Abstract
A proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes são ferramentas amplamente utilizado para estudar a localização de proteínas e na dinâmica de eventos, tais como a remodelação do citoesqueleto e tráfico vesicular em células vivas. Metodologias quantitativas utilizando fusões quiméricas GFP foram desenvolvidos para muitas aplicações; No entanto, a GFP é um tanto resistente à proteólise, assim, a sua fluorescência persistir no lisossoma / vacúolo, o que pode dificultar a quantificação de tráfico de carga na via endocítica. Um método alternativo para a quantificação de endocitose e pós-endocíticas eventos de tráfico faz uso de superecliptic pHluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que é extinta em ambientes ácidos. fusão quimérica de pHluorin à cauda citoplasmática de transmembrana de carga proteínas resulta em um amortecimento de fluorescência após a incorporação da carga em corpos multivesiculares (MVBs) e entrega para o lúmen lisossoma / vacúolo. Assim, extinção da fluorescência vacuolar facilita quantificatião de endocitose e eventos precoces na via endocítica. Este artigo descreve métodos que utilizam cargas pHluorin-marcadas para quantificação de endocitose via microscopia de fluorescência, bem como ensaios de base populacional utilizando citometria de fluxo.
Introduction
tráfico vesicular desempenha um papel importante na manutenção e função identidade organelo em células eucariotas, e é um mecanismo fundamental para a regulação da composição de proteína e membrana de compartimentos celulares individuais. Na membrana plasmática, a fusão de vesículas exocíticos proporciona novas proteínas e membranas à superfície da célula, ao passo que as vesículas gerados através de endocitose remover membrana e proteínas a partir da superfície para a reciclagem ou o direccionamento para o lisossoma subsequente. Assim, é importante para a endocitose a absorção de nutrientes e para as respostas para o ambiente extracelular. A exocitose e endocitose são equilibradas para regular a área de superfície da membrana de plasma, e para permitir a rotatividade de proteínas danificadas.
Os estudos em células de levedura e de mamífero ter identificado um grande número de proteínas envolvidos em endocitose, bem como a múltiplas vias de endocitose que promovem a internalização de cargas específicas ou que agem em resposta a uma variedade de encondições tações. A via mais bem estudado é endocitose mediada por clatrina (CME), em que a proteína clatrina e acessórios citosólico em montar uma estrutura de revestimento para estabilizar a vesícula endocítica nascente. Experiências no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae produziram informações importantes sobre a dinâmica ea ordem de recrutamento para muitas proteínas de endocitose 1-3. Notavelmente, a maquinaria CME é altamente conservada ao longo da evolução de tal modo que a maioria das proteínas relacionadas com o CME em levedura tem ortólogos humanos; Assim, a brotação levedura tem sido uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de endocitose que são conservados em eucariotas superiores. Por exemplo, estudos utilizando levedura de germinação determinado que a formação e maturação de estruturas CME (referidas manchas de actina como corticais em levedura) envolve o recrutamento sequencial de muitas proteínas, começando com clatrina e proteínas adaptadoras de ligação de carga, seguido de recrutamento de acessório endocítica adicional proteínas,activação da polimerização de actina Arp2 / 3-mediada, e recrutamento de proteínas envolvidas em 1,2 vesícula cisão. Recrutamento de proteínas para máquinas CME cortical manchas de actina é um processo altamente ordenada e estereotipada, e a ordem exacta do recrutamento para muitas proteínas foi estabelecida com respeito a outros componentes da maquinaria de CME. Importante, estudos mais recentes confirmaram uma ordem semelhante de recrutamento de proteínas CME em depressões revestidas de clatrina-4 em células de mamífero.
Além CME, muitos tipos de células possuem um ou mais endocítica (CIE) vias independentes de clatrina que se baseiam em mecanismos alternativos para promover a formação de vesículas e internalização da membrana do plasma de 5-7. Em leveduras, que recentemente identificaram um caminho CIE que utiliza a pequena GTPase Rho1 e sua ativação guanina fator de troca de nucleotídeos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa o formin Bni1 para promover a polimerização da actina 10,11, o que é necessário para esta forma de endocitose independente de clatrina em levedura 12. Além disso, a família α-arrestina de proteínas recrutar o ubiquitina ligase Rsp5 para promover ubiquitination carga e internalização posterior pelo CME 13-17, e também promover a internalização de carga pela via CIE, possivelmente através de interacção directa com proteínas envolvidas no CIE 18. Uma variedade de vias CIE também existe nas células dos mamíferos, incluindo as vias independentes de clatrina e fagocíticas que dependem do ortólogo Rho1, RhoA 9,19. O papel de RhoA em CIE de mamífero é mal compreendida; Assim, os estudos em levedura de brotamento pode fornecer insights mecanicistas adicionais que são aplicáveis a CIE mamíferos.
quantificação precisa dos acontecimentos de endocitose pode fornecer informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas na regulação endocitose, e pode revelar os efeitos das mutações no internalização carga ou progressioN através da via endocítica. Para este efeito, métodos bioquímicos podem ser utilizados para monitorar a absorção do ligando ou para medir as taxas de degradação de proteínas de carga de endocitose. Em células vivas, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes para cargas de interesse permite a visualização direta de transporte de carga. No entanto, cargas GFP são de uso limitado para a quantificação de endocitose porque GFP é resistente à degradação no lisossoma (ou vacúolo em levedura). Além disso, a GFP fluorescente é apenas parcialmente sensível a mudanças no pH, e permanece detectável dentro do vacúolo lúmen 20,21. Consequentemente, a fluorescência do marcador GFP persistir no vacúolo longo após o restante da carga foi degradada, e quantificação baseado em células inteiras de intensidade de carga podem ser imprecisas devido à fluorescência da GFP longo prazo no vacúolo.
A fim de ultrapassar os inconvenientes da fluorescência de GFP vacuolar, que anteriormente feito uso de pH supereclipticluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que fluoresce intensamente a pH neutro, mas perde fluorescência em ambientes ácidos, tais como o lúmen do vacúolo / lisossomo 20,22,23. Colocação de uma etiqueta pHluorin na cauda citoplasmática de cargas de endocitose permite a visualização das cargas na membrana plasmática e em endossomas precoces, onde a etiqueta pHluorin permanece exposta ao citoplasma (Figura 1A). Já endossomos maduros, o complexo endossomal triagem necessária para embalagens de transporte (ESCRT) máquinas cargas localizadas de superfície em vesículas que brotam no lúmen do endossomo, gerando corpos multivesiculares (MVBs) 24. Para cargas que foram incorporados em vesículas internas MVB, a tag pHluorin faces para o lúmen das vesículas. MVB vesículas internas são acidificada; Assim, cargas pHluorin-tag perder sua fluorescência no início endossomas à medida que amadurecem em MVBs 20. fusão subsequente da MVB com o vacúolo oferece o conteúdo MVB luminaispara a degradação, tags e pHluorin permanecem extinta no ambiente ácido do lúmen do vacúolo.
Este artigo fornece descrições detalhadas dos ensaios de endocitose quantitativos usando cargas com marcas pHluorin citoplasmáticos em levedura. As estirpes que expressam cargas pHluorin-tag podem ser utilizados em ensaios cinéticos e / ou ponto de extremidade, em função das propriedades e o comportamento de tráfico da carga específica. Além disso, algumas cargas pHluorin-tag são passíveis de métodos de análise de alto rendimento, incluindo citometria de fluxo. Importante, a tag pHluorin é um instrumento versátil para estudar eventos de endocitose nas células vivas, permitindo a quantificação de endocitose e comparação da função endocítica no tipo selvagem e estirpes mutantes.
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Protocol
1. Soluções e mídia
- Prepare os estoques A seguir, Mídia e Placas:
- Para preparar 10x YNB, dissolve-se 67 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, em 1 L de água. Esterilizar por filtração através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 um.
- Prepare meio YNB usando 1x YNB (a partir de 10x estoque) com dextrose% 2 (de um estéril 50% w / v estoque) e mistura 1x aminoácido / nutriente (de 100x estoque, consulte o passo 1.1.4). Para a selecção do plasmídeo, omitir aminoácidos individuais ou nutrientes conforme necessário. Para indução da expressão Mup1, adicionalmente omitir a metionina a partir da mistura de aminoácidos / nutriente.
- Prepare placas YNB YNB usando 1x (10x de estoque), 2% de dextrose (a partir de uma solução estéril de 50% w / v de estoque), 0,7 g / L de mistura de amino ácido / nutriente (ver o passo 1.1.5) e 2,5% de agar. Preparar o meio da placa em autoclave 25 g de ágar e 0,7 g de ácido amino mistura / nutriente por 860 ml de água. Deixar a mistura arrefecer até 55 ° C, depois adicionar 100 ml de 10x YNB e 40 ml de oF 50% de glucose. Verter em placas (cerca de 30 ml de meio por caixa de 10 cm), permitem que a forma a solidificar à temperatura ambiente, e armazenar as placas a 4 ° C.
- Preparar uma solução de ácido da amina / nutriente 100x (para meio líquido), dissolvendo o seguinte em 100 ml de água desionizada: 0,1 g de L-metionina, 0,3 g cada de L-leucina e L-lisina, e 0,2 g cada de L-histidina , L-triptofano, adenina e uracilo (outros aminoácidos e os nutrientes podem ser incluídos, conforme necessário para as estirpes específicas). Use suave calor se necessário para dissolver, e esterilizar através de um filtro de nitrocelulose de 0,45 um. Armazenar à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Para a selecção do plasmídeo, preparar soluções de reserva sem componentes específicos, conforme necessário.
- Prepare de aminoácidos / mistura de nutrientes (por placas) por combinação do seguinte: 0,5 g de adenina, 4 g de L-leucina, e 2 g de cada de L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-triptofano, L- tirosina e uracilo. Moer com um almofariz e pilão, e guarde com proproteção da luz. Para a selecção do plasmídeo, preparar misturas faltam componentes específicos, conforme necessário, e utilizar 0,7 g de uma mistura de aminoácidos por litro de meio de placa (ver o passo 1.1.3).
- Preparar lâminas de câmaras de 8 poços para a microscopia por revestimento da superfície da lâmina com concanavalina A (ConA). A cada cavidade da lâmina câmara, adicionar 25 ul de 2 mg / ml de ConA dissolvidos em água. Utilizando uma ponta de pipeta, propagar a ConA em toda a superfície do fundo do poço, em seguida, permitir que a corrediça se secar ao ar à temperatura ambiente durante pelo menos 4-8 horas. Idealmente, usar lâminas de câmaras dentro de 24 h de revestimento ConA.
- Gerar linhagens de leveduras com fusões em-frame de GFP ou pHluorin para a carga endocítica de interesse utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) método de integração baseado descrito no Longtine et al. e Goldstein e McCusker 25,26.
NOTA: Os plasmídeos contendo pHluorin marcação com cassetes de genes para resistência a canamicina (KANMX6) e (nourseothricin- Amplificar cassetes GFP ou pHluorin contendo marcadores seleccionáveis com iniciadores contendo sequências adicionais específicos para o local de integração genómica 20,25.
- Transformar o produto de PCR resultante na estirpe de levedura desejado usando o método do acetato de lítio 27.
- Seleccionar para integração da cassete de células que crescem em placas de YPD contendo a droga apropriada. Para preparar as placas, autoclave 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 0,1 g de triptofano e 25 g de ágar em 960 ml de água. Antes de vazar placas, deixar a mistura arrefecer até 55 ° C, e depois adicionar 40 ml de 50% de glicose e ou G418 para uma concentração final de 200 ug / ml para selecção KANMX6, ou nourseothricin a uma concentração final de 100 ug / ml durante selecção NATMX4.
- Confirmar a integração da GFP ou etiqueta pHluorin em colónias individuais por PCR e / ou transferência de Western utilizando anticorpos anti-GFP,bem como por detecção da proteína etiquetada por microscopia de fluorescência 20.
NOTA: estirpes de levedura específica e plasmídeos usados neste estudo estão listados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.
2. Endpoint Ensaio para a fluorescência no estado estacionário de constitutivamente Internalized endocítica Carga
- Inoculação das células (~ 3 pequenas colónias) em 5 ml de meio YNB que faltam os ácidos aminados ou nutrientes conforme necessário para a manutenção do plasmídeo (se aplicável). Crescer as células durante 16-24 h num incubador com agitação orbital a 30 ° C, com agitação 250 rpm. Alternativamente, uma sequência de ~ 1-2 mm de colónias de células para uma placa de YNB sem aminoácidos ou nutrientes para selecção de plasmídeos, e as células crescer durante a noite a 30 ° C.
- Medir a densidade (OD 600) de cada cultura durante a noite utilizando um espectrofotómetro. Prepare uma diluição de 5 ml a 0,35-0,4 OD 600 / ml em meio YNB sem aminoácidos ou nutrientes para PLAmanutenção Smid, e crescer durante cerca de 3 horas a 30 ° C com agitação. Se usando células semeadas em uma placa, ignore esta etapa e prossiga com o passo 2.4 (veja abaixo).
- Medir a densidade (OD 600) de células, que deve agora ser entre 0,6-1,0 OD 600 / ml. Transferir 1,5 mL da cultura para um tubo de microcentrífuga, e células de pelotas a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Remover 1.475 ul de sobrenadante.
- Traga células a um microscópio de fluorescência. Antes de imagem cada amostra, preparar um slide por ressuspensão das células no meio restante e montar 3 ul de suspensão de células sob uma lamela. Em alternativa, preparar a lâminas de câmaras de 8 poços tal como descrito abaixo no protocolo 3, utilizando meio YNB conforme apropriado para selecção de plasmídeos. Idealmente, as células da imagem com um 100X, 1,4 ou superior abertura numérica (NA) de imersão em óleo lente objectiva, uma câmara de 12 ou 16 bits, e os filtros de excitação / emissão optimizados para a fluorescência de GFP.
NOTA: Se utilizar células cultivadas por listando ona placa, prepare o slide, colocando 3 mL de meio YNB fresca sobre uma lamela. Utilizando uma ponta de pipeta, recolher uma pequena colónia de células a partir da placa, dispersar as células para o meio YNB, e montar a suspensão resultante em uma lâmina de vidro imediatamente antes da imagiologia. - Imagem 4-6 campos aleatórios de células para cada uma das condições, utilizando os mesmos parâmetros de aquisição (isto é, conjuntos de filtros e tempo de exposição) para todas as imagens dentro de uma experiência.
NOTA: Coletando uma imagem DIC de campo claro ou para cada campo pode ser útil para as células onde o sinal pHluorin se apaga em MVB e compartimentos vacuolares. - Quantificar a intensidade de fluorescência de pelo menos 30-50 células para cada condição (ver protocolo 5).
3. Kinetic Ensaio para Quantificação de endocitose de Cargos que sofrem endocitose Regulado
- Inocular 2-3 colónias de células de levedura (cerca de 2 mm de diâmetro por colónia) em 5 ml de meio YNB sem metionina e adicionaraminoácidos itional ou nutrientes para a manutenção da selecção do plasmídeo. Crescer as culturas durante 16-24 horas a 30 ° C com agitação.
NOTA: Neste trabalho, protocolos para estudar as proteínas de carga de endocitose regulados fará uso da permease metionina, Mup1. Outras cargas que são submetidos a endocitose regulado também são adequados para a marcação com pHluorin (por exemplo, a uracil permease Fur4, que se acumula na membrana plasmática na ausência de uracilo, e em resposta a internaliza aplicado externamente uracilo); para essas cargas, condições mídia deve ser modificada para refletir as condições específicas de expressão, de indução e de internalização para que a carga. - Medir a densidade (OD 600) de cada cultura durante a noite a cerca de 3 horas antes de imagem. Prepare uma diluição de 5 ml a 0,35-0,4 OD 600 / ml em meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para a manutenção do plasmídeo, e crescer a 30 ° C com agitação.
- Pré-equilibrar as microslidar de câmara ambiental ou estágio aquecida (se disponível) a 30 ° C durante a incubação de 3 horas da etapa 3.2.
- Transferir 1 ml de cultura de células para um tubo de microcentrífuga, e células de pelotas a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Retirar 975 ul de sobrenadante.
- Prepare um slide câmara de tratados ConA, de 8 poços de fundo de vidro para imagens (protocolo 1.2).
- Adicionar 200 ul de meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para selecção de plasmídeos a cada poço. Ressuspender o sedimento celular a partir do passo 3.4 no sobrenadante remanescente, e queda de 2,5 ul de suspensão de células no centro de cada poço. Dispersar células em toda a superfície do poço pipetando para cima e para baixo, e permitir que as células se contentar com 5-10 min.
- Colocar a lâmina na câmara de um microscópio de fluorescência invertido, equilibrada a 30 ° C (ver passo 3.3). Localize um campo de células com uma iluminação de campo claro.
- Adicionar 50 ul de meio YNB contendo 100 ug / ml de metionina(Pré-aquecido a 30 ° C) aos 200 ul de meio do poço para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml. Evitar a ruptura do meio no poço, a fim de evitar que as células de flutuação a partir do fundo.
- Permitir que as células a equilibrar durante 2 min antes do início da imagiologia. Imediatamente antes de capturar a primeira imagem, ajuste o microscópio para o plano focal desejado (tipicamente, um plano focal equatorial funciona melhor).
- Adquirir imagens GFP e brightfield (ou DIC) em intervalos de 5 min para 45-60 min, utilizando parâmetros de aquisição idênticos para todas as imagens dentro de uma série de tempo (por exemplo, 100X 1.4 NA objectiva de imersão em óleo e 500 tempo de aquisição ms usando o filtro GFP, 100 o tempo de aquisição usando mseg filtro DIC).
NOTA: Se fase do microscópio e o software de imagens não permitem para a correcção automática de desvio do plano focal, pode ser necessário reajustar manualmente o foco antes de cada ponto de tempo de imagem. Além disso, os tempos de aquisiçãovariar entre microscópios devido a diferenças na iluminação e filtros, e as condições óptimas devem ser determinados manualmente antes de se iniciar o experimento. Se uma carga diferente de endocítica Mup1 é usado, pode ser necessário modificar os intervalos de tempo de aquisição e de imagem, bem como a duração da experiência, de modo a reflectir a cinética internalização de que a carga. - Quantificar a intensidade de fluorescência de células individuais em cada ponto de tempo (ver protocolo 5), e expressar os valores como uma percentagem da intensidade inicial da primeira imagem.
4. Endpoint Ensaio para Quantificação de endocítica Cargos que sofrem endocitose Regulado
- Prepare células para geração de imagens como descrito no protocolo 3 (passos 3.1 a 3.6).
- Imagem 4-5 campos aleatórios de células para cada condição imediatamente antes de adicionar metionina, usando claro e filtro GFP sets.
- Adicionar 50 ul de meio YNB contendo 100 ug / ml de metionina (pré-guerraMed para 30 ° C) aos 200 ul de meio do poço para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml. Evitar a ruptura do meio no poço, a fim de evitar que as células de flutuação a partir do fundo.
- Imagem 4-5 campos aleatórios de células de 30 min após a adição de metionina, utilizando os mesmos parâmetros de aquisição como para o ponto de tempo 0 min (passo 4.2).
- Quantificar a intensidade de fluorescência de pelo menos 30-50 células para cada ponto de tempo (ver protocolo 5). valores expressos como a percentagem de Mup1-pHluorin internalizado depois de 30 min, utilizando a fórmula: [intensidade média a 0 min - intensidade média de 30 min] / [intensidade média a 0 min] x 100%.
NOTA:. É possível realizar simultaneamente até oito ensaios pontos finais ao escalonar o tempo de início de cada ensaio Tabela 3 fornece um fluxo de trabalho exemplo para oito ensaios simultâneos.
5. Pós-aquisição Análise
- imagens de exportação de software de aquisição como um 16-bit formato de arquivo de imagem com etiquetas (.tif ou tiff).
NOTA: Outros formatos de arquivo também podem ser adequados, e deve idealmente usar algoritmos de compressão lossless. imagens de 8 bits não são geralmente adequadas para fins de quantificação. - Abrir arquivos usando o software ImageJ (disponível gratuitamente opção 'Abrir' em no menu 'File'. Use a imagem de fluorescência para a quantificação e a imagem de campo claro / DIC como referência para identificar a localização das células e para excluir as células mortas (se presente ), que aparecem mais escuras do que as células vivas quando vistos por DIC e são autofluorescente quando visto com filtros GFP excitação / emissão.
- Realizar uma subtracção de fundo a imagem de fluorescência. Para imagens com um sinal de fundo irregular, usar o algoritmo 'subtração' encontrado na 'menu Process'. Use a configuração padrão (raio de rolamento bola de 50 pixels), que é geralmente suficiente para fins de quantificação.
NOTA: Um backgro alternativamétodo de subtração und para imagens com fundo uniforme é descrito na etapa 5.3.1.-5.3.2; No entanto, o método também funciona acima para o fundo uniforme.- Para as imagens com fundo uniforme (isto é, a intensidade do fundo é aproximadamente constante em todas as extremidades e no centro da imagem), executar um manual de subtracção do fundo. Clique no botão 'seleções à mão livre' encontrada na janela ImageJ principal e selecione 3-5 regiões aleatórias dentro da imagem que não contêm células.
- Abra a função 'set' Medidas localizado no menu "Analisar", selecione o parâmetro 'Média Cinza Valor', e medir valores de intensidade utilizando a função 'Medida' (também encontrado no menu "Analisar"). Calcule o valor médio das 3-5 regiões medidos, e subtrair todas as medições posteriores dessa imagem.
- Para quantificação dos ensaios cinéticos (protocolo 3), gerar uma imagem única, empilhadas para o timE Series. Abra as imagens de fluorescência de cada ponto de tempo em ordem cronológica, e gerar uma pilha utilizando as 'imagens para Stack' função (encontrado no menu 'Imagem', sob o sub-menu Stacks).
- Delinear uma célula usando a ferramenta de seleção à mão livre, certificando-se de incluir toda a célula, mas tão pouco área externa da célula possível.
- Medir os seguintes parâmetros: 'Área, Densidade Integrada "e" Média Cinza Valor'. Selecione os parâmetros usando a função "Definir Medidas", localizado no menu "Analisar".
NOTA: Densidade integrada corresponde à soma de todas as intensidades de pixel dentro da região seleccionada, e a média Cinzento valor corresponde a [Densidade integrada / Área], o qual corrige os valores de intensidade para o tamanho da célula. - Abra o "ROI Manager 'localizado no menu" Analisar ", na sub-menu" Ferramentas ". Na janela de ROI Manager, clique no botão "Adicionar" para entrar na regio em destaquen como uma nova região de interesse (ROI).
- Repita os passos 5.4 através de 5.6 para as células restantes na imagem. Excluir quaisquer células mortas, como avaliadas pelo brightfield / DIC e fluorescência (células mortas aparecem mais escuras em imagens DIC, e ter sinal citoplasmática autofluorescente quando visto com GFP excitação / emissão; veja a Figura 2F), e quaisquer células que tocam a borda da imagem. Salvar as ROIs selecionadas como um arquivo .zip, clicando no botão 'Mais' na janela 'ROI Manager' e exportar todas as medições para uma planilha ou software de análise estatística.
- Para a quantificação de ensaios cinéticos (Protocolo 3), delinear e medir uma célula a partir do ponto inicial de tempo, tal como descrito nas etapas 5.4 e 5.5. Utilizar o mesmo ROI para a medição de todos os pontos de tempo subsequentes no experimento.
- Para os ensaios de endpoint (protocolos 2 e 4), medida de um mínimo de 30-50 células para cada condição. Realizar quantificação por pelo menos 2-3 imagens, e inclui todas as células em cadaimagem que atender aos critérios descritos no passo 5.8 na análise.
- Avaliar a significância estatística entre as amostras utilizando ANOVA de uma via, seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey para análise post hoc.
6. Análise da População de Mup1-pHluorin Endocytosis por citometria de fluxo
- Inocular 2-3 colónias de células de levedura (cerca de 2 mm de diâmetro por colónia) em 0,5 ml de meio YNB sem metionina e amino ácidos adicionais ou de nutrientes para a manutenção da selecção do plasmídeo. Cultivar células em tubos de 5 ml de fundo redondo durante 16-24 h a 30 ° C num tambor de rolos.
- Adicionar 1,5 ml de meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para a manutenção do plasmídeo, e crescer a 30 ° C durante mais 3 horas num tambor de rolos.
- Transferir 1 ml de células em cada um de dois tubos de 5 ml de fundo redondo. Adicionar 0,25 ml de meio YNB -Met para o primeiro tubo (condição -Met), e 0,25 ml de meio YNB contendo 100 ug/ Ml de metionina para o segundo tubo para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml (estado + Met). Incubar as células a 30 ° C durante 45 minutos num tambor de rolos.
- Analise as células por citometria de fluxo, a selecção de dispersão para a frente (FS) como uma medida do tamanho da célula, e Mup1-pHluorin intensidade de fluorescência a partir de um filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) como uma medida da internalização de carga.
- Utilizar os botões de controle deslizante para ajustar a tensão dos canais FITC e FS para optimizar a detecção para a gama de tamanho e intensidade de fluorescência das células de levedura a ser utilizado (para estas experiências, foram utilizadas configurações de 50 V para o FS e 400 V para FITC).
NOTA: Tensão para ambos os canais irá variar dependendo do citómetro de fluxo a ser utilizado. Este passo deve ser feito antes ou durante o tratamento de 45 min com metionina (passo 6.3). - Meça FS e intensidade de fluorescência para 10.000 células de cada estado, usando a configuração de caudal elevado. Gerar um gráfico de dispersão de FS contra fluorescência intensidade: clique em "adicionar gráfico", selecione FITC (eixo-x) e FS (eixo y), e gráfico 1.000 pontos (o software irá exibir valores para 1000 células, mesmo que 10.000 células foram medidos).
NOTA: Para manter a consistência máxima, analisar células 45-50 min após a adição de metionina; para experiências que envolvem um grande número de amostras, escalonar adição de metionina para acomodar o tempo necessário para a análise de citometria de fluxo. - Incluem condições Met e + reuniram-se para células do tipo selvagem (WT) como controle. Usando a função de porta, atribuir uma porta vertical, utilizando a condição WT + Met, de tal modo que cerca de 5% das células brilhantes cair para a direita do portão. Utilize este gating para todas as outras condições do experimento.
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Representative Results
Localização de estado estacionário e quantificação da proteína carga endocítica constitutivamente internalizado Ste3
Para demonstrar que as cargas pHluorin-tag pode ser utilizada para a quantificação de endocitose em células vivas, a localização de GFP quimérico e fusões pHluorin com a cauda citoplasmática de terminal-C de Ste3, o receptor de feromonas do factor A em levedura, foram comparados. Ste3 é um receptor acoplado a proteína G (GPCR) que é constitutivamente transportados para a membrana do plasma, internalizadas, e direccionada para o vacúolo de degradação 28. Assim, sob condições de estado estacionário, a maioria das Ste3 localiza no lúmen vacúolo, como pode ser visto nas células de tipo selvagem (WT) que expressam Ste3-GFP (Figura 2A). Em contraste, as células sem os genes que codificam para as quatro proteínas de ligação do adaptador de clatrina ENT1, Ent2, Yap1801 e Yap1802 (ENT1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, doravante referida como 4Δ) não conseguem estabilizar clatrina em locais de endocitose 29, e estão gravemente defeituosa em CME 30. Células 4Δ requerem expressão da homologia N-terminal (Enth) de domínio de qualquer ENT1 ou Ent2 epsin para 30,31 viabilidade. O domínio Enth não é suficiente para a endocitose em 4Δ células, como mostrado pela retenção de Ste3-GFP na membrana plasmática nas células 4Δ ENTH1 + que expressam o domínio Enth de ENT1 (Figura 2A) 8,30; de retenção da membrana do plasma semelhante em células 4Δ + ENTH1 tem sido observada para outros cargas de endocitose, incluindo Ste2-GFP (o receptor de feromonas-fator α) e Mup1-GFP ou Mup1-pHluorin (uma permease de metionina) 8,18. Em contraste, a expressão de ENT1 de comprimento completo a partir de um plasmídeo em células 4Δ (4Δ + ENT1) restaura a endocitose e localização de Ste3-GFP para o vacúolo. células 4Δ + ENTH1 foram usados recentemente ina tela genética para identificar uma via CIE em levedura que se baseia na modulação da GTPase-actina Rho1 e sua GEF, Rom1, bem como a formin Bni1 e membros da família α-arrestina de proteínas envolvidas na carga triagem 8,18. Consistente com um papel na CIE, a expressão de Rom 1 ou a LDB19 α-arrestina-de elevado número de cópias em células plasmídeos 4Δ + ENTH1 internalização de Ste3-GFP (Figura 2A) melhoradas.
As células que expressam Ste3-GFP ou outras cargas de endocitose GFP têm vacúolos brilhantes devido à acumulação e resistência proteolítica da tag GFP. Em contraste, as células que expressam Ste3-pHluorin têm níveis muito baixos de fluorescência devido à têmpera vacuolar da etiqueta pHluorin em ambientes ácidos 20. Como se viu anteriormente, as células WT e 4Δ + ENT1 mostrou muito pouco detectável Ste3-pHluorin por microscopia de fluorescência (Figura 2B). Em contraste, Ste3-pHluorinfoi prontamente detectável na membrana plasmática de células 4Δ + ENTH1, enquanto vacuolar Ste3-pHluorin permaneceu quase indetectável em todos os casos. -Expressão de elevado número de cópias de Rom 1 ou LDB19 reduziu a quantidade de detectável Ste3-pHluorin na superfície da célula, semelhante aos resultados com Ste3-GFP, embora vacuolar Ste3-pHluorin permaneceu quase indetectável em todos os casos.
Para comparar a eficácia da GFP e cargas como ferramentas pHluorin-marcado para quantificar alterações na capacidade endocítica de células, fluorescência de células inteiras de Ste3-GFP e Ste3-pHluorin foi medida em WT e 4Δ células. Embora as alterações na localização Ste3-GFP foram prontamente detectável por microscopia (Figura 2A), as diferenças de intensidade de fluorescência total não foram estatisticamente significativas entre WT, 4Δ ENT1 + e células 4Δ + ENTH1 transformadas com vector vazio (Figura 2C) 20. Likewise, células 4Δ + ENTH1 transformadas com o vector, e ROM1 LDB19 tinham intensidades de fluorescência de células completas semelhantes. Notavelmente, as células 4Δ + ENTH1 transformadas com ROM1 ou LDB19 foram significativamente mais fraca do que as células WT (Figura 2C) 8,18; No entanto, os níveis de proteína Ste3-GFP foram semelhantes tal como avaliado por imunotransferência (Figura 2E). Embora a diferença na intensidade pode ser devida, em parte, a mudanças no tamanho do vacúolo ou morfologia, ou para diferenças de retenção da etiqueta de GFP no vacúolo, quantificação de fluorescência Ste3-GFP não reflecte as alterações na localização observadas por microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em contraste, a quantificação da intensidade Ste3-pHluorin demonstraram que as células 4Δ + ENTH1 transformadas com vector foram significativamente mais brilhante do que as células WT ou 4Δ + ENT1, e expressão de alta cópia do ROM1 ou LDB19 em células 4Δ + ENTH1 reduzida intensidade Ste3-pHluorin paraníveis que eram semelhantes aos WT e 4Δ + ENT1 (Figura 2D). Assim, a quantificação da intensidade de estado estacionário Ste3-pHluorin reflete com precisão as diferenças na localização observadas por microscopia de fluorescência.
Os ensaios de internalização cinéticos usando a carga endocítica regulada, Mup1
A quantificação da intensidade de fluorescência para cargas constitutivamente internalizados no estado estacionário pode revelar as diferenças na capacidade de endocitose de células mutantes em comparação com células WT. No entanto, é possível que algumas cargas podem alcançar a mesma distribuição em estado estacionário e a intensidade em células mutantes WT e endocíticas, mesmo que as células mutantes têm um atraso na endocitose ou mais lentas cinética para a internalização de carga. Em vez de cargas, pHluorin-tag que sofrem endocitose regulada, em resposta a um estímulo ou ligando específico pode ser utilizado para monitorizar ocinética de endocitose. Para este efeito, a internalização da metionina permease de alta afinidade, Mup1, foi monitorizada 32. Na ausência de metionina extracelular, Mup1 expressão é regulada positivamente, e a permease é retida na membrana plasmática; após a adição de metionina ao meio, Mup1 sofre interiorização rápida e direccionamento para o vacúolo 13.
Para monitorizar a cinética da Mup1 internalização, as estirpes que expressam WT-GFP ou Mup1 Mup1-pHluorin a partir do locus genómico foram cultivadas na ausência de metionina, a fim de acumular Mup1 fluorescente na membrana plasmática (Figura 3A ponto de tempo, 0 min). imagiologia de lapso de tempo de células foi, em seguida, realizada a intervalos de 5 min na ausência ou na presença de metionina para monitorar a internalização de carga e as alterações na fluorescência. Como esperado, GFP e pHluorin-tagged Mup1 fotografada na ausência de metionina manteve-se na membrana plasmática de fou todo o período de observação de 45 min 20. Em contraste, as células fotografada na presença de metionina mostrou a progressiva diminuição do sinal de fluorescência da superfície celular, consistente com a internalização de carga. Notavelmente, Mup1-GFP fluorescência acumulada em estruturas internas (isto é, endossomas e o vacúolo), ao passo que Mup1-pHluorin localizada punctae interna que provavelmente correspondem aos primeiros endossomas, mas não foi observada no vacúolo.
Quando a fluorescência foi quantificada através de todos os pontos de tempo para células individuais, Mup1-GFP e Mup1-pHluorin intensidade apresentaram pouca alteração na ausência de metionina aplicado externamente no decurso de 45 min experimento, consistente com a proteína restante localizada de forma estável para a membrana plasmática (Figura 3B). Em contraste, de célula inteira intensidade Mup1-pHluorin rapidamente diminuída na presença de metionina, de modo a que uma redução de 50% no fluorescence intensidade foi observada após aproximadamente 20-25 min, e uma redução de 80% foi observada após aproximadamente 40 min 20. células Mup1-GFP também mostraram uma diminuição na intensidade de fluorescência após a adição de metionina; No entanto, a cinética da perda de fluorescência foram atrasado em comparação com os de Mup1-pHluorin, tal que uma diminuição de 50% na intensidade foi observada apenas após 40 min. Como pode ser visto na Figura 3A, Mup1-GFP era apenas detectável na membrana plasmática, neste momento, indicando que persistente vacuolar fluorescência GFP impedido quantificação precisa dos acontecimentos de endocitose na superfície da célula.
Os ensaios de ponto de extremidade utilizando o endocítica carga regulada, Mup1
Além ensaios quantitativos, cinéticas de endocitose conforme descrito acima, cargas de endocitose regulamentados, tais como Mup1 também podem ser utilizadas para ensaios de ponto de extremidade, semelhante à quantificaçãode steady-state intensidade Ste3-pHluorin. Para este efeito, o ensaio para a quantificação de Mup1-pHluorin internalização foi modificado para permitir a comparação das intensidades médias de fluorescência de populações de células fotografada imediatamente antes ou 30 min após a adição de metionina 8,18. Esta abordagem permite a comparação da percentagem de Mup1 internalizado entre células mutantes WT e endocitose.
De acordo com os resultados do ensaio de cinética (Figura 3), Mup1-pHluorin foi rapidamente consumido a partir da membrana plasmática em células WT (Figura 4A), de tal modo que cerca de 60% de Mup1-pHluorin foi internalizado 30 min após a adição de metionina ( A Figura 4B). Como esperado, Mup1-pHluorin internalização foi igualmente eficaz em 4 + ENT1 células, enquanto que a internalização foi significativamente reduzida em células 4Δ + ENTH1, consistentes com um defeito grave em endocitose. expressão de alta cópiade ROM1 ou LDB19 α-arrestina, que é especificamente necessário para Mup1 internalização via tanto CME e CIE vias 13,18, melhorou internalização de Mup1-pHluorin, coerente com a sua capacidade de promover a endocitose nas células 4Δ + ENTH1 18. Notavelmente, apesar de steady-state intensidade Ste3-pHluorin em células 4Δ + ENTH1 expressar de alta cópia ROM1 ou LDB19 era indistinguível de células WT ou 4Δ + ENT1, internalização de Mup1-pHluorin foi apenas parcialmente melhorada em células 4Δ + ENTH1 expressar de alta cópia ROM1 LDB19 ou (Figura 4C). Assim, estes dados indicam que os ensaios cinéticos e / ou ponto de extremidade pode revelar as diferenças nas taxas de endocitose entre WT e estirpes mutantes para algumas cargas, apesar de distribuição em estado estacionário semelhante de outras cargas podem ser alcançados nas mesmas estirpes.
Análise baseada em população de Mup1-PHLuorin internalização utilizando citometria de fluxo
análise de alto rendimento de populações maiores de células usando citometria de fluxo pode fornecer uma alternativa para realizar ensaios cinéticos e de terminal para internalização de carga por microscopia. Para este efeito, a intensidade de fluorescência de Mup1-pHluorin foi comparada em células WT a partir de uma cultura que cresceu na ausência de metionina (Met WT, que deve ser "brilhante") ou na presença de metionina durante 45 minutos (WT + Met, que deve ser "dim" em comparação com células não tratadas com base na redução de 80% na intensidade de fluorescência visto na Figura 3B). Após análise por citometria de um portão vertical foi aplicada à condição WT + Met, onde ~ 5% das células estavam contidos no lado da mão direita do portão, e correspondeu às células brilhantes dentro da população (Figura 5A e 5B fluxo , vermelho população). Quando o mesmo portão foi aplicadocom a condição WT -Met, aproximadamente 65% das células caiu na categoria brilhante, demonstrando que a citometria de fluxo pode ser usado para observar facilmente diferenças no Mup1-pHluorin intensidade de fluorescência entre as populações de células antes e após a adição de metionina. Em contraste, a distribuição de células brilhantes contra dim era indistinguível em condições 4Δ + ENTH1 Met e Met + usando a mesma porta aplicado à população WT + Met, consistente com endocitose defeituoso. Assim, a citometria de fluxo pode detectar alterações na capacidade de endocitose de células, e permite a análise rápida de grandes populações de células. É importante notar, citometria de fluxo podem também ser usados em telas genéticos como uma ferramenta para a triagem e selecção de células mutantes com endocitose defeituoso (K. Wrasman e B. Wendland, manuscrito em preparação) 33.
Figura 1:
Figura 2:. Localização e quantificação de Ste3-GFP e Ste3-pHluorin no tipo selvagem e mutantes de células de endocitose (A) WT, 4Δ + ENT1 e 4Δ + ENTH1 células que expressam genomicamente codificados Ste3-LFP e transformada com vector, de alta cópia ROM1 ou de alto cópia LDB19 como indicado foram visualizados por microscopia de fluorescência (linha superior) ou DIC (linha de fundo). imagens Ste3-GFP foram ajustadas para as mesmas intensidades máximas e mínimas para permitir a comparação directa de Ste3 localização. Células (B) WT, 4Δ + ENT1 e 4Δ + ENTH1 expressando genomically codificado Ste3-pHluorin foram transformadas e fotografada como descrito no painel A. Barra de escala = 2 uM. (C, D) Quantificação da intensidade de fluorescência para Ste3-GFP (C) e Ste3-pHluorin (D) estirpes utilizadas nos painéis A e B. Para cada condição, de fluorescência de células inteiras foi quantificada por um período mínimo de 40 células. Os valores foram corrigidos para o tamanho das células, e expresso em unidades arbitrárias (UA) como média ± EPM (*** p <0,001 em comparação com WT; ††† p <0,001 em comparação com 4Δ + + ENTH1 vector). (E) Relative expressão de Ste3-GFP avaliado em WT, 4Δ + ENT1 e células 4Δ + ENTH1 transformada com vector, ROM1 de alta cópia ou cópia de alta LDB19 como indicado. Os extractos celulares foram preparados como descrito anteriormente 20, e quantidades iguais de cada amostra foram resolvidas por SDS-PAGE. expressão ste3-GFP foi avaliada por imunotransf erência com anticorpos anti-GFP, e carga de proteína foi avaliada utilizando anti-GAPDH. (F), as células que expressam o tipo selvagem codificado genomicamente Ste3 viram-GFP por microscopia de fluorescência (painel Ste3-GFP) e DIC óptica, com uma célula morta indicado pelas setas. As células mortas aparecem autofluorescente no filtro GFP, e são mais escuras quando vistas por DIC. Barra de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Ensaio cinético de Mup1-GFP e Mup1-pHluorin internalização células do tipo selvagem (A) que expressa genomicamente codificados Mup1-GFP (dois painéis superiores) ou Mup1-pHluorin (inferiores dois painéis) foram cultivadas até à fase semi-logarítmica em meio YNB sem metionina para induzir a expressão e retenção Mup1 na membrana plasmática. As células foram então fotografadas por microscopia de fluorescência a cada 5 minutos, na ausência (- Met) ou na presença (+ MET) com 20 ug / ml de metionina. Para cada ponto de tempo dentro de uma condição, os valores de intensidade mínimo e máximo idênticos foram aplicadas para permitir a comparação da intensidade de fluorescência e localização. 0, 5, 10, 20 e 40 pontos de tempo mínimo são mostrados como indicado para todas as condições. Barra de escala = 2 uM. (B) Quantificação do Mup1-GFP e Mup1-pHluorin internalização em células do tipo selvagem a partir do painel Uma. intensidade de fluorescência de células inteiras de Mup1-GFP (- Met, quadrados roxos; + Met, diamantes azuis) ou Mup1-pHluorin (- MET, triângulos verdes; + Met, círculos vermelhos) foi medido para células individuais fotografada em intervalos de 5 minutos, e expressa como uma porcentagem da intensidade de fluorescência inicial (média ± SEM, n = 6 células por condição). Reproduzido de Prosser et al. (2010) 20, com a autorização do editor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Ensaio Endpoint de Mup1-pHluorin internalização (A) WT, 4Δ + ENT1 e 4Δ + ENTH1 células que expressam genomically codificado Mup1-pHluorin e transformada com vector, de alta cópia ROM1 ou de alto cópia LDB19 como indicado foram cultivadas até meados fase -logarithmic em meio YNB metionina falta. campos aleatórios de células foram fotografadas pela fluorescenc e microscopia imediatamente antes (- Met) ou 30 min depois (+ Met) adição de 20 ug / ml de metionina. Todas as imagens foram ajustadas para os mesmos valores máximos e mínimos de intensidade. Barra de escala = 2 uM. (B) Quantificação de Mup1-pHluorin internalização em células de painel A. Para cada condição, a intensidade de fluorescência de células inteiras foi medida durante um mínimo de 40 células e corrigidas para o tamanho celular. A percentagem de Mup1-pHluorin internalizada foi calculada comparando os valores médios da intensidade antes e após 30 min de tratamento com metionina. Os valores são apresentados como média ± SEM (n = 4; *** p <0,001 em comparação com WT; † p <0,05 em comparação com 4Δ + + ENTH1 vector). Este valor foi modificado a partir Prosser et al. (2015) 18 com a autorização do editor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. A análise populacional de Mup1-pHuorin internalização por citometria de fluxo de células WT e 4Δ + ENTH1 (A) foram cultivadas até à fase semi-logarítmica em meio YNB sem metionina. As células foram em seguida incubadas na ausência (- Met) ou na presença (+ MET) com 20 ug / ml de metionina durante 45 minutos antes da análise por citometria de fluxo. Para cada condição, de dispersão para a frente (em unidades arbitrárias, AU) foi representada graficamente contra a intensidade da fluorescência (UA, utilizando um filtro FITC) por 1.000 células num total de 10.000 células medido. As populações foram ainda analisados através da aplicação de um portão vertical (seta azul) para a condição WT + Met, em que cerca de 5% das células brilhantes (mostrados em vermelho) caiu no lado da mão direita do portão. O gating gerado para a condição WT + MET foi então aplicada às condições restantes para permitir a comparaçãode distribuição de amostra. (B) Síntese da percentagem de células dim (pontos negros, para a esquerda da porta) e células vivas (pontos vermelhos, para a direita do portão) para WT e 4Δ + ENTH1 ± ensaios Met mostrados no painel A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tensão | Genótipo | Fonte |
| SEY6210 um | MAT α HIS3-Δ200 trp1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 suc2-Δ9 | plasmídeo Laboratory |
| BWY2858 | STE3 :: GFP-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et ai. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 :: HIS3 yap1801Δ yap1802Δ :: LEU2 :: STE3-GFP KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 :: HIS3 yap1801Δ yap1802Δ :: LEU2 :: STE3-GFP KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | PrOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| um Todas as cepas utilizadas neste estudo são isogênico para SEY6210 exceto no loci indicada. | ||
Tabela 1: As estirpes de levedura utilizadas neste estudo.
| plasmídeo | Descrição | Fonte |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski e Hieter, 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, plasmídeo Laboratório |
| pBW0778 | pRS414 :: ENT1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, plasmídeo Laboratório |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | pROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | baseada em PCR pFA6a-GFP-KANMX6, o plasmídeo de integração para GFP-tagging em leveduras | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabela 2: Os plasmídeos usados neste estudo.
| Tempo (min) | Ações) |
| -5 | Imagem de Exemplo 1 (Met) |
| 0 | Adicionar metionina para provar 1 |
| Imagem de Exemplo 2 (Met) | |
| 5 | Adicionar metionina para provar 2 |
| amostra Imagem 3 (Met) | |
| 10 | Adicionar metionina para a amostra 3 |
| Imagem de Exemplo 4 (Met) | |
| 15 | Adicionar metionina a Amostra 4 |
| Imagem de Exemplo 5 (Met) | |
| 20 | Adicionarmetionina a Amostra 5 |
| Imagem de Exemplo 6 (Met) | |
| 25 | Adicionar metionina para provar 6 |
| Imagem de Exemplo 7 (Met) | |
| 30 | Adicionar metionina para provar 7 |
| amostra de imagem de 8 (Met) | |
| Imagem de Exemplo 1 (+ Met) | |
| 35 | Adicionar metionina para provar 8 |
| Imagem de Exemplo 2 (+ Met) | |
| 40 | Imagem de Exemplo 3 (+ Met) |
| 45 | Imagem de Exemplo 4 (+ Met) |
| 50 | Imagem de Exemplo 5 (+ Met) |
| 55 | Imagem de Exemplo 6 (+ Met) |
| 60 | Imagem de Exemplo 7 (+ Met) |
| 65 | amostra de imagem de 8 (+ Met) |
tabela 3: Fluxo de trabalho Exemplo de 8 ensaios escalonamento endpoint Mup1-pHluorin.
