18; (ד) רקומביננטי אנושי IL-21 (100 ng / mL) ו sCD40L רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מ"ל) 12, 15, 33; ו- (ה) רקומביננטי אנושי IL-2 (10 ng / mL) ו R848 (1 מיקרוגרם / מ"ל) חברה TLR7 אגוניסט 33-34. למרות שתאי B יכול להיות מובחן לתוך ASCs בשלושה ימים 11, תאים הם בדרך כלל מראש שלtimulated במשך 5 עד 6 ימים לפני להתווסף הצלחת ELISPOT כימות של ASCs 11, 18. במהלך תקופת התרבות, בדרך כלל אין חידוש של סוכני הבידול מתחילים.

התוספת של IL-2 ו- IL-10 לתרבויות המכילים CPG יכול להגדיל באופן משמעותי את מספר IgM- מבודל IgG-ASCs 15, 35. הנוכחות של IL-2 בתרבות יכולה לספק גירוי mitogenic כדי להקל על הרחבת תאי B נבדלים CPG. IL-10 בטווח של 10-25 ng / mL יכול להגדיל את הייצור של ASCs (~ 3 עד פי 10) בנוכחות של CPG 35 מאוד. אגוניסטים BCR, כולל אנטי-BCR ו- SAC, ו PWM יכול גם לעורר התפשטות של תאי B אדם מן המעלה הראשונה 18. דוגרים תאי זיכרון B עם CPG ותוצאות אנטי BCR polyclonal בעיקר מגידול IgM-ASCs אך לא IgG-ASCs 28. למניעת עיכוב של איתות דרך BCR ידי FcγRIIB, F (ab &# 39;) 2 שבר של אנטי-איג (10 - 20 מיקרוגרם / מ"ל לכל 10 6 תאים) מומלץ כאשר crosslinking BCR 11. במקום אנטי איג polyclonal, אנטי-BCR מבז ספציפית או IgM + או IgG + B התאים צריכים להיחשב למקד תת אלוטיפ ספציפי B-cell לבידול לתוך ASCs. שילוב של CPG, SAC (דילול 1: 10,000), ו PWM (1: 100,000 דילול) יכול ביעילות להפעיל תאי B זיכרון להתמיין IgM- ו IgG-ASCs 18, 24. יתר על כן, CPG יכול בינוני לגרום בכיתה מיתוג של איג במבחנה 28-29. לעומת זאת, IL-21 (100 ng / mL) ו sCD40L (1 מיקרוגרם / מ"ל) ביעילות להשרות התמיינות תאי זיכרון B בלעדי החליפה IgG-ASCs 12, 30. SCD40L יכול להפעיל תאי B בכך שהם מחקים עזרת תאי T באמצעות CD40 על תאי B, משפיעי הבידול שלהם לתוך מחשבי in vivo. ראוי לציין, אנטי CD40 (שיבוטים: 89 או G28.5) יכול להוות תחליף sCD40L בתרבות 15. Howevאה, לא sCD40L ולא-CD40 אנטי לבד הוא מסוגל לעורר את הבידול של תאי B זיכרון. לפיכך, הפעלת CD40 בתאי B בתרבית לעיתים קרובות בשילוב עם סוכן בידול, כגון IL-4, CPG, R848, או IL-21, כל אחד מהם יכול לקדם מיתוג בכיתה איג. IL-4 משחק תפקיד מפתח ההתמיינות של תאים מסוג CD4 Th2, המאפשרים האינדוקציה של רוב תאי IgM + B כדי לעבור תאי IgG1 + B בתרבות. באופן דומה, בנוכחות IL-21, שני תאי B זיכרון ותאי B נאיביים להבדיל באופן בלעדי לתוך ASCs ממותגת בכיתה 12, 32. כמו CPG, R848 יכול לגרום מתג בכיתה שולי של תאי B 34. לבסוף, ראוי להזכיר כי למרות lipopolysaccharide (LPS) יכול להשרות התמיינות ביעילות של תאים עכבר B לתוך ASCs, תאי B האדם להביע רמות נמוכות של TLR4 ו CD14 29. בגלל התוספת של סוכן בידול בתרבות מקדמת את הדור של תאי B חליפה, תוספת זו יש להימנעכאשר PBS / מחשבים קיימים או תאי B זיכרון unswitched ימדדו.

