Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت

doi: 10.3791/54586 Published: September 17, 2016

Summary

تنظم الساعة اليومية عن ثلث Transcriptome على نبات الأرابيدوبسيس، لكن نسبة الجينات التي تغذي مرة أخرى إلى ضبط الوقت ما زال مجهولا. نحن هنا تصور طريقة لتقييم بسرعة الظواهر الإيقاعية في أي خط متحولة من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام التصوير الانارة مراسل الإيقاعية أعرب عابر في جبلة مجردة.

Introduction

معظم الكائنات الحية تمتلك وناظما الذاتية لمساعدة التفاوض الفعال من التغيرات اليومية في البيئة. هذا ناظما، على مدار الساعة الساعة البيولوجية، وينظم العديد من جوانب عملية التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء من كائن حي الى توقع التغيرات يمكن التنبؤ بها في البيئة الخارجية. في النباتات على سبيل المثال، تحسبا لوقوع هجمات الممرض أو عاشب يمكن التنبؤ بها مؤقتا يقلل بقوة قابلية الشاملة 1-4. وينظم عملية الأيض النشا بإحكام قبل الساعة اليومية لضمان أن احتياطيات النشا تستمر حتى الفجر سواء نمت في طويلة أو قصيرة الظروف اليوم 5. في الواقع، والنباتات مع الساعات الإيقاعية مطابقة المعرض بيئة زيادة معدلات النمو مدار 24 ساعة، ومعدلات تثبيت الكربون ومعدلات البقاء على قيد الحياة مقارنة مع محطات تشغيل على مدار الساعة لفترة غير متطابقة 6. تأثير واسع النطاق من ايقاعات كل يوم في جميع هذه العمليات يطرح نفسه إلى حد كبير من التنظيم الإيقاعي لمدة تصل إلى الثلثمن Transcriptome على الكلي في نبات الأرابيدوبسيس 7. وتشارك هذه المنتجات الجينات الإيقاعية في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية بما في ذلك مسارات التمثيل الغذائي، وهرمون الإشارات، واستجابات التوتر 7. وعلاوة على ذلك، يتم تأسيس تنظيم الساعة البيولوجية المباشر من وظيفة البروتين عن طريق تنظيم الساعة البيولوجية من الفسفرة 8 وغيرها من التعديلات بعد متعدية على الأرجح (PTMs).

في وسط الساعة اليومية التي تحرك هذا برمجة النسخي اليومية يكمن شبكة من النسخي / ردود الفعل متعدية حلقات (TTFLs)، بما في ذلك الجينات وأعرب الصباح الساعة البيولوجية CLOCK المرتبطين 1 (CCA1) وأواخر ممدود التحتفلقي (LHY) التي تقمع التعبير من توقيت الجينات مساء CAB 1 (TOC1)، ضخامي (GI) وأعضاء من المجمع مساء (EC)؛ LUX ARRHYTHMO (LUX)، المزهرة في وقت مبكر 3 (ELF3)، وELF4 9-11. الطرافة معاح -genes REGULATOR الزائف استجابة (PRR3 و 5 و 7 و 9)، TOC1 يقمع CCA1 التعبير / LHY في حين تعمل المفوضية الأوروبية كمنظم إيجابي 12-14. الإضافي لآليات التغذية المرتدة، بعد النسخي وبعد متعدية تنظيم مكونات شبكة الاتصال TTFL يلعب دورا هاما في ضبط الإيقاع اليومي. حتى الآن، PTM الأكثر وفرة التعرف على البروتينات الساعة اليومية هو الفسفرة 15. فسفرة CCA1 من الكازين كيناز 2 (CK2) يؤثر ملزمة لاستهداف المروجين 16 و مهم لتعويض درجة الحرارة على مدار الساعة الإيقاعية 17. وفسفرته البروتينات PRR تفاضلي خلال دورة الساعة البيولوجية، والفسفرة من TOC1 يؤثر التفاعل مع منظم السلبي، وZEITLUPE عنصر مدار الساعة على مراحل مساء (ZTL) 18. وتوضح هذه الأمثلة كيف PTMs وتفاعلات البروتين البروتين ضبط شبكة TTFL في-ساعة 24مذبذب النسخي. للحصول على مقدمة أكثر تفصيلا للشبكة على مدار الساعة النسخي ولائحته التنفيذية، واستعراض ممتازة الأخيرة المتاحة (مثل إشارة 15).

ومع ذلك، ما يزال أقل وضوحا هو مدى عمليات ينظم بشكل متوازن وغيرها من جوانب الأيض الخلوي تتغذى مرة أخرى إلى آلية ضبط الوقت نفسه. فحص واسعة من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس عن عيوب مدار الساعة ويمكن الحصول على مزيد من الفهم الذي آليات أو مسارات إشارات يمكن أن تشارك في توليد 24 إيقاعات ساعة من شبكة TTFL. تحقيقا لهذه الغاية، كيم وسومرز نشرت سابقا طريقة اختراق للتحليل الفعال والسريع من وظيفة على مدار الساعة في أي خط نبات الأرابيدوبسيس 19. تعتمد على استخدام التعبير عابر في جبلة مجردة، هذه المنهجية تفوق الحاجة لخطوط المعدلة وراثيا مستقرة أو يعبر إلى خطوط مدار الساعة علامة الانارة. هنا، نحن تصور عالية isolatio البروتوبلازم للاستسلامن طريقة 20 جنبا إلى جنب مع بروتوكول الأمثل للكشف العيوب الساعة البيولوجية بواسطة التصوير الانارة من علامات الساعة أعرب عابر في قارئ لوحة 96-جيدا.

سنقارن من النوع البري زملاؤه 0 نبات الأرابيدوبسيس إلى طفرات على مدار الساعة تتميز جيدا لتأكيد منهجية الموصوفة هنا بنجاح بالكشف عن الإيقاعات اليومية المتغيرة. و transfected جبلة مجردة المستمدة من هذه الخطوط مع بناء مراسل التي تعبر عن وسيفيراز اليراع من المروج CCA1 الإيقاعية، CCA1pro: لوك 19. وسيفيراز يحفز رد فعل متعددة الخطوات التي يتم تحويلها إلى وسيفيرين متحمس إلكترونيا oxyluciferin التي تنبعث ضوء 21، الذي التقط مع مرور الوقت لتقييم الفترة، السعة ومرحلة من الإيقاعات النسخي في هذه جبلة مجردة.

يتكون البروتوكول من ثلاثة أجزاء رئيسية. عزل جبلة مجردة، transfecting في جبلة مجردة مع البلازميد مراسل، والتراسل الفوري الانارةشيخوخة. وينبغي دائما أن يتم تنفيذ هذه الأجزاء الثلاثة في يوم واحد، وذلك باستخدام الطازجة المخازن والكواشف. يجب أن يتم تنفيذ نمو النبات وتنقية كميات كافية من البلازميد مراسل مقدما ولا تصور في هذا البروتوكول.

Protocol

ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتم التعبير عن الكواشف وأحجام وصفها في كل سطر نبات الأرابيدوبسيس أن يتم اختباره، وسوف يؤدي إلى ستة آبار تكرار لهذا النمط الجيني. مضاعفة المواد مع عدد الخطوط ليتم تحليلها عند تحليل أكثر من سطر واحد. في الفيديو، وسيتم مقارنة البرية من نوع نبات الأرابيدوبسيس إلى الساعة اليومية ZTL خط متحولة (على الرغم من وستقدم نتائج ممثلة من خطوط إضافية في وقت لاحق).

حل انزيم
السليوليز 0.5٪ (ث / ت)
بكتيناز R10 0.25٪ (ث / ت)
مد مانيتول 400 ملي
CaCl 2 10 ملي
بوكل 20 ملي
ألبومين المصل البقري 0.1٪ (ث / ت)
MES، ودرجة الحموضة 5.7 20 ملي
حل W5
كلوريد الصوديوم 150 مم
CaCl 2 125 ملي
بوكل 5 ملم
MES، ودرجة الحموضة 5.7 2 مم
جلوكوز 5 ملم
حل مجموعة محمد المعجل
MES، ودرجة الحموضة 5.7 4 مم
مد مانيتول 400 ملي
MgCl 2 15 ملي
حل PEG
PEG4000 40٪ (ث / ت)
مد مانيتول 200 ملي
CaCl 2 100 ملي
الحل التصوير
حل W5 إلى الحجم النهائي
مصل بقري جنيني 5٪ (ت / ت)
وسيفيرين 1.2 ملم
الأمبيسلين 50 ملغ / مل

الجدول 1: قائمة من الحلول.

1. إعداد المواد والمخازن

  1. المواد النباتية
    1. الحفاظ نبات الأرابيدوبسيس العقيد -0 البذور في الماء في أنبوب 1.5 مل في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة أربعة أيام. ماصة البذور على التربة في وعاء ونقل لظروف اليوم طويلة (16 ساعة ضوء 8 ساعات الظلام) في 21 درجة مئوية لمدة 7 أيام. ترك غطاء على القدر في الأيام الثلاثة الأولى لضمان ارتفاع نسبة الرطوبة. زرع ستة الشتلات إلى 8 سم × 13 سم × 5 سم جديد وعاء ومواصلة النمو النباتات في ظل نفس الظروف لعنوتإيه 21 يوما. تأكد من أن التربة رطبة طوال الوقت.
  2. مراسل البلازميد
    1. تنقية CCA1pro: لوك مراسل البلازميد 19 من ثقافة البكتيرية مقدما، وذلك باستخدام عدة عزل الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: مطلوب 20 ميكروغرام مراسل البلازميد (10 ميكرولتر في 2 ميكروغرام / ميكرولتر في DH 2 O) لترنسفكأيشن.
  3. حلول
    ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول نحن بحاجة إلى خمسة حلول: حل أنزيم، حل غسل 5 (W5) حل، مانيتول-المغنيسيوم (MMG)، البولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل، والحل التصوير (الجدول 1). إعداد هذه قبل المتابعة إلى الخطوة البروتوبلازم العزلة.
    1. إعداد 10 مل من محلول أنزيم كما في الجدول رقم 1، إضافة الإنزيمات الماضي، وتصفية تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون حقنة.
    2. إعداد الحلول المتبقية في حجم التالية: 15 مل W5 حل، 10 مل مجموعة محمد المعجل الصورةolution، 1 مل حل PEG و 1.5 مل من محلول التصوير كما في الجدول 1.
      ملاحظة: من المهم أن الحل PEG مستعدة بما لا يقل عن ساعة قبل ترنسفكأيشن للتأكد من أن الربط قد حلت تماما. فلتر تعقيم الحل التصوير من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.

شكل 1

يتم إصلاحها البروتوبلازم العزلة وأوراق النباتات نبات الأرابيدوبسيس الكبار (A) على شريط الأوتوكلاف مع طبقة البشرة السفلية التي تواجه حتى (ب): الشكل 1. الضغط (C) الشريط ماجيك بلطف على طبقة البشرة السفلية مع غيض من 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إزالة (D) الشريط سحرية لفضح خلايا نسيج الورقة المتوسط ​​(E). (F) شرائط من شريط الأوتوكلاف مع إجازةوطرحت الصورة تعلق على حل الانزيم التي تحتوي على السيلولوز وبكتيناز، والإفراج عن جبلة مجردة إلى الحل. (G) يتم تجاهل ورقة لا تزال هياكل عظمية على شريط الأوتوكلاف بعد انزيم الهضم و، وترك جبلة مجردة في حل انزيم (H). (I) مما أدى النهائية جبلة مجردة نسيج الورقة المتوسط ​​(مقياس بار = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. البروتوبلازم عزل

  1. تسمية طبق بتري وإضافة 10 مل من محلول أنزيم فلتر تعقيم.
  2. إصلاح أربع شرائح من شريط الأوتوكلاف مع الجانب زجة حتى على سطح مختبر نظيفة، ووضع علامة على حجم طبق بتري على شرائط.
  3. قطع أوراق النباتات القديمة لمدة 4 أسابيع (الشكل 1A)، ثم اضغط على البشرة العليا على الشريط الأوتوكلاف (أي سطح البشرة أقل مواجهة (
  4. اضغط بلطف شرائح من الشريط السحر على سطح البشرة أقل باستخدام أنبوب مخروطي 15 مل. الحرص على عدم سحق أنسجة نبات (الشكل 1C). بعناية سحب الشريط السحر من لتجريد البشرة السفلية (1D الشكل) وفضح خلايا نسيج الورقة المتوسط ​​(الشكل 1E).
  5. قص الشريط الأوتوكلاف لتتناسب مع طبق بتري، واستخدام الملقط لتحريك الشريط في طبق بتري وتطفو على حل انزيم (الشكل 1F)، ويترك لأسفل. تناوب على 60 دورة في الدقيقة على شاكر منصة لمدة 60 دقيقة، يتم خلالها الإفراج عن جبلة مجردة إلى الحل.
  6. استخدام ملاقط لإزالة والتخلص من شرائط من شريط الأوتوكلاف (الشكل 1G) وماصة للمحلول يحتوي على جبلة مجردة (الشكل 1H) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام ماصة معلومات سرية واسعة تتحمل (مثل تلميح P5000 أو تلميح P1000 مع نهاية قطع).
  7. أجهزة الطرد المركزي في جبلة مجردة في 100 ×ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف مع ماصة. رعاية، وبيليه واهية جدا.
  8. إضافة 10 مل من محلول W5 إلى جبلة مجردة و resuspend التي يحوم بلطف الأنبوب.
  9. ضع جبلة مجردة على الجليد لمدة 30-60 دقيقة. خلال هذه الخطوة، وتقييم العائد عن طريق عد جبلة مجردة في عدادة الكريات (الشكل 1I).
  10. جمع جبلة مجردة عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف مع ماصة. رعاية، وبيليه واهية جدا.
  11. Resuspend وجبلة مجردة إلى تركيز 5 × 10 5 جبلة مجردة / مل في حل مجموعة محمد المعجل.

3. البروتوبلازم ترنسفكأيشن

  1. إضافة 10 ميكرولتر مراسل البلازميد (2 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  2. إضافة 400 ميكرولتر جبلة مجردة إلى الأنبوب.
  3. إضافة مجلد واحد (410 ميكرولتر) حل PEG وتخلط بواسطة أنبوب عكس بلطف 12 مرة ل transfect في جبلة مجردة.
  4. بعد المؤتمر الوطني العراقي 8-15 دقيقةubation في درجة حرارة الغرفة، يخفف من خليط البروتوبلازم-DNA-PEG مع أربعة مجلدات (1640 ميكرولتر) حل W5 وتخلط بواسطة قلب بلطف ست مرات.
  5. جمع جبلة مجردة transfected بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف مع ماصة. مرة أخرى، ورعاية، وبيليه واهية جدا.
  6. Resuspend وجبلة مجردة في 1250 حل ميكرولتر التصوير.
  7. قسامة 200 ميكرولتر إلى ستة تكرار آبار لوحة 96-جيدا، وملء أي آبار فارغة مع حل W5، وختم لوحة مع غطاء واضح لاصقة مناسبة للتصوير الانارة.

4. التصوير

  1. نقل لوحة لأي الإعداد والتصوير الانارة مناسبة للتصوير النبات. تغيير أغطية لاصقة على لوحات 10-15 دقيقة بعد نقل لتجنب الخلافات التكثيف والضغط بين الآبار، ثم بدء التصوير. قراءة لوحة كل ~ 45 دقيقة (3 ثوان لكل بئر) لمدة خمسة أيام في درجة حرارة الغرفة.
    لاحظ التردد لوحة يقرأ والوقت للقراءة لكل بئر قد تختلف تبعا لالإعداد والتصوير.

تحليل 5. البيانات

  1. تحليل النتائج التلألؤ باستخدام أي برامج التحليل (على سبيل المثال، البيولوجية إيقاعات تحليل نظام البرمجيات (النحاس) 22). مقارنة خط متحولة إلى ضوابط من النوع البري للكشف عن العيوب الإيقاعية.

Representative Results

وتمت مقارنة جبلة مجردة من النوع البري نبات الأرابيدوبسيس إلى طفرات على مدار الساعة يعرف cca1 / lhy (فترة قصيرة متحولة 2)، ZTL (فترة طويلة متحولة 23)، والخط overexpression CCA1 -OX (عدم اتساق نبضات القلب 24). و transfected كل عابر مع CCA1pro: المراسل لوك وتصويرها في ضوء المستمر على قارئ لوحة أكثر من 5 أيام.

نحن هنا تظهر أنه في متحولة cca1 / lhy، هو تقصير فترة تشغيل خالية من التعبير الجيني تسيطر الإيقاعية (الشكل 2A)، وذلك تمشيا مع الفترة نشرت تحليلها من قبل مستقر التعبير المعدلة وراثيا على مدار الساعة الانارة علامات 2،9. فترة التذبذبات الإيقاعية في جبلة مجردة من متحولة ZTL هي أطول مما كانت عليه في النوع البري (الشكل 2B)، وفقا للنتائج التي نشرت في وقت سابق من الشتلات، تعليق خلية cultuالدقة وجبلة مجردة 19،23،25.

overexpression من CCA1 تأمين على مدار الساعة في الصباح المرحلة والنسخ العالمي يصبح عدم اتساق نبضات القلب 24. باستمرار، لاحظنا أي تقلبات في CCA1pro: لوك التعبير في جبلة مجردة -OX CCA1 (الشكل 2C).

الشكل 2
الشكل 2: البروتوبلازم ايقاعات كل يوم جبلة مجردة من زملاؤه 0، cca1 / lhy، ZTL، وCCA1 -OX تحولت عابر مع CCA1pro: لوك بناء وتم تصوير إيقاعات الساعة البيولوجية في التألق على مدى 5 أيام (A - C). (د) تقديرات الفترة الإيقاعية على أساس آثار التلألؤ في العقيد -0، cca1 / lhy وZTL (A - B). أناو± SEM، ن = 3-5، اختبار t ع القيمة كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ZTL
الطراز العرقى الفترة (جبلة مجردة) الفترة (المعدلة وراثيا) تم عمل تقرير بواسطة: المراجع
زملاؤه 0 23.0 ± 0.21 24.4 ± 0.09 pCCA1: لوك في العقيد -0 (2)
cca1 / lhy 20.6 ± 0.13 19.9 ± 0.11 pCCA1: لوك في العقيد -0 (2)
~ 18 الحمض النووي الريبي في L إيه الخلفية (9)
25.1 ± 0.12 27.4 ± 0.5 CAB2: لوك في C24 نوع إيكولوجي (22)
CCA1 -OX عدم اتساق نبضات القلب عدم اتساق نبضات القلب pCCA1: لوك (بيانات دينار فقط) (2)
عدم اتساق نبضات القلب RNA والبروتين في الخلفية العقيد -0 (23)

الجدول 2: إيقاعات الساعة البيولوجية في جبلة مجردة مقارنة المعدلة وراثيا الشتلات فترة الإيقاعية من pCCA1: لوك التعبير في جبلة مجردة مقارنة مع أطوال فترة لاول مرة للطفرة، وإذا كان متوفرا، مع pCCA1: لوك التعبير في العقيد -0.

Discussion

هنا، نقدم الفحص السريع للكشف عيوب فترة الإيقاعية في خطوط نبات الأرابيدوبسيس، بما في ذلك عزل البروتوبلازم، ترنسفكأيشن، والتصوير luminecent. فترة الإيقاعية في البرية من نوع نبات الأرابيدوبسيس وعلى مدار الساعة المسوخ cca1 / lhy، ZTL، وكان يحسب CCA1 -OX من القياسات من التألق من CCA1pro: المراسل لوك وجدت لتكون متسقة مع البيانات المنشورة الناتجة من النباتات الكاملة باستخدام أكثر قت- تستهلك النهج المعدلة وراثيا (الجدول 2). استخدام هذا الاختبار لفحص المسوخ نبات الأرابيدوبسيس يتجنب الشرط الأولي لتوليد خطوط الانارة المعدلة وراثيا، والتي تستغرق وقتا طويلا، وربما تكشف إلا أن المسخ بعينه المعارض من النوع البري الإيقاعات. وهناك ميزة واضحة من هذا البروتوكول هو أن أي خط نبات الأرابيدوبسيس يمكن فحص في وقت قصير لإيقاعات الساعة البيولوجية النسخي المتغيرة، الأمر الذي سيساعد على تحديد المزيد من الجينات التي تؤثر على ضبط الوقت في النباتات.

= "jove_content"> عزل جبلة مجردة يمكن أن يكون شاقة، خاصة إذا تعرض خط متحولة النمط الظاهري تتضاءل. أساليب ذكرت سابقا لتوليد جبلة مجردة تشمل قطع الأوراق أو الشتلات إلى شرائح رقيقة وفراغ التسلل إلى قطاع غزة مع حل الانزيم للسماح للأنزيمات لتصل إلى جدران الخلايا 26،27. عملية الهضم لاحق يتطلب على الأقل 3 ساعة حضانة في الظلام للافراج عن جبلة مجردة في حل الانزيم. عندما لا يتم تطبيق تسلل الفراغ، وينصح حضانة زمنية تصل إلى 18 ساعة. في بروتوكول المعروضة هنا، فراغ تسلل غير ضروري لأن إزالة طبقة الخلايا البشرة منيع لالانزيمات التي كتبها الشريط. عند إنشاء جبلة مجردة عن طريق خفض المواد النباتية من الضروري جبلة مجردة منفصلة عن الحطام جدار الخلية بعد الهضم. ويتم ذلك عادة من خلال تصفية حل أو مطهرا إياها على 27،26 السكر التدرج. هنا، سوف يبقى أي نوع من الأنسجة غير المهضومة على الشريط الأوتوكلاف بعدالهضم، لذلك الترشيح والسكر التدرج تنقية جبلة مجردة يمكن حذفها. هناك فرصة أن الإجهاد الناجم عن الإجراءات protoplasting طويلة يؤثر على بقاء الخلية والساعة اليومية. على شريط القائمة على طريقة protoplasting 20 تصور هنا ينتج عددا كبيرا من جبلة مجردة. ونظرا لبقاء الخلايا على سلسلة زمنية الإيقاعية وأطوال فترة المطابقة من جبلة مجردة والشتلات كاملة (الجدول 2)، ويفضل المنهجية الواردة هنا على طرق بديلة لتوليد جبلة مجردة.

