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Biology

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

doi: 10.3791/54586 Published: September 17, 2016

Summary

L'orologio circadiano regola circa un terzo del trascrittoma di Arabidopsis, ma la percentuale di geni che alimentano di nuovo nel cronometraggio rimane sconosciuto. Qui visualizziamo un metodo per valutare rapidamente fenotipi circadiani in qualsiasi linea mutante di Arabidopsis utilizzando immagini luminescenti di un reporter circadiano transitoriamente espresso in protoplasti.

Introduction

La maggior parte degli organismi viventi possiedono una cronometrista endogena per aiutare efficiente negoziazione di variazioni giornaliere per l'ambiente. Questo cronometrista, l'orologio circadiano, regola molti aspetti del metabolismo e la fisiologia di un organismo di anticipare i cambiamenti prevedibili nell'ambiente esterno. Nelle piante, per esempio, l'anticipazione di patogeni o erbivori attacchi temporalmente prevedibili riduce fortemente la suscettibilità complessivo 1-4. Metabolismo L'amido è strettamente regolata dall'orologio circadiano al fine di garantire che le riserve di amido scorso fino all'alba se cresciuti in condizioni di lunghe o corte al giorno 5. In effetti, le piante con gli orologi circadiani corrispondenti ai ambiente spettacolo aumento dei tassi di crescita 24 ore, i tassi di fissazione del carbonio e il tasso di sopravvivenza rispetto agli impianti che eseguono un orologio di periodo non corrispondenti 6. L'ampia influenza dei ritmi circadiani in tutti questi processi deriva in larga misura dalla regolazione ritmico di fino a un terzodel trascrittoma totale in Arabidopsis 7. Questi prodotti genici ritmiche sono coinvolti in una vasta gamma di processi cellulari tra cui vie metaboliche, segnalazione ormonale, e le risposte allo stress 7. In cima a quello, la regolazione circadiana diretta della funzione della proteina è stabilita dal regolamento circadiano della fosforilazione 8 e molto probabilmente altre modificazioni post-traduzionali (PTM).

Al centro dell'orologio circadiano che guida questa riprogrammazione trascrizionale quotidianamente si trova una rete di trascrizione / feedback traslazionale loop (TTFLs), compresi i geni del mattino-espresso circadiani CLOCK collegate 1 (CCA1) e tardiva ALLUNGATA hypocotyl (LHY) che reprimere l'espressione dei geni sera TIMING dELLA CABINA 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) ei membri del complesso sera (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), fioritura precoce 3 (ELF3), e ELF4 9 - 11. insieme ingegnoh le -Genès REGOLATORE PSEUDO risposta (PRR3, 5, 7 e 9), TOC1 reprime CCA1 espressione / LHY mentre la CE agisce come un regolatore positivo 12 - 14. Ulteriori meccanismi di retroazione, post-trascrizionale e post-traslazionale regolazione dei componenti di rete TTFL svolge un ruolo importante in ritmi circadiani tuning. Fino ad oggi, il PTM più abbondante identificato sulle proteine ​​orologio circadiano è fosforilazione 15. La fosforilazione di CCA1 da Casein Kinase 2 (CK2) colpisce il suo legame di indirizzare i promotori 16 ed è importante per la compensazione della temperatura dell'orologio circadiano 17. Le proteine ​​PRR sono fosforilati differenziale nel corso del ciclo circadiano, e la fosforilazione di TOC1 colpisce interazione con il suo regolatore negativo, la sera-phased componente orologio Zeitlupe (ZTL) 18. Questi esempi illustrano come PTM e le interazioni proteina-proteina sintonizzare la rete TTFL in 24 oreoscillatore trascrizionale. Per una più dettagliata introduzione alla rete di clock trascrizionale e la sua regolazione, recensioni eccellenti recenti sono disponibili (ad esempio di riferimento 15).

Tuttavia, ciò che rimane meno chiaro è la misura in cui i processi ritmicamente regolamentati e altri aspetti del metabolismo cellulare feed back nel meccanismo di misurazione del tempo per sé. Ampia selezione di mutanti di Arabidopsis per difetti di clock potrebbe ottenere una maggiore comprensione di quali meccanismi o vie di segnalazione potrebbero essere coinvolti nella generazione di 24 ritmi hr da una rete TTFL. A tal fine, Kim e Somers pubblicati in precedenza un metodo di break-through per l'analisi efficiente e rapida di funzione orologio in qualsiasi linea Arabidopsis 19. Basato sull'utilizzo di espressione transiente in protoplasti, questa metodologia supera la necessità di linee transgeniche stabili o mette a linee marcatore orologio luminescenti. Qui, visualizziamo un alto rendimento isolatio protoplastiMetodo n 20 in combinazione con un protocollo ottimizzato per schermare difetti circadiani di immagini luminescente marcatori orologio transitoriamente espressi in un lettore di piastre a 96 pozzetti.

Confronteremo wild-type Col- 0 Arabidopsis di mutanti di clock ben caratterizzati per confermare la metodologia descritta qui con successo rileva ritmi circadiani alterati. Protoplasti derivati ​​da queste linee sono transfettate con un costrutto giornalista che esprime lucciola luciferasi dal promotore CCA1 circadiano; CCA1pro: LUC 19. Luciferasi catalizza la reazione multistadio in cui luciferina viene convertito eccitato elettronicamente oxyluciferin che emette luce 21, che viene ripreso nel tempo per valutare il periodo, ampiezza e fase dei ritmi trascrizionali in questi protoplasti.

Il protocollo è costituito da tre parti principali; isolare i protoplasti, transfecting i protoplasti con il plasmide giornalista, e im luminescentiinvecchiamento. Queste tre parti devono essere sempre eseguite in un solo giorno, utilizzando tamponi e reagenti preparati al momento. La crescita delle piante e la purificazione di quantità sufficienti di giornalista plasmide devono essere eseguiti in anticipo e non sono visualizzati in questo protocollo.

Protocol

NOTA: In questo protocollo, i reagenti ei volumi descritti sono espressi per linea Arabidopsis che è testato, e si tradurrà in sei pozzi replicati in quel genotipo. Moltiplicare i materiali con il numero di righe da analizzare quando si analizza più di una riga. Nel video, wild-type Arabidopsis sarà confrontato con l'orologio circadiano mutante linea ZTL (anche se i risultati rappresentativi da linee aggiuntive verranno forniti in seguito).

soluzione enzimatica
cellulase 0.5% (w / v)
pectinasi R10 0,25% (w / v)
D-mannitolo 400 mm
CaCl 2 10 mM
KCl 20 mm
Albumina sierica bovina 0,1% (w / v)
MES, pH 5.7 20 mm
soluzione W5
NaCl 150 mm
CaCl 2 125 mm
KCl 5 mM
MES, pH 5.7 2 mm
Glucosio 5 mM
soluzione MMg
MES, pH 5.7 4 mM
D-mannitolo 400 mm
MgCl 2 15 mM
soluzione PEG
PEG4000 40% (w / v)
D-mannitolo 200 mM
CaCl 2 100 mM
soluzione di imaging
soluzione W5 al volume finale
Siero fetale bovino 5% (v / v)
Luciferin 1,2 mm
ampicillina 50 mg / ml

Tabella 1: elenco delle soluzioni.

1. Preparazione dei Materiali e tamponi

  1. materiali vegetali
    1. Mantenere Arabidopsis Col -0 semi in acqua in una provetta da 1,5 ml a 4 ° C al buio per quattro giorni. Pipettare i semi nel suolo in una pentola e trasferimento in condizioni di giorno lungo (16 ore di luce 8 ore scuro) a 21 ° C per 7 giorni. Lascia un coperchio sulla pentola per i primi tre giorni di tempo per garantire l'alta umidità. Trapianto sei piantine ad un nuovo 8 cm x 13 cm x 5 cm pentola e continuare a crescere le piante nelle stesse condizioni per another 21 giorni. Assicurarsi che il terreno è umido tutto.
  2. Reporter plasmidi
    1. Purificare il CCA1pro: giornalista plasmide LUC 19 da coltura batterica in anticipo, utilizzando un kit di isolamento del DNA secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: è richiesto 20 mcg giornalista plasmide (10 ml a 2 mg / mL in DH 2 O) per una trasfezione.
  3. soluzioni
    NOTA: per questo protocollo sono necessari cinque soluzioni: soluzione enzimatica, soluzione di lavaggio 5 (W5) soluzione, mannitolo-Magnesio (MMG), il polietilene glicole (PEG) soluzione, e la soluzione di imaging (Tabella 1). Preparare questi prima di passare alla fase di isolamento protoplasti.
    1. Preparare 10 ml di soluzione enzimatica come da Tabella 1, aggiungendo gli enzimi ultima, e filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron siringa.
    2. Preparare le soluzioni rimanenti nei seguenti volumi: 15 ml di soluzione di W5, 10 ml MMg soluzione, 1 ml di soluzione di PEG e soluzione di imaging 1,5 ml come da Tabella 1.
      NOTA: È importante che la soluzione PEG è non meno preparato di un hr prima della trasfezione per garantire che il PEG è completamente dissolto. Filtro sterilizzare la soluzione di imaging attraverso un filtro siringa da 0,22 micron.

Figura 1

Figura 1:. Isolamento Protoplast Le foglie delle piante di Arabidopsis adulti (A) sono fissati su nastro autoclave con lo strato epidermico inferiore rivolta verso l'alto (B). (C) Nastro Magic è leggermente premuto sullo strato epidermico inferiore con la punta di un tubo da 15 ml. (D) Il nastro magico viene rimosso per esporre le cellule del mesofillo (E). (F) strisce di nastro autoclave con permessos collegati siano galleggiare sulla soluzione enzimatica contenente cellulasi e pectinasi, rilasciando protoplasti nella soluzione. (G) La foglia scheletri rimangono sul nastro autoclave dopo digestione enzimatica e vengono scartati, lasciando i protoplasti in soluzione enzimatica (H). (I) finali protoplasti mesofillo risultanti (scala bar = 50 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Isolamento Protoplast

  1. Etichettare una capsula di Petri e aggiungere 10 ml di soluzione enzimatica sterilizzata per filtrazione.
  2. Fissare quattro strisce di nastro autoclave con la parte adesiva su una superficie pulita laboratorio e contrassegnare le dimensioni della capsula di Petri sulle strisce.
  3. Tagliare le foglie di 4 settimane piante vecchie (Figura 1a), e premere l'epidermide superiore sul nastro autoclave (cioè la superficie epidermica inferiore rivolta verso l'alto (
  4. Premere delicatamente le strisce di nastro magico sulla superficie epidermica inferiore usando un tubo da 15 ml. Fare attenzione a non schiacciare il tessuto fogliare (Figura 1c). Estrarre con cautela il nastro magico fuori per mettere a nudo l'epidermide inferiore (Figura 1d) ed esporre le cellule del mesofillo (Figura 1e).
  5. Tagliare il nastro autoclave per adattarsi alla capsula di Petri, usa le pinzette per spostare il nastro nella capsula di Petri e galleggiare sulla soluzione enzimatica (Figura 1F), lascia rivolto verso il basso. Ruotare a 60 rpm su un agitatore piattaforma per 60 minuti, durante il quale i protoplasti saranno rilasciati nella soluzione.
  6. Utilizzare le pinzette per rimuovere ed eliminare le strisce di nastro autoclave (Figura 1 g) e pipetta la soluzione contenente i protoplasti (Figura 1h) in un tubo conico da 50 ml. Utilizzare un puntale ampio tunnel (come ad esempio una punta P5000 o P1000 una punta con l'estremità tagliate).
  7. Centrifugare la protoplasti a 100 xg per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Fate attenzione, come il pellet è molto sciolto.
  8. Aggiungere 10 ml di soluzione W5 ai protoplasti e risospendere agitando delicatamente il tubo.
  9. Appoggiare i protoplasti in ghiaccio per 30-60 min. Durante questa fase, valutare la resa contando protoplasti in un emocitometro (Figura 1i).
  10. Raccogliere i protoplasti da centrifugazione a 100 xg per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Fate attenzione, come il pellet è molto sciolto.
  11. Risospendere le protoplasti ad una concentrazione di 5 x 10 5 protoplasti / ml in soluzione MMg.

3. Protoplast Trasfezione

  1. Aggiungere 10 ml giornalista plasmide (2 mg / mL) a un tubo da 15 ml.
  2. Aggiungere 400 microlitri protoplasti al tubo.
  3. Aggiungere un volume (410 ml) soluzione di PEG e mescolare capovolgendo la provetta delicatamente 12 volte per trasfettare i protoplasti.
  4. Dopo 8-15 min incubation a temperatura ambiente, diluire la miscela di protoplasti-DNA-PEG con quattro volumi (1640) microlitri soluzione W5 e mescolare invertendo delicatamente sei volte.
  5. Raccogliere i protoplasti trasfettati mediante centrifugazione a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta. Ancora una volta, fare attenzione, come il pellet è molto sciolto.
  6. Risospendere le protoplasti a 1.250 ml soluzione di imaging.
  7. Aliquota 200 ml in sei replicano pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, colmare eventuali pozzi vuoti con soluzione W5, e sigillare il piatto con un coperchio trasparente adesivo idoneo per l'imaging luminescenti.

4. Imaging

  1. Trasferire la piastra a qualsiasi configurazione di imaging luminescente adatto per l'imaging impianto. Modificare i coperchi adesivi sulle piastre 10-15 minuti dopo il trasferimento per evitare differenze di condensazione e di pressione tra i pozzi, quindi avviare l'imaging. Leggere la piastra ogni ~ 45 min (3 sec per pozzetto) per cinque giorni a temperatura ambiente.
    Notare lala frequenza di targa legge e il tempo di lettura per pozzetto possono variare a seconda della configurazione di imaging.

Analisi 5. I dati

  1. Analizzare i risultati di luminescenza con qualsiasi software di analisi (per esempio, Biological Rhythms Analysis System Software (BRASS) 22). Confrontare la linea mutante di controlli wild-type per rivelare difetti circadiani.

Representative Results

Protoplasti di wild-type di Arabidopsis sono stati confrontati con i noti mutanti orologio CCA1 / Lhy (breve periodo mutante 2), ZTL (lungo periodo mutante 23), e la linea di sovraespressione CCA1 -OX (aritmici 24). Tutti sono stati transitoriamente trasfettate con il CCA1pro: giornalista LUC e ripreso in luce costante su un lettore di piastre in 5 giorni.

Qui si dimostra che nel mutante CCA1 / Lhy, il periodo di free-running dell'espressione genica circadiano controllato si accorcia (Figura 2a), in linea con il periodo pubblicato analizzato da stabile espressione transgenica di orologio luminescenti marcatori 2,9. Il periodo di oscillazioni circadiane in protoplasti del mutante ztl è più lungo rispetto al tipo selvatico (figura 2b), in conformità con i risultati precedentemente pubblicati da piantine, sospensione cellulare cultures e protoplasti 19,23,25.

Sovraespressione di CCA1 blocca l'orologio mattina fase e trascrizione globale diventa aritmico 24. Coerentemente, abbiamo osservato nessun oscillazioni in CCA1pro: espressione LUC in protoplasti -oX CCA1 (Figura 2c).

figura 2
Figura 2: protoplasti ritmi circadiani protoplasti di Col- 0, CCA1 / Lhy, ZTL, e CCA1 -OX sono stati transitoriamente trasformato con il CCA1pro: LUC costruire e ritmi circadiani in luminescenza sono stati ripreso in 5 giorni (A - C). (D) periodale circadiani basate su tracce di luminescenza in Col -0, CCA1 / Lhy e ZTL (A - B). Meun ± SEM, n = 3-5, t-test p-value come indicato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ZTL
Genotipo Periodo (protoplasti) Periodo (transgenici) Segnalato da: Riferimenti
col- 0 23.0 ± 0.21 24.4 ± 0.09 pCCA1: LUC a Col -0 (2)
CCA1 / Lhy 20.6 ± 0.13 19.9 ± 0.11 pCCA1: LUC a Col -0 (2)
~ 18 RNA a L er sfondo (9)
25.1 ± 0.12 27.4 ± 0.5 CAB2: LUC in C24 ecotipo (22)
CCA1 -OX aritmica aritmica pCCA1: LUC (dati LD solo) (2)
aritmica RNA e proteine ​​a Col -0 sfondo (23)

Tabella 2: ritmi circadiani in protoplasti Rispetto ai transgenici Piantine Il periodo circadiano di pCCA1. Espressione LUC in protoplasti confronto con le lunghezze d'epoca segnalati per la mutazione e, se disponibile, con pCCA1: espressione LUC a Col -0.

Discussion

Qui, vi presentiamo un rapido test per lo screening difetti periodo circadiani nelle linee di Arabidopsis, tra cui l'isolamento di protoplasti, trasfezione, e di imaging luminecent. Il periodo circadiano nel wild-type Arabidopsis e l'orologio mutanti CCA1 / Lhy, ZTL, e CCA1 -OX è stato calcolato da misure di luminescenza da un CCA1pro: giornalista LUC ed è risultato essere coerenti con i dati pubblicati generati dalle piante intere che utilizzano più tempo- consumano approcci transgenici (Tabella 2). Usando questo test per lo screening mutanti di Arabidopsis evita il requisito iniziale per generare linee luminescenti transgeniche, che richiede tempo e potrebbe rivelare che soltanto una particolare mutante presenta ritmi wild-type. Un chiaro vantaggio di questo protocollo è che ogni linea di Arabidopsis può essere proiettato in breve tempo per i ritmi circadiani alterati trascrizionali, che aiuterà l'identificazione di altri geni che influenzano cronometraggio nelle piante.

26,27. La digestione successiva richiede almeno 3 ore di incubazione al buio per rilasciare i protoplasti nella soluzione enzimatica. Quando l'infiltrazione vuoto non viene applicata, si consiglia di incubazione di tempo fino a 18 ore. Nel protocollo qui presentato, infiltrazione vuoto è inutile perché lo strato di cellule epidermiche impenetrabili agli enzimi viene rimosso dal nastro. Durante la generazione di protoplasti tagliando materiale vegetale è necessario protoplasti separati da detriti parete cellulare dopo la digestione; Ciò avviene tipicamente filtrando la soluzione o purificare su un gradiente di 27,26 zucchero. Qui, qualsiasi tessuto non digerito rimane sul nastro autoclave dopola digestione, così filtrazione e zucchero gradiente purificazione dei protoplasti può essere omesso. C'è una possibilità che lo stress derivante da procedure protoplasting prolungati colpisce la vitalità cellulare e l'orologio circadiano. Il metodo protoplasting basato su nastro 20 visualizzati qui produce un elevato numero di protoplasti; e data la vitalità delle cellule nel corso di una serie temporale circadiano e le lunghezze d'epoca corrispondenza di protoplasti e le piante intere (Tabella 2), la metodologia qui descritta è preferito rispetto ai metodi alternativi per generare protoplasti.

Il passo trasfezione del protocollo è un passaggio fondamentale che ha un impatto sulla vitalità delle protoplasti. La soluzione PEG consente il DNA da consegnare nella cella, e sia il tempo di incubazione in questa soluzione (passo 3.4) e la percentuale di PEG deve essere determinato empiricamente. La concentrazione standard è 20%, con concentrazioni inferiori riducendo l'efficienza di trasformazione e superioriLe concentrazioni che riducono la vitalità 28. Tempo di incubazione più breve di cinque minuti potrebbe produrre efficiente trasfezione dei protoplasti 27.

I protoplasti possono essere esposte su qualsiasi piattaforma di imaging luminescenti. In questo video, abbiamo utilizzato un lettore di piastre luminescenza dotato di luci esterne (rosso e LED blu, 630 e 470 nm, rispettivamente, ad una intensità combinata di ~ 20 μE), che consente lo screening high-throughput e le misure frequenti. Altre apparecchiature di imaging che rileva luminescenza, come ad esempio lettori di piastre alternativi o messe a punto, basata soprattutto un dispositivo (CCD) fotocamera ad accoppiamento di carica, potrebbe essere applicato ugualmente bene fino a quando l'illuminazione è disponibile per la fotosintesi. Il vantaggio di utilizzare una telecamera CCD montata su un mobile controllabile è che la luce e la temperatura può essere programmata. Uno svantaggio è il tempo di acquisizione più lungo, introducendo periodi prolungati di oscurità che possono causare stress per i protoplasti oltre a perturbareing cronometraggio endogena. Indipendentemente da quale piattaforma sperimentale viene scelto, la regolazione delle impostazioni è probabile che sia necessaria rispetto alle impostazioni di piantine o piante mature. Nella nostra esperienza, aumentando le concentrazioni di giornalista plasmide durante trasfezione e / o luciferina nel buffer di imaging potrebbe risolvere eventuali ritmi irregolari o bagnatura rapidamente che potrebbero verificarsi negli esperimenti iniziali.

In esperimenti futuri, la metodologia qui descritta può essere applicata per studiare il fenotipo circadiano di qualsiasi linea Arabidopsis mutante. Con piccole modifiche, ad esempio l'effetto di diversi farmaci sulla misurazione del tempo potrebbe essere studiato in questa configurazione. Inoltre, la trasfezione può essere modificato per includere microRNA artificiale per silenziamento genico 19, espandendo ulteriormente la versatilità di questo protocollo. Protocolli per generare protoplasti di riso sono ben stabiliti 29 ed il protocollo di imaging qui presentata potrebbe ugualmente essere applicate per migliorare la nostra understanding dell'orologio in economicamente importanti piante coltivate monocot.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948

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References

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Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).More

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).

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