Assay ELISPOT

את assay ELISPOT משלב ELISAs מבוסס צלחת עם טכנולוגיות מערביות סופגות מבוסס קרום, המאפשר זיהוי של שרירי בטן מופרש על ידי תאי B יחידים 18. ELISPOT גם הותאם לכמת תאי T Ag ספציפיים אשר מפרישים ציטוקינים 17, 36. במאמר assay ELISPOT, או תאים מטוהרים או PBMCs unfractionated (ללא RBCs) יכול לשמש. עם זאת, ~ פי 10 יותר PBMCs נדרשים מאשר תאים מטוהרים להשיג תוצאות עקביות מבחני ELISPOT. נקודת התחלה טובה היא 1 - 2 x 10 5 תאים לכל טוב שיסייע באיתור ASCs במחזור PBMCs. זיהוי של ASCs Ag ספציפי, אנטי-איג מוחלף בדרך כלל על ידי Ag (5 - 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) כדי ללכוד Ag ספציפי ACSs (שלב 5.4). השימוש Abs זיהוי ספציפי אלוטיפ מתיר את ההבחנה בין Ag ספציפי IgM-ASCs ו-ASCs אלוטיפ IgG (שלב 5.14). מן הראוי לציין כי, ללא קשר לשאלה אם משמשים אנטי איג או Ag ללכוד ASCs, את שרירי הבטן הזיהוי המשמשת עבור ELISA אולי לא תמיד מתאים ELISPOT. בדומה לכך, לא כל מצעי הצבע עבור ELISA לתפקד כראוי ELISPOT. AP- ו- ABS HRP-מצומדות משמשים בדרך כלל לגילוי מקום ELISPOT. פתרון המצע BCIP / NBT הוא בחירה פופולרית עבור זיהוי מבוסס AP, בעוד 3,3 ', 5,5'-tetramethyl-benzidine (TMB) ו -3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) פתרונות הם מצעים משותפים HRP ב ELISPOT. אם ה- AP או HRP הוא מצומדות ישירות Abs זיהוי, רק צעד אחד נדרש לגילוי, כמתואר בפרוטוקול (שלב 5.14). לעומת זאת, שרירי בטן האיתור הם biotinylated ודורשים דגירה שהתפתחה עם AP- או HRP-מצומדות streptavidin לפני מגיב עם המצעים בשיטה דו-שלבים. צעד אחד ואת שני שלבים שתי השיטות לעבוד ביעילות לזהות כתמים ELISPOT.

את assay ELISPOT יכול לכמת לא רק circulating אבל גם בדיל ASCs בתרבות (שלב 1.19 לעומת 4.6). אם ההווה, במחזור ASCs, אשר בדרך כלל לא לחיות יותר מיומיים בתרבות, יכול להיות מתורבת ישירות צלחת ELISPOT, עם או בלי טיהור מ PBMCs 11. לעומת זאת, את הבידול של תאי B זיכרון דורש 5 ימים. לפיכך, culturing ישירה בצלחות ELISPOT לאחר בידוד תא (שלב 1.19) אינה מומלצת; הריסות התאים מתים כתוצאה מתקופת התרבות המורחבת יכולות להגדיל את רקע זיהוי מקום. במקום זאת, הוא תאי B מטוהרים PBMCs הכולל יכולים להיות מתורבתים ראשון צלחת 6-היטב או 12 גם בנוכחות mitogens וסוכני בידול (שלב 4.3). במהלך תהליך התרבות, החיבור החוזר של סוכני גירוי מיותר (שלב 4.3). בעוד צלחות בחממה, דלת החממה אמורה להיפתח בעדינות וסגר למנוע ASCs זורע לנוע, שכן הם יכולים לפזר Abs מופרש לאורך המסילה נעה, יצירת כתמיםעם זנבות (מה שנקרא "כמו-שביט" כתמים) (שלב 5.11). תקופת הדגירה בצלחות ELISPOT נקבעת על פי משך הזמן הדרוש תאים להפריש כמויות לגילוי של שרירי הבטן מבלי לאפשר התאים להתחלק, אשר תיצור קשיים ספירת במקום. לכן, תאים הם בדרך כלל בתרבית בטווח של 8 שעות עד הלילה (שלב 5.11).