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Discussion
Aplicações de pHluorin para quantificação de eventos de endocitose em células de levedura faz uso de cargas transmembranares em que o marcador fluorescente está fundido com a cauda citoplasmática da proteína (Figura 1A). Para os ensaios aqui descritos, as cargas são fluorescentes brilhantemente quando a etiqueta pHluorin é exposta a ambientes neutros, mas tornar-se temperada, quando a etiqueta encontra pHluorin condições ácidas. Assim, uma carga endocítica pHluorin-etiquetado é facilmente detectada na face citoplasmática da membrana de plasma e no início dos endossomas, mas torna-se "dim", quando incorporado em vesículas MVB luminais ou no momento da entrega ao lúmen do vacúolo. Em geral, as cargas de endocitose recentemente sintetizadas provável deixar o retículo endoplasmático (ER) e atingir a membrana de plasma antes de GFP e muitas das suas variantes foram totalmente amadurecido; Assim, as cargas que ainda não atingiram a superfície da célula estão previstos pHluorin-etiquetada a menos que permanecem indetectáveis sair do RE ou Golgi é impaired.
O uso de cargas de endocitose pHluorin-tag, como Ste3 e Mup1 facilitou a caracterização de um certo número de proteínas envolvidas na via de levedura CIE (Figura 1B) 8,18. Especificamente, os métodos descritos no presente documento foram utilizados para demonstrar que o aumento da produção de actina-modulação GTPase Rho1 e promover a sua endocitose GEF Rom1 em uma variedade de mutantes de levedura com defeitos de CME 8. Além disso, cargas pHluorin-tag foram recentemente usados para demonstrar quantitativamente que a-Arrestinas, que têm papéis bem estabelecidos no CME 13-15,34-36, desempenham papéis de carga selectivo, tanto CME e CIE, e têm funções distintas mecanicamente nas duas vias 18.
Para os protocolos descritos neste documento, vários fatores importantes devem ser consideradas a fim de obter resultados quantitativos, consistentes. Em primeiro lugar, Mup1-GFP ou Mup1-pHluorin expressão e FLUOREScência pode diminuir à medida que as células de levedura aproximar ou entram na fase estacionária de crescimento (resultados não publicados); Assim, as células cultivadas a partir de uma cultura durante a noite devem ser diluídas e re-cultivadas durante mais 3 horas (ver passos 3.1-3.2 e 6.1-6.2). Além disso, quando o escalonamento várias condições experimentais ou estirpes em ensaios de ponto final ou para análise por citometria de fluxo, é importante recolher dados para todas as amostras depois de a mesma duração do tratamento metionina, a fim de permitir comparações entre as condições individuais. Para a análise pós-aquisição, quantificação deve ser efectuada utilizando imagens de 16 bits, uma vez que a conversão para o formato de 8 bits faz com que a perda de dados que podem afectar os valores da intensidade de fluorescência. Além disso, a subtracção de fundo deve ser realizada antes da quantificação (passo 5.3), uma vez que o sinal de fundo pode ocluir significativamente diferenças de intensidade entre amostras.
Considerando pHluorin-tagged Ste3 e Mup1 provaram passíveis de quantificação, nãotodas as cargas será bem adequado para pHluorin tagging. Por exemplo, as tentativas de marcar o receptor de factor-α Ste2 produziram resultados quantitativos inconsistentes, possivelmente devido à menor intensidade de fluorescência de Ste2-pHluorin comparada com a de Ste3 ou Mup1 (resultados não publicados), embora seja possível que as etiquetas em tandem pHluorin poderia melhorar a intensidade do sinal. Além disso, as cargas com taxas muito baixas de endocitose induzida pelo ligando podem não ser passíveis de pHluorin marcação de quantificação, especialmente se a meia-vida de internalização é mais longo do que o ciclo da célula de levedura (cerca de 90 min). Para essas cargas, uma diminuição na fluorescência poderia surgir de endocitose e / ou de particionamento da carga entre as células mãe e filha durante a divisão. Assim, testar cargas individuais de interesse é recomendado, a fim de determinar se a sua expressão e cinética são adequados para pHluorin-tagging e quantificação.
Embora estudos recentes utilizando PHLuorin têm-se centrado principalmente em eventos de endocitose na membrana plasmática, cargas pHluorin-tag pode ser usado para estudar os eventos posteriores de tráfico na via endocítica. Por exemplo, Mup1-pHluorin tem sido utilizado com sucesso no fluxo de ensaios baseados em citometria de carga mediada por ESCRT triagem em MVBs 37, uma vez que a etiqueta fica pHluorin extinta por incorporação em vesículas MVB luminais 20. Esta abordagem é semelhante ao o repórter de luciferase mais recentemente descrita de deposição intraluminal ensaio (LUCID), que faz uso de cargas com uma marcação de luciferase citoplasmática para gerar um sinal bioluminescente na presença de luciferina 38,39. Semelhante a extinção do pHluorin fluorescência após a incorporação MVB vesículas luminais, bioluminescência no ensaio LUCID é atenuada com a incorporação da marca luciferase em vesículas MVB. Enquanto pHluorin e ensaios lúcidos são conceptualmente semelhantes, cargas pHluorin-tag pode ser usado para estudar a endocitose e MVB maturação iN células intactas.
existem métodos alternativos para a quantificação de endocitose, e forneceram informação valiosa sobre as taxas de internalização em carga de tipo selvagem e mutantes de células de endocitose. Exemplos incluem a absorção de monitorização de ligandos radiomarcados tais como α-fator (que se liga ao receptor de feromonas Ste2) e uracilo (que é internalizado pela permease Fur4) 40,41, ou o controlo da velocidade de degradação para cargas de endocitose, tais como Ste3 como eles são internalizados e transportados para o vacúolo 42. Estas abordagens bioquímicas requerem a lise das células, e assim não são adequados para a quantificação directa em células vivas. Alternativamente, marcado por fluorescência α-fator, o corante de fase fluida Amarelo Lucifer, ou o corante de estirilo FM4-64 pode ser usado para visualizar endocitose nas células vivas, mas não permitem a monitorização directa de proteínas expressas endogenamente carga 40,43,44. Por estas abordagens, a persistência de fluorescência no valumen cuole pode complicar a quantificação, como visto com GFP. É também possível utilizar cargas GFP para a quantificação de endocitose por medição da intensidade de fluorescência de células inteiras e subtraindo o sinal de / vacuolares compartimentos endossomais e citoplasmáticos; No entanto, endossomas e vacúolos são muitas vezes em estreita proximidade com a membrana plasmática. Em contraste, as cargas de endocitose pHluorin-tag são temperadas em MVB / vacúolo compartimentos, o que pode ser uma vantagem distinta para a quantificação de eventos de tráfico em comparação com a etiqueta de GFP mais amplamente utilizado. Nossos estudos futuros irá expandir o conhecimento atual das vias de endocitose e triagem de carga em levedura para identificar fatores adicionais que contribuem para a CME e CIE, e para compreender os mecanismos que regulam as decisões de triagem de carga.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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