Abstract
체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.
Introduction
B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC (1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 2 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 + CD27 + CD38 -) 나이브 B 세포 (- - CD38 CD19 + CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 + CD27 + IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 5 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 + 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 + PB들 / PC를 6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 4-7 이질성을 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 8 CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 (6), 11-15에 위치 할 때 십일 - 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 (6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / 6 PC의 순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다.
지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 (16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) - 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 (17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다.
ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 17 ~ 18에서 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.
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Protocol
인간의 말초 혈액은 동의서에서 건강한 기증자로부터 얻을 수 있어야하며, 혈액 샘플의 사용은 개별 기관 생명 윤리위원회에 의해 설립 승인 가이드 라인을 준수해야합니다. 본 연구에서는 프로토콜은 국립 대만 대학 병원의 내부 검토위원회 (프로토콜 번호 201307019RINB)에 의해 승인되었다 유동 세포 계측법 (그림 1)과 ELISPOT 분석 (그림 3)의 결과의 데모 인간의 혈액을 사용합니다.
1. 분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화
- K 2 EDTA (1.5-2.0 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 15 ML의 튜브로 (팔꿈치에 cubital 포사 앞쪽에) 중간 cubital 정맥에서 혈액 ~ 10 ㎖를 그리고 즉시 튜브를 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전 형성.
- 적혈구가 (RBC)의 버퍼 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 1 mM의 EDTA를 용해 (121 ° C, 15 분) 오토 클레이브의 35 mL를 넣고, 페이지신선한 혈액 샘플 (≥ 3 함유 튜브 H 7.4) : 1 부피 / 부피)을 더 이상 5 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
주 : 튜브를 통해 빛의 전송의 모양은 RBC 용해의 완료를 나타냅니다. - 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 펠렛 색 흰색 있는지 확인하십시오.
- 10 멸균 된 인산 완충 식염수 mL로 펠렛을 재현 탁 (PBS, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 단계 1.3에서와 같이 원심 분리기.
- 상등액을 버리고 ㎖의 RPMI 1640 배지 (첨가제 : 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 2 mM L- 글루타민) 10 펠렛을 재현 탁 다음과는 판형 10 cm 배양 접시에 세포 (접시 당 혈액 10 ㎖). 30 분 동안 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 조심스럽게 배양 접시를 몇 번 소용돌이 및 배치15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 배지 (서스펜션 세포). 배양 접시에 부착 세포 (주로 대 식세포)를 폐기하십시오.
- 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- RPMI 1640 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 혈구 또는 자동 셀 카운터 셀 수를 계산합니다.
주 : 절연 백혈구의 생존 정상적으로 트리 판 블루 배제에 의해 90 %보다 크다. - 단계 1.7에서와 같이 원심 분리기 (5)의 농도로 차가운 PBS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA)의 ~ 200 μL의 세포를 재현 탁 - 10 × 106 세포 / ㎖.
- 106 세포 당 (B 세포를 음성 선별 용) 혈액 세포에 특정 비오틴 화 항 - 인간 구간 칵테일 5 μL를 넣고, 30 분 21 얼음 위에서 배양한다.
참고 : 항 - 인간 Ab의 칵테일은 적어도 CD2 (또는 CD3), CD14 및 CD16 특정 애비를 포함해야합니다. - 10 배를 초과하는 볼륨 추가멸균 PBS의 세포를 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하고, 상등액을 폐기한다.
- 동일 스트렙 타비 딘 - 복합 마이크로 비드의 양 펠릿에 (10 6 세포 당 5 μL)을 추가하고 철저하게 섞는다.
- 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에서 30 분 동안 얼음에 품어.
- 튜브에 PBS 버퍼 2 ML을 추가합니다.
- 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 8 분 동안 실온에서 품어. 갈색 마이크로 비드 서서히 옆의 자석 (22)에 튜브 벽에 부착된다.
- 자기 스탠드에 남아있는 관으로, 조심스럽게 새로운 멸균 15 ML의 튜브 (22)에 뜨는을 전송합니다.
- 반복 1.16-1.14 단계를하고, 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층 액을 결합한다. 마이크로 비드를 폐기하십시오.
- 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- 하류 실험 RPMI 1640 배지에 펠렛을 재현 탁.
참고 : 일반적으로 1-5 × 10 5 B 세포의 지혜HA 말초 혈액 10 mL의 95 % 이상의 순도가 23을 분리 할 수있다.
격리 된 B 세포 2. 정제 및 메모리의 분리 및 나이브 B 세포
- 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다.
- 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리 및 RT 후 차가운 PBS 완충액 100 μL의 세포를 재현 탁.
- 추가 1 - 10 6 세포 당 바이오틴 CD27 단클론 항체 μg의 2를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기에 PBS 버퍼의 10 ML을 추가합니다.
- 뜨는을 취소하고 PBS 버퍼 50 μL의 세포를 재현 탁.
- 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 세포 - (2 μg의 / 10 6 세포 1) 스트렙 타비 딘 자기 마이크로 비즈의 동일한 금액을 추가합니다.
- 부드럽게 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 튜브에 PBS 버퍼의 3 mL의 - (2)를 추가합니다.
- 놓고자기 스탠드에 관하고 갈색 마이크로 비드를 자석에 가까운 측에 부착 할 수 있도록 8 분 동안 RT에서 배양한다.
- 자기 받침대의 관을 조심스럽게 새로운 멸균 튜브로 상청액 분획을 전송. 순진한 B 세포 -이 부분은 풍부한 CD27가 포함되어 있습니다.
- 마이크로 비드를 포함하는 튜브에 5 mL를 추가하고 부드럽게 마이크로 비드를 재현 탁 (즉, CD27 + 메모리 B 세포의 농축 비율) 24 ~ 25.
- 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 하류 실험 RPMI 1640 배지와 펠렛을 재현 탁.
주 : 일반적으로, ~ 30 - B 세포의 60 %는 건강한 공여체 (7), 25-26의 한 PBMC로부터의 CD27 + 메모리 셀들로 정제 할 수있다.
나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 /의 PC의 컬렉션에 대한 정렬 3. 셀
- 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하는 hemocytome를 이용하여 세포 수를 결정터 또는 자동 세포 계수기.
- 5 mL의 폴리스티렌 튜브에서 107 mL 당 농도에 차가운 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁.
- 1 추가 - 10 6 셀 당 인간 IgG의 2 μg의 및은 FC 블록 10 분 동안 얼음에 품어.
- 1 μg의 각 추가 항 CD19를-APC (클론 : HIB19), 항 CD27-eFluor450 (클론 : O323), 및 항 CD38-PE (클론 : HIT2) 10 6 세포 당; 잘 혼합하고 30 분 4, 27 얼음에 품어.
- 단계 3.4의 마지막 5 분에서, 상업 7 aminoactinomycin의 D (7-AAD)의 5 μL를 추가합니다.
- 5 분 동안 600 XG에 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 PBS의 2 ML을 추가합니다.
- 15 ㎖의 튜브 용액 당 5 × 107 세포 - 1의 농도 (2 % BSA, 2 mM의 EDTA로 멸균 PBS) 정렬 버퍼에 세포를 재현 탁.
- 세포 덩어리를 제거하기 위해 나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 ㎛의 공극 크기)를 통해 세포를 필터.
- 유동 세포 계측 정렬하여 세포를 분리바이올렛 (405 ㎚), 청색 (488 nm의)과 빨간색 (640 ㎚) : 어 세 가지 레이저를 장착.
참고 : 3 색이 세포 계측법 27-28 흐름을 위해 혼자 블루 레이저 충분하다. - 정렬 세 나이브 B 세포의 동시 수집을 위해 (5 ㎖ RPMI 매질 포함) 15-㎖의 튜브 (CD19 + CD27 -)로 세포, 기억 세포 (CD19 + CD27 +) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38의 +) 3-4, 28.
주의 : 단계 4에 기재된 바와 같이 분류 및 나이브 기억 B 세포를 배양 할 수있다.
나이브 B 세포 - 고립 된 인간의 CD19 + B 세포, CD19 + CD27 + 메모리 B 세포와 CD19 + CD27의 체외 분화 4.
- 단계 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10로 정제하여 세포를 이용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 결정한다.
- RPMI 1640 배지로 세포를 재현 탁1의 농도에서 -는 ml 당 10 × 105은 12 웰 플레이트로 나누어지는.
- / mL의 18, 29 5 μg의 / 10 6 세포에서의 CpG (ODN 2006)를 추가합니다.
- 배양 5 일간 5 % CO 2, 37 ° C의 배양기에서 세포.
- 물론 각각의 세포를 수확 15 ML의 튜브에 개별적으로 배치, 각 튜브에 PBS의 5 mL를 넣어 5 분 동안 600 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
- 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. RPMI 1640 배지로 용액에 10 × 105 - (1)의 농도로 세포를 재현 탁.
5. ELISPOT 분석
- 30 초 동안 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 증류수 35 % 에탄올의 30 μL를 추가한다.
참고 : 피펫 팅 할 때, 항상 우물에서 막를 만지지 마십시오. - 에탄올을 제거하기 위해 ELISPOT 판을 반전.
- 각 웰에 150 μL 멸균 DDH 2 O의 넣고 배양5 분간 RT에서 그들을 잔류 에탄올을 세척하는 단계; 3 분 동안 실온에서 멸균 PBS의 세척에 따릅니다.
참고 : 5.3-5.1이 판의 제조에 따라 선택 될 수있다 단계. - 넣어 5 μg의 / mL의 클론 F (AB ') 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 2 조각 50 μL 4 ° C에서 하룻밤을 품어 (PBS로) ELISPOT 플레이트의 각 웰에와 (선호) 또는 2 시간 11 37 ° C를.
참고 : 사용할 때까지 파라 필름과 판의 가장자리를 밀봉합니다. - 3 분마다 RT에서 두 번, 언 바운드 복근을 제거 각 웰에 PBS 200 μL를 추가하고,이를 배양 접시를 반전.
- 잘 차단 각각 5 % BSA (또는 RPMI 1640 배지)를 PBS 200 μL를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 이들을 배양한다.
- 차단 버퍼를 제거하기 위해 번호판을 반전. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
- 각 웰에 RPMI 1640 배지 100 μL를 추가하고 37 ° C에서 그들을 품어.
- 준비된 세포를 시드하는 경우, RPMI 1640 배지를 제거하기 위해 반전 플레이트.
- 종자 100 μL (5 × 104) 50 μL (2.5 × 104)과의 웰에 25 μL의 셀 (1.25 × 104) (단계 1.19, 2.10, 2.11, 3.10에서 4.6) ELISPOT 판. RPMI 1640 배지로, / 잘 150 μL에 볼륨을 가지고.
참고 : 세포를 도금 하나 또는 두 개의 2 배 연속 희석의 최소 권장합니다. - 14 시간 18-8 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 중에 플레이트를 이동하지 마십시오.
- 세포 및 RPMI 1640 배지를 제거하는 번호판을 반전.
- 3 분 동안 실온에서 때마다 5 회 (0.05 % 트윈 20과 PBS) 200 μL / 잘 PBS-T의를 추가하고 그들에게 품어. 5 회 세척 각 사이의 세척 완충액을 제거하기 위해 판을 전환.
- 염소 항 - 인간 IgG-알칼리성 포스파타제 (AP), Fcγ 특정 애비를 추가 (IgG를 감지, 1 : 5,000 PBS-T에서) 또는 염소 항 - 인간 IgM의-AP, Fcμ 단편 특정 애비 (IgM의 검출, 1 : PBS-T 5,000) 지정된 우물에와 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
- 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
- 50 μL / 웰의 bromochloroindolyl 인산 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT) 기질 용액을 추가합니다. 15 분 - 퍼플 색의 반점은 보통 5에 나타납니다.
- 관광 명소의 과도한 개발을 방지하기 위해 100 μL / 잘 DDH 2 O를 추가합니다.
- 모든 지점의 전체 개발 후 수돗물을 실행하는 접시를 씻어.
- 판의 암거를 제거하고 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다.
- 이미지 획득 / 분석 부 (예를 들면, 자동 또는 수동으로 스캐너 해부 현미경을 통해)로 자동 플레이트 판독기를 사용하여 스폿을 카운트.
주 : 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 저장하고 나중에 분석 될 수있다.
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Representative Results
PBMC를이 적혈구 및 부착 세포 (1.7-1.2 단계)의 고갈되었다. 세포의 분취 량 (2 × 106)의 말초 혈 (도 1)의 B 나이브 세포, 메모리 B 세포, PBS를 / PC를 모집단을 설명하기 위해 유세포 분석을 행 하였다. 이 공여자의 PBMC를, 상기 림프구의 약 10 %가 CD19 + B 세포이다. ㄴ 세포 구획에서 CD19 + CD27의 비율 - 나이브 B 세포는 약 50 %였다. 한편, CD19 + B 세포의 약 50 %가 25 ~ 26는 CD27 + B 세포의 메모리 (7)였다. 참고로, CD27 + B의 메모리 셀은 상기 IgD의 (4)를 포함하여 분리 될 수있다. 2, 30 ~ 31 - PB들 순환의 표현형은 더 낮거나없는 표면의 CD20의 발현 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38 + CD20 보라 /)로 정의 할 수 있습니다. 죽은 세포 7-AAD를 제외하려면세포 얼룩 (단계 3.5), 7-AAD 대 FSC에 대한 플롯에 포함 할 수있는 것은 살아있는 세포 (7-AAD -)의 인구를 게이팅 수 있습니다.
ELISPOT 분석의 주요 단계가도 2에 도시된다. 두 정제 된 인간 B 세포 및 CD19 + CD27 + 기억 B 세포는 5 일간 RPMI 1640 배지에서의 CpG의 존재 하에서 배양 하였다. 세포는 새로 부상의 ASC를 정량화 대한 ELISPOT 분석을 위해 수확 하였다. 존재하는 경우, 기존의 PBS를 48 시간 11에서 죽을 말초 혈액으로부터 분리. ELISPOT 분석을 수행하고, 자동 평판 스캐너에 의해 취득 된 현장 이미지는도 3에서 설명된다. 104 세포에 11 - 50의 IgG-의 ASC의 수는 10 인 반면, 5 일간의 CpG 처리 104 B 세포에서 IgM의-200의 ASC - ELISPOT의 결과는 일반적으로 (50)을 표시한다.
게이팅 전략의 그림 1 그림 순진한 B 세포, 메모리 B 세포를 분리하고, PBMC를에 PB들 수 있습니다. (A) 세포 (2 × 106)를 CD19-APC, CD27-eFluor450 및 CD38-PE mAb에 (단계 3.4) 2 μg의 각각 염색 하였다. 림프구 함 측면 산란 (SSC) 대 앞으로 산란 (FSC)의 도트 플롯 (G1)을 게이트했다. 서로 붙어 두 개의 세포에 의해 형성된다 (B) 세포 이중선은, FSC-W (폭) FSC-H 대 (높이)의 음모에 (그 외부 G2) 제외 하였다. (C) CD19 + B 세포는 SSC-A (영역) 및 CD19-APC의 음모에 G3로 문이되었다. CD19 + 세포 (D), CD27 및 CD38 파라미터의 도트 플롯 나이브 B 세포 (CD19 + CD27 -; Q1 및 Q4) 보였다 기억 세포 (CD19 + CD27 +를;Q2와 Q3) 및 PB들 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38 +, G4, Q2의 0.6 %). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ELISPOT 분석의 주요 단계 2. 삽화 그림. (A) 넣어 50 μL / 웰 (5 μg의 / mL)을 2 시간에 대한 ELISPOT 플레이트에 F (AB ') 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 2 조각 37 ° C에서 또는 밤새 4 °에서 C (선호) (단계 5.4). ELISPOT 플레이트의 웰에 세포를 시드. 14 시간 (단계 5.11 참조) -의 ASC는 PVDF 막에 부착하고 8 복근을 분비 할 수 있습니다. (B) (0.05 %와 트윈 20) PBS로 세포를 씻어. (C)이 AP-또는 HRP-접속사 추가비공 액 검출의 IgG 또는 IgM의 어느 하나에 해당 ABS. (D) 언 바운드되는 검출 복근을 씻으십시오. (E) 상기 검출 복근 일치하는 AP 또는 HRP의 기질 용액 스폿을 개발한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대표자 플레이트 3. ELISPOT 결과를 그림. (A) 정제 된 CD19 + B 세포를 ELISPOT 플레이트의 세 개의 인접한 웰 (각각도 1에서 50,000 세포도 2에서 25,000 세포 및도 3에 12,500 세포)에 넣었다. 세포를 RPMI 1640 배지 밤새 (~ 14 시간)에서 배양 하였다. ELISPOT 분석이 문화를 완료 한 후 수행 하였다 (5.18-5.12 단계). analyz하려면즉 결과의 ELISPOT 플레이트 스캐너 및 소프트웨어를 구비 한 자동 분석 장치를 통하여 화상을 취득하는 검사 하였다. (B) 정제 된 CD19 + CD27 + 메모리 셀 (106 개 / ㎖) 5 일간 5㎍을 된 CpG의 / ㎖의 존재하에 배양 하였다. 세포는 ELISPOT 분석에 대한 (A)에서와 같이 처리 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화
일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다.
산 스트로스 구연산 (ACD) 완충액으로 신선한 전혈 믹스 (39 mM의 시트르산, 75 mM의 시트르산 나트륨, 135 mM의 덱 스트로스하여 pH 7.4) 9 부피비 : 1, 혈액에 버퍼. 실온에서 10 분 동안 250 XG에 원심 분리기. 분리를 나타내는 층의 형성에주의를 기울이십시오. 기음과 혈소판 및 혈소판이 풍부한 혈장 (노란색)를 포함하는 상위 계층을 버린다. PBMC를 포함 된 인터페이스에 얇은 중간 층을 제거 (전합니다 .e., 버피 코트를). D (맨 아래 층에서 적혈구의 오염을 방지) 붉은 색 방주. 잔류 적혈구를 제거하고 1.19에 단계 1.2을 따르도록 한 PBMC에 용해 버퍼를 추가합니다.
양성 및 음성 선별 21 개의 접근법 된 PBMC에서 B 세포를 분리하는데 사용될 수있다. 부정적인 선택의 방법은 다운 스트림 실험없이 바운드 애비 또는 마이크로 비드로, 손길이 닿지 않은, 기능 B 세포를 얻는 데 사용됩니다 (1.1 1.19에 단계). 활성화 및 / 또는 정제 된 B 세포의 분화 문화에 발생했을 때이를 고려하는 것이 중요하다. 우려가 양성 선별 그래피 세포 실수 단클론 공역 마이크로 비드 (직경 0.2 내지 5 μm의)에 의해 영향을받을 수 있다는 것이다. 모노클로 날 항체는 활성화 수용체를 가교 할 수 있으므로 B 세포의 특정 수용체에 결합 할 수 있습니다. 또한, 마이크로 비드가 결합 된 수용체를 통해 B 세포에 의해 endocytosed 수있다. 생분해 성 있지만, 마이크로 비드는 일주일 이상 세포 내부에 머물 수 있습니다. 여부 체험관에 영향을 미칠 것이다 마이크로 비드의 보존정신 결과는 경험적으로 결정되어야한다. 양성 선별, 항 CD19 (클론 : 4G7 또는 HIB19)를 통해 인간 B 세포의 정제에 널리 CD19 B 세포의 발달 단계에 걸쳐 발현되기 때문에 마이크로 비드는 일반적으로 사용된다. 항 CD19 마이크로 비드 별개의 에피토프를 인식한다 (SJ25C1 또는 클론 LT19) 분리 한 후 B 세포의 순도는 항 CD19 모노클로 유동 세포 계측법에 의해 결정될 수있다.
정제 및 격리 된 B 세포에서 메모리 및 나이브 B 세포의 분리
CD27 인간 메모리 나이브 B 셀 구분 (24)에 대한 널리 표면 마커이다. CD27 분자는 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 패밀리에 속한다. 나이브 B 세포 - 인간 CD27 가장 기억 세포에서 발현되기 때문에, 일반적으로 CD27 그들을 구별하기 위해 사용된다. 그러나, CD27은 T 세포 및 NK 세포, 항 CD27 microbea의 사용에 발현되기 때문에DS (클론 : O323) 양의 메모리 B 세포를 선택하는데는 B 세포의 사전 정제 (1.19-1.1 단계)가 필요합니다. 분리 후 순도 검사의 경우, 인간의 CD27에 대한 특정 단클론 항체 (클론 : L128 또는 LG.3A10)는 (단계 2.12)를 추천합니다. CD27 + 메모리 B 세포가 이종 때문에 이러한 IgD의 FCRL4와 같은 추가 표면 마커, 셀 4, 7 분류에있어서 구분이 고려 될 수있다.
나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 / PC를 구하는 정렬 셀
B 세포는 FcγRIIB을 표현하기 때문에, 된 Fc 블록 (단계 3.3) 유동 세포 계측법에 대한 단클론 항체와 세포를 염색하기 전에하는 것이 좋습니다. 단독 인간 IgG의 Fc 단편은 1 μg의 / 106 개 세포로 전체 인간 IgG로 동일하게 차단할 수있다. 안티 - 인간 CD32 단클론 항체 (클론 : 3D3 또는 AT10)가 된 Fc 블록에 대한 또 다른 옵션입니다. FcγRIIB은 표면 마커 인 경우 참고로, 정제 된 B 세포에 염색되는, 형광 접합 된 항 CD32 단클론 항체 쉬PBS의 세척없이 다른 모노클로 날 항체로 염색 하였다은 FC 블록을 포기 첨가 할 울드.
세 가지 컬러를 들어 CD38-FITC (형광), CD27-PE (피코 에리 트린), 및 CD19-APC (알로 피코)는 형광체의 전형적인 조합, 유동 세포 계측법. 유세포 분류기는 같은 405 nm의, 488 nm의 640 nm 인 것과 같은 세 가지 레이저가 장착되어 있다면 그럼에도 불구하고, 연구자는 셀 정렬에 대해 서로 다른 레이저에 의해 여기 된 형광을 선택할 수있는 고급 스러움이 있습니다. , CD27-eFluor450 (퍼시픽 블루 클론 상당 : O323) 및 CD38-PE (클론 : HB7) 순진한 B 세포를 분리하는 메모리도 1에 도시 된 바와 같이, 세포를 CD19-APC (HIB19 클론)으로 염색 하였다 B 세포 및 PB들. CD45 + CD19 + 인구로 백혈구 혈통 마커 및 게이트 B 세포와 같은 : (HI30 복제) 참고로, 일부 연구자들은 CD45의 포함을 선호합니다. 정상 상태에서 순환의 PBS 검출 희귀 이브이기 때문에입증 할 자신의 선의의 존재 2, 30 ~ 31 - NT 건강한 낮은 개인, 또는 PB들 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38 + CD20 보라 /)에 CD20 심지어 어떤 표면 발현한다. ELISPOT 분석에 의한 표면 표현형과의 ASC로의 PBS 정량 결과를 비교되는 경우에 유용합니다. 종래 셀 소트 기간 동안 7-AAD로 인해 그 좁은 방출 스펙트럼 및 유세포 빛깔의 하부 유출로 사균의 배제를 위해 요오드화 프로피 듐하는 것이 바람직하다.
체외 자극과 격리 된 인간 B 세포의 분화
타입 B의 CpG (2006 ODN)은 단독으로 메모리 B 세포로부터 IgM-과의 IgG-의 ASC 모두의 제한으로 분화를 유도 할 수 있습니다. 또한, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포는 않은 CpG 약하게 반응이 주로-IgM의 ASC를 6 내지 11 일으킨다. 배양 된 CpG의 농도는 2.5의 범위이다 - 5 μg의 / ㎖ 106 B 세포 당또는 PBMC를 11, 18. 된 CpG 이외 정제 B 세포와 PBMC를한다 (단계 4.3), 미토 젠, 사이토 카인, 및 BCR 작용제와 조합 된 CpG의 존재 하에서 배양 할 수있는 배양의 ASC로 인간 B 세포를 구별하기. 예를 들어, 일반적으로 용액에 10 6 세포 레시피를 사용하는 등 (a)의 CpG (5 μg의 / ㎖), 재조합 인간 IL-2 (10 ng의 / ㎖) 및 재조합 인간 IL-10 (10 ng의 / ㎖) 15 (34); (b)의 CpG (5 μg의 / mL) 및 F (AB ') 항 인간 IG (의 IgG + IgM의 +의 IgA) 2 단편 (20 μg의 / ㎖) (11); (c)의 CpG (5 μg의 / ㎖) 황색 포도상 구균 코완 (SAC)로부터 단백질 A (1 : 10,000 희석) 및 미토 겐의 pokeweed (PWM) (1 : 100,000 희석) 18; (d) 재조합 인간 IL-21 (100 NG / mL) 및 재조합 sCD40L (1 μg의 / ㎖) 12, 15, 33; 및 (e) 재조합 인간 IL-2 (10 ng의 / mL) 및 R848 (1 μg의 / ㎖) 효능 TLR7 33-34. B 세포 사흘 11의 ASC로 분화 할 수 있지만 세포는 일반적으로 이전의 아르이전의 ASC (11), (18)의 정량화에 대한 ELISPOT 판에 추가로 5 ~ 6 일 동안 timulated. 배양 기간 동안 일반적으로 출발 분화 에이전트 더 보충 없다.
된 CpG 함유 배양 물을 IL-2 및 IL-10의 첨가는 크게 구별 IgM-과의 IgG-의 ASC (15), (35)의 수를 증가시킬 수있다. 배양에서 IL-2의 존재에 의해 구별 된 CpG B 세포의 확장을 용이하게 분열의 자극을 제공 할 수있다. IL-10 10-25 NG의 범위는 / ㎖ 크게의 CpG (35)의 존재의 ASC의 제조 (3 ~ 10 배) 증가시킬 수있다. 안티 BCR 및 SAC 및 PWM 포함 BCR 작용제, 일차 인간 B 세포 (18)의 증식을 자극 할 수있다. 의 CpG과 클론 항 BCR의 IgG-의 ASC (28)에 주로 IgM의-의 ASC의 증가의 결과가 아니라와 메모리 B 세포를 배양. FcγRIIB하는 F 의해 BCR 통해 시그널링의 억제 예방 (AB 및# 39;) 안티 IG의 2 조각 (10-20 μg의 BCR (11) 가교 때 권장) 10 6 세포 당 / mL로. 대신 클론 항 IG의 어느 IgM의 + 또는 IgG의 + B 세포에 특정 안티 BCR 모노클로 날 항체가의 ASC에 차별화를위한 아이소 타입 별 B 세포 하위 집합을 대상으로 고려되어야한다. (10,000 희석 1) 및 PWM (1 : 100,000 희석)의 CpG, SAC의 조합 효율적 IgM-과의 IgG-의 ASC (18), (24)로 분화하는 기억 B 세포를 활성화 할 수있다. 또한, 시험 관내의 CpG 적당히 28-29에서 IG 클래스 스위칭을 유도 할 수있다. 대조적으로, IL-21 (100 NG / mL) 및 sCD40L (1 μg의 / mL)을 효과적으로 전환의 IgG-의 ASC (12), (30)에 독점적으로 기억 B 세포의 분화를 유도한다. sCD40L는 생체 내에서의 PC로 분화에 영향을 미치는, B 세포에 CD40 통해 T 세포의 도움을 모방하여 B 세포를 활성화 할 수 있습니다. 참고로, 항 CD40 (클론 : 89 또는 G28.5)이 문화 15 sCD40L를 대체 할 수 있습니다. HowevER 단독 sCD40L이나 항 CD40 어느 메모리 B 세포의 분화를 유도 할 수있다. 따라서, 배양 된 B 세포의 CD40 활성화가 종종 IG 클래스 전환을 촉진 할 수있는있는 IL-4의 CpG, R848, 또는 IL-21와 같은 분화 링제와 조합된다. IL-4는 배양의 IgG1 + B 세포로 전환 IgM의 가장 + B 세포의 유도를 허용 TH2 CD4 세포의 분화에 중요한 역할을한다. 유사하게, IL-21의 존재 하에서, 메모리 B 세포 및 B 세포 나이브 모두 클래스 스위칭의 ASC (12), (32)에 독점적으로 구별. 된 CpG 같이, R848은 B 세포 (34)의 한계 클래스 스위치를 유도 할 수있다. 마지막으로, 지질 다당류 (LPS)를 효과적으로의 ASC에 마우스 B 세포의 분화를 유도 할 수 있지만, 인간 B 세포는 CD14 및 TLR4 (29)의 낮은 레벨을 표현하는 것을 언급 할 가치가있다. 배양 분화 제의 첨가는 전환 된 B 세포의 생성을 촉진하기 때문에이 또한 피해야한다기존 PB들 / PC 나 스위치없는 기억 세포 인 경우에 측정 될 수있다.
ELISPOT 분석
ELISPOT 분석은 하나의 B 세포에 의해 분비 18 복근의 검출을 허용 멤브레인 기반 웨스턴 블랏 기술 플레이트 기반 ELISA를 결합. ELISPOT은 사이토킨 17 36 분비 AG-특이 T 세포를 계량하도록되어있다. ELISPOT 분석에서 정제 된 세포 (적혈구 무료) 분획 중 PBMC를 사용할 수있다. 그러나 ~ 정제 된 세포 ELISPOT 분석에서 일관된 결과를 얻기 위해보다 PBMC를이 요구되는 10 배량 이용한다. PBMC를 상기 순환의 ASC를 검출 웰 당 2 × 105 세포 - 좋은 출발점 일이다. AG-특정의 ASC의 검출에 방지 IG 보통의 Ag로 대체됩니다 (5-10 μg의 PBS에서 / ㎖) AG-특정 ACSS (단계 5.4)을 촬영합니다. 이소 타입 - 특정 검출 복근의 사용이 AG-IgM의 특정의 ASC-및 IgG의 이소 타입의 ASC-간의 차이 (5.1 단계 허용4). 참고로,에 관계없이 항 IG Ag 등이의 ASC를 캡처하는 데 사용 여부, ELISA에 사용되는 검출 애비는 항상 ELISPOT에 적합하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로,하지 ELISA에 대한 모든 색 기판은 ELISPOT에서 제대로 작동합니다. AP-와 HRP - 복합 애비 가장 일반적으로 ELISPOT 스폿 검출에 사용된다. BCIP / NBT 기질 용액은 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 및 3- 아미노 9 에틸 카바 졸 반면 (AEC) 솔루션은 HRP에 대한 일반적인 기질, AP 기반의 검출을위한 대중적인 선택이다 ELISPOT있다. 액세스 포인트 또는 HRP를 직접 검출 복근에 접합되는 경우 프로토콜 (단계 5.14)에 기재된 바와 같이, 하나의 단계는, 검출이 필요하다. 반대로, 검출 복근은 비오틴되고 두 단계에있어서의 기질과 반응하기 전에 AP- 또는 HRP 접합 된 스트렙 타비 딘과 함께 다음의 배양을 필요로한다. 모두 한 단계 및 두 단계의 방법은 ELISPOT 스팟을 검출하도록 효율적으로 작동한다.
ELISPOT 분석뿐만 아니라 circulat 정량화 할 수 있습니다보내고뿐만 아니라 (4.6 대 1.19 단계) 문화의 ASC 차별화. 존재하는 경우, 일반적으로 더 이상 문화에 두 개의 일 이상 거주의 ASC를, 순환, 또는 PBMC를 11에서 정제없이 ELISPOT 판에 직접 배양 할 수있다. 반대로, 기억 세포의 분화는 오일이 필요하다. 따라서, 세포 분리 (단계 1.19) 후 ELISPOT 판에 직접 배양하지 않는 것이 좋습니다; 확장 배양 기간에 따른 죽은 세포 파편이 자리 검출의 배경을 증가시킬 수있다. 대신 정제 된 B 세포와 전체 PBMC를 모두 제 분열 촉진 및 분화 에이전트 (단계 4.3)의 존재하에 6- 웰 또는 12 웰 플레이트에서 배양 할 수있다. 배양 과정 동안 자극 에이전트 반복 또한 불필요한 (단계 4.3)이다. 플레이트를 인큐베이터에있는 동안 인큐베이터의 도어가 부드럽게 이동 트랙을 따라 분비 복근 확산 될 수 위해 스폿을 생성, 이동 시드의 ASC를 방지하기 위해 개폐되어야꼬리 (소위 "혜성 같은"반점) (단계 5.11)와 함께. ELISPOT 플레이트의 잠복기 스폿 계산하는데 어려움을 만들 것이다 셀 분할 할 수없는 복근 검출 가능한 양을 분비하는 세포에 필요한 시간에 의해 결정된다. 따라서, 세포는 8 시간에 하룻밤 (단계 5.11)의 범위에서 일반적으로 배양한다.
ELISPOT 분석 메모리 B 세포 반응을 정량화하기위한 가장 널리 사용되는 방법이다. 그것은 체액 성 면역 반응과 면역 메모리의 인기, 독립 판독되고있다. 실제로, 선행 분열 배양의 ASC (단계 4.3)로 분화 기억 B 세포를 활성화 할 필요가있다. 그러나, 상술 한 바와 같이 기억 세포는 확장의 ASC로 분화되는 주파수는, 다른 배양 환경 변화한다. 일치하지 않지만, 대부분의 연구자의 ASC의 생산을 극대화 할 수있는 유도 조건을 채택한다. 에이전트의 관점에서 현장 detectio에 사용N, 가용성 바이오틴 AG는 감도 (37)을 손상시키지 않고 만족스럽지 검출 순이를 교체 할 수 있습니다. Ag로 훨씬 적은 양이 판을 코팅보다 검출에 필요한 때문에의 Ag의 이용이 제한되는 경우에 특히 중요하다. 마지막으로, ELISPOT은 세포 이질성의 표현형 분석을 허용하지 않으며, 따라서 세포 개체군의 사전 분류가 필요합니다. 최근 검출 복근 상이한 형광 물질로 표지 된 다색 ELISPOT 분석은 하나의 웰 38-39 카인을 분비하는 세포의 여러 타입을 검출하기 위해 개발되었다. 이 새로운 기술은 PBMC를 낮은 주파수 셀의 검출을위한 백신 유도 된 B 세포 반응의 대규모 분석을 위해 특히 중요한 것이다.
ELISPOT 분석은의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포를 정량화 빠르고 효율적이므로,뿐만 아니라 새로운 Circu의 기능성을 측정하기 위해 확장 된이러한 간내 백혈구 림프구 (40)뿐만 아니라 조직의 면역 세포가 쌓이면. 심지어 하나의 ASC를 검출 레벨에 도달 감도의 때문에 ELISPOT 분석 점점 기존 및 새로운 병원균 백신 효능에 대한 인간의 면역 반응을 측정하기 위해 사용되었다. ELISPOT 분석의 높은 처리 성능과 안정성이 한 PBMC를 사용하여 면역 반응의 대규모 평가를위한 최상의 있지만 분석법의 결과는 셀이 신선하거나 냉동 여부 등 샘플의 처리 지연 등의 각종 요인에 의해 영향을받을 수있다 혈청 배지의 성분 및 ELISPOT 플레이트 (41)에 추가 된 셀의 개수. 따라서, 정규화 과정은 대규모 및 종 후속 연구들 (예를 들어, 백신 실험)에서 인트라 간 변화 분석을 최소화 ELISPOT 프로토콜에 포함되어야한다. 판 독서의 정규화 방법은 직선 성, 정확성 및 단점 중요하다분석에 istency은 41 ~ 42 결과. 플레이트 판독 정규화를 수행하는 한 가지 방법은 ELISPOT 플레이트 (단계 5.10)에 접종 세포의 일련의 희석 절차를 확장하는 것이다. 기준 판을 만들고,보다 연속 희석 웰 당 도금 셀 번호 및 웰 당 스폿 카운트 사이의 선형 관계를 입증한다. ELISPOT 판의 반복 검사는 모두 자동으로 수동으로 자리 계산의 템플릿을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 자리 카운트에서 최소 내 잘 변동성은 이러한 정상화 절차 (43) 후 예상된다. 마지막 ELISPOT의인가는 감염 복용 암 면역 요법 환자의 치료 반응을 모니터링 할뿐만 아니라 행 immunotoxicity의 평가 (예를 들어, 면역 억제제 및 약물 - 유도 된자가 면역)에 관한 다양한 방법으로 확장 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
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