את assay ELISPOT הוא השיטה הנפוצה ביותר לכימות תגובות תא הזיכרון B. זה הפך הודעה פופולרית, ללא תלות בתגובת לחות חיסונית וזיכרון אימונולוגית. בפועל, תרבות mitogenic שקדמו נדרש להפעיל תאי B זיכרון לבידול לתוך ASCs (שלב 4.3). עם זאת, את התדירות שבה זיכרון B תא להרחיב להתמיין ASCs משתנית תרבות חיים שונים, כפי שתואר לעיל. אמנם ללא הסכמה, רוב החוקרים לאמץ את מצב אינדוקציה שיכולים למקסם את הייצור של ASCs. במונחים של הסוכן משמש מקום detection, מסיסים biotinylated Ag יכול להחליף את Ab זיהוי משביעת רצון מבלי להתפשר על הרגישות 37. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כאשר הזמינות של Ag מוגבלת בגלל כמות נמוכה בהרבה של Ag נדרשה לגילוי מ לציפוי הצלחות. לבסוף, ELISPOT אינה מאפשרת ניתוח פנוטיפי של ההטרוגניות הסלולר, ובכך דורשת חלוקה מוקדמת של תת-אוכלוסיות תאים. לאחרונה, assay ססגוני ELISPOT, שבו Abs זיהוי מסומן עם fluorophores השונה, פותחה כדי לזהות סוגים שונים של תאי מפרישי ציטוקין אחד גם 38-39. טכנולוגיה חדשה זו תהיה עניין מיוחד עבור זיהוי של תאים בתדירות נמוכה ב PBMCs ובמשך ניתוח בקנה מידה גדולה של תגובות חיסון מושרה B-cell.

מכיוון assay ELISPOT הוא מהיר ויעיל בכימות ASCs ותאי ציטוקינים, מפריש, זה הוארך עד למדוד את הפונקציונליות של לא רק circulating לימפוציטים, אבל גם תאי רקמות חיסון כגון לויקוציטים intrahepatic 40. בשל הרגישות שלה והגיעה לרמה של גילוי אפילו ASC יחיד, assay ELISPOT נוצל בעבר ויותר למדוד תגובות חיסון אנושיות כדי efficacies חיסון נגד פתוגנים קיימים ומתפתחות. למרות הביצועים וחוסנם תפוקה הגבוהה של assay ELISPOT הם מעולים עבור הערכות בקנה מידה גדולה של תגובות חיסוניות באמצעות PBMCs, התוצאות של המבחנים יכולות להיות מושפעות מגורמים שונים, כגון עיכוב בעיבוד של דגימות, אם תאים הם טריים או קפואים רכיבים בסרום, במדיום התרבות, ואת מספר התאים מתווספים צלחת ELISPOT 41. לכן, נהלי נורמליזציה יש לכלול בפרוטוקול ELISPOT למזער וריאציות תוך והבין-assay ב בקנה מידה גדולה מחקרי מעקב ארוך טווח (למשל, ניסויי חיסון). שיטת הנורמליזציה של קריאת צלחת הנה עניין מהותי ליניאריות, דיוק, וחסרונותistency ב assay תוצאות 41-42. דרך אחת לבצע נורמליזציה קריאה צלחת היא להרחיב את ההליך של דילול סדרתי של תאים שנזרעו צלחות ELISPOT (שלב 5.10). על ידי יצירת צלחת התייחסות, דילולים סדרו יותר צריכים להוכיח קשר לינארי בין המספרים הסלולריים מצופים בכל טוב ואת ספירת הנקודה לכל טוב. סריקות חוזרות על צלחת ELISPOT יכולים לשמש כדי לאמת את התבנית של ספירת מקום, הוא באופן אוטומטי באופן ידני. השתנות תוך גם מינימל בספירת נקודה צפויה לאחר הליכי נורמליזציה אלה 43. לבסוף, היישום של ELISPOT יכול להתארך במובנים רבים, כגון על המעקב של תגובות לטיפול בחולים עם זיהומים immunotherapies סרטן לוקח, כמו גם ההערכה של immunotoxicity (למשל, דיכוי המערכת החיסונית ואת אוטואימוניות סמים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Tags

אימונולוגיה גיליון 118 רפואה האדם חסינות הלחות תאי דם היקפיים mononuclear תאי B בידוד בידול נוגדן מפריש תאים enzyme-linked Immunospot assay Immunoabsorbance enzyme-linked Cytometry זרימה
הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tzeng, S. J. The Isolation,… More

Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter