Abstract
protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes sont des outils largement utilisés pour étudier la localisation des protéines et la dynamique des événements tels que le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans les cellules vivantes. méthodologies quantitatives utilisant des fusions de GFP chimériques ont été développés pour de nombreuses applications; Cependant, la GFP est quelque peu résistant à la protéolyse, donc sa fluorescence persiste dans le lysosome / vacuole, ce qui peut nuire à la quantification du trafic de fret dans la voie endocytique. Une méthode alternative pour la quantification endocytose et post-endocytose événements de trafic utilise superecliptic pHluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui est trempé dans des environnements acides. fusion chimériques de pHluorin à la queue cytoplasmique de fret transmembranaire des protéines entraîne un amortissement de la fluorescence lors de la constitution de la cargaison dans des corps multivésiculaires (de MVBS) et la livraison à la lumière lysosome / vacuole. Ainsi, extinction de la fluorescence vacuolaire facilite quantification de l'endocytose et les événements précoces de la voie d'endocytose. Cet article décrit les méthodes utilisant des cargaisons pHluorin-marqués pour la quantification de l'endocytose par microscopie de fluorescence, ainsi que des analyses basées sur la population à l'aide de cytométrie en flux.
Introduction
le trafic vésiculaire joue un rôle important dans le maintien de l'identité et de la fonction des organites dans les cellules eucaryotes et est un mécanisme clé pour la régulation de la composition des protéines et de la membrane des compartiments cellulaires particuliers. À la membrane plasmique, la fusion des vésicules d'exocytose fournit de nouvelles protéines et les membranes à la surface de la cellule, tandis que les vésicules produites par endocytose retirer la membrane et des protéines de la surface pour un recyclage ultérieur ou le ciblage vers le lysosome. Ainsi, l'endocytose est importante pour l'absorption des nutriments et des réponses à l'environnement extracellulaire. Exocytose et endocytose sont équilibrés pour réguler la membrane plasmique de surface, et pour permettre le chiffre d'affaires des protéines endommagées.
Des études chez la levure et les cellules de mammifères ont identifié un grand nombre de protéines impliquées dans l'endocytose, ainsi que de multiples voies d'endocytose qui favorisent l'intériorisation de cargaisons spécifiques ou qui agissent en réponse à une variété de frconditions environnemen-. La voie la plus étudiée est la clathrine endocytose (CME), dans laquelle les protéines de clathrine et accessoires cytosolique assemblent en une structure de revêtement pour stabiliser la vésicule endocytaire naissante. Les expériences de la levure Saccharomyces cerevisiae ont donné des renseignements clés sur la dynamique et l' ordre de recrutement pour de nombreuses protéines d' endocytose 1-3. En particulier, le mécanisme de FMC est hautement conservée par l'évolution de telle sorte que la majorité des protéines liées à la FMC dans la levure ont orthologues humains; ainsi, la levure bourgeonnante a été un outil important pour les mécanismes d'endocytose qui sont conservés chez les eucaryotes supérieurs comprendre. Par exemple, des études utilisant des levures en herbe ont déterminé que la formation et la maturation des structures de FMC (appelée patches d'actine comme corticales dans la levure) implique le recrutement séquentiel de nombreuses protéines, en commençant par la clathrine et des protéines adaptatrices cargaison de liaison, suivi par le recrutement d'accessoire endocytose supplémentaire les protéines,activation de la polymérisation de l' actine Arp2 / 3 médiation et le recrutement de protéines impliquées dans des vésicules de scission 1,2. Le recrutement de protéines de machines de FMC à corticale patches d'actine est un processus très ordonné et stéréotypée, et l'ordre précis de recrutement pour de nombreuses protéines a été mis en place par rapport aux autres composants de la machinerie CME. Fait important, les études récentes ont confirmé un ordre similaire de recrutement pour les protéines de FMC à puits recouverts de clathrine dans les cellules de mammifères 4.
En plus de la FMC, de nombreux types de cellules possèdent un ou plusieurs endocytique (CIE) , les voies de clathrine indépendantes qui reposent sur des mécanismes alternatifs pour favoriser la formation de vésicules et l' intériorisation de la membrane plasmique 5-7. Chez la levure, nous avons récemment identifié une voie de CIE qui utilise la petite GTPase Rho1 et son guanine facteur d' activation d'échange nucléotidique (FEM), Rom1 8,9. Rho1 active le Formin Bni1 pour favoriser la polymérisation de l' actine 10,11, qui est requis pour cette forme de clathrine endocytose indépendante dans la levure 12. En outre, la famille des protéines α-arrestine recruter l'ubiquitine ligase Rsp5 pour promouvoir l' ubiquitination de la cargaison et intériorisation ultérieure par CME 13-17, ainsi que la promotion du fret intériorisation par la voie de la CIE, éventuellement par interaction directe avec les protéines impliquées dans la CIE 18. Une variété de voies CIE existent également dans les cellules de mammifères, y compris les voies de clathrine indépendant et phagocytaires qui comptent sur l'orthologue Rho1, RhoA 9,19. Le rôle de RhoA chez les mammifères CIE est mal comprise; ainsi, les études dans la levure en herbe peuvent fournir des indications mécanistes supplémentaires qui sont applicables à la CIE de mammifères.
Une quantification exacte des événements endocytose peut fournir des informations importantes sur les rôles des protéines spécifiques dans la régulation de l'endocytose, et peut révéler les effets des mutations sur l'intériorisation de la cargaison ou progression par la voie endocytique. A cet effet, les méthodes biochimiques peuvent être utilisées pour contrôler l'absorption du ligand ou de mesurer le taux de dégradation des protéines cargo endocytose. Dans les cellules vivantes, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes à cargaisons d'intérêt permet la visualisation directe de transport de fret. Toutefois, les cargaisons de GFP-tagged sont d'une utilité limitée pour la quantification de l'endocytose parce GFP est résistant à la dégradation dans le lysosome (ou vacuole dans la levure). Par ailleurs, la fluorescence de la GFP est seulement partiellement sensible aux variations du pH, et reste détectable au sein de la vacuole lumière 20,21. Par conséquent, la fluorescence de la balise GFP persiste dans la vacuole longtemps après le reste de la cargaison a été dégradée, et la quantification à base de cellules entières de l'intensité de la cargaison peuvent être inexacts en raison de long terme GFP fluorescence dans la vacuole.
Afin de pallier les inconvénients de la fluorescence vacuolaire de la GFP, nous avons précédemment fait usage de pH supereclipticluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui émet une fluorescence vive à pH neutre, mais il perd la fluorescence dans des environnements acides tels que la lumière de la vacuole / lysosome 20,22,23. Placer une balise pHluorin sur la queue cytoplasmique de cargaisons endocytose permet la visualisation des cargaisons à la membrane plasmique et sur endosomes précoces, où l'étiquette pHluorin reste exposée au cytoplasme (figure 1A). Comme endosomes précoces arrivent à maturité, le complexe de tri endosomal requis pour les paquets de transport (ESCRT) de machines cargos de surface localisée dans des vésicules qui bourgeonnent dans la lumière de l'endosome, générant corps multivésiculaires (MVBS) 24. Pour les cargaisons qui ont été incorporés dans les vésicules MVB internes, la balise pHluorin tournée vers la lumière de la vésicule. vésicules MVB internes sont acidifiés; ainsi, cargos pHluorin-taggés perdent la fluorescence sur endosomes précoces comme ils mûrissent dans MVBS 20. fusion subséquente du MVB avec la vacuole fournit le contenu MVB luminalpour la dégradation, les étiquettes et pHluorin restent éteintes dans l'environnement acide de la lumière de vacuoles.
Ce document fournit des descriptions détaillées des analyses quantitatives en utilisant endocytose des cargaisons avec des étiquettes de pHluorin cytoplasmiques dans la levure. Souches exprimant pHluorin-cargos marqués peuvent être utilisés dans des essais cinétiques et / ou finaux, selon les propriétés et le trafic comportement de la cargaison spécifique. En outre, certains cargos pHluorin-marqués se prêtent à des méthodes d'analyse à haut débit, y compris de cytométrie de flux. Fait important, la balise pHluorin est un outil polyvalent pour l'étude des événements endocytose dans les cellules vivantes, permettant la quantification de l'endocytose et la comparaison de la fonction d'endocytose dans de type sauvage et des souches mutantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Solutions et médias
- Préparer les stocks suivants, des médias et des plaques:
- Pour préparer 10x YNB, dissoudre 67 g de base azotée de levure dont les acides aminés dans 1 litre d'eau. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um de nitrocellulose.
- Préparer le milieu YNB utilisant 1x YNB (de 10x stock) avec 2% de dextrose (à partir d'un stérile à 50% p / v stock) et le mélange 1x acide aminé / nutritif (de 100x actions, voir étape 1.1.4). Pour la sélection de plasmide, omettre des acides aminés ou des nutriments individuels selon les besoins. Pour l'induction de l'expression Mup1, omettre en outre la méthionine à partir du mélange d'acide aminé / des éléments nutritifs.
- Préparer des plaques YNB utilisant 1x YNB (de 10x stock), 2% de dextrose (à partir d'un stérile à 50% p / v stock), mélange acide / nutriment 0,7 g / L aminé (voir étape 1.1.5) et 2,5% d'agar. Préparer le milieu de la plaque à l'autoclave 25 g d'agar-agar et de 0,7 g d'amino mélange acide / nutritif par 860 ml d'eau. Laisser refroidir le mélange à 55 ° C, puis ajouter 100 ml de 10x YNB et 40 ml of 50% de glucose. Verser plaques (environ 30 ml de milieu par boîte de 10 cm), laissez le moyen de se solidifier à la température ambiante, et des plaques de magasin à 4 ° C.
- Préparer la solution 100x acide aminé / nutriment stock (pour un milieu liquide) en dissolvant le suivant dans 100 ml d'eau déminéralisée: 0,1 g L-Méthionine, 0,3 g chacun de L-leucine et la L-lysine, et 0,2 g chacun de L-histidine L-tryptophane, d'adénine et d'uracile (d'autres acides aminés et des substances nutritives peuvent être inclus selon les besoins spécifiques pour les souches). Utiliser la chaleur douce si nécessaire pour dissoudre, et stériliser à travers un filtre de 0,45 um de nitrocellulose. Stocker à température ambiante à l'abri de la lumière. Pour la sélection de plasmide, de préparer des solutions mères dépourvues de composants spécifiques selon les besoins.
- Préparer l'acide aminé / mélange nutritif (pour les tôles) en combinant ce qui suit: 0,5 g d'adénine, 4 g de L-leucine et 2 g chacun de L-histidine, la L-lysine, la L-méthionine, L-tryptophane, la L- la tyrosine et l'uracile. Broyer avec un mortier et un pilon, et stocker avec proprotection de la lumière. Pour la sélection de plasmide, préparer des mélanges dépourvus de composants spécifiques, selon les besoins, et d'utiliser 0,7 g d'un mélange d'acide aminé par litre de milieu de la plaque (voir étape 1.1.3).
- Préparer huit puits des lames à chambres pour la microscopie en revêtant la surface de la lame avec de la concanavaline A (ConA). A chaque puits de la glissière de chambre, ajouter 25 ul de 2 mg / ml de ConA dissous dans l'eau. En utilisant une pointe de pipette, répartir la ConA à travers la surface inférieure du puits, puis laisser la lame sécher à l'air à la température ambiante pendant au moins 4-8 heures. Idéalement, utilisez les diapositives de chambre dans les 24 heures de revêtement ConA.
- Générer des souches de levure avec des fusions en cadre de la GFP ou de la cargaison pHluorin endocytique d'intérêt en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) , la méthode d'intégration à base décrite dans Longtine et al. et Goldstein et McCusker 25,26.
NOTE: Les plasmides contenant pHluorin marquage des cassettes avec des gènes de résistance pour la kanamycine (KANMX6) et nourseothricine (- Amplifier cassettes GFP ou pHluorin contenant des marqueurs sélectionnables avec des amorces contenant des séquences supplémentaires spécifiques au site d'intégration génomique 20,25.
- Transformer le produit de PCR résultant dans la souche de levure désirée en utilisant la méthode à l'acétate de lithium 27.
- Sélectionnez pour l'intégration de la cassette par des cellules de plus en plus sur des plaques YPD contenant le médicament approprié. Pour préparer des plaques, l'autoclave 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 0,1 g de tryptophane et 25 g d'agar-agar dans 960 ml d'eau. Avant de couler des plaques, laisser le mélange refroidir à 55 ° C, puis on ajoute 40 ml de glucose à 50% et soit G418 à une concentration finale de 200 ug / ml pour la sélection KANMX6 ou nourseothricine à une concentration finale de 100 ug / ml sélection NATMX4.
- Confirmer l'intégration de la GFP ou pHluorin balise dans des colonies individuelles par PCR et / ou transfert de Western en utilisant des anticorps anti-GFP,ainsi que par la détection de la protéine marquée par microscopie à fluorescence 20.
REMARQUE: Les souches et plasmides utilisés dans cette étude levures spécifiques sont indiquées dans les tableaux 1 et 2, respectivement.
2. Endpoint Essai pour l'état d'équilibre Fluorescence de constitutivement internalisés endocytique Cargo
- Inoculer des cellules (~ 3 petites colonies) dans 5 ml de milieu YNB manquant des acides aminés ou des éléments nutritifs nécessaires à la maintenance du plasmide (le cas échéant). Cultiver les cellules pour 16-24 h dans un incubateur à agitation orbitale à 30 ° C, avec 250 rpm agitation. Alternativement, une série ~ 1-2 mm colonie de cellules sur une plaque YNB dont les acides aminés ou de nutriments pour la sélection plasmidique, et cultiver des cellules pendant la nuit à 30 ° C.
- Mesurer la densité (DO 600) de chaque culture d'une nuit en utilisant un spectrophotomètre. Préparer une dilution de 5 ml à 0.35-0.4 OD 600 / ml dans un milieu YNB dont les acides aminés ou d' éléments nutritifs pour les plaentretien smid et croître pendant environ 3 heures à 30 ° C avec agitation. Si en utilisant des cellules striées sur une plaque, ignorez cette étape et passez à l'étape 2.4 (voir ci-dessous).
- Mesurer la densité (OD 600) de cellules, qui doit maintenant être comprise entre 0,6-1,0 DO 600 / ml. Transférer 1,5 ml de la culture à un tube de micro, et un culot de cellules à 8000 rpm (6800 xg) pendant 2 min. Retirer 1.475 pi de surnageant.
- Amener les cellules à un microscope à fluorescence. Avant imagerie chaque échantillon, préparer une lame en remettant en suspension les cellules dans le milieu restant, et monter 3 pl de suspension cellulaire sous une lamelle. Vous pouvez également préparer des lames de chambre 8 ainsi que décrit ci-dessous dans le protocole 3, en utilisant un milieu YNB comme approprié pour la sélection de plasmide. Idéalement, les cellules d'image avec un 100X, 1,4 ou supérieur ouverture numérique (NA) immersion dans l'huile lentille d'objectif, une caméra 12 ou 16 bits, et des filtres d'excitation / d'émission optimisés pour la fluorescence de GFP.
NOTE: Si en utilisant des cellules cultivées en striant oplaque na, préparer la diapositive en plaçant 3 pi de milieu YNB frais sur une lamelle. En utilisant une pointe de pipette, recueillir une petite colonie de cellules de la plaque, disperser les cellules dans le milieu YNB, et monter immédiatement la suspension résultante sur une lame de verre avant l'imagerie. - Image 4-6 champs aléatoires de cellules pour chaque condition, en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition (c. -à- ensembles de filtres et temps d'exposition) pour toutes les images dans une expérience.
NOTE: La collecte d'une image DIC ou fond clair pour chaque champ peut être utile pour les cellules où le signal pHluorin est trempé dans MVB et compartiments vacuolaires. - Quantifier l'intensité de fluorescence d'au moins 30-50 cellules pour chaque condition (voir le protocole 5).
3. Kinetic Assay pour la quantification de l'endocytose de Cargos que Subir endocytose Réglementé
- Inoculer 2-3 colonies de cellules de levure (environ 2 mm de diamètre) par colonie dans 5 ml de milieu YNB sans methionine et ajoutezdes acides aminés ou des nutriments itional pour maintenir la sélection du plasmide. Cultivez cultures pour 16-24 heures à 30 ° C avec agitation.
NOTE: Dans cet article, les protocoles pour l'étude des protéines cargo endocytose réglementés feront usage de la perméase méthionine, Mup1. D'autres cargaisons qui subissent une endocytose régulée sont également adaptés pour le marquage avec pHluorin (par exemple, l'uracile perméase FUR4, qui accumule à la membrane du plasma en l'absence d'uracile et uracile internalise en réponse à appliqué depuis l'extérieur); pour ces cargaisons, les conditions des médias doivent être modifiés pour refléter l'expression, l'induction et l'internalisation des conditions spécifiques pour que la cargaison. - Mesurer la densité (OD 600) de chaque culture d'une nuit à environ 3 heures avant l' imagerie. Préparer une dilution de 5 ml à DO 600 0.35-0.4 / ml dans du milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour le maintien du plasmide et de croître à 30 ° C sous agitation.
- Pré-équilibrer les microsface de la chambre de l'environnement ou le stade chauffé (si disponible) à 30 ° C pendant l'incubation de 3 heures de l'étape 3.2.
- Transférer 1 ml de culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse, et un culot de cellules à 8000 tours par minute (6800 x g) pendant 2 min. Retirer 975 ul de surnageant.
- Préparer, une lame de chambre 8 puits à fond de verre ConA traité pour l'imagerie (protocole 1.2).
- Ajouter 200 ul de milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour la sélection du plasmide pour chaque puits. Reprendre le culot cellulaire de l'étape 3.4 dans le surnageant restant, et déposer 2,5 pi de suspension cellulaire dans le centre de chaque puits. Disperser les cellules à travers la surface du puits par pipetage de haut en bas, et permettent aux cellules de se déposer pendant 5-10 min.
- Placer la lame de la chambre sur un microscope à fluorescence inversé équilibré à 30 ° C (voir étape 3.3). Repérez un champ de cellules en utilisant un éclairage en fond clair.
- Ajouter 50 ul de milieu YNB contenant 100 pg / ml de methionine(Préchauffée à 30 ° C) à 200 ul de milieu dans le puits pour obtenir une concentration finale de methionine de 20 pg / ml. Éviter de perturber le milieu dans le puits afin d'empêcher les cellules de flotter à partir du bas.
- Laisser les cellules se stabiliser pendant 2 minutes avant de commencer l'imagerie. Immédiatement avant de capturer la première image, réglez le microscope au plan focal désiré (typiquement, un plan focal équatorial fonctionne le mieux).
- Acquérir GFP et fond clair (ou DIC) des images à intervalles de 5 min pendant 45-60 min, en utilisant des paramètres d'acquisition identiques pour toutes les images dans une série chronologique (par exemple, 100X 1.4 NA objectif à immersion d'huile et 500 msec temps d'acquisition en utilisant un filtre de GFP, 100 temps d'acquisition msec en utilisant un filtre DIC).
NOTE: Si la scène du microscope et un logiciel d'imagerie ne permettent pas de correction automatique de la dérive du plan focal, il peut être nécessaire de réajuster manuellement la mise au point avant chaque point de temps d'imagerie. De plus, les temps d'acquisitionvarient entre les microscopes en raison des différences d'illumination et les filtres et les conditions optimales doivent être déterminées manuellement avant de commencer l'expérience. Si une cargaison endocytose autre que Mup1 est utilisé, il peut être nécessaire de modifier les intervalles de temps d'acquisition et d'imagerie, ainsi que la durée de l'expérience, pour tenir compte de la cinétique de l'intériorisation de cette cargaison. - Quantifier intensité de fluorescence des cellules individuelles à chaque point de temps (voir le protocole 5), et exprimer des valeurs en pourcentage de l'intensité initiale de la première image.
4. Endpoint Assay pour Quantification de endocytique Cargos que Subir endocytose Réglementé
- Préparer les cellules pour l'imagerie comme décrit dans le protocole 3 (étapes 3.1 à 3.6).
- Image 4-5 champs aléatoires de cellules pour chaque condition immédiatement avant d'ajouter la méthionine, en utilisant clair et filtres de GFP ensembles.
- Ajouter 50 ul de milieu YNB contenant 100 ug / ml de méthionine (avant-guerreMed à 30 ° C) à 200 ul de milieu dans le puits pour obtenir une concentration finale de methionine de 20 pg / ml. Éviter de perturber le milieu dans le puits afin d'empêcher les cellules de flotter à partir du bas.
- 4-5 images des champs aléatoires de cellules 30 minutes après l'addition de la methionine, en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition que pour le point temporel 0 min (étape 4.2).
- Quantifier l'intensité de fluorescence d'au moins 30-50 cellules pour chaque point de temps (voir le protocole 5). valeurs express que le pourcentage de Mup1-pHluorin intériorisé après 30 minutes en utilisant la formule: [intensité moyenne à 0 min - intensité moyenne à 30 min] / [intensité moyenne à 0 min] x 100%.
NOTE:. Il est possible d'effectuer simultanément jusqu'à huit points d' extrémité des essais en décalant l'heure de début de chaque essai Le tableau 3 donne un exemple de flux pour huit essais simultanés.
5. Postes acquisition Analyse
- Exporter des images à partir du logiciel d'acquisition en tant que 16-bit format de fichier-image étiqueté (.tif ou .tiff).
NOTE: D'autres formats de fichiers peuvent également convenir, et devrait idéalement utiliser des algorithmes de compression sans perte. images 8 bits ne conviennent généralement pas à des fins de quantification. - Ouvrir les fichiers en utilisant le logiciel ImageJ (disponible gratuitement option 'Ouvrir' à dans le menu "Fichier". Utilisez l'image de fluorescence pour la quantification, et l'image de fond clair / DIC comme référence pour identifier l'emplacement des cellules et à exclure les cellules mortes (si présent ), qui apparaissent plus sombres que les cellules vivantes quand vu par les DIC et sont autofluorescents vus avec des filtres GFP excitation / émission.
- Effectuer une soustraction d'arrière-plan sur l'image de fluorescence. Pour les images avec un signal de fond inégal, utiliser l'algorithme «Contexte Soustraction 'trouvé dans le menu' Process '. Utilisez le réglage par défaut (rayon de roulement de boule de 50 pixels), ce qui est généralement suffisant à des fins de quantification.
NOTE: Une solution de rechange backgroprocédé de soustraction und pour les images avec un fond uniforme est décrit à l'étape 5.3.1.-5.3.2; Cependant, le procédé ci-dessus fonctionne également pour le fond uniforme.- Pour les images avec uniforme de fond (c. -à- intensité de fond est à peu près constante à tous les bords et dans le centre de l'image), effectuer un fond manuel soustraction. Cliquez sur le bouton «sélections» freehand trouvé dans la fenêtre de ImageJ principale, et sélectionnez 3-5 régions aléatoires dans l'image qui ne contiennent pas de cellules.
- Ouvrez la fonction «Set mesures» situé dans le menu "Analyse", sélectionnez le paramètre 'Mean Gris Value', et de mesurer des valeurs d'intensité en utilisant la fonction "Mesure" (également trouvé dans le menu «Analyser»). Calculer la valeur moyenne des régions mesurées 3-5, et soustraire de toutes les mesures ultérieures dans cette image.
- Pour la quantification des essais cinétiques (protocole 3), générer une image unique, empilés pour le timsérie e. Ouvrez les images de fluorescence de chaque point de temps dans l'ordre chronologique, et de générer une pile en utilisant les «Images à Stack 'fonction (qui se trouve dans le menu' Image ', dans le cadre du sous-menu Stacks).
- Décrire une cellule en utilisant l'outil de sélection à main levée, en veillant à inclure la cellule entière, mais aussi peu zone à l'extérieur de la cellule que possible.
- Mesurer les paramètres suivants: ', densité intégrée »et« Mean Gris Value'. Sélectionnez les paramètres à l'aide de la fonction «Set mesures», situé dans le menu 'Analyse'.
REMARQUE: La densité intégrée correspond à la somme des intensités de pixels dans la région sélectionnée, et la valeur moyenne gris correspond à [Densité intégrée / Zone], qui corrige des valeurs d'intensité pour la taille des cellules. - Ouvrez le "Gestionnaire de retour sur investissement» situé dans le menu "Analyse", dans le sous-menu 'Outils. Dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur le bouton "Ajouter" pour entrer dans la regio soulignén comme une nouvelle région d'intérêt (ROI).
- Répéter les étapes 5.4 à 5.6 pour les cellules restantes de l'image. Exclure les cellules mortes tel qu'évalué par fond clair / DIC et fluorescence (cellules mortes apparaissent plus sombres dans les images DIC, et ont le signal cytoplasmique autofluorescents lorsqu'ils sont considérés avec GFP excitation / émission; voir la figure 2F), et toutes les cellules qui touchent le bord de l'image. Enregistrer les ROIs sélectionnés dans un fichier .zip en cliquant sur le bouton «Plus» dans la fenêtre «Gestionnaire de retour sur investissement», et d'exporter toutes les mesures vers un tableur ou d'un logiciel d'analyse statistique.
- Pour la quantification des essais cinétiques (protocole 3), définir et mesurer une cellule à partir du point de temps initial comme décrit dans les étapes 5.4 et 5.5. Utilisez le même retour sur investissement pour la mesure de tous les points de temps ultérieurs dans l'expérience.
- Pour les tests finaux (protocoles 2 et 4), mesurer un minimum de 30-50 cellules pour chaque condition. Effectuer la quantification pendant au moins 2-3 images, et comprennent toutes les cellules dans chaqueimage qui répondent aux critères énoncés à l'étape 5.8 dans l'analyse.
- Évaluer la signification statistique entre les échantillons à l' aide d' une ANOVA, suivie par un test de comparaison multiple de Tukey pour une analyse post hoc.
6. Analyse de la population de Mup1-pHluorin endocytose par cytométrie de flux
- Inoculer 2-3 colonies de cellules de levure (environ 2 mm de diamètre par colonie) dans 0,5 ml de milieu YNB sans methionine et des acides aminés ou des nutriments supplémentaires pour maintenir la sélection du plasmide. Cultiver les cellules dans 5 ml tubes à fond rond pour 16-24 heures à 30 ° C sur un rouleau tambour.
- Ajouter 1,5 ml de milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour le maintien du plasmide et de croître à 30 ° C pendant 3 heures supplémentaires sur un rouleau tambour.
- Transfert 1 ml de cellules dans chacune des deux 5 ml tubes à fond rond. Ajouter 0,25 ml de milieu YNB -Met au premier tube (condition -Met) et 0,25 ml de milieu YNB contenant 100 pg/ Ml de methionine au second tube pour obtenir une concentration en methionine finale de 20 pg / ml (état + Met). Incuber les cellules à 30 ° C pendant 45 min sur un rouleau tambour.
- Analyser les cellules par cytométrie en flux, avec diffusion vers l'avant (FS) en tant que mesure de la taille des cellules et Mup1-pHluorin intensité de fluorescence à partir d'un isothiocyanate de fluorescéine (FITC), le filtre en tant que mesure de la cargaison intériorisation.
- Utilisez les touches de curseur pour régler la tension des FS et des canaux FITC pour optimiser la détection de la gamme de taille et l'intensité de fluorescence des cellules de levure utilisée (pour ces expériences, les paramètres utilisés étaient 50 V pour FS et 400 V pour FITC).
NB: La tension des deux canaux varie en fonction du cytomètre de flux utilisé. Cette étape doit être effectuée avant ou pendant le traitement de 45 minutes avec de la methionine (étape 6.3). - Mesure FS et de l'intensité de fluorescence pour 10.000 cellules de chaque état, en utilisant le réglage de débit élevé. Générer un diagramme de dispersion des FS contre Fluorescence intensité: cliquez sur 'ajouter graphique', sélectionnez FITC (axe-x) et FS (axe y), et le graphique 1.000 points (le logiciel affichera des valeurs pour 1000 cellules, même si 10.000 cellules ont été mesurés).
NOTE: Pour la cohérence maximale, analyser des cellules 45-50 minutes après l'addition de méthionine; pour des expériences impliquant un grand nombre d'échantillons, échelonner addition de méthionine pour recevoir le temps nécessaire à l'analyse de cytométrie en flux. - Inclure -MET et + Met conditions de type sauvage (WT) cellules en tant que témoin. Utilisation de la fonction de porte, attribuer une porte verticale en utilisant la condition WT + Met, de telle sorte que 5% environ des cellules brillantes tombent à droite de la porte. Utilisez cette gating pour toutes les autres conditions de l'expérience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Localisation état d' équilibre et la quantification de la protéine cargo endocytose constitutivement intériorisé Ste3
Afin de démontrer que les cargaisons pHluorin étiquetées peuvent être utilisées pour la quantification de l'endocytose dans des cellules vivantes, la localisation de la GFP chimère et des fusions pHluorin avec la queue cytoplasmique C-terminale de Ste3, le récepteur de phéromone du facteur a dans la levure, ont été comparés. STE3 G est un récepteur couplé à une protéine (GPCR) qui est constitutivement transportée vers la membrane plasmique, intériorisé et ciblées vers la vacuole de la dégradation 28. Ainsi, dans des conditions de régime permanent, la majorité des Ste3 localise à la lumière des vacuoles, comme on le voit dans le type sauvage (WT) des cellules exprimant Ste3-GFP (figure 2A). En revanche, les cellules dépourvues des gènes codant pour les protéines de quatre adaptateurs de clathrine de liaison Ent1, ent2, et Yap1801 Yap1802 (Δ ent1ent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, ci - après dénommée 4Δ) ne parviennent pas à stabiliser la clathrine sur les sites d'endocytose 29, et sont gravement défectueux CME 30. Cellules 4Δ exigent l' expression de la Epsin homologie N-terminal (ENTH) domaine soit Ent1 ou Ent2 pour la viabilité 30,31. Le domaine ENTH ne suffit pas pour l' endocytose dans des cellules 4Δ, comme le montre la rétention de Ste3-GFP à la membrane plasmatique dans des cellules exprimant 4Δ + ENTH1 le domaine ENTH de Ent1 (figure 2A) 8,30; similaire rétention de la membrane plasmique dans les cellules 4Δ + ENTH1 a été observé pour d' autres cargaisons endocytose, y compris Ste2-GFP (récepteur de phéromone α-factor) et Mup1-GFP ou Mup1-pHluorin (une perméase methionine) 8,18. En revanche, l'expression de pleine longueur Ent1 d'un plasmide dans les cellules 4Δ (4Δ + Ent1) restaure l'endocytose et la localisation de Ste3-GFP vers la vacuole. cellules 4Δ + ENTH1 ont été récemment utilisés icriblage génétique na pour identifier une voie de CIE dans la levure qui repose sur l'actine modulant GTPase Rho1 et son FEM, Rom1, ainsi que la Formin Bni1 et les membres de la famille de protéines impliquées dans la cargaison de tri 8,18 α-arrestine. Conformément à un rôle dans la CIE, l' expression de ROM1 ou LDB19 α-arrestine à partir de plasmides élevé de copies dans les cellules 4Δ + ENTH1 intériorisation de Ste3-GFP (figure 2A) améliorées.
Les cellules exprimant Ste3-GFP ou d'autres cargaisons d'endocytose GFP-tagged ont vacuoles lumineuses dues à l'accumulation et la résistance protéolytique de la balise GFP. En revanche, les cellules exprimant Ste3-pHluorin ont de très faibles niveaux de fluorescence vacuolaire due à la trempe de l'étiquette pHluorin dans les milieux acides 20. Comme vu précédemment, les cellules WT et 4Δ + ent1 ont montré très peu détectable Ste3-pHluorin par microscopie à fluorescence (figure 2B). En revanche, Ste3-pHluorinétait facilement détectable au niveau de la membrane plasmique des cellules 4Δ + ENTH1, tandis que vacuolaire Ste3-pHluorin est resté pratiquement indétectable dans tous les cas. Haute-copie expression de ROM1 ou LDB19 réduit la quantité de détectable Ste3-pHluorin à la surface cellulaire, semblable aux résultats obtenus avec Ste3-GFP, bien que vacuolaire Ste3-pHluorin resté presque indétectable dans tous les cas.
Pour comparer l'efficacité de GFP et de cargaisons comme outils pHluorin marqués pour quantifier les changements dans la capacité d'endocytose des cellules, la fluorescence de cellules entières de Ste3-GFP et Ste3-pHluorin a été mesurée dans WT et 4Δ cellules. Bien que les changements dans Ste3-GFP localisation sont facilement détectables par microscopie (figure 2A), les différences dans l' intensité globale de fluorescence ne sont pas statistiquement significative entre WT, 4Δ + Ent1 et les cellules 4Δ + ENTH1 transformées avec le vecteur vide (figure 2C) 20. Likewise, les cellules 4Δ + ENTH1 transformées avec le vecteur, ROM1 et LDB19 avaient des intensités similaires de fluorescence de cellules entières. Notamment, les cellules 4Δ + ENTH1 transformées avec ROM1 ou LDB19 étaient significativement plus faible que les cellules WT (figure 2C) 8,18; cependant, les niveaux de protéine Ste3-GFP étaient similaires évalués par immunotransfert (figure 2E). Bien que la différence d'intensité peut être due en partie à des changements dans la taille des vacuoles ou de la morphologie, ou à des différences dans la rétention de l'étiquette de la GFP dans la vacuole, la quantification de la fluorescence Ste3-GFP ne reflète pas les changements de localisation observées par microscopie à fluorescence (Figure 2A). En revanche, la quantification de l' intensité Ste3-pHluorin démontré que les cellules 4Δ + ENTH1 transformées avec le vecteur étaient significativement plus lumineux que les cellules WT ou 4Δ + ent1, et de haute expression de copie ROM1 ou LDB19 dans les cellules 4Δ + ENTH1 réduit l' intensité Ste3-pHluorin àles niveaux qui étaient semblables à WT et 4Δ + Ent1 (figure 2D). Ainsi, la quantification de l'état d'équilibre intensité Ste3-pHluorin reflète fidèlement les différences de localisation observées par microscopie à fluorescence.
Des dosages d'internalisation cinétiques à l' aide de la cargaison endocytose régulée, Mup1
Quantification de l'intensité de fluorescence pour les cargaisons constitutivement intériorisés à l'état d'équilibre peut révéler des différences dans la capacité d'endocytose des cellules mutantes par rapport aux cellules WT. Cependant, il est possible que certaines cargaisons peuvent atteindre la même distribution à l'état stable et de l'intensité dans les cellules mutantes WT et endocytose, même si les cellules mutantes ont un retard dans endocytose ou plus lente cinétique pour le fret intériorisation. Au lieu de cargos, pHluorin-etiquettée qui subissent une endocytose régulée en réponse à un stimulus ou d'un ligand spécifique peuvent être utilisés pour surveiller lacinétique d'endocytose. A cet effet, l' intériorisation de la methionine permease haute affinité, Mup1, a été contrôlée 32. En l'absence de methionine extracellulaire, l'expression est régulée positivement Mup1 et la permease est maintenu à la membrane plasmique; lors de l' addition de méthionine dans le milieu, Mup1 subit une internalisation rapide et le ciblage vers la vacuole 13.
Pour contrôler la cinétique de Mup1 intériorisation, souches WT exprimant Mup1-GFP ou Mup1-pHluorin du locus génomique ont été cultivées en l'absence de méthionine afin d'accumuler Mup1 fluorescent à la membrane plasmique (figure 3A, 0 min point de temps). imagerie time-lapse de cellules a ensuite été effectuée à intervalles de 5 minutes en l'absence ou en présence de méthionine pour surveiller l'intériorisation de chargement et les modifications de la fluorescence. Comme on s'y attendait, GFP et pHluorin étiquetée Mup1 imagée en l'absence de methionine est resté à la membrane plasmique fou bien l' ensemble de la période d'observation de 45 min 20. En revanche, les cellules imagées en présence de méthionine ont montré l'épuisement progressif du signal de fluorescence provenant de la surface cellulaire, en accord avec la cargaison intériorisation. En particulier, la fluorescence GFP Mup1 accumulée dans les structures internes (c. -à endosomes et la vacuole), tandis que Mup1-pHluorin localisée punctae interne qui correspondent vraisemblablement aux endosomes précoces, mais n'a pas été observé dans la vacuole.
Quand la fluorescence a été mesurée dans tous les points de temps pour des cellules individuelles, Mup1-GFP et Mup1-pHluorin intensité a peu changé en l'absence de methionine appliqué depuis l'extérieur au cours de l'expérience de 45 minutes, conformément à la protéine restante de manière stable localisée à la membrane plasmatique (figure 3B). En revanche, les cellules entières d'intensité Mup1-pHluorin diminue rapidement en présence de méthionine, de sorte qu'une réduction de 50% dans fluorescence l' intensité a été observée au bout d' environ 20-25 min, et une réduction de 80% a été observée au bout d' environ 40 min 20. Mup1 cellules GFP ont également montré une diminution de l'intensité de la fluorescence lors de l'addition de la methionine; cependant, la cinétique de la perte de fluorescence ont été retardées par rapport à celles de Mup1-pHluorin, de telle sorte qu'une diminution de 50% de l'intensité n'a été observée après 40 minutes. Comme on le voit sur la figure 3A, Mup1-GFP était à peine détectable au niveau de la membrane plasmique , à ce moment, ce qui indique que la fluorescence persistante vacuolaire de la GFP a empêché une quantification précise des événements d' endocytose à la surface cellulaire.
Essais de Endpoint utilisant la cargaison endocytose régulée, Mup1
En plus des dosages quantitatifs, la cinétique d'endocytose comme décrit ci-dessus, les cargaisons endocytose régulés tels que Mup1 peuvent également être utilisées pour des dosages de point final, similaire à la quantificationde l'état d'équilibre d'intensité Ste3-pHluorin. A cet effet, le dosage pour la quantification des Mup1-pHluorin intériorisation a été modifiée pour permettre la comparaison des intensités de fluorescence moyennes des populations de cellules imagées immédiatement avant ou 30 minutes après l' addition de la methionine 8,18. Cette approche permet de comparer le pourcentage de Mup1 intériorisé entre les cellules mutantes WT et endocytose.
En accord avec les résultats de l'analyse cinétique (figure 3), Mup1-pHluorin est rapidement déchargée à partir de la membrane plasmatique dans des cellules wt (figure 4A), de telle sorte que 60% environ de Mup1-pHluorin a été internalise 30 minutes après l' addition de la methionine ( La figure 4B). Comme on s'y attendait, Mup1-pHluorin intériorisation était également efficace dans les cellules Ent1 4 +, tandis que l'internalisation a été significativement réduite dans les cellules 4Δ + ENTH1, conformément à un défaut grave dans endocytose. Haute-copie expressionde ROM1 ou LDB19 d'α-arrestine, qui est spécifiquement requis pour Mup1 intériorisation via à la fois CME et CIE voies 13,18, l' amélioration de l' internalisation des Mup1-pHluorin, compatible avec leur capacité à promouvoir l' endocytose dans les cellules 4Δ + ENTH1 18. Notamment, bien que l' état d' équilibre intensité Ste3-pHluorin dans les cellules 4Δ + ENTH1 exprimant à haute copie ROM1 ou LDB19 était impossible de distinguer les cellules WT ou 4Δ + ent1, intériorisation de Mup1-pHluorin n'a été que partiellement améliorée dans les cellules 4Δ + ENTH1 exprimant à haute copie ROM1 ou LDB19 (figure 4C). Ainsi, ces données indiquent que les essais cinétiques et / ou finaux peuvent révéler des différences de taux d'endocytose entre WT et souches mutantes pour certaines cargaisons, même si la distribution à l'état stationnaire d'autres cargaisons similaire peut être obtenu dans les mêmes souches.
Analyse basée sur la population de Mup1-PHLuorin intériorisation par cytométrie de flux
l'analyse à haut débit des plus grandes populations de cellules en utilisant la cytométrie de flux peut fournir une alternative à la réalisation d'essais cinétiques et finaux pour le fret intériorisation par microscopie. A cet effet, l'intensité de fluorescence de Mup1-pHluorin a été comparée dans des cellules WT à partir d'une culture cultivée en l'absence de methionine (WT -Met, qui doit être «brillant») ou en présence de méthionine pendant 45 min (WT + Met, qui devrait être "faible" par rapport aux cellules non traitées en fonction de la réduction de 80% de l'intensité de fluorescence visible sur la figure 3B). Après analyse par cytométrie en flux, une porte verticale a été appliquée à la condition WT + Met, où ~ 5% des cellules ont été contenues sur le côté droit de la porte, et correspondait aux cellules les plus brillants au sein de la population (figure 5A et 5B , population rouge). Lorsque la même porte a été appliquéeà la condition WT -Met, environ 65% des cellules est tombé dans la catégorie brillante, ce qui démontre que la cytométrie en flux peut être utilisé pour observer facilement les différences dans Mup1-pHluorin intensité de fluorescence entre les populations de cellules avant et après addition de méthionine. En revanche, la répartition lumineuse par rapport aux cellules sombres ne se distinguait pas dans des conditions ENTH1 4Δ + + Met -Met et en utilisant la même grille appliquée à la population WT + Met, conformément à l'endocytose défectueux. Ainsi, la cytométrie de flux permet de détecter des changements dans la capacité d'endocytose des cellules et permet une analyse rapide de grandes populations de cellules. Il est important, cytométrie en flux peut également être utilisé dans les écrans génétiques comme un outil pour le tri et la sélection des cellules mutantes avec endocytose défectueux (K. Wrasman et B. Wendland, manuscrit en préparation) 33.
Figure 1:
Figure 2:. Cellules localisation et la quantification des Ste3-GFP et Ste3-pHluorin dans de type sauvage et des cellules mutantes endocytose (A) WT, 4Δ + ent1 et 4Δ + ENTH1 exprimant génomiquement encodés Ste3-GFP et transformé avec le vecteur, haute-copie ROM1 ou haute copie LDB19 comme indiqué ont été visualisées par microscopie à fluorescence (rangée du haut) ou DIC (rangée du bas). images Ste3-GFP ont été ajustées pour les mêmes intensités maximales et minimales pour permettre la comparaison directe de Ste3 localisation. (B) WT, 4Δ + ent1 et 4Δ + ENTH1 cellules exprimant génomiquement encodé Ste3-pHluorin ont été transformées et imagés comme décrit dans le panneau A. Barre d'échelle = 2 pm. (C, D) La quantification de l' intensité de fluorescence pour la GFP Ste3 (C) et Ste3-pHluorin (D) , les souches utilisées dans les panneaux A et B. Pour chaque condition, la fluorescence des cellules entières a été quantifiée pendant un minimum de 40 cellules. Les valeurs ont été corrigées pour la taille des cellules et exprimés en unités arbitraires (UA) moyenne ± SEM (*** p <0,001 par rapport à WT; ††† p <0,001 par rapport à ENTH1 4Δ + + vecteur). (E) Relative expression de Ste3-GFP évaluée dans WT, 4Δ + Ent1 et les cellules 4Δ + ENTH1 transformé avec le vecteur, haute copie ROM1 ou haute copie LDB19 comme indiqué. Des extraits cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment 20, et des quantités égales de chaque échantillon ont été résolues par SDS-PAGE. l'expression STE3-GFP a été évaluée par immunotransfert avec des anticorps anti-GFP et les protéines de chargement a été évaluée en utilisant l'anti-GAPDH. (F) des cellules de type sauvage exprimant génomiquement encodé Ste3-GFP vu par microscopie à fluorescence (panneau Ste3-GFP) et de l' optique DIC, avec une cellule morte indiquée par les flèches. Les cellules mortes apparaissent dans le filtre autofluorescente GFP, et sont plus foncées lorsqu'elle est vue par DIC. Barre d' échelle = 2 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. (A) cellules de type sauvage dosage cinétique de Mup1-GFP et Mup1-pHluorin intériorisation exprimant génomiquement encodés Mup1-GFP (deux panneaux supérieurs) ou Mup1-pHluorin (inférieurs deux panneaux) ont été cultivées jusqu'à la phase mi-logarithmique milieu YNB sans methionine pour induire l'expression Mup1 et de rétention sur la membrane plasmique. Les cellules ont ensuite été imagées par microscopie à fluorescence toutes les 5 minutes en l'absence (- Met) ou en présence (+ Met) à 20 pg / ml de methionine. Pour chaque point de temps dans un état, les valeurs d'intensité maximale et minimale identiques ont été appliquées pour permettre la comparaison de l'intensité de fluorescence et de localisation. 0, 5, 10, 20 et 40 points de temps minimum sont représentés comme indiqué dans toutes les conditions. Barre d'échelle = 2 pm. (B) Quantification de Mup1-GFP et Mup1-pHluorin intériorisation dans les cellules de type sauvage à partir du panneau A. Whole-cell intensité de fluorescence de Mup1-GFP (- Met, carrés violets; + Met, diamants bleus) ou Mup1-pHluorin (- Met, triangles verts, + Met, cercles rouges) a été mesurée pour les cellules individuelles imagées à intervalles de 5 minutes, et exprimés en pourcentage de l'intensité de fluorescence initiale (moyenne ± SEM, n = 6 cellules par condition). Reproduit de Prosser et al. (2010) 20 avec l' autorisation de l'éditeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Cellules test Endpoint de Mup1-pHluorin intériorisation (A) WT, 4Δ + ent1 et 4Δ + ENTH1 exprimant génomiquement encodés Mup1-pHluorin et transformées avec le vecteur, haute-copie ROM1 ou haute copie LDB19 comme indiqué ont été cultivées jusqu'à la mi la phase -logarithmic en milieu YNB méthionine manquant. champs aléatoires de cellules ont été imagées par fluorescenc e microscopie immédiatement avant (- Met) ou 30 minutes après (+ Met) addition de 20 pg / ml de méthionine. Toutes les images ont été ajustées à la même valeur maximale et minimale d'intensité. Barre d'échelle = 2 pm. (B) Quantification de Mup1-pHluorin intériorisation dans les cellules du panneau A. Pour chaque condition, la cellule entière intensité de la fluorescence a été mesurée pendant un minimum de 40 cellules et corrigées pour la taille des cellules. Le pourcentage de Mup1-pHluorin internalisée a été calculé en comparant les valeurs moyennes d'intensité avant et après un traitement de 30 minutes avec de la méthionine. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 4; *** p <0,001 par rapport à WT, † p <0,05 par rapport à 4Δ + ENTH1 + vecteur). Ce chiffre a été modifié depuis Prosser et al. (2015) 18 avec l' autorisation de l'éditeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Analyse de la population de Mup1-pHuorin intériorisation par cytométrie en flux (A) cellules WT et 4Δ + ENTH1 ont été cultivées jusqu'à la phase semi-logarithmique en milieu YNB sans methionine. Les cellules ont été ensuite mises en incubation en l'absence (- Met) ou en présence (+ Met) à 20 pg / ml de méthionine pendant 45 minutes avant l'analyse par cytométrie en flux. Pour chaque condition, diffusion vers l'avant (en unités arbitraires Au) a été tracée en fonction de l'intensité de fluorescence (au, en utilisant un filtre FITC) pour 1000 cellules sur un total de 10.000 cellules mesurées. Les populations ont été analysées plus en appliquant une grille verticale (flèche bleue) à la condition WT + Met, où environ 5% des cellules les plus brillants (en rouge) est tombé sur le côté droit de la porte. La transmission sélective généré pour l'état WT + Met a été ensuite appliqué sur les autres conditions pour permettre la comparaisonles distributions de l'échantillon. (B) Résumé du pourcentage de cellules sombres (points noirs, à gauche de la porte) et les cellules lumineuses (points rouges, à droite de la porte) pour WT et 4Δ + ENTH1 ± essais Met indiqués dans le panneau A. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Souche | Génotype | La source |
| SEY6210 un | MAT α his3-Δ200 trp1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 suc2-Δ9 | Laboratoire plasmidique |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | PrOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| une Toutes les souches utilisées dans cette étude sont isogène SEY6210 , sauf au niveau des loci indiqué. | ||
Tableau 1: souches de levure utilisées dans cette étude.
| Plasmide | La description | La source |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski et Hieter 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, Laboratoire plasmidique |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Laboratoire plasmidique |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | PROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | plasmide intégrant par PCR pFA6a-GFP-KANMX6, pour la GFP-tagging dans la levure | Longtineet al. (1998) 21 |
Tableau 2: Plasmides utilisés dans cette étude.
| Temps (min) | Actes) |
| -5 | Image échantillon 1 (-Met) |
| 0 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 1 |
| Image échantillon 2 (-Met) | |
| 5 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 2 |
| Image échantillon 3 (-Met) | |
| dix | Ajouter la méthionine à l'échantillon 3 |
| Image échantillon 4 (-Met) | |
| 15 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 4 |
| Image échantillon 5 (-Met) | |
| 20 | Ajouterméthionine pour échantillonner 5 |
| Image échantillon 6 (-Met) | |
| 25 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 6 |
| Image échantillon 7 (-Met) | |
| 30 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 7 |
| Image échantillon 8 (-Met) | |
| Image échantillon 1 (+ Met) | |
| 35 | Ajouter la méthionine à l'échantillon 8 |
| Image échantillon 2 (+ Met) | |
| 40 | Image échantillon 3 (+ Met) |
| 45 | Image échantillon 4 (+ Met) |
| 50 | Image échantillon 5 (+ Met) |
| 55 | Image échantillon 6 (+ Met) |
| 60 | Image échantillon 7 (+ Met) |
| 65 | Image échantillon 8 (+ Met) |
Tableau 3: Exemple workflow pour stupéfiante 8 Mup1-pHluorin tests finaux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des applications de pHluorin pour la quantification des événements endocytose dans des cellules de levure fait usage de cargaisons transmembranaires , dans lequel le marqueur fluorescent est fusionnée à la queue cytoplasmique de la protéine (figure 1A). Pour les essais décrits ici, sont fluorescentes vives cargaisons lorsque la balise pHluorin est exposé à des environnements neutres, mais devenir éteint lorsque la balise pHluorin rencontre des conditions acides. Ainsi, une cargaison d'endocytose pHluorin-tagged est facilement détectée à la surface cytoplasmique de la membrane plasmique et endosomes précoces, mais devient "dim" lorsqu'ils sont incorporés dans des vésicules luminal MVB ou lors de la livraison à la lumière des vacuoles. En général, les cargaisons endocytose nouvellement synthétisés probablement quittent le réticulum endoplasmique (ER) et peut atteindre la membrane plasmique avant que la GFP et plusieurs de ses variantes sont entièrement mûri; ainsi que les cargaisons ont pas encore atteint la surface cellulaire sont prédits pHluorin-étiqueté à rester indétectable à moins sortie de l'ER ou Golgi est impaired.
Utilisation des chargements endocytose pHluorin-taggés tels que Ste3 et Mup1 a facilité la caractérisation d'un certain nombre de protéines impliquées dans la voie de levure CIE (figure 1B) 8,18. Plus précisément, les méthodes décrites dans le présent document ont été utilisées pour démontrer que l' augmentation de la production de l'actine modulation GTPase Rho1 et son endocytose promouvoir FEM Rom1 dans une variété de mutants de levure avec des défauts de CME 8. En outre, cargos pHluorin-marqués ont été récemment utilisé pour démontrer quantitativement que les a-arrestins, qui ont des rôles bien établis dans CME 13-15,34-36, jouer un rôle de fret sélectif à la fois CME et CIE, et ont des fonctions distinctes mécaniste dans les deux voies 18.
Pour les protocoles décrits dans le présent document, plusieurs facteurs importants doivent être pris en considération afin d'obtenir des résultats quantitatifs cohérents. Tout d'abord, Mup1-GFP ou Mup1-pHluorin expression et fluorescence peut diminuer à mesure que les cellules de levure approchent ou entrent dans la phase de croissance stationnaire (résultats non publiés); ainsi, les cellules cultivées à partir d'une culture de la nuit doivent être dilués et re-cultivées pour un 3 heures supplémentaires (voir les étapes 3.1-3.2 et 6.1-6.2). En outre, lorsque décalant de multiples conditions expérimentales ou souches dans des tests finaux ou pour l'analyse par cytométrie en flux, il est important de recueillir des données pour tous les échantillons après la même durée de traitement de methionine afin de permettre une comparaison entre les conditions individuelles. Pour l'analyse post-acquisition, la quantification doit être effectuée en utilisant les images 16 bits, depuis la conversion au format 8 bits provoque la perte de données qui peuvent affecter les valeurs d'intensité de fluorescence. En outre, la soustraction du fond doit être effectué avant la quantification (étape 5.3), étant donné que le signal d'arrière-plan peut occlure sensiblement les différences d'intensité entre les échantillons.
Considérant que pHluorin marqués Ste3 et Mup1 ont été influencées par la quantification, nontous les chargements seront bien adaptés à pHluorin tagging. Par exemple, les tentatives pour marquer le récepteur α-facteur Ste2 ont donné des résultats quantitatifs contradictoires, probablement en raison de la baisse d'intensité de fluorescence de Ste2-pHluorin par rapport à celui de Ste3 ou Mup1 (résultats non publiés), bien qu'il soit possible que les étiquettes tandem pHluorin pourraient améliorer l'intensité du signal. En outre, avec des taux très cargos lents d'endocytose induite par le ligand peuvent ne pas se prêter à des pHluorin de marquage pour la quantification, surtout si la mi-temps d'intériorisation est plus long que le cycle cellulaire de la levure (environ 90 min). Pour de telles cargaisons, une diminution de la fluorescence pourrait découler de l'endocytose et / ou de séparation de la cargaison entre les cellules mères et filles lors de la division. Ainsi, les tests individuels cargaisons d'intérêt est recommandée afin de déterminer si leur expression et la cinétique sont appropriés pour pHluorin-tagging et la quantification.
Bien que des études récentes utilisant PHLuorin ont porté principalement sur les événements d'endocytose à la membrane plasmique, pHluorin-cargos marqués peuvent être utilisés pour étudier les événements de trafic plus tard dans la voie d'endocytose. Par exemple, Mup1-pHluorin a été utilisé avec succès dans l' écoulement des essais de fret ESCRT médiée par le tri dans MVBS 37 à base de cytométrie, depuis la balise pHluorin devient désactivé lors de l' incorporation dans MVB vésicules luminal 20. Cette approche est similaire à la reporter de luciférase plus récemment décrit des dépôts intraluminal essai (LUCID), ce qui rend l' utilisation de cargaisons avec une étiquette de luciférase cytoplasmique pour générer un signal de bioluminescence en présence de luciférine 38,39. Semblable à la trempe de pHluorin fluorescence lors de l'incorporation dans MVB vésicules luminal, bioluminescence dans le test LUCID est atténué lors de l'incorporation de l'étiquette de la luciférase dans des vésicules de MVB. Bien que pHluorin et des essais LUCID sont conceptuellement similaires, pHluorin-cargos marqués peuvent être utilisés pour étudier l'endocytose et MVB maturation in cellules intactes.
D'autres méthodes existent pour la quantification de l'endocytose, et ont fourni des informations précieuses sur les taux de fret intériorisation dans de type sauvage et des cellules mutantes endocytose. Des exemples comprennent l' absorption de surveillance de ligands radiomarqués tels que l' α-facteur (qui se lie au récepteur de phéromone Ste2) et uracile (qui est internalisé par la perméase FUR4) 40,41 ou la surveillance du taux de dégradation pour les chargements endocytose tels que Ste3 qu'ils sont internalisés et transportés vers la vacuole 42. Ces approches biochimiques nécessitent la lyse cellulaire, et ne sont donc pas appropriés pour la quantification directe dans les cellules vivantes. En variante, marqué par fluorescence α-facteur, le colorant en phase liquide jaune Lucifer, ou le colorant styryle FM4-64 peut être utilisé pour visualiser l' endocytose dans des cellules vivantes, mais ne permettent pas une surveillance directe de protéines cargo exprimé de manière endogène 40,43,44. Pour ces approches, la persistance de la fluorescence dans le valumen cuole peuvent compliquer la quantification, comme on le voit avec la GFP. Il est également possible d'utiliser des cargaisons GFP étiquetées pour la quantification de l'endocytose par la mesure de l'ensemble des cellules et l'intensité de fluorescence en soustrayant le signal à partir des compartiments cytoplasmiques et / endosomique vacuolaires; cependant, les endosomes et les vacuoles sont souvent à proximité de la membrane plasmique. En revanche, les cargaisons d'endocytose pHluorin-taggés sont trempés à l'MVB / compartiments vacuoles, qui peut être un avantage distinct pour la quantification des événements de trafic par rapport à la balise GFP plus largement utilisé. Nos études futures élargir les connaissances actuelles des voies d'endocytose et de fret tri dans la levure pour identifier d'autres facteurs qui contribuent à la CME et CIE, et de comprendre les mécanismes qui régissent les décisions de la cargaison de tri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