الخطوة ترنسفكأيشن من البروتوكول هو خطوة حاسمة تؤثر على صلاحية جبلة مجردة. الحل PEG تمكن الحمض النووي ليتم تسليمها إلى داخل الخلية، وكلاهما فترة حضانة في هذا الحل (الخطوة 3.4) ونسبة الربط يجب أن تحدد تجريبيا. التركيز هو معيار 20٪، مع تركيز أقل التقليل من كفاءة التحول وأعلىتركيزات الحد من قابلية 28. فترة حضانة قصيرة بقدر خمس دقائق يمكن أن تسفر ترنسفكأيشن كفاءة من جبلة مجردة 27.

في جبلة مجردة يمكن تصويرها على أي منصة الانارة التصوير. في هذا الفيديو، وقد استخدمنا قارئ لوحة التلألؤ مجهزة أضواء الخارجية (أحمر وأزرق المصابيح، 630 و 470 نانومتر، على التوالي، في شدة مجتمعة ~ 20 μE)، والذي يسمح لفحص عالية الإنتاجية وقياسات متكررة. غيرها من معدات التصوير التي يكشف التلألؤ، مثل القراء لوحة بديلة أو الاجهزة التي تدور حول جهاز (CCD) وكاميرا مزدوجة الشحن، ويمكن تطبيق جيد على قدم المساواة طالما الإضاءة المتاحة لعملية التمثيل الضوئي. وميزة استخدام كاميرا CCD التي شنت على الحكومة السيطرة عليها هي أن الضوء ويمكن برمجتها درجة الحرارة. والعيب هو الوقت التقاط أطول، وإدخال فترات طويلة من الظلام الذي يمكن أن يسبب الضغط على جبلة مجردة بالإضافة إلى التشويشجي ضبط الوقت الذاتية. بغض النظر عن أي منصة التجريبية التي يتم اختيارها، ومن المرجح أن تكون ضرورية بالمقارنة مع إعدادات لشتلات أو النباتات الناضجة تعديل الإعدادات. في تجربتنا، وزيادة تركيز البلازميد مراسل أثناء ترنسفكأيشن و / أو وسيفيرين في المخزن المؤقت التصوير قد حل أي إيقاعات عدم انتظام أو الملطف بسرعة التي قد تحدث في التجارب الأولية.

في التجارب المستقبلية، يمكن تطبيق منهجية الموصوفة هنا لدراسة النمط الظاهري الساعة البيولوجية من أي خط نبات الأرابيدوبسيس متحولة. مع تعديلات طفيفة، وتأثير مختلف انواع المخدرات على سبيل المثال على ضبط الوقت يمكن دراسة في هذا الإعداد. وعلاوة على ذلك، فإن ترنسفكأيشن يمكن تعديلها لتشمل الرنا الميكروي الاصطناعي لجين إسكات 19، زيادة توسيع براعة هذا البروتوكول. و-راسخة بروتوكولات لتوليد جبلة مجردة الأرز (29) وبروتوكول التصوير المقدمة هنا يمكن بنفس القدر أن تطبق لتعزيز موقعنا شnderstanding على مدار الساعة في النباتات ذات الأهمية الاقتصادية للمحاصيل monocot.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9, (6), 1003370 (2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6, (10), 26968 (2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309, (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9, (8), 130 (2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14, (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2, (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44, (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158, (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22, (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21, (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6, (11), e1001201 (2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283, (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154, (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4, (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6, (424), 424 (2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101, (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93, (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2, (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217, (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7, (1), 30 (2011).
تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).More

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter