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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

एक Published: December 8, 2016 doi: 10.3791/54592
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, *1, *1
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster
* These authors contributed equally

Introduction

3 - रक्त मस्तिष्क बाधा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 से प्रणालीगत संचलन अलग करती है। यह एक शारीरिक बाधा है कि कोशिकाओं की मुक्त आवाजाही और पानी में घुलनशील अणुओं के प्रसार को रोकता है और रोगज़नक़ों और हानिकारक पदार्थों से मस्तिष्क की सुरक्षा प्रदान करता है। इसकी बाधा समारोह के अलावा, बीबीबी मस्तिष्क पैरेन्काइमा, जो न्यूरोनल ऊतक के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के लिए सक्षम बनाता है। बीबीबी के कार्यात्मक संपत्तियों अत्यधिक अति विशिष्ट ईसीएस इसकी मुख्य संरचनात्मक तत्व होने के साथ सबसे सेलुलर और अकोशिकीय घटकों द्वारा विनियमित रहे हैं। बीबीबी की ईसीएस तंग जंक्शन (टीजे) परिसरों, fenestrations की कमी, बहुत कम pinocytic गतिविधि है, और स्थायी रूप से सक्रिय परिवहन तंत्र की उपस्थिति की विशेषता है। बीबीबी के अन्य घटकों के चुनाव आयोग के तहखाने झिल्ली, pericytes endothelium, astrocytic अंत पैर और = जुड़े बराबर embeddingन्यूरॉन्स और microglia के साथ एक साथ 6 और, neurovascular इकाई (NVU), जिसमें से सीएनएस 7 समुचित कार्य के लिए सक्षम बनाता है के रूप में - - enchymal तहखाने झिल्ली भी की बीबीबी 2,4 विकास, रखरखाव और समारोह में योगदान 9।

ऐसे neurodegenerative, सूजन या संक्रामक रोगों के रूप में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों की एक किस्म में, बीबीबी के समारोह 2,5,10 समझौता किया है। टी जे परिसरों और आणविक परिवहन तंत्र का अनियंत्रण बीबीबी पारगम्यता, ल्युकोसैट परिस्त्राव, सूजन और neuronal नुकसान वृद्धि की ओर जाता है। ऐसे pathophysiological शर्तों के तहत बीबीबी गुणों का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल 9,11,12 स्थापित किया गया है। साथ में वे बाधा अखंडता, पारगम्यता के साथ ही परिवहन तंत्र के परिवर्तन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इन मॉडलों को मानव, माउस, चूहे, सुअर या बी के endothelial कोशिकाओं को रोजगारovine उत्पत्ति 13 - 18; 25 - प्राथमिक endothelial कोशिकाओं या सेल लाइनों या तो एक मोनोकल्चर के रूप में या pericytes और / या आदेश विवो 19 में और अधिक बारीकी से बीबीबी की नकल करने में astrocytes के साथ एक साथ सुसंस्कृत हैं। हाल के वर्षों में, transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) की माप endothelial बाधा गुण 26,27 आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते उपकरण बन गया है।

तीर सेल monolayer भर आयन प्रवाह को प्रतिबाधा को दर्शाता है और इसकी कमी से समझौता endothelial बाधा अखंडता और इसलिए वृद्धि की पारगम्यता के एक संवेदनशील उपाय प्रदान करता है। 30 - विभिन्न Teer माप सिस्टम उपकला Voltohmmeter (EVOM), इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट मुक़ाबला सेंसिंग (ECIS), और वास्तविक समय सेल विश्लेषण 15,28 सहित विकसित किया गया है। तीर (paracellular मार्ग) आसन्न ईसीएस के बीच आयन प्रवाह के लिए प्रतिरोध को दर्शाता है और सीधे करने के लिए आनुपातिक हैबाधा अखंडता। प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी 27,31 में, जटिल कुल प्रतिबाधा (जेड) में मापा जाता है, जो सीसीएल को मापने के द्वारा बाधा अखंडता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। सीसीएल कोशिका झिल्ली (transcellular मार्ग) के माध्यम से कैपेसिटिव वर्तमान से संबंधित है: सेल परत, बराबर बिजली के सर्किट में एक संधारित्र की तरह कार्य करता झिल्ली के दोनों किनारों पर आरोपों को अलग करने और व्युत्क्रमानुपाती बाधा अखंडता के लिए आनुपातिक है। जब पारगम्य सम्मिलित करता है पर हो, ईसीएस, पालन पैदा करना और microporous झिल्ली में फैल गया। इस डालने की पृष्ठभूमि कैपेसिटिव वर्तमान (जो अपने आप में एक संधारित्र की तरह काम करता है) और समाई में कमी की ओर जाता है, जब तक यह अपने न्यूनतम स्तर तक पहुँच को तैयार नहीं। यह टी जे की स्थापना के द्वारा पीछा किया जाता है आसन्न ईसीएस के बीच अंतरिक्ष के लिए रवाना कि मुहर परिसरों। इस paracellular मार्ग के माध्यम से आयन प्रवाह प्रतिबंधित, और तीर बढ़ जाती है जब तक वह अपने पठार तक पहुँचता है। भड़काऊ शर्तों के तहत, हालांकि, endotheliअल बाधा समझौता किया है: Teer कम हो जाती है टी जे परिसरों बाधित हो और सीसीएल बढ़ जाती है के रूप में डालने की कैपेसिटिव घटक फिर से बढ़ जाता है।

हमारे Teer माप का उपयोग करता है स्वचालित सेल निगरानी प्रणाली 32: यह प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के सिद्धांत को मानता है और अपने पिछले अनुप्रयोगों फैली हुई है। यहाँ, हम इन विट्रो बीबीबी मॉडल है कि बाधा गुण का अध्ययन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क endothelium की बातचीत सहित सक्षम बनाता का वर्णन; विशेष रूप से सक्रिय टी कोशिकाओं में। 37 - इस तरह के pathophysiological की स्थिति ऐसी एकाधिक काठिन्य और उसके पशु मॉडल प्रयोगात्मक autoimmune encephalomyelitis 33 के रूप में सीएनएस के स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों, में मनाया जाता है। इधर, एक महत्वपूर्ण कदम बीबीबी भर encephalitogenic, माइलिन विशेष टी कोशिकाओं की स्थानांतरगमन है। इस परिवाहकीय अंतरिक्ष और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश में उनकी पुनर्सक्रियन द्वारा पीछा किया जाता है, वे अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और मुझे जहाँdiate सूजन और बाद में माइलिन रहित 1,35,38। हालांकि, इस तरह के टी कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत के आणविक तंत्र, BBB के मुख्य घटकों, अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं। हमारी प्रोटोकॉल इस अंतर को भरने और endothelial कोशिकाओं (यानी, बाधा अखंडता और पारगम्यता) उनके सीधे संपर्क और जटिल परस्पर क्रिया पर सक्रिय टी कोशिकाओं के साथ पर परिणामों में नए अंतर्दृष्टि देने के लिए करना है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं, microporous झिल्ली के साथ पारगम्य सम्मिलित करता है पर एक monolayer के रूप में उगाया का उपयोग करता है। Endothelial कोशिकाओं सह सुसंस्कृत सीडी 4+ टी कोशिकाओं है, जो या तो polyclonally या एक विशिष्ट प्रतिजन फैशन में पूर्व सक्रिय हो सकते हैं के साथ कर रहे हैं। पूर्व सक्रिय है, लेकिन नहीं भोले टी कोशिकाओं के साथ MBMECs के सह-संस्कृति Teer में कमी और सीसीएल में वृद्धि हुई है, जो MBMEC शिथिलता और बाधा व्यवधान का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है लाती है। तकनीकगैर इनवेसिव है: यह chopstick इलेक्ट्रोड, जो चुनाव आयोग monolayer के प्रमुख गड़बड़ी रोकने के बजाय निर्मित में उपयोग करता है; यह सेल मार्कर के उपयोग के बिना बाधा समारोह पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक स्वचालित फैशन में सतत मापन करता है और दो बाधा मानकों (तीर और सीसीएल) एक साथ समय के साथ की एक स्वतंत्र मूल्यांकन सक्षम बनाता है। विधि को भी काफी संवेदनशील टी सेल सक्रियण के विभिन्न स्तरों और ईसी पर इस तरह के टी कोशिकाओं के प्रभाव के बीच भेद करने के लिए है।

यह कार्यात्मक assays की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग किया जा सकता है: अलग साइटोकिन्स और / या chemokines सूजन प्रक्रियाओं में फंसा MBMECs और टी कोशिकाओं के सह संस्कृति को जोड़ा जा सकता है; पर या तो चुनाव आयोग या टी सेल की ओर सेल आसंजन अणुओं के खिलाफ अवरुद्ध एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है; और टी सेल सक्रियण मार्कर की या उनके cytolytic संपत्तियों की अवरोधकों टी सेल भड़काना या ईसीएस के साथ उनके सह-संस्कृति के दौरान जोड़ा जा सकता है। परख भी टी सेल स्थानांतरगमन के लिए उपयोगी हैassays, के रूप में यह MBMEC monolayer अखंडता टी कोशिकाओं के अलावा पहले की एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं। यह सब इस विधि चुनाव आयोग monolayer अखंडता पर सक्रिय टी कोशिकाओं के प्रभाव पर ध्यान देने के साथ, इन विट्रो में बीबीबी अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी और विश्वसनीय उपकरण बनाती है। यह ऐसे एमएस और उसके पशु मॉडल EAE, जहां आत्म प्रतिक्रियाशील, encephalitogenic टी कोशिकाओं बीबीबी पार और सूजन और neuronal नुकसान का कारण के रूप में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के रोगजनन में बीबीबी विघटन के तंत्र को समझने के लिए विशेष महत्व का है।

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Protocol

सभी प्रयोगों के लिए, चूहों नस्ल और हैम्बर्ग विश्वविद्यालय में केंद्रीय जानवरों की सुविधा में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में बनाए रखा गया है, जानवरों की देखभाल के लिए जर्मन के दिशा-निर्देशों के अनुसार। सभी प्रयोगों पशु प्रयोगात्मक आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया और नॉर्थ राइन वेस्टफेलिया, जर्मनी (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) के स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. MBMEC अलगाव और संस्कृति

नोट: MBMECs पृथक रूप में पहले निम्नलिखित संशोधनों के साथ विस्तार 14 में वर्णित है:

  1. बलिदान 20 वयस्क C57BL 6 / सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों (6-8 सप्ताह पुराने) और हृदय और सांस की गिरफ्तारी का पता लगाने से उनकी मौत की पुष्टि करें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ माउस कुल्ला और कैंची का उपयोग कर इसे सिर काटना; खोपड़ी संदंश और कैंची का उपयोग कर हटा दें। खोपड़ी के बाएँ और दाएँ पक्ष पर चीरों बनाओ, रंध्र मैग्नम से शुरू। अपनी दुम पक्ष और Tak से खोपड़ी लिफ्टबाहर ई संदंश के साथ मस्तिष्क।
  3. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, बाँझ संदंश का उपयोग एक पेट्री डिश में मस्तिष्क जगह है और मस्तिष्क स्टेम, सेरिबैलम, और चेतक को हटाने, केवल कोर्टेक्स रखने के लिए।
    नोट: एक माइक्रोस्कोप का उपयोग इन चरणों में से किसी के लिए आवश्यक नहीं है।
  4. बाँझ पश्चिमी सोख्ता कागज के एक टुकड़े पर कोर्टेक्स प्लेस और यह धीरे रोल संदंश के साथ जब तक तानिका नहीं रह दिखाई दे रहे हैं।
  5. यांत्रिक और enzymatic पाचन (प्रोटोकॉल 14 के बाद) के बाद, एक लंबे, बाँझ सुई और एक 5 मिलीलीटर सवार का उपयोग करके घनत्व ढाल से endothelial कोशिकाओं को इकट्ठा। Endothelial कोशिकाओं एरिथ्रोसाइट्स के साथ लाल अंगूठी के ऊपर एक संदिग्ध परत के रूप में दिखाई देते हैं। एक नया 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में इस परत का हस्तांतरण 20-25 मिलीलीटर; DMEM के साथ ट्यूब ऊपर।
  6. धोने के 14 में से दो राउंड के बाद, MBMEC (4 माइक्रोग्राम / एमएल) puromycin युक्त मध्यम के 6 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और उन्हें एक 24 अच्छी तरह से थाली के छह लेपित कुओं पर बीज, उन्हें एक ऊतक में छोड़37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर संस्कृति तीन दिनों के लिए (यहाँ पर से 'इन्क्यूबेटर' के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
    नोट: MBMEC कोटिंग समाधान की जानकारी के लिए, सामग्री तालिका देखें।
  7. Puromycin बिना ताजा MBMEC माध्यम की हर अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़कर मध्यम बदलें; 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर वापस दो और दिनों के लिए थाली रख दिया।

2. फसल काटने MBMECs

  1. MBMEC अलगाव के बाद पांच दिन, MBMEC कोटिंग समाधान के साथ पूर्व कोट पारगम्य सम्मिलित करता है: डालने के प्रति समाधान के 80 μl जोड़ें और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें छोड़ने के लिए और 5% सीओ 2।
  2. ध्यान से कोटिंग समाधान बाहर पिपेट और 30 मिनट के लिए सम्मिलित हवा शुष्क करते हैं। थाली की अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान के 2 मिलीलीटर (आरटी) पीबीएस जोड़ें, मध्यम धोने के लिए MBMECs उपयोग करते हुए; इस चरण को दोहराएँ। 0.05% trypsin EDTA (अच्छी तरह से प्रति 300 μl) जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में थाली छोड़ दें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से MBMEC मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें रोकने के लिएtrypsinization। एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब के लिए एकत्र कोशिकाओं स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 700 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और puromycin बिना MBMEC माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
  4. कोशिकाओं की गणना; 0.04% Trypan ब्लू के 90 μl (कोशिकाओं की 10x कमजोर पड़ने) के साथ सेल निलंबन के 10 μl मिश्रण। पिपेट गिलास को कवर और सेल गिनती चैम्बर (hemocytometer) के बीच इस मिश्रण के 10 μl। चैम्बर (एन) के सभी चार quadrants में Trypan ब्लू-मुक्त कोशिकाओं की गणना और गिना कोशिकाओं (एन) की औसत संख्या का निर्धारण इस प्रकार है: 'एन = एन / 4।
  5. निम्न सूत्र का उपयोग (10 6 कोशिकाओं / एमएल) में सेल एकाग्रता की गणना: सी = 'एन 10 x 4 x 10, जहां 10 4 hemocytometer के आयामों के द्वारा दिया जाता है और 10 2.4 कदम से कमजोर पड़ने कारक है।
  6. बीज डालने के प्रति 260 μl की मात्रा में 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं। अच्छी तरह से प्रत्येक के निचले डिब्बे में MBMEC माध्यम के 810 μl जोड़े। तैयार है जब तक इनक्यूबेटर में सम्मिलित करता है के साथ थाली की धारा 4 के साथ आगे बढ़ने के लिए रखें।
    नोट: ऊपरी और निचले डिब्बे के लिए संस्करणों डालने विशिष्ट है और सभी 24 अच्छी तरह से प्रारूपों के लिए काम नहीं करते।

3. सीडी 4+ टी सेल अलगाव और उत्तेजना

  1. सीडी 4+ टी सेल अलगाव
    1. सीओ 2 साँस लेना द्वारा एक वयस्क माउस (6-8 सप्ताह पुराने) बलिदान और हृदय और सांस की गिरफ्तारी सुनिश्चित करने के द्वारा अपनी मौत की पुष्टि करें।
    2. एक साफ विच्छेदन बोर्ड पर अपनी पीठ पर माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ यह कुल्ला; पेरिटोनियम खोलने के लिए और प्लीहा और लिम्फ नोड्स (वंक्षण, कक्षा, बाहु और गर्भाशय ग्रीवा) को हटाने के लिए बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करें; अंत में, बर्फ पर पीबीएस के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में ऊतक हस्तांतरण।
    3. लामिना का प्रवाह हुड के तहत, शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के साथ एक 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में ऊतक के साथ पीबीएस decanting द्वारा ऊतक स्थानांतरण; homogenizeझरनी के माध्यम से 1 मिलीलीटर सवार के साथ यह दबाकर ऊतक।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर FACS बफर और यह सेंट्रीफ्यूज के 30 मिलीलीटर जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FACS बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर, ट्यूब के लिए FACS बफर के एक और 20 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर यह अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FACS बफर के 500 μl में कोशिकाओं resuspend।
    6. , माउस सीडी 4 चुंबकीय microbeads के 20 μl जोड़े मिश्रण अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर FACS बफर और यह सेंट्रीफ्यूज के 25 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. इस बीच में, चुंबक में एक LS जुदाई स्तंभ जगह है और FACS बफर के 3 मिलीलीटर के साथ यह कुल्ला। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FACS बफर के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    8. स्तंभ कोशिकाओं जोड़ें। FACS के 3 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो तीन बार बफर। चुंबक से स्तंभ निकालें और एक नया 15 मिलीलीटर Centri पर यह जगहfugation ट्यूब। , FACS बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 XG पर स्तंभ सवार और यह सेंट्रीफ्यूज के साथ लेबल कोशिकाओं को बाहर निकलवाने।
    9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और टी सेल के माध्यम से 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। 2.4 और बीज प्रति अच्छी तरह से माध्यम के 100 μl में 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गणना।
  2. सीडी 4+ टी सेल उत्तेजना
    1. पॉलीक्लोनल सीडी 4+ टी सेल उत्तेजना
      1. प्री-कोट शुद्ध विरोधी माउस CD3 एंटीबॉडी पीबीएस में (क्लोन 145-2C11), के साथ एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली एक वांछित अंतिम एकाग्रता में। उदाहरण के लिए, पूर्व कोट करने के लिए 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में α-CD3 के साथ पूरी थाली पीबीएस, भंवर के 5 मिलीलीटर के साथ एंटीबॉडी के 10 μl (शेयर एकाग्रता = 0.5 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण और मिश्रण के 50 μl जोड़ने अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक के साथ प्रत्येक।
      2. 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में थाली छोड़ दें। टी कोशिकाओं को अलग करने के बाद, पीबीएस के साथ दो बार पूर्व लेपित थाली धो लें। शुद्ध विरोधी CD28 एंटीबॉडी जोड़ें (क्लोन37.51) एक वांछित अंतिम एकाग्रता में पृथक टी कोशिकाओं (जैसे, 1 माइक्रोग्राम / एमएल) पर; अच्छी तरह मिलाएं। टी कोशिकाओं बीज और दो से तीन दिन के लिए इनक्यूबेटर में उन्हें छोड़ दें।
    2. वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) के साथ विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4+ टी सेल उत्तेजना
      नोट: डीसी प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, तो इन अपवादों के साथ, टी सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. तिल्ली homogenizing से पहले, 0.5 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस में कोलेजिनेस आइए प्रकार के 1 मिलीलीटर के साथ यह इंजेक्षन और एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब को हस्तांतरण।
      2. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में सेते हैं। पीबीएस के साथ धोने के बाद, FACS बफर में गोली resuspend और सीडी 4 microbeads माउस CD11c चुंबकीय microbeads के 20 μl, बजाय जोड़ें।
      3. एक एमएस जुदाई स्तंभ और उचित मात्रा में प्रयोग करें: FACS बफर के 1 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला; FACS बफर के 1 मिलीलीटर और resuspend कोशिकाओं FACS बफर तीन बार के 1 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें।
      4. विज्ञापनDCS (जैसे, माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) हूँ 35-55 20 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए पसंद की डी प्रतिजन, अच्छा मिश्रण है और बीज 5 एक्स 10 4 टी सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl में प्रति कोशिकाओं 96 राउंड bottom- कुंआ।
      5. 1 एक्स 10 5 टी कोशिकाओं टी सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl में टी के लिए प्रोटोकॉल सेल अलगाव में वर्णित है, अंत में प्रति 96 दौर नीचे अच्छी तरह से जोड़ें।
    3. बी कोशिकाओं के साथ विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4+ टी सेल उत्तेजना
      नोट: बी कोशिकाओं APCs के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, इन अपवादों के साथ, टी सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. ट्रांसजेनिक चूहों जिसका बी कोशिकाओं विशिष्ट प्रतिजन (जैसे, IGH MOG (ध) चूहों, जिसका बी कोशिकाओं को विशेष रूप MOG 35-55 को पहचान कर रहे हैं) से spleens का प्रयोग करें।
      2. प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं (जैसे, TCR MOG (2D2) चूहों से) का प्रयोग करें। सीडी 4 microbeads के बजाय माउस CD19 चुंबकीय microbeads के 20 μl जोड़ें।
      3. पसंद के प्रतिजन बी सेल में जोड़ेरास (जैसे, MOG 35-55 20 माइक्रोग्राम / एमएल पर), अच्छी तरह से प्रति 96 दौर नीचे अच्छी तरह से मिश्रण और बीज बी सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं।
      4. प्रति टी सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl में 1 एक्स 10 5 टी कोशिकाओं मे 96 दौर नीचे अच्छी तरह से, टी सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है।

