Abstract
Grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter er mye brukt verktøy for å studere protein lokalisering og dynamikk hendelser som cytoskeletal ombygging og vesikulær menneskehandel i levende celler. Kvantitative metoder bruker kimære GFP fusjoner har blitt utviklet for mange bruksområder; imidlertid, er GFP noe resistent mot proteolyse, og dermed dens fluorescens vedvarer i lysosomet / vakuole, noe som kan vanskeliggjøre kvantifisering av last handel med endocytoseveien. En alternativ metode for å kvantifisere endocytose og post-endocytiske hendelser smugler gjør bruk av superecliptic pHluorin, et pH-følsomt variant av GFP som bråkjøles i sure miljøer. Kimær fusjon av pHluorin til den cytoplasmiske hale av transmembrane laste proteiner resulterer i en demping av fluorescens ved inkorporering av lasten inn i multivesikulære legemene (MVBs) og levering til lysosomet / vacuole lumen. Dermed slukking av vacuolar fluorescens letter quantifisering av endocytose og tidlige hendelser i endocytoseveien. Dette notatet beskriver metoder ved hjelp pHluorin-merket last for kvantifisering av endocytose via fluorescens mikroskopi, samt befolkningsbaserte analyser ved hjelp av flowcytometri.
Introduction
Vesikulært handel spiller en viktig rolle i å opprettholde organeller identitet og funksjon i eukaryote celler, og er en viktig mekanisme for å regulere protein og membran preparat av individuelle cellulære rom. Ved plasmamembranen, fusjon av vesiklene exocytic leverer nye proteiner og membraner til overflaten av cellen, mens vesikler som er generert via endocytose fjerne membranen og proteiner fra overflaten for påfølgende resirkulering eller målretting til lysosomet. Således er endocytose viktig for næringsopptak og for respons til det ekstracellulære miljø. Eksocytose og endocytose er balansert til å regulere plasma membran areal, og å tillate omsetning av skadede proteiner.
Studier i gjær og pattedyrceller har identifisert et stort antall proteiner som er involvert i endocytose, så vel som flere endocytiske veier som fremmer internalisering av spesielle last eller som fungerer som reaksjon på en rekke nojømessige forhold. Den best studerte reaksjonsveien er clathrin endocytose (CME), hvori klatrin og cytosoliske aksessoriske proteiner montere inn et lag struktur for å stabilisere den begynnende endocytiske vesikkel. Eksperimenter i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae har gitt et viktig innblikk i dynamikken og for rekruttering i mange endocytiske proteiner 1-3. Spesielt, er det CME maskineri sterkt konservert gjennom evolusjon slik at flertallet av CME-beslektede proteiner i gjær har humane ortologer; dermed spirende gjær har vært et viktig verktøy for å forstå mekanismene for endocytose som er bevart i høyere eukaryoter. For eksempel, studier ved hjelp av spirende gjær fastslått at dannelse og modning av CME strukturer (også omtalt som kortikale aktin flekker i gjær) omfatter den sekvensielle rekruttering av mange proteiner, som begynner med clathrin og last-bindende adapter proteiner, etterfulgt av rekruttering av ytterligere endocytiske tilbehør proteiner,aktivering av Arp2 / 3-mediert aktin polymerisasjon, og rekruttering av proteiner involvert i vesikkel spalting 1,2. Rekruttering av CME maskiner proteiner til kortikal aktin lapper er et høyt organisert og stereotype prosess, og den nøyaktige rekkefølgen av rekrutteringen for mange proteiner er blitt etablert med hensyn til andre komponenter av CME maskineri. Viktigere, har nyere studier bekrefter en tilsvarende ordre rekruttering for CME proteiner på clathrin belagt groper i pattedyrceller 4.
I tillegg til CME, mange celletyper har en eller flere clathrin uavhengig endocytic (CIE) trasé som er avhengige av alternative mekanismer for å fremme vesikkeldannelse og intern fra plasmamembranen 5-7. I gjær, vi nylig identifisert en CIE sti som benytter den lille GTPase Rho1 og dens aktivere guanin nukleotid utveksling faktor (GEF), Rom1 8,9. Rho1 aktiverer formin Bni1 å fremme aktin polymerisasjon 10,11, noe som er nødvendig for denne form for clathrin-uavhengig endocytose i gjær 12. Videre er α-arrestin familie av proteiner rekruttere ubiquitin ligase Rsp5 for å fremme last ubiquitinering og påfølgende internalisering via CME 13-17, og også fremmer internalisering via CIE vei, eventuelt gjennom direkte interaksjon med proteiner som er involvert i CIE 18. En rekke CIE trasé også eksisterer i pattedyrceller, inkludert clathrin uavhengig og fagocyterende trasé som er avhengige av Rho1 ortolog, RhoA 9,19. Rollen RhoA i pattedyr CIE er dårlig forstått, dermed kan studier i spirende gjær gi ytterligere mekanistiske innsikt som gjelder for pattedyr CIE.
Nøyaktig kvantifisering av endocytiske hendelser kan gi viktig informasjon om rollene til spesifikke proteiner i å regulere endocytose, og kan avsløre effekten av mutasjoner på last internalisering eller progresjonn gjennom endocytoseveien. For dette formål kan biokjemiske metoder anvendes for å overvåke ligand opptak eller for å måle forekomst av degradering av endocytiske cargoproteiner. I levende celler, blanding av grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter til laster med interesse tillater direkte visualisering av lastebiler. Imidlertid GFP-merket last er av begrenset bruk for kvantifisering av endocytose fordi GFP er motstandsdyktig mot nedbrytning i lysosomet (eller vakuolen i gjær). Videre er GFP fluorescens bare delvis følsom overfor forandringer i pH, og fortsatt påvises innenfor vakuolen lumen 20,21. Følgelig fluorescensen av GFP-taggen vedvarer i vakuolen lenge etter at den siste del av lasten er blitt forringet, og hel cellebasert kvantifisering av last intensitet kan være unøyaktig på grunn av langvarig GFP fluorescens i vakuolen.
For å overvinne ulempene ved vacuolar GFP fluorescens, vi tidligere har gjort bruk av superecliptic pH-luorin, et pH-følsomt variant av GFP som fluorescerer sterkt ved nøytral pH, men taper fluorescens i sure miljøer som lumen vakuolen / lysosomet 20,22,23. Plassere en pHluorin koden på cytoplasmatiske hale av endocytiske last tillater visualisering av last på plasmamembranen og på tidlige endosomer, der pHluorin tag forblir eksponert til cytoplasma (figur 1A). Som tidlige endosomer modne, den endosomal sortering komplekse kreves for transport (ESCRT) maskiner pakker overflate lokalisert laster inn vesikler som bud i lumen av endosomet, genererer muitivesikulære organer (MVBs) 24. For last som har blitt innarbeidet i interne MVB vesikler, står pHluorin tag mot vesikkel lumen. Interne MVB vesikler er syrnet; dermed pHluorin-merket last ned fluorescens på tidlige endosomer som de modnes inn MVBs 20. Påfølgende fusjon av MVB med vakuolen leverer MVB luminal innholdetfor nedbrytning, forblir og pHluorin koder slukket i det sure miljøet i vakuolen lumen.
Dette papiret gir detaljerte beskrivelser av kvantitative endocytiske analyser ved hjelp av last med cytoplasmatiske pHluorin tagger i gjær. Stammer som uttrykker pHluorin-merket last kan brukes i kinetiske og / eller endepunkt analyser, avhengig av egenskaper og trafficking oppførsel av den spesifikke last. I tillegg er noen pHluorin-merket last er mottagelig for high-throughput analysemetoder, herunder flowcytometri. Viktigere er det pHluorin tag et allsidig verktøy for å studere endocytiske hendelser i levende celler, slik at kvantifisering av endocytose og sammenligning av endocytic funksjon i villtype og mutant stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Solutions og Media
- Forbered følgende aksjer, Media og plater:
- For å fremstille 10x YNB, oppløse 67 g gjærnitrogenbase som mangler aminosyrene i 1 liter vann. Steriliser ved filtrering gjennom en 0,22 um nitrocellulosefilter.
- Forbered YNB medium med 1x YNB (fra 10x lager) med 2% dekstrose (fra en steril 50% w / v lager) og 1x aminosyre / næringsblanding (fra 100x lager, se trinn 1.1.4). For plasmid seleksjon, utelate enkelte aminosyrer eller næringsstoffer som trengs. For induksjon av Mup1 uttrykk, i tillegg utelate metionin fra aminosyren / næringsblanding.
- Forbered YNB plater ved anvendelse av 1x YNB (fra 10x lager), 2% dekstrose (fra en steril 50% w / v lager), 0,7 g / l aminosyre / næringsblanding (se trinn 1.1.5) og 2,5% agar. Fremstille plate medium ved autoklavering 25 g agar og 0,7 g av aminosyre / næringsblanding per 860 ml vann. Tillat blandingen å avkjøles til 55 ° C, tilsett deretter 100 ml 10x YNB og 40 ml of 50% glukose. Hell plater (ca. 30 ml medium pr 10 cm plate), tillate mediet å stivne ved romtemperatur, og lagre platene ved 4 ° C.
- Fremstille 100x aminosyre / næringsløsning (for flytende medium) ved oppløsning av følgende i 100 ml avionisert vann: 0,1 g L-metionin, 0,3 g hver av L-leucin og L-lysin og 0,2 g hver av L-histidin , L-tryptofan, adenin og uracil (andre aminosyrer og næringsstoffer kan inkluderes etter behov for spesifikke stammer). Bruk svak varme hvis det er nødvendig for å løse opp, og sterilisere gjennom et 0,45 mikrometer nitrocellulosefilter. Oppbevar ved romtemperatur med beskyttelse mot lys. For plasmid utvalg, utarbeide stamløsninger mangler bestemte komponenter som trengs.
- Fremstille aminosyre / næringsblanding (for plater) ved å kombinere de følgende: 0,5 g adenin, 4 g L-leucin, og 2 g hver av L-histidin, L-lysin, L-metionin, L-tryptofan, L- tyrosin og uracil. Grind med en morter, og lagre med probeskyttelse mot lys. For plasmid utvalg, forberede blandinger mangler bestemte komponenter som trengs, og bruker 0,7 g aminosyre blanding per liter plate medium (se trinn 1.1.3).
- Forbered åtte-brønns kammermusikk lysbilder for mikroskopi av belegg på overflaten av lysbildet med concanavalin A (ConA). Til hver brønn av kammeret lysbilde, tilsett 25 ul av 2 mg / ml ConA oppløst i vann. Ved hjelp av en pipette, spre ConA over bunnen overflaten av brønnen, og deretter tillate sleiden å lufttørke ved romtemperatur i minst 4-8 timer. Bruk helst kammer lysbilder innen 24 timer fra ConA belegg.
- Generer gjærstammer med i-ramme fusjon av GFP eller pHluorin til den endocytiske last av interesse ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR) -basert integrasjonsmetoden beskrevet i Longtine et al. og Goldstein og McCusker 25,26.
MERK: Plasmider inneholder pHluorin merking kassetter med resistensgener for kanamycin (KANMX6) og nourseothricin (- Forsterke GFP eller pHluorin kassetter som inneholder markører med primere som inneholder flere sekvenser spesifikke til området av genomisk integrering 20,25.
- Omforme det resulterende PCR-produktet til den ønskede gjærstammen ved hjelp av litiumacetatmetoden 27.
- Selektere for integrering av kassetten ved å dyrke cellene på YPD plater inneholdende det aktuelle medikament. For å fremstille plater, autoklav 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 0,1 g tryptofan og 25 g agar i 960 ml vann. Før helling plater, la blandingen avkjøles til 55 ° C, tilsett deretter 40 ml 50% glukose og enten G418 til en endelig konsentrasjon på 200 pg / ml for KANMX6 utvalg, eller nourseothricin til en sluttkonsentrasjon på 100 ug / ml for NATMX4 utvalg.
- Bekreft integrering av GFP eller pHluorin tag i enkelte kolonier ved PCR og / eller Western blotting ved hjelp av anti-GFP antistoffer,så vel som ved påvisning av det merkede proteinet ved fluorescens mikroskopi 20.
MERK: Spesifikke gjærstammer og plasmider anvendt i denne undersøkelse er oppført i tabellene 1 og 2, respektivt.
2. Endpoint analyse for Steady-state fluorescens av konstitutivt internalisert endocytic Cargo
- Inokuler celler (~ 3 små kolonier) i 5 ml YNB-medium som mangler aminosyrer eller næringsstoffer som er nødvendig for plasmid vedlikehold (hvis aktuelt). Grow celler for 16-24 timer i en orbital riste inkubator ved 30 ° C, med 250 rpm risting. Alternativt strek en ~ 1-2 mm koloni av celler på en YNB plate som mangler aminosyrene eller næringsstoffer for plasmid utvalg, og dyrke cellene over natten ved 30 ° C.
- Måle tettheten (OD 600) for hver natten kultur ved hjelp av et spektrofotometer. Forbered en 5 ml fortynning på 0.35-0.4 OD 600 / ml i YNB medium mangler aminosyrer eller næringsstoffer for plaSmid vedlikehold, og vokse i ca. 3 timer ved 30 ° C med risting. Ved bruk av celler streket på en plate, hopper du over dette trinnet og fortsette med trinn 2.4 (se nedenfor).
- Måle tettheten (OD 600) fra celler, som bør nå være mellom 0,6 til 1,0 OD 600 / ml. Overfør 1,5 ml av kulturen til et mikrosentrifugerør, og pellets cellene ved 8000 rpm (6800 x g) i 2 min. Fjern 1,475 mL av supernatant.
- Bringe cellene til et fluorescens mikroskop. Før bildebehandling hver prøve, forberede et lysbilde av resuspending cellene i de resterende medium, og montere 3 mL av cellesuspensjon under et dekkglass. Alternativt forberede åtte-brønns kammermusikk lysbilder som beskrevet nedenfor i protokoll 3, ved hjelp YNB medium som passer for plasmid valg. Ideelt sett bildet celler med 100X, 1,4 eller høyere numerisk apertur (NA) olje nedsenking objektiv, en 12- eller 16-bit-kamera, og eksitasjon / emisjonsfiltre optimalisert for GFP fluorescens.
MERK: Hvis du bruker celler dyrket ved å stryke ona plate, forberede raset ved å plassere 3 mL av fersk YNB medium på en dekkglass. Ved hjelp av en pipette, samle en liten koloni av celler fra platen, dispergere cellene inn i YNB-medium, og montere den resulterende suspensjonen på en glass-slide umiddelbart før avbildning. - Bilde 4-6 tilfeldige felt av celler for hver tilstand, ved hjelp av de samme innhentingsparametre (dvs. filtersett og eksponeringstid) for alle bildene i et eksperiment.
MERK: Samle et lysfelt eller DIC bilde for hvert felt kan være nyttig for celler der pHluorin signalet er slukket i MVB og vacuolar avdelinger. - Kvantifisere fluorescens intensitet på minst 30-50 celler for hver tilstand (se protokoll 5).
3. Kinetic Assay for Kvantifisering av Endocytose av Cargos som gjennomgår Regulert Endocytose
- Inokulere 2-3 kolonier av gjærceller (ca. 2 mm i diameter per koloni) i 5 ml YNB-medium som manglet metionin og tilsettitional aminosyrer eller næringsstoffer for å opprettholde plasmid utvalg. Dyrke kulturer i 16-24 timer ved 30 ° C med risting.
MERK: I denne artikkelen skal protokoller for å studere regulert endocytiske cargoproteiner gjøre bruk av metionin permease, Mup1. Andre last som gjennomgår endocytose regulerte er også egnet for merking med pHluorin (for eksempel uracil permease Fur4, som akkumulerer på plasmamembranen i fravær av uracil, og internaliserer som reaksjon på eksternt påførte uracil); for disse lastene, bør medie forholdene endres for å gjenspeile de spesifikke uttrykk, induksjon og internalise vilkår for at lasten. - Måle tettheten (OD 600) for hver natten kultur ca. 3 timer før avbildning. Fremstille en 5 ml fortynning på 0.35-0.4 OD 600 / ml i YNB-medium som mangler metionin og ytterligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmid vedlikehold, og vokse ved 30 ° C med risting.
- Pre-likevekt mikroertåle miljøkammer eller oppvarmet trinn (hvis tilgjengelig) til 30 ° C i løpet av 3 timers inkubering i trinn 3.2.
- Overføre 1 ml av cellekultur til et mikrosentrifugerør, og pellets cellene ved 8000 rpm (6800 x g) i 2 min. Fjern 975 mL av supernatant.
- Forbered en ConA behandlet, 8-godt glass-bunn kammer sklie for imaging (protokoll 1.2).
- Tilsett 200 ul av YNB-medium som mangler metionin og ytterligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmid utvalg til hver brønn. Resuspender cellepelleten fra trinn 3,4 i den gjenværende supernatant, og slippe 2,5 mL av cellesuspensjonen i midten av hver brønn. Dispergere cellene på tvers av overflaten av brønnen ved å pipettere opp og ned, og tillate cellene å slå seg ned i 5-10 min.
- Plasser kammeret lysbildet på en invertert fluorescens mikroskop ekvilibrert til 30 ° C (se trinn 3.3). Finn et felt av celler ved hjelp lysfelt belysning.
- Tilsett 50 ul av YNB-medium inneholdende 100 pg / ml metionin(Forvarmet til 30 ° C) til 200 ul av medium i brønnen for å oppnå en endelig metionin konsentrasjon på 20 ug / ml. Unngå å forstyrre medium i brønnen for å hindre at cellene i å flyte fra bunnen.
- La cellene komme i likevekt i 2 min før begynnelsen avbildning. Umiddelbart før du tar det første bildet, justere mikroskop til ønsket fokusplanet (vanligvis en ekvatorfokusplan fungerer best).
- Acquire GFP og lysfelt (eller DIC) bilder med 5 minutters intervaller for 45-60 min, ved hjelp av identiske innhentingsparametre for alle bildene i en tidsserie (for eksempel 100X 1,4 NA oljeneddyppingsobjektivet og 500 msek oppkjøpet tid ved hjelp av GFP filter, 100 msek oppkjøpet tid ved hjelp av DIC filter).
MERK: Hvis mikroskopet scenen og bildebehandling ikke tillater for automatisk korrigering av fokusplan drift, kan det være nødvendig å justere fokus før hver tenkelig tidspunkt manuelt. Videre innhentingstider vilvariere mellom mikroskoper grunn av forskjeller i belysnings og filtre, og optimale forhold bør bestemmes manuelt før start av eksperimentet. Dersom en last endocytiske annet enn Mup1 anvendes, kan det være nødvendig å modifisere akvisisjonstid og bildeintervaller, så vel som varigheten av eksperimentet, for å reflektere internkinetikken til den last. - Kvantifisere fluorescensintensiteten av individuelle celler ved hvert tidspunkt (se protokoll 5), og hurtig verdier i prosent av den opprinnelige intensitet av det første bildet.
4. Endpoint analyse for Kvantifisering av endocytic Cargos som gjennomgår Regulert Endocytose
- Forbered celler for avbildning som beskrevet i protokollen 3 (trinn 3.1 gjennom 3.6).
- Bilde 4-5 tilfeldige felt av celler for hver tilstand umiddelbart før du legger metionin, ved hjelp av lysfelt og GFP filtersett.
- Tilsett 50 ul av YNB-medium inneholdende 100 pg / ml metionin (før krigenMed til 30 ° C) til 200 ul av medium i brønnen for å oppnå en endelig metionin konsentrasjon på 20 ug / ml. Unngå å forstyrre medium i brønnen for å hindre at cellene i å flyte fra bunnen.
- Bilde 4-5 tilfeldige områder av celler som 30 minutter etter tilsetting av metionin, ved hjelp av de samme innhentingsparametere som for 0 min tidspunkt (trinn 4.2).
- Kvantifisere fluorescens intensitet på minst 30-50 celler for hvert tidspunkt (se protokoll 5). Uttrykte verdier som prosentandelen av Mup1-pHluorin internalisert etter 30 min ved anvendelse av formelen: [midlere intensitet ved 0 min - midlere intensitet ved 30 min] / [Midlere intensitet ved 0 min] x 100%.
MERK:. Det er mulig å samtidig utføre opptil åtte endepunkter analyser av svimlende starttidspunktet for hver analyse Tabell 3 gir et eksempel arbeidsflyt for åtte samtidige analyser.
5. Post-oppkjøpet Analysis
- Eksportere bilder fra oppkjøpet programvare som en6-bit kodet-bildefil format (.tif eller .tiff-format).
MERK: Andre filformater kan også være egnet, og bør ideelt sett bruke lossless komprimeringsalgoritmer. 8-bits bilder er generelt ikke egnet for kvantifisering formål. - Åpne filer ved hjelp ImageJ programvare (fritt tilgjengelig på 'Open' i 'Fil-menyen. Bruk fluorescens bildet for kvantifisering og lysfelt / DIC image som en referanse for å identifisere plasseringen av celler og for å utelukke døde celler (hvis det finnes ), som vises mørkere enn levende celler når så av DIC og autofluorescent sett med GFP eksitasjon / emisjonsfiltre.
- Utføre en bakgrunn subtraksjon på fluorescensen bildet. For bilder med en ujevn bakgrunn signal, bruke 'Bakgrunn subtraksjon' algoritme finnes i "Process-menyen". Bruke standardinnstilling (rullende ball radius på 50 bildeelementer), som vanligvis er tilstrekkelig for kvantifisering formål.
MERK: En alternativ background subtraksjon metode for bilder med ensartet bakgrunn er beskrevet i trinn 5.3.1.-5.3.2; Men den ovennevnte metoden fungerer også for jevn bakgrunn.- For bilder med ensartet bakgrunn (dvs. bakgrunn intensitet er tilnærmet konstant på alle kanter, og i midten av bildet), utføre en manuell bakgrunn subtraksjon. Klikk på "frihånd valg 'knappen som finnes i hoved ImageJ vinduet, og velg 3-5 tilfeldige områder i bildet som ikke inneholder celler.
- Åpne "Set Målinger 'funksjon ligger i" Analyze "-menyen, velg" Mean Gray Value' parameter, og måle intensitetsverdier ved hjelp av "Mål" -funksjonen (også funnet i "Analyze" -menyen). Beregn gjennomsnittlig verdi fra 3-5 målte regioner, og trekke fra alle etterfølgende målinger i det bildet.
- For kvantifisering av kinetiske analyser (protokoll 3), generere et enkelt, stablet bilde for timE-serien. Åpne fluorescens bilder fra hvert tidspunkt i kronologisk rekkefølge, og generere en stabel med de 'bilder til Stack' funksjon (finnes i "Image" menyen under Stabler undermenyen).
- Skissere en celle ved hjelp av verktøyet for frihåndsutvalg, og husk å ta hele cellen, men så lite område utenfor cellen som mulig.
- Mål følgende parametre: 'Area, Integrert tetthet "og" Mean Gray Value'. Velg parameter ved hjelp av "Set Målinger 'funksjon, som ligger i" Analyze "-menyen.
MERK: Integrert Tetthet tilsvarer summen av alle pixel intensiteter innenfor det valgte området, og Mean grå verdi tilsvarer [Integrert Tetthet / Area], som korrigerer intensitetsverdiene for cellestørrelse. - Åpne 'ROI Manager "ligger i" Analyze "-menyen, under" Verktøy "undermenyen. I ROI Manager-vinduet, klikker du på "Legg til" knappen for å åpne det merkede region som en ny region av interesse (ROI).
- Gjenta trinn 5.4 ved 5.6 for de gjenværende cellene i bildet. Utelukke noen døde celler som vurderes av lysfelt / DIC og fluorescens (døde celler mørkere i DIC bilder og har autofluorescent cytoplasma signal når sett med GFP eksitasjon / emisjon, se figur 2F), og eventuelle celler som berører kanten av bildet. Lagre de valgte Rois som en ZIP-fil ved å klikke på "Mer" -knappen i 'ROI Manager "vinduet, og eksportere alle målinger til et regneark eller statistisk analyse programvare.
- For kvantifisering av kinetiske analyser (protokoll 3), skissere og måle en celle fra den første tidspunkt slik det er beskrevet i trinn 5.4 og 5.5. Bruk samme avkastningen for måling av alle tidspunkter i forsøket.
- For endepunkt assays (protokoller 2 og 4), å måle et minimum på 30-50 celler for hver betingelse. Utfør kvantifisering i minst 2-3 bilder, og inkluderer alle cellene i hverbilde som tilfredsstiller kriteriene som er beskrevet i trinn 5,8 i analysen.
- Bedømme statistisk signifikans mellom prøvene ved hjelp av en-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for post hoc-analyse.
6. Befolkning Analyse av Mup1-pHluorin Endocytose ved flowcytometri
- Inokulere 2-3 kolonier av gjærceller (ca. 2 mm i diameter per koloni) i 0,5 ml YNB-medium som manglet metionin og ytterligere aminosyrer eller næringsmidler for å opprettholde plasmid-utvalg. Dyrke cellene i 5 ml rundbunnet rør i 16-24 timer ved 30 ° C på en valsetrommel.
- Tilsett 1,5 ml YNB-medium som mangler metionin og ytterligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmid vedlikehold, og vokse ved 30 ° C i ytterligere 3 timer på en rulletrommel.
- Overføre 1 ml av celler i hver av de to 5 ml rundbunnet rør. Legg 0,25 ml YNB -Met medium til det første røret (-Met tilstand), og 0,25 ml YNB-medium inneholdende 100 ug/ Ml metionin til det andre rør for å gi en sluttkonsentrasjon på metionin 20 ug / ml (+ Met tilstand). Inkuber cellene ved 30 ° C i 45 minutter på en valse trommel.
- Analyser cellene ved flowcytometri, velge forover spredning (FS) som et mål på cellestørrelse, og Mup1-pHluorin fluorescens intensitet fra et fluorescein isothiocyanat (FITC) filter som et mål på last internalisering.
- Bruk glidebryteren for å justere spenningen i FS og FITC kanaler for å optimalisere deteksjon for størrelsesområdet og fluorescens intensiteten av gjærceller som brukes (for disse eksperimentene, innstillingene som ble brukt var 50 V for FS og 400 V for FITC).
MERK: Spenning for begge kanaler vil variere avhengig av strømningscytometer som brukes. Dette trinnet bør gjøres før eller i løpet av 45 min behandling med metionin (trinn 6.3). - Mål FS og fluorescens-intensitet for 10.000 celler fra hvert tilstanden ved hjelp av den høye strømningshastighetsinnstilling. Generere et punktplott av FS mot fluorescence intensitet: Klikk "Legg graf", velg FITC (x-aksen) og FS (y-aksen), og graf 1000 poeng (programvaren viser verdier for 1.000 celler, selv om 10.000 celler ble målt).
MERK: For maksimal konsistens, analysere cellene 45-50 minutter etter tilsetting av metionin; for forsøk med et stort antall prøver, rave tilsetning av metionin til å romme den nødvendige tid for strømningscytometri-analyse. - Omfatte -Met og + Met betingelser for villtype (WT) celler som en kontroll. Ved hjelp av portfunksjonen, tildele en vertikal port ved hjelp av WT + Met tilstand, slik at ca. 5% av de skarpcellene faller til høyre for porten. Bruk denne gating for alle andre betingelser i forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state lokalisering og kvantifisering av konstitutivt internalisert endocytic last protein Ste3
For å demonstrere at pHluorin-merkede last kan anvendes for kvantifisering av endocytose i levende celler, lokaliseringen av kimære GFP og pHluorin fusjoner med det cytoplasmatiske C-terminale hale av Ste3, a-faktor-reseptor feromon i gjær, ble sammenlignet. Ste3 er et G-protein-koblet reseptor (GPCR) som konstitutivt transporteres til plasmamembranen, internalisert, og målrettet til vakuolen for degradering 28. Således, under konstante betingelser, de fleste av Ste3 lokaliserer til vakuolen lumen, som det fremgår av villtype (WT) celler som uttrykker Ste3-GFP (figur 2A). I motsetning til celler som mangler genene som koder for de fire clathrin bindende adapter proteiner Ent1, ent2, Yap1801 og Yap1802 (ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, heretter kalt 4Δ) ikke klarer å stabilisere clathrin på områder av endocytose 29, og er alvorlig skadet i CME 30. 4Δ celler krever uttrykk for epsin N-terminal homologi (enth) domene av enten Ent1 eller ent2 for levedyktighet 30,31. Enth domene er ikke tilstrekkelig for endocytose i 4Δ celler, som vist ved retensjon av Ste3-GFP på plasmamembranen i 4Δ + ENTH1-celler som uttrykker den n-te domenet av Ent1 (figur 2A) 8,30; lignende plasmamembran oppbevaring i 4Δ + ENTH1 celler er blitt observert for andre endocytiske last, inkludert STE2-GFP (den α-faktor feromon-reseptor) og Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin (en metionin permease) 8,18. I motsetning til ekspresjon av full-lengde Ent1 fra et plasmid i 4Δ celler (4Δ + Ent1) gjenoppretter endocytose og lokalisering av Ste3-GFP til vakuolen. 4Δ + ENTH1 celler ble sist brukt ina genetisk skjerm for å identifisere et CIE bane i gjær som er avhengig av den aktin-modulerende GTPase-Rho1 og dens GEF, Rom1, samt formin Bni1 og medlemmer av α-arrestin familie av proteiner som er involvert i laste sortering 8,18. I samsvar med en rolle i CIE, uttrykk for ROM1 eller α-arrestin LDB19 fra high-kopi plasmider i 4Δ + ENTH1 celler forbedret internalisering av Ste3-GFP (figur 2A).
Celler som uttrykker Ste3-GFP eller andre GFP-merket endocytiske last har lyse vakuoler grunn av opphopning og proteolytisk motstand av GFP tag. I kontrast, celler som uttrykker Ste3-pHluorin har svært lave nivåer av vacuolar fluorescens på grunn av stopping av pHluorin tag i sure miljøer 20. Som sett tidligere, WT og 4Δ + Ent1 celler viste svært lite påvisbare Ste3-pHluorin ved fluorescens mikroskopi (figur 2B). I kontrast, Ste3-pHluorinvar mulig å påvise ved plasmamembranen av 4Δ + ENTH1 celler, mens vacuolar Ste3-pHluorin forble nesten umulig å oppdage i alle tilfeller. Høy-kopi ekspresjon av ROM1 eller LDB19 redusert mengden av påvisbart Ste3-pHluorin på celleoverflaten, i likhet med resultater med Ste3-GFP, selv om vacuolar Ste3-pHluorin forble nesten ikke påvises i alle tilfeller.
For å sammenligne effektiviteten av GFP- og pHluorin-merket last som verktøy for å kvantifisere endringer i endocytic kapasitet på cellene, ble hel-celle fluorescens av Ste3-GFP og Ste3-pHluorin målt i WT og 4Δ celler. Selv om forandringer i Ste3-GFP lokalisering var lett påvisbar ved mikroskopi (figur 2A), forskjeller i total fluorescens intensitet var ikke statistisk signifikante mellom WT, 4Δ + Ent1 og 4Δ + ENTH1 celler transformert med tom vektor (figur 2C) 20. Likewise, 4Δ + ENTH1 celler transformert med vektoren, ROM1 og LDB19 hadde lignende hel-celle fluorescensstyrkene. Spesielt 4Δ + ENTH1 celler transformert med ROM1 eller LDB19 var betydelig svakere enn WT celler (Figur 2C) 8,18; imidlertid Ste3-GFP proteinnivåer var tilsvarende som bedømt ved immunblotting (figur 2E). Mens forskjellen i intensitet kan være delvis skyldes endringer i vakuolen størrelse eller morfologi, eller til forskjeller i retensjon av GFP-taggen i vakuolen, tillater kvantifisering av Ste3-GFP fluorescens ikke gjenspeile endringer i lokalisering observert ved fluorescens mikroskopi (figur 2A). I kontrast, kvantifisering av Ste3-pHluorin intensitet viste at 4Δ + ENTH1 celler transformert med vektoren var betydelig lysere enn WT eller 4Δ + Ent1 celler, og høy-kopi uttrykk for ROM1 eller LDB19 i 4Δ + ENTH1 cellene reduseres Ste3-pHluorin intensitet tilnivåer som var lik WT og 4Δ + Ent1 (figur 2D). Dermed kvantifisering av steady-state Ste3-pHluorin intensitet nøyaktig gjenspeiler forskjeller i lokalisering observert av fluorescens mikroskopi.
Kinetic internalise analyser ved hjelp av regulert endocytic last, Mup1
Kvantifisering av fluorescens intensitet for konstitutivt internlaster ved steady-state kan avsløre forskjeller i endocytic kapasitet på mutante celler sammenlignet med WT celler. Imidlertid er det mulig at noen laster kan nå samme steady-state fordeling og intensitet i WT og endocytiske mutante celler, selv om de mutante celler har en forsinkelse i endocytose eller langsommere kinetikk for last internalisering. I stedet pHluorin-merkede last som gjennomgår endocytose regulert som respons på en spesifikk stimulus, eller ligand kan anvendes for å overvåkekinetikk av endocytose. For dette formål ble internalisering av den høyaffinitets-metionin permease, Mup1, overvåket 32. I fravær av ekstracellulær metionin, blir Mup1 uttrykk oppregulert, og den permease bibeholdes ved plasmamembranen; ved tilsetning av metionin til mediet, gjennomgår internalisering Mup1 hurtig og målretting til vakuolen 13.
For å overvåke kinetikken Mup1 internalisering, ble WT-stammer som uttrykker Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin fra det genomiske lokuset dyrket i fravær av metionin for å samle fluorescerende Mup1 på plasmamembranen (figur 3A, 0 min tidspunkt). Time-lapse avbildning av celler ble deretter utført ved 5 minutters intervaller i fravær eller nærvær av metionin for å overvåke lasten internalisering og endring i fluorescens. Som forventet, GFP- og pHluorin-tagget Mup1 avbildes i fravær av metionin holdt seg på plasmamembranen feller hele 45 min observasjonsperioden 20. I kontrast, celler som avbildes i nærvær av metionin viste progressiv utarming av fluorescens-signalet fra celleoverflaten, i samsvar med last internalisering. Spesielt, Mup1-GFP fluorescens akkumulert i interne strukturer (dvs. endosomer og vakuolen), mens Mup1-pHluorin lokalisert til intern punctae som sannsynligvis tilsvarer tidlige endosomer, men ble ikke sett i vakuolen.
Når fluorescens ble kvantifisert på tvers av alle tidspunkter for individuelle celler, Mup1-GFP og Mup1-pHluorin intensitet viste liten endring i fravær av eksternt påført metionin i løpet av 45 min eksperiment, i samsvar med proteinet gjenværende stabilt lokalisert i plasmamembranen (Figur 3B). I motsetning til dette, hel-celle Mup1-pHluorin intensitet raskt redusert i nærvær av metionin, slik at en 50% reduksjon i fluorescence intensitet ble observert etter ca. 20-25 min, og en 80% reduksjon ble observert etter ca. 40 min 20. Mup1-GFP-celler viste også en reduksjon i fluorescensintensitet ved tilsetning av metionin; imidlertid, ble kinetikken av fluorescens tap forsinket i forhold til de av Mup1-pHluorin, slik at en 50% reduksjon i intensitet ble kun observert etter 40 min. Som vist i figur 3A, Mup1-GFP var knapt synlig på plasmamembranen på dette tidspunkt, noe som indikerer at vedvarende vacuolar GFP fluorescens forhindret nøyaktig kvantifisering av endocytiske hendelser på celleoverflaten.
Endepunkt analyser ved hjelp av regulert endocytic last, Mup1
I tillegg til kvantitative, kinetiske undersøkelser av endocytose, som beskrevet ovenfor, kan regulerte endocytiske last som Mup1 også brukes til endepunkt analyser, i likhet med kvantifiseringav steady-state Ste3-pHluorin intensitet. For dette formål, ble analysen for kvantifisering av Mup1-pHluorin internalise modifisert for å tillate sammenligning av gjennomsnittlige fluorescensstyrkene fra cellepopulasjoner avbildes umiddelbart før eller 30 min etter tilsetning av metionin 8,18. Denne tilnærmingen gjør sammenligning av andelen Mup1 internalisert mellom WT og endocytiske mutante celler.
I overensstemmelse med resultatene av den kinetiske analysen (figur 3), ble Mup1-pHluorin raskt oppbrukt fra plasmamembranen i WT-celler (figur 4A), slik at ca. 60% av Mup1-pHluorin ble internalisert 30 min etter tilsetning av metionin ( Figur 4B). Som forventet, Mup1-pHluorin intern var tilsvarende effektiv i 4 + Ent1 celler, mens internalisering ble betydelig redusert i 4Δ + ENTH1 celler, i samsvar med en alvorlig feil i endocytose. Høy kopi uttrykkav ROM1 eller α-arrestin LDB19, som er spesielt nødvendig for Mup1 intern via både CME og CIE trasé 13,18, forbedret internalisering av Mup1-pHluorin, i samsvar med deres evne til å fremme endocytose i 4Δ + ENTH1 celler 18. Spesielt, men steady-state Ste3-pHluorin intensitet i 4Δ + ENTH1 celler uttrykker høy kopi ROM1 eller LDB19 var umulig å skille fra WT eller 4Δ + Ent1 celler, internalisering av Mup1-pHluorin ble bare delvis forbedret i 4Δ + ENTH1 celler uttrykker høy-kopi ROM1 eller LDB19 (Figur 4C). Således er disse data indikerer at kinetiske og / eller endepunkt analyser kan avsløre forskjeller i endocytiske rater mellom WT og mutante stammer av noen last, selv om lignende steady-state fordeling av andre laster kan oppnås i de samme stammer.
Populasjonsbasert analyse av Mup1-PHLuorin intern bruker flowcytometri
Høy throughput analyser av større bestander av celler ved hjelp av flowcytometri kan gi et alternativ til å utføre kinetiske og endepunkt analyser for last intern ved mikroskopi. For dette formål, ble fluorescensintensiteten av Mup1-pHluorin sammenlignet i WT-celler fra en kultur dyrket i fravær av metionin (WT -Met, som bør være "lys"), eller i nærvær av metionin i 45 min (WT + Met, som skal være "dim" sammenlignet med ubehandlede celler, basert på 80% reduksjon i fluorescensintensitet vist på figur 3B). Etter analyse ved flowcytometri, ble en vertikal port påført på WT + Met tilstand, hvor ~ 5% av cellene inneholdt på den høyre side av porten, og tilsvarte de lyseste cellene i populasjonen (figur 5A og 5B , rød befolkningen). Når den samme gate ble påførttil WT -Met tilstand, falt ca. 65% av cellene i den lyse kategori, viser at flowcytometri kan brukes til lett å observere forskjellene i Mup1-pHluorin fluorescens intensitet mellom populasjoner av celler før og etter tilsetning av metionin. I motsetning til dette fordeling av lys i forhold til dim-celler var utvisket i 4Δ + ENTH1 -Met og + Met betingelser ved bruk av de samme port påført WT + Met befolkning, i samsvar med defekt endocytose. Således flowcytometri kan detektere endringer i den endocytiske kapasiteten av celler, og muliggjør hurtig analyse av store populasjoner av celler. Viktigere, flow cytometri kan også brukes i genetiske skjermer som et verktøy for sortering og utvalg av mutante celler med defekt endocytose (K. Wrasman og B. Vendland, manuskript under forberedelse) 33.
Figur 1:
Figur 2:. Lokalisering og kvantifisering av Ste3-GFP og Ste3-pHluorin i villtype og endocytiske mutante celler (A) WT, 4Δ + Ent1 og 4Δ + ENTH1 celler som uttrykker genomisk kodet Ste3-GFP og transformert med vektoren høy kopi ROM1 eller høy-kopi LDB19 som indikert ble visualisert ved fluorescens mikroskopi (øverste rad) eller DIC (nederste rad). Ste3-GFP bilder ble justert til den samme maksimale og minimale intensitet for å tillate direkte sammenligning av Ste3 lokalisering. (B) WT, 4Δ + Ent1 og 4Δ + ENTH1 celler som uttrykker genomisk kodet Ste3-pHluorin ble transformert og avbildes som beskrevet i panel A. Scale bar = 2 mikrometer. (C, D) Kvantifisering av fluorescens-intensitet for Ste3-GFP (C) og Ste3-pHluorin (D) stammer som ble anvendt i panelene A og B. For hver tilstand, ble hel-celle fluorescens kvantifisert i minst 40 celler. Verdiene ble korrigert for cellestørrelse, og uttrykt i vilkårlige enheter (AU) som gjennomsnitt ± SEM (*** p <0,001 sammenlignet med WT; ††† p <0,001 sammenlignet med 4Δ + ENTH1 + vektor). (E) Relative uttrykk for Ste3-GFP vurdert i WT, 4Δ + Ent1 og 4Δ + ENTH1 celler transformert med vektoren høy kopi ROM1 eller høy-kopi LDB19 som angitt. Celleekstrakter ble fremstilt som beskrevet tidligere 20, og like mengder av hver prøve ble oppløst ved SDS-PAGE. Ste3-GFP-ekspresjon ble bestemt ved immunoblotting med anti-GFP-antistoffer, og protein lasting ble bedømt ved bruk av anti-GAPDH. (F) Vill-type celler som uttrykker genomisk kodet Ste3-GFP sett av fluorescensmikroskopi (Ste3-GFP panel) og DIC optikk, med en død celle antydet med piler. Døde celler vises autofluorescent i GFP filter, og er mørkere når sett av DIC. Scale bar = 2 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Kinetic analyse av Mup1-GFP og Mup1-pHluorin intern (A) Wild-type celler som uttrykker genomisk kodet Mup1-GFP (to øverste panelene) eller Mup1-pHluorin (nedre to paneler) ble dyrket til mid-logaritmisk fase i YNB medium mangler metionin for å indusere Mup1 uttrykk og oppbevaring på plasmamembranen. Cellene ble så fotografert ved fluorescens mikroskopi hver 5 min i fravær (- Met) eller nærvær (+ Met) til 20 pg / ml metionin. For hvert tidspunkt innenfor en tilstand, ble identiske maksimums- og minimumsintensitetsverdier anvendes for å tillate sammenligning av fluorescens-intensitet og lokalisering. 0, 5, 10, 20 og 40 min tidspunkter er vist som indikert for alle forhold. Scale bar = 2 mikrometer. (B) Kvantifisering av Mup1-GFP og Mup1-pHluorin intern i villtype celler fra panel A. Hel-celle fluorescens intensitet Mup1-GFP (- Met, lilla firkanter; + Met, blå diamanter) eller Mup1-pHluoRin (- Met, grønne trekanter; + Met, røde sirkler) ble målt i individuelle celler avbildes ved 5 minutters intervaller, og uttrykt som en prosent av det opprinnelige fluorescensintensitet (gjennomsnitt ± SEM, n = 6 celler pr tilstand). Gjengitt fra Prosser et al. (2010) 20 med tillatelse fra forlaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Endpoint analyse av Mup1-pHluorin intern (A) WT, 4Δ + Ent1 og 4Δ + ENTH1 celler som uttrykker genomisk kodet Mup1-pHluorin og transformert med vektoren høy kopi ROM1 eller høy-kopi LDB19 som angitt ble dyrket til midten -logarithmic fase i YNB medium mangler metionin. Tilfeldige områder av celler ble fotografert ved fluorescenc e mikros umiddelbart før (- Met) eller 30 minutter etter (+ Met) tilsetning av 20 pg / ml metionin. Alle bildene ble justert til den samme maksimale og minimale intensitetsverdier. Scale bar = 2 mikrometer. (B) Kvantifisering av Mup1-pHluorin intern i celler fra panel A. For hver tilstand, ble hel-celle fluorescens intensitet målt for et minimum av 40 celler og korrigert for cellestørrelse. Prosentandelen av Mup1-pHluorin internalisert ble beregnet ved å sammenligne bety intensitetsverdier før og etter 30 minutters behandling med metionin. Verdiene er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 4; *** p <0,001 sammenlignet med WT; † p <0,05 sammenlignet med 4Δ + ENTH1 + vektor). Dette tallet har blitt forandret fra Prosser et al. (2015) 18 med tillatelse fra forlaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Populasjonsanalyse av Mup1-pHuorin internalisering ved strømningscytometri (A) WT og 4Δ + ENTH1-celler ble dyrket til midt-logaritmisk fase i YNB medium som mangler metionin. Celler ble deretter inkubert i fravær (- Met) eller nærvær (+ Met) til 20 pg / ml metionin i 45 minutter før analyse ved strømningscytometri. For hver tilstand, ble forover spredning (i vilkårlige enheter, au) plottet mot fluorescensintensitet (au, ved hjelp av et FITC-filter) for 1000 celler av en total på 10.000 celler målt. Populasjoner ble videre analysert ved å bruke en vertikal gate (blå pil) til WT + Met tilstand, hvor ca 5% av de skarpeste celler (vist i rødt) falt på høyre side av porten. Den gating generert for WT + Met tilstand ble deretter brukt til de øvrige vilkår for å tillate sammenligningav prøven distribusjoner. (B) Sammendrag av prosentandelen av dim celler (svarte punkter, til venstre for porten) og lyse celler (røde punkter, til høyre for gate) for WT og 4Δ + ENTH1 ± Møtte studier vist i panel A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Press | genotype | Kilde |
| SEY6210 en | MAT α HIS3-Δ200 TRP1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | Laboratory plasmid |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| en Alle stammer brukt i denne studien er isogen å SEY6210 unntatt på angitte loci. | ||
Tabell 1: gjærstammer anvendt i denne studien.
| plasmid | Beskrivelse | Kilde |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski og Hieter 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, Laboratory plasmid |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Laboratory plasmid |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | pROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | pFA6a-GFP-KANMX6, PCR-basert integrere plasmid for GFP-tagging i gjær | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabell 2: Plasmider som brukt i denne studien.
| Tid (min) | Handling (er) |
| -5 | Bilde prøve 1 (-Met) |
| 0 | Legg metionin å prøve en |
| Bilde utvalg 2 (-Met) | |
| 5 | Legg metionin å prøve 2 |
| Bilde prøve 3 (-Met) | |
| 10 | Legg metionin å prøve 3 |
| Bilde prøve 4 (-Met) | |
| 15 | Legg metionin å prøve 4 |
| Bilde prøve 5 (-Met) | |
| 20 | Legg tilmetionin å prøve 5 |
| Bilde prøve 6 (-Met) | |
| 25 | Legg metionin å smake 6 |
| Bilde prøven 7 (-Met) | |
| 30 | Legg metionin å prøve 7 |
| Bilde sample 8 (-Met) | |
| Bilde prøve 1 (+ Met) | |
| 35 | Legg metionin å prøve 8 |
| Bilde utvalg 2 (+ Met) | |
| 40 | Bilde prøve 3 (+ Met) |
| 45 | Bilde prøve 4 (+ Met) |
| 50 | Bilde prøve 5 (+ Met) |
| 55 | Bilde prøve 6 (+ Met) |
| 60 | Bilde prøve 7 (+ Met) |
| 65 | Bilde sample 8 (+ Met) |
Tabell 3: Eksempel arbeidsflyt for svimlende 8 Mup1-pHluorin endepunkt analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelser av pHluorin for kvantifisering av endocytiske hendelser i gjærceller som gjør bruk av transmembranlaster, hvor den fluorescerende taggen er fusjonert til den cytoplasmiske hale av proteinet (figur 1A). For analysene beskrevet her, last er sterkt fluorescerende når pHluorin tag er utsatt for nøytrale omgivelser, men blir stoppet når pHluorin tag møter sure forhold. Dermed er en pHluorin-merket endocytiske last lett påvises ved cytoplasmisk overflate av plasmamembranen og på tidlig endosomer, men blir "dim" når den inkorporeres i luminal MVB vesikler eller ved levering til vakuolen lumen. Generelt nylig syntetiserte endocytiske laster sannsynlig lar det endoplasmatiske retikulum (ER) og nå plasmamembranen før GFP og mange av variantene har fullt modnet; dermed pHluorin-merket last som ennå ikke har nådd celleoverflaten er spådd å være umulig å oppdage med mindre exit fra ER eller Golgi er jegmpaired.
Bruk av pHluorin-merkede endocytiske last som Ste3 og Mup1 har mulig karakterisering av et antall proteiner som er involvert i gjær CIE pathway (figur 1 B) 8,18. Nærmere bestemt, har metodene beskrevet i dette dokumentet blitt anvendt for å demonstrere at økt produksjon av aktin-modulerende GTPase-Rho1 og dens GEF Rom1 fremme endocytose i en rekke gjær mutanter med defekter i CME 8. I tillegg ble pHluorin-merket last nylig brukt til å kvantitativt vise at a-arrestins, som har veletablerte roller i CME 13-15,34-36, spille cargo-selektiv roller i både CME og CIE, og har mechanistically forskjellige funksjoner i de to veier 18.
For protokollene som er skissert i denne artikkelen, bør flere viktige faktorer vurderes for å oppnå konsistente og kvantitative resultater. Først Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin uttrykk og Fluorescerendecence kan redusere som gjærceller nærmer seg eller gå inn i stasjonær vekstfase (upubliserte resultater); derfor bør celler dyrket fra en overnatting kultur fortynnes og re-vokst i ytterligere 3 timer (se trinn 3,1-3,2 og 6,1-6,2). I tillegg, når vakling av flere forsøksbetingelser eller påkjenningen i endepunkt analyser eller for analyse ved strømningscytometri, er det viktig å samle inn data for alle prøver etter samme varighet av metionin behandling for å tillate sammenligninger mellom de enkelte betingelser. For etter oppkjøpsanalyse bør kvantifisering utføres ved hjelp av 16-biters bilder, siden konvertering til 8-bits format forårsaker tap av data som kan påvirke fluorescens intensitetsverdier. Videre bør bakgrunn subtraksjon utføres før kvantifisering (trinn 5.3), siden bakgrunnssignalet i betydelig grad kan tilstoppe forskjeller i intensitet mellom prøver.
Mens pHluorin-merket Ste3 og Mup1 har vist seg mottagelig for kvantifisering, ikkealle lastene vil være godt egnet til pHluorin tagging. For eksempel forsøke å merke α-faktor reseptor STE2 har gitt inkonsistente kvantitative resultater, muligens på grunn av lavere fluorescens intensitet STE2-pHluorin sammenlignet med Ste3 eller Mup1 (upubliserte resultater), selv om det er mulig at tandem pHluorin koder kan forbedre signalintensiteten. I tillegg kan last med meget langsomme hastigheter for ligand-induserte endocytose ikke være mottakelig for pHluorin merking for kvantifisering, særlig hvis den halve tiden av internalisering er lengre enn den gjærcellesyklusen (ca. 90 min). For slike laster, kan en reduksjon i fluorescens oppstår fra endocytose og / eller fra oppdeling av last mellom mor og datter-celler under deling. Dermed teste enkelt laster med interesse anbefales for å avgjøre om deres uttrykk og kinetikk er egnet for pHluorin merking og kvantifisering.
Selv om nyere studier som bruker PHLuorin har fokusert hovedsakelig på endocytiske hendelser på plasmamembranen, kan pHluorin-merket last brukes til å studere senere menneskehandel hendelser i endocytoseveien. For eksempel har Mup1-pHluorin blitt brukt i flowcytometri-baserte analyser av ESCRT-mediert last sortering i MVBs 37, ettersom den pHluorin taggen blir quenchet ved inkorporering i MVB luminal vesikler 20. Denne fremgangsmåten er lik den mer nylig beskrevet luciferase reporter for intraluminal nedfall (LUCID) assay, som gjør bruk av last med en cytoplasmisk luciferase signal for å generere et bioluminescent signal i nærvær av luciferin 38,39. I likhet med slukking av pHluorin fluorescens ved innlemmelse i MVB luminal vesikler, er bioluminesens i LUCID analysen dempes ved inkorporering av luciferase tag i MVB blemmer. Mens pHluorin og klar analysene er konseptuelt lik, kan pHluorin-merket last brukes til å studere endocytose og MVB modning jegn intakte celler.
Alternative metoder finnes for kvantifisering av endocytose, og har gitt verdifull informasjon om forekomst av last intern i villtype og endocytiske mutante celler. Eksempler på dette er overvåkning opptak av radioaktivt merkede ligander såsom α-faktor (som binder til reseptoren feromon STE2) og uracil (som internaliseres av permease Fur4) 40,41 eller overvåking av nedbrytingshastigheten for endocytiske last som Ste3 som de blir internalisert og transportert til vakuolen 42. Disse biokjemiske metoder krever cellelyse, og er således ikke egnet for direkte kvantifisering i levende celler. Alternativt fluorescensmerkede α-faktor, væskefase-fargestoff Lucifer gult, eller styryl fargestoff FM4-64 kan brukes til å visualisere endocytose i levende celler, men tillater ikke direkte overvåking av endogent uttrykte cargoproteiner 40,43,44. For disse tilnærmingene, utholdenhet av fluorescens i vacuole lumen kan komplisere kvantifisering, sett med GFP. Det er også mulig å anvende GFP-merket last for kvantifisering av endocytose ved måling av hel-celle fluorescens intensitet og subtrahering av signalet fra cytoplasmiske og endosomale / vacuolar kamre; imidlertid, endosomer og vakuoler er ofte i umiddelbar nærhet til plasmamembranen. I kontrast er pHluorin-merket endocytiske last slukket i MVB / vacuole avdelinger, som kan være en klar fordel for kvantifisering av menneskehandel hendelser sammenlignet med den mer utbredt GFP tag. Våre fremtidige studier vil utvide på nåværende kunnskap endocytiske trasé og last sortering i gjær til å identifisere flere faktorer som bidrar til CME og CIE, og for å forstå mekanismene som regulerer laste- og sortering beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
