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Biology

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

doi: 10.3791/54586 Published: September 17, 2016

Summary

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Introduction

La mayoría de los organismos vivos poseen un cronometrador endógeno para ayudar negociación eficiente de los cambios diarios en el medio ambiente. Este cronometrador, el reloj circadiano, regula muchos aspectos del metabolismo y la fisiología de un organismo para anticiparse a los cambios previsibles en el entorno externo. En las plantas, por ejemplo, la anticipación de los ataques de patógenos o herbívoros temporalmente predecibles reduce fuertemente la susceptibilidad general de 1 - 4. El metabolismo del almidón está estrechamente regulada por el reloj circadiano para asegurar que las reservas de almidón última hasta el amanecer si crecido en condiciones largas o cortas del día 5. De hecho, las plantas con los relojes circadianos que coinciden con los medio ambiente muestran un aumento de las tasas de crecimiento de 24 h, las tasas de fijación de carbono y las tasas de supervivencia en comparación con las plantas que ejecutan un reloj de tiempo coincidentes 6. La amplia influencia de los ritmos circadianos en todos estos procesos surge en gran medida de la regulación rítmica de hasta un terciodel transcriptoma total de 7 en Arabidopsis. Estos productos génicos rítmicos están involucrados en una amplia gama de procesos celulares, incluyendo las vías metabólicas, de señalización de la hormona, y las respuestas al estrés 7. Además de eso, la regulación circadiana directa de la función de las proteínas es establecido por la regulación circadiana de la fosforilación de 8 y más probablemente otras modificaciones post-traduccionales (PTM).

En el centro del reloj circadiano que impulsa esta reprogramación transcripcional diaria se encuentra una red de transcripción / retroalimentación de traslación bucles (TTFLs), incluyendo los genes de la mañana-expresado reloj circadiano ASOCIADOS 1 (CCA1) y tardía alargada hipocotilo (PGA) que reprimen la expresión genes de la noche MOMENTO dE CABINA 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) y los miembros del complejo de la tarde (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floración temprana 3 (ELF3), y ELF4 9-11. junto ingenioh los -genes REGULADOR DE PSEUDO de respuesta (PRR3, 5, 7 y 9), TOC1 reprime la expresión CCA1 / PGA mientras que la CE actúa como un regulador positivo 12 - 14. Adicional a los mecanismos de retroalimentación, post-transcripcional y post-translacional regulación de los componentes de la red TTFL juega un papel importante en el ajuste de los ritmos circadianos. Hasta la fecha, el PTM identificado más abundante en las proteínas del reloj circadiano es la fosforilación 15. La fosforilación de CCA1 por caseína quinasa 2 (CK2) afecta su unión a orientar promotores 16 y es importante para la compensación de temperatura del reloj circadiano de 17. Las proteínas PRR son fosforilados diferencialmente durante el ciclo circadiano, y la fosforilación de TOC1 afecta a la interacción con su regulador negativo, el componente de reloj Zeitlupe la tarde-etapas (ZTL) 18. Estos ejemplos ilustran cómo PTM y las interacciones proteína-proteína sintonizar la red TTFL en un 24 hroscilador transcripcional. Para una introducción más detallada a la red de reloj de la transcripción y su regulación, excelentes críticas recientes están disponibles (por ejemplo, referencia 15).

Sin embargo, lo que queda menos claro es el grado en que los procesos regulados rítmicamente y otros aspectos del metabolismo celular se alimentan de nuevo en el propio mecanismo de relojería. Revisión exhaustiva de los mutantes de Arabidopsis por defectos de reloj podría lograr una mejor comprensión de qué mecanismos o vías de señalización podrían estar involucrados en la generación de ritmos 24 hr desde una red TTFL. Con este fin, Kim y Somers publicados previamente un método de desintegración a través de para el análisis rápido y eficiente de las funciones de tiempo en cualquier línea de Arabidopsis 19. Basado en el uso de la expresión transitoria en protoplastos, esta metodología supera la necesidad de líneas transgénicas estables o cruza a las líneas de marca de ciclo luminiscentes. Aquí, visualizamos un alto rendimiento de protoplastos isolatiométodo n 20 combinado con un protocolo optimizado para la pantalla defectos circadianos por imágenes luminiscente de marcadores de reloj expresadas transitoriamente en un lector de placas de 96 pocillos.

Compararemos de tipo salvaje de Arabidopsis Col- 0 a mutantes de reloj bien caracterizados para confirmar la metodología descrita aquí con éxito detecta la alteración de los ritmos circadianos. Protoplastos derivados de estas líneas son transfectadas con un constructo indicador que expresa la luciferasa de luciérnaga a partir del promotor CCA1 circadiano; CCA1pro: LUC 19. Luciferasa cataliza la reacción de múltiples etapas en la que la luciferina se convierte en electrónicamente excitado oxiluciferina que emite luz 21, que es imaginada con el tiempo para evaluar el período, amplitud y fase de los ritmos de la transcripción en estos protoplastos.

El protocolo consta de tres partes principales; el aislamiento de los protoplastos, la transfección de los protoplastos con el plásmido reportero, y im luminiscenteenvejecimiento. Estas tres partes siempre deben realizarse en un solo día, utilizando tampones y reactivos recién preparados. crecimiento de las plantas y la purificación de cantidades suficientes de plásmido reportero deben realizarse por adelantado y no se visualizan en este protocolo.

Protocol

NOTA: En este protocolo, los reactivos y los volúmenes descritos se expresan por línea de Arabidopsis que se prueba, y dará lugar a seis pocillos replicados para que el genotipo. Multiplicar los materiales con el número de líneas que deben analizarse en el análisis de más de una línea. En el video, de tipo salvaje de Arabidopsis se comparará con el reloj circadiano ZTL línea mutante (aunque se proporcionarán los resultados representativos de las líneas adicionales posteriormente).

solución de la enzima
celulasa 0.5% (w / v)
pectinasa R10 0,25% (w / v)
D-manitol 400 mM
CaCl 2 10 mM
KCl 20 mM
Albúmina de suero bovino 0.1% (w / v)
MES, pH 5,7 20 mM
solución W5
NaCl 150 mM
CaCl 2 125 mM
KCl 5 mM
MES, pH 5,7 2 mM
Glucosa 5 mM
solución MMg
MES, pH 5,7 4 mM
D-manitol 400 mM
MgCl 2 15 mM
solución de PEG
PEG4000 40% (w / v)
D-manitol 200 mM
CaCl 2 100 mM
solución de imagen
solución W5 hasta el volumen final
Suero bovino fetal 5% (v / v)
luciferina 1,2 mM
ampicilina 50 mg / ml

Tabla 1: Lista de soluciones.

1. Preparación de Materiales y búferes

  1. Materiales de plantas
    1. Mantenga Arabidopsis Col -0 semillas en agua en un tubo de 1,5 ml a 4 ° C en la oscuridad durante cuatro días. Pipetear las semillas al suelo, goteo en una olla y transferir a las condiciones de día largo (16 horas de luz 8 h de oscuridad) a 21 ° C durante 7 días. Deja un tapa en la olla durante los tres primeros días para asegurar una alta humedad. Trasplante de plántulas de seis a una nueva olla de 8 cm x 13 cm x 5 cm y seguir creciendo las plantas en las mismas condiciones para another 21 días. Asegúrese de que el suelo está húmedo en todo momento.
  2. plásmido reportero
    1. Se purifica el CCA1pro: reportero plásmido LUC 19 de cultivo bacteriano con antelación, utilizando un kit de aislamiento de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Se requiere 20 mg plásmido indicador (10 l a 2 mg / l de dH 2 O) para una transfección.
  3. soluciones
    NOTA: Para este protocolo se necesitan cinco soluciones: Solución de la enzima, la solución de lavado 5 (W5) solución, manitol-magnesio (MMg), polietilenglicol (PEG) solución y solución de imágenes (Tabla 1). Preparar estos antes de pasar a la etapa de aislamiento de protoplastos.
    1. Preparar 10 ml de solución de enzima según la Tabla 1, la adición de las enzimas pasado, y el filtro de esterilizar la solución a través de un filtro de 0,22 micras jeringa.
    2. Preparar las soluciones restantes en los siguientes volúmenes: 15 ml de solución W5, 10 ml MMg slución, 1 ml de solución de PEG y solución de imagen de 1,5 ml según la Tabla 1.
      NOTA: Es importante que la solución de PEG se preparó no menos de una hora antes de la transfección para asegurar que el PEG se ha disuelto completamente. Filtro de esterilizar la solución de imagen a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.

Figura 1

Figura 1:. Aislamiento de protoplastos Las hojas de las plantas de Arabidopsis adultos (A) se fija en cinta de autoclave con la capa epidérmica inferior hacia arriba (B). (C) cinta mágica se presiona suavemente sobre la capa epidérmica inferior con la punta de un tubo cónico de 15 ml. (D) La cinta mágica se quita para exponer las células del mesófilo (E). (F) Las tiras de cinta de autoclave con licencias adjuntos están flotando en la solución de enzima que contiene celulasa y pectinasa, la liberación de protoplastos en la solución. (G) La hoja de esqueletos permanecen en la cinta autoclave después de la digestión enzimática y se descartan, dejando a los protoplastos en solución de enzima (H). (I) protoplastos de mesófilo resultantes finales (Barra de escala = 50 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Aislamiento de protoplastos

  1. Etiqueta de una placa de Petri y añadir 10 ml de solución de enzima esterilizada por filtración.
  2. Fijar cuatro tiras de cinta de autoclave con la cara adhesiva hacia arriba en una superficie de laboratorio limpia, y marcar el tamaño de la placa de Petri en las tiras.
  3. Cortar las hojas de 4 semanas de edad plantas (Figura 1a), y presione la epidermis superior a la cinta de autoclave (es decir, la superficie epidérmica inferior hacia arriba (
  4. Presione suavemente tiras de cinta mágica sobre la superficie epidérmica inferior utilizando un tubo cónico de 15 ml. Tenga cuidado de no aplastar el tejido de la hoja (Figura 1c). Tire con cuidado la cinta mágica fuera para despojar a la epidermis inferior (Figura 1d) y exponer las células del mesófilo (Figura 1e).
  5. Cortar la cinta de autoclave para adaptarse a la placa de Petri, utilizar pinzas para mover la cinta en la placa de Petri y flotar en la solución de enzima (Figura 1F), las hojas hacia abajo. Girar a 60 rpm en un agitador de plataforma durante 60 min, durante los cuales los protoplastos se liberan en la solución.
  6. Utilice pinzas para retirar y desechar las tiras de cinta de autoclave (Figura 1g) y pipeta de la solución que contiene los protoplastos (Figura 1h) en un tubo cónico de 50 ml. Utilice una punta de pipeta de gran calibre (tal como una punta P5000 o P1000 con una punta al final cortados).
  7. Centrifugar los protoplastos en 100 xg durante 3 min a 4 ° C y separar el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja.
  8. Añadir solución W5 10 ml a los protoplastos y resuspender girando suavemente el tubo.
  9. Descansar los protoplastos en hielo durante 30-60 min. Durante este paso, evaluar el rendimiento mediante el recuento de protoplastos en un hemocitómetro (Figura 1i).
  10. Recoger los protoplastos por centrifugación a 100 x g durante 3 min a 4 ° C y separar el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja.
  11. Resuspender los protoplastos a una concentración de 5 x 10 5 protoplastos / ml en solución MMg.

3. La transfección de protoplastos

  1. Añadir 10 l de plásmido reportero (2 g / l) a un tubo cónico de 15 ml.
  2. Añadir 400 protoplastos mu l al tubo.
  3. Añadir un volumen (410 l) y la solución de PEG mezclar invirtiendo el tubo suavemente 12 veces para transfectar los protoplastos.
  4. Después de 8-15 min incubation a temperatura ambiente, diluir la mezcla de protoplastos-DNA-PEG con cuatro volúmenes (1.640 l) de solución W5 y mezclar por inversión suave seis veces.
  5. Recoger los protoplastos transfectados por centrifugación a 100 xg durante 2 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante con una pipeta. Una vez más, tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja.
  6. Resuspender los protoplastos en la solución de formación de imágenes 1250 l.
  7. L alícuota de 200 en seis replican pocillos de una placa de 96 pocillos, llenar los pozos vacíos con solución W5, y sellar la placa con una tapa transparente adhesivo adecuado para la imagen luminiscente.

4. Imaging

  1. La transferencia de la placa para cualquier configuración de imagen luminiscente adecuado para la imagen de la planta. Cambiar las tapas adhesivas en las placas de 10-15 minutos después de la transferencia para evitar diferencias de presión de condensación y entre los pozos, a continuación, iniciar la imagen. Lea la placa de cada ~ 45 min (3 segundos por pocillo) durante cinco días a temperatura ambiente.
    Nota lafrecuencia de la placa lee y el tiempo de lectura por pozo podría variar dependiendo de la configuración de imagen.

Análisis 5. Datos

  1. Analizar los resultados de luminiscencia usando cualquier software de análisis (por ejemplo, Biological Rhythms Sistema de Software de Análisis (latón) 22). Comparación de la línea mutante de tipo salvaje controles para revelar defectos circadianos.

Representative Results

Los protoplastos de tipo salvaje de Arabidopsis se compararon con el reloj mutantes conocidos CCA1 / lhy (corto período mutante 2), ZTL (largo período mutante 23), y la línea de sobreexpresión CCA1 -OX (arrítmicos 24). Todos fueron transfectadas transitoriamente con el CCA1pro: reportero LUC y la imagen en luz constante en un lector de placas durante 5 días.

Aquí nos muestran que en el mutante CCA1 / lhy, el período de funcionamiento libre de la expresión génica-circadiano controlada se acorta (Figura 2a), de acuerdo con el período analizado publicada por la expresión transgénica estable de reloj de 2,9 luminiscentes marcadores. El período de las oscilaciones circadianas en protoplastos del mutante ZTL es más largo que en el tipo salvaje (Figura 2b), de acuerdo con los resultados publicados anteriormente de las plantas de semillero, la suspensión de células cultures y protoplastos 19,23,25.

La sobreexpresión de CCA1 bloquea el reloj en la mañana de fase y la transcripción global se vuelve arrítmico 24. Consistentemente, se observó que no oscilaciones en CCA1pro: LUC expresión en protoplastos -oX CCA1 (Figura 2c).

Figura 2
Figura 2: protoplastos Los protoplastos ritmos circadianos de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL, y CCA1 -OX fueron transformados transitoriamente con el CCA1pro: LUC y los ritmos circadianos en la luminiscencia se obtuvieron imágenes de más de 5 días (A - C). (D) Las estimaciones período circadiano en base a las huellas de luminiscencia en Col -0, CCA1 / lhy y ZTL (A - B). Youn ± SEM, n = 3-5, t-test, p-valor que se indica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ZTL
Genotipo Período (protoplastos) Período (transgénicos) Reportado por: referencias
0 co- 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC en Col -0 (2)
CCA1 / lhy 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC en Col -0 (2)
~ 18 ARN en el fondo L er (9)
25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC en el ecotipo C24 (22)
CCA1 -OX arrítmico arrítmico pCCA1: LUC (datos LD solamente) (2)
arrítmico ARN y proteína en fondo Col -0 (23)

Tabla 2: Los ritmos circadianos en comparación con protoplastos transgénicos plántulas El período circadiano de pCCA1:. LUC expresión en protoplastos en comparación con la longitud del período reportado por primera vez para la mutación y, si están disponibles, con pCCA1: LUC expresión de Col -0.

Discussion

A continuación, presentamos un ensayo rápido para detectar defectos período circadiano en líneas de Arabidopsis, como el aislamiento de protoplastos, la transfección, y las imágenes luminecent. El período circadiano de tipo salvaje de Arabidopsis y el reloj mutantes CCA1 / lhy, ZTL, y CCA1 -OX se calculó a partir de mediciones de luminiscencia de un CCA1pro: reportero LUC y se encontró que ser consistente con los datos publicados generados a partir de plantas enteras utilizando más tiempo- consumen enfoques transgénicos (Tabla 2). Utilizando este ensayo para detectar mutantes de Arabidopsis evita el requisito inicial para generar líneas luminiscentes transgénicos, lo que consume tiempo y sólo podría revelar que un mutante particular, exhibe ritmos de tipo salvaje. Una clara ventaja de este protocolo es que cualquier línea de Arabidopsis se puede examinar en breve periodo de tiempo para alterados los ritmos circadianos de la transcripción, que ayudarán a la identificación de más genes que afectan a la hora normal en las plantas.

26,27. La digestión subsiguiente requiere al menos 3 horas de incubación en la oscuridad para liberar los protoplastos en la solución de enzima. Cuando no se aplica infiltración al vacío, se aconseja tiempo de incubación de hasta 18 h. En el protocolo que se presenta aquí, la infiltración de vacío es innecesario porque la capa de células epidérmicas impenetrable a las enzimas se elimina por cinta. Al generar protoplastos mediante la reducción de material vegetal es necesario protoplastos separados de los desechos de la pared celular después de la digestión; Esto normalmente se hace mediante el filtrado de la solución o la purificación en un gradiente de 27,26 azúcar. Aquí, cualquier tejido sin digerir permanece en la cinta de autoclave despuésla digestión, por lo que la filtración y purificación en gradiente de azúcar de los protoplastos se puede omitir. Hay una posibilidad de que el estrés resultante de procedimientos de protoplastos prolongados afecta a la viabilidad celular y el reloj circadiano. El método de protoplastos basado en cinta 20 visualizada aquí se obtiene un alto número de protoplastos; y dada la viabilidad de las células a través de una serie de tiempo circadiano y las longitudes de época a juego de protoplastos y plantas enteras (Tabla 2), la metodología descrita aquí se prefieren sobre los métodos alternativos para generar protoplastos.

La etapa de transfección del protocolo es un paso crítico que los impactos sobre la viabilidad de los protoplastos. La solución de PEG permite al DNA a ser entregado en la célula, y tanto el tiempo de incubación en esta solución (paso 3.4) y el porcentaje de PEG debe ser determinada empíricamente. La concentración estándar es de 20%, con concentraciones más bajas que reducen la eficiencia de transformación y mayorconcentraciones que reducen la viabilidad 28. El tiempo de incubación tan corto como cinco minutos podría producir la transfección eficiente de los protoplastos 27.

Los protoplastos se pueden obtener imágenes en cualquier plataforma de imágenes luminiscente. En este vídeo, hemos utilizado un lector de placas de luminiscencia equipado con luces externas (rojo y LEDs azules, 630 y 470 nm, respectivamente, a una intensidad combinada de ~ 20 E ·), que permite la selección de alto rendimiento y mediciones frecuentes. Otros equipos de imagen que detecta la luminiscencia, tales como lectores de placas alternativas o configuraciones basadas en torno a una cámara del dispositivo (CCD) acoplado de carga, podría aplicarse igualmente bien, siempre y cuando la iluminación está disponible para la fotosíntesis. La ventaja de usar una cámara CCD montada en un gabinete controlable es que la luz y la temperatura se puede programar. Una desventaja es el tiempo de captura más largo, la introducción de períodos prolongados de oscuridad que pueden causar estrés a los protoplastos, además de perturbaring cronometraje endógeno. Independientemente de la plataforma experimental que se elija, es probable que sea necesario, en comparación con la configuración de plántulas o plantas maduras ajuste de la configuración. En nuestra experiencia, el aumento de las concentraciones de plásmido reportero durante la transfección y / o luciferina en la memoria intermedia de imágenes podría resolver cualquier ritmos irregulares o de mojado rápido que pudieran ocurrir en los experimentos iniciales.

En experimentos futuros, la metodología descrita aquí se puede aplicar para estudiar el fenotipo circadiano de cualquier línea de Arabidopsis mutante. Con pequeñas modificaciones, por ejemplo, el efecto de los diferentes medicamentos en la hora normal podría ser estudiado en esta configuración. Además, la transfección puede ser modificado para incluir microARN artificial para el silenciamiento de genes 19, ampliando aún más la versatilidad de este protocolo. Protocolos para generar protoplastos de arroz están bien establecidos 29 y el protocolo de formación de imágenes que aquí se presenta igualmente se podrían aplicar para mejorar nuestra uOMPRENDER del reloj en económicamente importantes plantas de cultivo monocotiledóneas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948

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References

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Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).More

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).

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