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Biology

एक luminescent घड़ी रिपोर्टर के साथ Arabidopsis Protoplasts ट्रांसफ़ेक्ट में circadian phenotypes के तेजी से विश्लेषण

doi: 10.3791/54586 Published: September 17, 2016

Summary

circadian घड़ी Arabidopsis transcriptome की एक तिहाई के बारे में नियंत्रित करता है, लेकिन जीनों का प्रतिशत है कि timekeeping में वापस खिलाओ अनजान बनी हुई है। यहाँ हम एक विधि कल्पना तेजी से एक circadian संवाददाता क्षणिक मूलतत्त्वों में व्यक्त की luminescent इमेजिंग का उपयोग Arabidopsis के किसी भी उत्परिवर्ती लाइन में circadian phenotypes आकलन करने के लिए।

Introduction

अधिकांश रहने वाले जीवों में पर्यावरण के लिए दैनिक परिवर्तन की कुशल बातचीत सहायता करने के लिए एक अंतर्जात टाइमकीपर के पास है। इस टाइमकीपर, circadian घड़ी, बाहरी वातावरण में उम्मीद के मुताबिक परिवर्तन की आशा चयापचय और एक जीव के शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं को नियंत्रित करता है। उदाहरण के लिए पौधों में, अस्थायी उम्मीद के मुताबिक रोगज़नक़ या शाकाहारी हमलों की प्रत्याशा दृढ़ता से समग्र संवेदनशीलता कम कर देता है 1 - 4। स्टार्च चयापचय कसकर circadian घड़ी द्वारा विनियमित है पिछले सुनिश्चित करने के लिए कि स्टार्च भंडार सुबह तक कि क्या लंबे या छोटे दिन शर्तों 5 से बढ़ी। दरअसल, 24 घंटा पर्यावरण शो वृद्धि की विकास दर मिलान circadian घड़ियों के साथ पौधों, कार्बन स्थिरीकरण दरों में और जीवित रहने की दरों बेमेल अवधि 6 के एक घड़ी चल पौधों की तुलना में। इन सभी प्रक्रियाओं में circadian लय का व्यापक प्रभाव एक तिहाई तक की लयबद्ध विनियमन से काफी हद तक उठताArabidopsis 7 में कुल transcriptome की। ये लयबद्ध जीन उत्पादों चयापचय मार्ग, हार्मोन संकेतन, और तनाव प्रतिक्रियाओं 7 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक व्यापक श्रेणी में शामिल कर रहे हैं। उस के शीर्ष पर, प्रोटीन समारोह का सीधा circadian विनियमन फोस्फोराइलेशन 8 के circadian विनियमन और सबसे शायद अन्य के बाद translational संशोधनों (PTMs) द्वारा स्थापित है।

Circadian घड़ी है कि इस दैनिक ट्रांसक्रिप्शनल reprogramming ड्राइव के केंद्र में ट्रांसक्रिप्शनल के एक नेटवर्क / translational प्रतिक्रिया छोरों (TTFLs), सुबह-व्यक्त जीनों सहित निहित है circadian घड़ी एसोसिएटेड 1 (CCA1) और देर लम्बी hypocotyl (LHY) उस अभिव्यक्ति को दबाने - 11 लक्स ARRHYTHMO (लक्स), जल्दी फूल 3 (ELF3), और ELF4 9; कैब 1 (TOC1), gigantea (सैनिक) और शाम जटिल (ईसी) के सदस्यों की शाम जीन समय की। साथ में बुद्धिज PSEUDO प्रतिक्रिया नियामक -genes (PRR3, 5, 7, और 9), TOC1 CCA1 / LHY अभिव्यक्ति represses जबकि चुनाव आयोग एक सकारात्मक नियामक 12 के रूप में कार्य - 14। TTFL नेटवर्क घटक की, प्रतिक्रिया तंत्र के लिए अतिरिक्त के बाद ट्रांसक्रिप्शनल और बाद translational विनियमन ट्यूनिंग circadian लय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आज की तारीख में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन पर PTM circadian घड़ी की पहचान फोस्फोराइलेशन 15 है। कैसिइन Kinase 2 (CK2) द्वारा CCA1 के फोस्फोराइलेशन उसके प्रवर्तकों 16 निशाना बनाने के लिए बाध्यकारी और circadian घड़ी 17 के तापमान को मुआवजे के लिए महत्वपूर्ण है को प्रभावित करता है। PRR प्रोटीन विभिन्न circadian चक्र से अधिक phosphorylated रहे हैं, और TOC1 के फोस्फोराइलेशन इसके नकारात्मक नियामक के साथ बातचीत को प्रभावित करता है, शाम को चरणबद्ध घड़ी घटक ZEITLUPE (ZTL) 18। इन उदाहरणों वर्णन कैसे PTMs और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत धुन TTFL नेटवर्क एक 24 घंटे की मेंट्रांसक्रिप्शनल थरथरानवाला। ट्रांसक्रिप्शनल घड़ी नेटवर्क और इसके नियमन के लिए एक अधिक विस्तृत परिचय के लिए, उत्कृष्ट हाल ही में समीक्षा (जैसे संदर्भ 15) उपलब्ध हैं।

लेकिन, क्या कम स्पष्ट रहता है किस हद तक ताल विनियमित प्रक्रियाओं और सेलुलर चयापचय के अन्य पहलुओं timekeeping तंत्र ही में वापस खिलाने के लिए है। घड़ी दोष के लिए Arabidopsis म्यूटेंट के व्यापक प्रदर्शन आगे समझने की जो तंत्र या संकेत दे रास्ते एक TTFL नेटवर्क से 24 घंटा लय की पीढ़ी में शामिल किया जा सकता हासिल कर सकता है। यह अंत करने के लिए, किम और सोमर्स पहले प्रकाशित किसी भी Arabidopsis लाइन 19 में घड़ी समारोह के कुशल और तेजी से विश्लेषण के लिए एक ब्रेक के माध्यम से विधि। मूलतत्त्वों में क्षणिक अभिव्यक्ति के उपयोग पर आधारित, इस पद्धति स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए जरूरत से बढ़कर है या luminescent घड़ी मार्कर लाइनों को पार करती है। यहाँ, हम एक उच्च उपज मूलतत्त्व isolatio कल्पनाn विधि 20 एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली रीडर में क्षणिक व्यक्त की घड़ी मार्करों के luminescent इमेजिंग द्वारा circadian दोष स्क्रीन करने के लिए।

हम कार्यप्रणाली यहाँ सफलतापूर्वक वर्णित बदल circadian लय का पता लगाता पुष्टि करने के लिए अच्छी तरह से विशेषता घड़ी म्यूटेंट को जंगली प्रकार के सहयोगी 0 Arabidopsis की तुलना करेंगे। ल्यूक 19: CCA1pro, इन लाइनों से निकाली गई Protoplasts एक संवाददाता का निर्माण कि circadian CCA1 प्रमोटर से जुगनू luciferase व्यक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। Luciferase multistep प्रतिक्रिया जिसमें luciferin इलेक्ट्रॉनिक रूप में उत्साहित करने के लिए बदल जाती है oxyluciferin कि प्रकाश 21 उत्सर्जन करता है, जो इन मूलतत्त्वों में अवधि, आयाम और ट्रांसक्रिप्शनल लय के चरण का आकलन करने के लिए समय के साथ imaged है उत्प्रेरित।

प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख भागों के होते हैं; मूलतत्त्वों को अलग-थलग, संवाददाता प्लाज्मिड, और luminescent आईएम के साथ protoplasts परासंक्रमितउम्र बढ़ने। इन तीन भागों हमेशा हौसले से तैयार buffers और अभिकर्मकों का उपयोग कर एक ही दिन पर किया जाना चाहिए। संयंत्र के विकास और रिपोर्टर प्लाज्मिड की पर्याप्त मात्रा की शुद्धि के लिए अग्रिम में किया जाना चाहिए और इस प्रोटोकॉल में कल्पना नहीं कर रहे हैं।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में, अभिकर्मकों और मात्रा वर्णित Arabidopsis लाइन है कि परीक्षण किया है प्रति व्यक्त कर रहे हैं, और यह कि जीनोटाइप के लिए छह को दोहराने के कुओं में परिणाम होगा। जब एक से अधिक लाइन का विश्लेषण विश्लेषण किया जा लाइनों की संख्या के साथ सामग्री गुणा करें। वीडियो में, जंगली प्रकार Arabidopsis circadian घड़ी उत्परिवर्ती लाइन ZTL की तुलना में किया जाएगा (हालांकि अतिरिक्त लाइनों से प्रतिनिधि परिणाम बाद में प्रदान किया जाएगा)।

एंजाइम समाधान
Cellulase 0.5% (w / v)
pectinase R10 0.25% (w / v)
डी-mannitol 400 मिमी
2 CaCl 10 मिमी
KCl 20 मिमी
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 0.1% (w / v)
एमईएस, पीएच 5.7 20 मिमी
W5 समाधान
NaCl 150 मिमी
2 CaCl 125 मिमी
KCl 5 मिमी
एमईएस, पीएच 5.7 2 मिमी
शर्करा 5 मिमी
एमएमजी समाधान
एमईएस, पीएच 5.7 4 मिमी
डी-mannitol 400 मिमी
2 MgCl 15 मिमी
खूंटी समाधान
PEG4000 40% (w / v)
डी-mannitol 200 मिमी
2 CaCl 100 मिमी
इमेजिंग समाधान
W5 समाधान अंतिम मात्रा
भ्रूण गोजातीय सीरम 5% (वी / वी)
luciferin 1.2 मिमी
एम्पीसिलीन 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर

तालिका 1: समाधान की सूची।

1. सामग्री और बफ़र की तैयारी

  1. संयंत्र सामग्री
    1. Arabidopsis कर्नल चार दिनों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें -0 पानी में बीज। एक बर्तन में मिट्टी पर बीज पिपेट और 7 दिनों के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर लंबे दिन की स्थिति (16 घंटा प्रकाश 8 घंटा अंधेरे) के लिए स्थानांतरण। पहले तीन दिन के लिए बर्तन पर एक ढक्कन छोड़ दो उच्च आर्द्रता सुनिश्चित करने के लिए। प्रत्यारोपण एक नया 8 सेमी x 13 सेमी एक्स 5 सेमी बर्तन को छह पौध और anoth के लिए एक ही परिस्थितियों में पौधों बढ़ती जारी21 दिन इंजी। सुनिश्चित करें कि मिट्टी भर नम है सुनिश्चित करें।
  2. रिपोर्टर प्लाज्मिड
    1. अग्रिम में जीवाणु संस्कृति से ल्यूक संवाददाता प्लाज्मिड 19, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डीएनए अलगाव किट का उपयोग: CCA1pro शुद्ध।
      नोट: 20 माइक्रोग्राम संवाददाता प्लाज्मिड एक अभिकर्मक के लिए (2 माइक्रोग्राम / में DH 2 हे μl में 10 μl) की आवश्यकता है।
  3. समाधान की
    नोट: इस प्रोटोकॉल पांच समाधान की जरूरत है के लिए: एंजाइम समाधान, धो 5 (W5) समाधान, mannitol-मैग्नीशियम (एमएमजी) समाधान, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) समाधान, और इमेजिंग समाधान (1 टेबल)। मूलतत्त्व अलगाव कदम के लिए जारी रखने से पहले इन तैयार करें।
    1. प्रति 1 टेबल के रूप में एंजाइम समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी एंजाइमों पिछले जोड़ने, और फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान बाँझ।
    2. निम्न मात्रा में शेष समाधान तैयार: 15 मिलीलीटर W5 समाधान, 10 मिलीलीटर एमएमजी रोंolution, 1 मिलीलीटर खूंटी समाधान और प्रति 1 टेबल के रूप में 1.5 मिलीलीटर इमेजिंग समाधान।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि खूंटी समाधान भी कम नहीं सुनिश्चित करने के लिए कि खूंटी पूरी तरह से भंग कर दिया है तैयार किया जाता है अभिकर्मक से पहले एक मानव संसाधन की तुलना में। फ़िल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से इमेजिंग समाधान बाँझ।

आकृति 1

चित्रा 1:। मूलतत्त्व अलगाव वयस्क Arabidopsis पौधों (ए) की पत्तियों कम एपिडर्मल परत (बी) के साथ सामना करना पड़ रहा आटोक्लेव टेप पर तय कर रहे हैं। (सी) जादू टेप धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब की नोक से कम एपिडर्मल परत पर दबाया जाता है। (डी) जादू टेप पर्णमध्यक कोशिकाओं (ई) को बेनकाब करने के लिए निकाल दिया जाता है। (एफ) छुट्टी के साथ आटोक्लेव टेप की स्ट्रिप्ससंलग्न रों एंजाइम समाधान Cellulase और pectinase युक्त पर जारी किया जाता है, समाधान में protoplasts रिहा। (G) पत्ती कंकाल एंजाइम पाचन के बाद आटोक्लेव टेप पर बने हुए हैं और खारिज कर रहे हैं, एंजाइम समाधान (ज) में protoplasts जा रही है। (आई) के अंतिम परिणामस्वरूप पर्णमध्यक protoplasts (स्केल बार = 50 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. मूलतत्त्व अलगाव

  1. एक पेट्री डिश लेबल और 10 मिलीलीटर फिल्टर निष्फल एंजाइम समाधान जोड़ें।
  2. एक साफ प्रयोगशाला सतह पर चिपचिपा पक्ष के साथ आटोक्लेव टेप के चार स्ट्रिप्स फिक्स, और स्ट्रिप्स पर पेट्री डिश के आकार के निशान।
  3. 4 सप्ताह पुराने पौधों (चित्रा 1 ए) के पत्तियों में कटौती, और ऊपरी एपिडर्मिस सामना करना पड़ रहा निचले एपिडर्मल सतह यानी (आटोक्लेव टेप पर प्रेस (
  4. धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग कम एपिडर्मल सतह पर जादू टेप के स्ट्रिप्स दबाएँ। देखभाल पत्ता ऊतक (चित्रा -1 सी) को कुचलने के लिए नहीं ले लो। ध्यान से निचले एपिडर्मिस पट्टी करने के लिए जादू टेप पुल बंद (चित्रा -1) और पर्णमध्यक कोशिकाओं (चित्रा 1E) को बेनकाब।
  5. आटोक्लेव टेप में कटौती पेट्री डिश में टेप के लिए कदम और एंजाइम समाधान (चित्रा 1F) पर तैरने लगते हैं, पेट्री डिश फिट करने के लिए उपयोग चिमटी, नीचे का सामना करना पड़ छोड़ देता है। 60 मिनट, जिसके दौरान protoplasts समाधान में जारी किया जाएगा के लिए एक मंच प्रकार के बरतन पर 60 rpm पर घुमाएँ।
  6. चिमटी का प्रयोग एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हटाने और आटोक्लेव टेप (चित्रा 1G) के स्ट्रिप्स त्यागने और पिपेट का हल protoplasts (चित्रा 1 के) युक्त। एक विस्तृत बोर विंदुक टिप (जैसे एक P5000 टिप या अंत के साथ एक P1000 टिप काट) का प्रयोग करें।
  7. पर 100 x protoplasts अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए जी और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ख्याल रखना, के रूप में गोली बहुत ढीली है।
  8. धीरे ट्यूब घूमता द्वारा मूलतत्त्वों को 10 मिलीलीटर W5 समाधान और resuspend जोड़ें।
  9. 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर protoplasts आराम करें। इस कदम के दौरान, एक hemocytometer (चित्रा 1 मैं) में protoplasts की गणना के द्वारा उपज का आकलन करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 100 x जी पर centrifugation द्वारा मूलतत्त्वों लीजिए और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ख्याल रखना, के रूप में गोली बहुत ढीली है।
  11. एमएमजी समाधान में 5 एक्स 10 5 protoplasts / एमएल की एकाग्रता के लिए protoplasts Resuspend।

3. मूलतत्त्व अभिकर्मक

  1. 10 μl संवाददाता प्लाज्मिड (2 माइक्रोग्राम / μl) एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़े।
  2. ट्यूब के लिए 400 μl protoplasts जोड़ें।
  3. एक मात्रा (410 μl) खूंटी समाधान जोड़ें और protoplasts transfect करने के लिए धीरे ट्यूब inverting 12 बार द्वारा मिश्रण।
  4. बाद 8-15 मिनट इंककमरे के तापमान पर ubation, चार खंडों (1640 μl) W5 समाधान के साथ मूलतत्त्व डीएनए खूंटी मिश्रण पतला और धीरे से छह बार inverting द्वारा मिश्रण।
  5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट protoplasts लीजिए और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक बार फिर, देखभाल के रूप में गोली बहुत ढीली है।
  6. 1,250 μl इमेजिंग समाधान में protoplasts Resuspend।
  7. अशेष 200 छह में μl एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं को दोहराने, W5 समाधान के साथ किसी भी खाली कुओं को भरने, और चिपकने वाला एक स्पष्ट luminescent इमेजिंग के लिए उपयुक्त ढक्कन के साथ थाली सील।

4. इमेजिंग

  1. किसी भी luminescent इमेजिंग संयंत्र इमेजिंग के लिए उपयुक्त सेटअप करने के लिए थाली हस्तांतरण। हस्तांतरण के बाद प्लेटों 10-15 मिनट पर चिपकने पलकों बदले कुओं के बीच संक्षेपण और दबाव मतभेद से बचने के लिए, तो इमेजिंग शुरू करते हैं। प्लेट पढ़ें कमरे के तापमान पर पांच दिनों के लिए हर ~ 45 मिनट (प्रति अच्छी तरह से 3 सेकंड)।
    ध्यान देंप्लेट की आवृत्ति को पढ़ता है और अच्छी तरह से प्रति पढ़ें समय इमेजिंग सेटअप के आधार पर भिन्न हो सकता है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. किसी भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, जैविक लय विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रणाली (पीतल) 22) का उपयोग luminescence परिणामों का विश्लेषण। जंगली प्रकार नियंत्रण करने के लिए उत्परिवर्ती लाइन की तुलना circadian दोषों को प्रकट करने के लिए।

Representative Results

जंगली प्रकार Arabidopsis की Protoplasts जाना जाता घड़ी म्यूटेंट cca1 / LHY (छोटी अवधि के उत्परिवर्ती 2), ZTL (लंबी अवधि उत्परिवर्ती 23), और overexpression लाइन CCA1 -OX (arrhythmic 24) की तुलना में थे। सभी क्षणिक CCA1pro साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया: ल्यूक रिपोर्टर और 5 दिनों में एक प्लेट रीडर पर लगातार प्रकाश में imaged।

यहां हम बताते हैं कि cca1 / LHY उत्परिवर्ती में, circadian नियंत्रित जीन अभिव्यक्ति की मुक्त चल अवधि luminescent घड़ी के स्थिर ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति मार्करों 2,9 द्वारा विश्लेषण प्रकाशित की अवधि के साथ, छोटा है लाइन में (चित्रा 2A)। ZTL उत्परिवर्ती की मूलतत्त्वों में circadian दोलनों की अवधि जंगली प्रकार की तुलना में लंबे समय तक है (चित्रा 2 बी), अंकुर से पहले प्रकाशित परिणामों के अनुसार, सेल निलंबन cultuरेस और protoplasts 19,23,25।

CCA1 की overexpression सुबह चरण में घड़ी ताले और वैश्विक प्रतिलेखन arrhythmic 24 हो जाता है। CCA1 -OX protoplasts (चित्रा 2 सी) में ल्यूक अभिव्यक्ति: लगातार, हम CCA1pro में कोई दोलनों मनाया।

चित्र 2
चित्रा 2: मूलतत्त्व circadian लय सहयोगी 0, cca1 / LHY, ZTL, और CCA1 की Protoplasts -OX क्षणिक CCA1pro के साथ बदल गया: ल्यूक का निर्माण और luminescence में circadian लय 5 दिनों में imaged थे (एक - सी)। (डी) Circadian अवधि कर्नल -0, cca1 / LHY और ZTL में luminescence निशान के आधार पर अनुमान (ए - बी)। मैंएक ± SEM, एन = 3-5, टी परीक्षण पी मूल्य के रूप में संकेत दिया। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

ZTL
जीनोटाइप अवधि (protoplasts) अवधि (ट्रांसजेनिक) रिपोर्ट द्वारा: संदर्भ
सहयोगी 0 23.0 ± 0.21 24.4 ± 0.09 pCCA1: कर्नल में ल्यूक -0 (2)
cca1 / LHY 20.6 ± 0.13 19.9 ± 0.11 pCCA1: कर्नल में ल्यूक -0 (2)
~ 18 एल एर पृष्ठभूमि में शाही सेना (9)
25.1 ± 0.12 27.4 ± 0.5 CAB2: C24 ecotype में ल्यूक (22)
CCA1 -OX arrhythmic arrhythmic pCCA1: ल्यूक (एलडी डेटा केवल) (2)
arrhythmic शाही सेना और कर्नल -0 पृष्ठभूमि में प्रोटीन (23)

तालिका 2: Protoplasts में circadian लय ट्रांसजेनिक Seedlings की तुलना में pCCA1 के circadian अवधि:। अवधि लंबाई पहले उत्परिवर्तन के लिए सूचना और, यदि उपलब्ध है के साथ तुलना में मूलतत्त्वों में ल्यूक अभिव्यक्ति, pCCA1 के साथ: कर्नल -0 में ल्यूक अभिव्यक्ति।

Discussion

यहाँ, हम Arabidopsis लाइनों में circadian अवधि दोष, मूलतत्त्व अलगाव, अभिकर्मक, और luminecent इमेजिंग सहित स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से परख प्रस्तुत करते हैं। जंगली प्रकार में circadian अवधि Arabidopsis और घड़ी म्यूटेंट cca1 / LHY, ZTL, और CCA1 -OX एक CCA1pro से luminescence के माप से गणना की गई: ल्यूक रिपोर्टर और अधिक समय का उपयोग करते हुए पूरे पौधों से उत्पन्न प्रकाशित आंकड़ों के साथ लगातार हो पाया ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण लेने वाली (तालिका 2)। Arabidopsis म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए इस परख का प्रयोग ट्रांसजेनिक luminescent लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है, जो समय लगता है और केवल प्रकट हो सकता है कि एक विशेष उत्परिवर्ती जंगली प्रकार लय दर्शाती बचा जाता है। इस प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट लाभ यह है कि किसी भी Arabidopsis लाइन बदल circadian लय ट्रांसक्रिप्शनल, जो अधिक पौधों में timekeeping प्रभावित करने वाले जीन की पहचान में मदद मिलेगी के लिए कम समय में जांच की जा सकती है।

26,27 तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए में पत्ते या पौध काटने शामिल है। बाद में पाचन एंजाइम समाधान में protoplasts जारी करने के लिए अंधेरे में कम से कम 3 घंटा ऊष्मायन की आवश्यकता है। जब वैक्यूम घुसपैठ लागू नहीं है, 18 घंटा के लिए ऊष्मायन समय को सलाह दी जाती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, वैक्यूम घुसपैठ अनावश्यक क्योंकि एपिडर्मल सेल एंजाइमों को अभेद्य परत टेप द्वारा हटा दिया जाता है। जब संयंत्र सामग्री काटने से protoplasts पैदा यह पाचन के बाद सेल की दीवार के मलबे से अलग protoplasts के लिए आवश्यक है; यह आम तौर पर समाधान छानने या एक चीनी ढाल 27,26 पर यह सफ़ाई के द्वारा किया जाता है। इधर, किसी भी पचाया नहीं ऊतक आटोक्लेव टेप के बाद पर रहेगापाचन, इसलिए निस्पंदन और चीनी protoplasts की ढाल शुद्धि छोड़ा जा सकता है। वहाँ है कि तनाव लंबे समय तक protoplasting प्रक्रियाओं से उत्पन्न सेल व्यवहार्यता और circadian घड़ी को प्रभावित करता है एक मौका है। टेप आधारित protoplasting विधि यहाँ 20 से कल्पना protoplasts के एक उच्च संख्या पैदावार; और एक circadian समय श्रृंखला पर कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिया और protoplasts और पूरे पौध (तालिका 2) के मिलान की अवधि लंबाई, यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली वैकल्पिक तरीकों से अधिक पसंद है protoplasts उत्पन्न करते हैं।

प्रोटोकॉल के अभिकर्मक कदम के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है कि protoplasts की व्यवहार्यता पर प्रभाव डालता है। खूंटी समाधान (3.4 कदम) इस समाधान में डीएनए सेल में वितरित किया जाना है, और दोनों ऊष्मायन समय और खूंटी का प्रतिशत अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए सक्षम बनाता है। मानक एकाग्रता, 20% है कम सांद्रता परिवर्तन दक्षता और उच्च कम करने के साथसांद्रता व्यवहार्यता 28 को कम करने। ऊष्मायन समय पांच मिनट के रूप में के रूप में कम protoplasts 27 के कुशल अभिकर्मक उपज सकता है।

protoplasts किसी भी luminescent इमेजिंग मंच पर imaged किया जा सकता है। इस वीडियो में, हम, जो उच्च throughput प्रदर्शन और लगातार मापन के लिए अनुमति देता है (~ 20 μE की एक संयुक्त तीव्रता पर लाल और नीले रंग के एल ई डी, 630 और 470 एनएम, क्रमश) एक luminescence प्लेट बाहरी रोशनी से सुसज्जित पाठक का इस्तेमाल किया है। अन्य इमेजिंग उपकरणों, इस तरह के विकल्प प्लेट पाठकों या setups के एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा के आसपास आधारित रूप में है कि luminescence का पता लगाता है, लंबे समय के रूप में अच्छी तरह से समान रूप से लागू किया जा सकता है के रूप रोशनी प्रकाश संश्लेषण के लिए उपलब्ध है। एक सीसीडी कैमरा एक चलाया कैबिनेट पर घुड़सवार का उपयोग करने का लाभ यह है कि प्रकाश है और तापमान प्रोग्राम किया जा सकता है। एक नुकसान यह है, अब समय आ गया है पर कब्जा अंधेरे की लंबी अवधि है कि उपद्रव के अलावा protoplasts के लिए तनाव का कारण बन सकता है शुरूअंतर्जात timekeeping हैैं। की जो प्रयोगात्मक मंच चुना जाता है भले ही, सेटिंग्स का समायोजन पौध या परिपक्व पौधों के लिए सेटिंग्स की तुलना में आवश्यक होने की संभावना है। हमारे अनुभव में, अभिकर्मक और / या इमेजिंग बफर में luciferin के दौरान संवाददाता प्लाज्मिड की सांद्रता बढ़ रही किसी भी अनियमित या जल्दी कमी लाने लय कि प्रारंभिक प्रयोगों में हो सकता है हल हो सकता है।

भविष्य प्रयोगों में, कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित किसी भी उत्परिवर्ती Arabidopsis लाइन के circadian phenotype अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। मामूली संशोधनों के साथ, timekeeping पर जैसे विभिन्न दवाओं का असर इस सेटअप में अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, अभिकर्मक, जीन मुंह बंद 19 के लिए कृत्रिम microRNA शामिल करने के लिए आगे इस प्रोटोकॉल के बहुमुखी प्रतिभा के विस्तार के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल चावल protoplasts उत्पन्न करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं 29 और यहाँ प्रस्तुत इमेजिंग प्रोटोकॉल समान रूप से हमारे यू और आगे के लिए लागू किया जा सकताआर्थिक रूप से महत्वपूर्ण monocot फसल पौधों में घड़ी की nderstanding।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (12), 4674-4677 (2012).
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एक luminescent घड़ी रिपोर्टर के साथ Arabidopsis Protoplasts ट्रांसफ़ेक्ट में circadian phenotypes के तेजी से विश्लेषण
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Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).More

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).

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