4. स्थापना और Teer मापन प्रदर्शन

  1. Teer साधन की 24 अच्छी तरह से मॉड्यूल लामिना का प्रवाह हुड के नीचे रखें। संदंश का उपयोग साधन में MBMECs साथ पलकों और जगह सम्मिलित निकालें।
  2. मॉड्यूल कुओं के निचले डिब्बे में ताजा माध्यम के 810 μl पिपेट: डालने और अच्छी तरह से मॉड्यूल की दीवार के बीच इसे ध्यान से जोड़ें।
  3. पलकों को बंद करने और इनक्यूबेटर में साधन जगह है। अपने कंप्यूटर के लिए साधन कनेक्ट; साधन नियंत्रक पर बारी और सॉफ्टवेयर खुला।
  4. पॉप-अप विंडो में 'नए माप' का चयन करें। चेसी.के. 'शो तीर' और 'शो सीसीएल' बक्से; तो प्रेस 'आरंभ'। पहली माप पूरा करने के बाद, 'परिणाम' टैब में 'सभी कुओं की जांच' सभी तीर और सीसीएल मूल्यों देखने के लिए का चयन करें।
  5. फ़ाइल सहेजें: फ़ाइल>> 'के रूप में अपनी फाइल का नाम' बचाओ।
    ध्यान दें: तीर और सीसीएल लगातार एक स्वचालित फैशन में मापा जाता है के रूप में, तीन से पांच दिन की अवधि में उनके मूल्यों की निगरानी। मध्यम बदलने आवश्यक नहीं है, जब तक कि सेल व्यवहार्यता सबऑप्टिमल है, के रूप में Teer में वृद्धि की कमी से कल्पना की है।
  6. टी कोशिकाओं के साथ MBMECs-संस्कृति सह करने के लिए जब सीसीएल स्थिर और की तुलना में कम 1 μF / 2 सेमी है और तीर अपने अधिकतम स्तर पर पहुंच गया है समय बिंदु का चयन करें।
  7. ध्यान से पूर्ण तीर और सीसीएल मूल्यों का निरीक्षण किया और कुओं जिसमें MBMECs ऐसे कुओं करें द्वारा मिला हुआ पर्याप्त monolayers विकसित नहीं किया है बाहर।
  8. समूह कुओं के बाकी: एक अच्छी तरह पर राइट क्लिक करें और 'नया औसत अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से जोड़ें' का चयन करें। वियतनामपॉप-अप विंडो में ई; सभी के लिए अलग-अलग कुओं बांटा जा करने के लिए एक ही है।
  9. इस बात की पुष्टि करने के लिए उन सभी को सह संस्कृति से पहले ही प्रारंभिक स्थिति है कि सभी औसत कुओं की जाँच करें। कुछ काफी अलग निरपेक्ष Teer मान हो या तीर ढलानों, या मानक त्रुटियों भी बड़े हैं, समूहीकरण फिर से करना।
    नोट: कुओं का इष्टतम समूह, Teer मूल्यों में कम से कम भिन्नता प्रदान करता है दोनों के भीतर और प्रयोगात्मक समूहों के बीच।
  10. 'प्रयोग' टैब में, प्रेस 'ठहराव', साधन काटना और इसे इनक्यूबेटर से बाहर ले। लामिना का प्रवाह हुड के तहत पलकों निकालें।
  11. तैयार पूर्व सक्रिय और / या भोले टी कोशिकाओं के साथ या विशिष्ट साइटोकिन्स, एंटीबॉडी या अन्य पदार्थों के बिना, के रूप में वांछित: उदाहरण के लिए: मिक्स शुद्ध ना / ले चूहा विरोधी माउस IFN-γ एंटीबॉडी (क्लोन XGM1.2) तैयार टी के साथ कोशिकाओं, 20 माइक्रोग्राम / Teer साधन की अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर पर।
    एक ऐसी granzyme बी अवरोध के रूप में पदार्थ इस्तेमाल कर रहे हैं, वे हैं: नोटटी सेल उत्तेजना की शुरुआत में टी सेल संस्कृति के लिए dded: जैसे, granzyme बी एफडीए द्वितीय (Calbiochem) DMSO में 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में पृथक टी कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। अधिक जानकारी के लिए सामग्री और उपकरण देखें।
  12. डालने से मध्यम (ऊपरी अच्छी तरह से डिब्बे) के कुछ निकालें: जैसे, ध्यान से 150 μl बाहर विंदुक (हटाने सभी मध्यम से परहेज किया जाना चाहिए क्योंकि यह MBMEC monolayer को परेशान कर सकता है)।
  13. ध्यान से 2 x 10 5 कोशिकाओं / डालने युक्त मध्यम के 150 μl pipetting द्वारा MBMECs करने के लिए टी कोशिकाओं जोड़ें।
    नोट: जब पूर्व सक्रिय टी कोशिकाओं की कटाई, केवल नष्ट करना, Trypan ब्लू-मुक्त कोशिकाओं की गिनती।
  14. पलकों को बंद करने और साधन वापस इनक्यूबेटर जगह है। साधन और प्रेस 'को फिर से शुरू माप' कनेक्ट करें। 24 घंटा 'प्रयोग' टैब में, प्रेस 'बंद' के बाद और फ़ाइल (फ़ाइल> सहेजें) बचाने के लिए।

5. डेटा निर्यात और सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. > फ़ाइल को चुनने के निर्यात से परिणामों को निर्यात।
  2. पॉप-अप विंडो का "सेटिंग" टैब में, "डॉट" "दशमलव विभाजक" विकल्प में और "टैब" "क्षेत्र सीमांकक" विकल्प का चयन करें।
  3. "निर्यात परिणाम" टैब में, फ़ाइल नाम, जाँच सभी कुओं का निर्यात किया जा सकता है, और "डेटा चुनें" विकल्प में "तीर" और "सीसीएल" बक्से की जाँच करें।
  4. प्रेस "निर्यात डेटा," निर्यात फ़ाइल खोलने के लिए, और एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा की प्रतिलिपि।
  5. निर्यात डेटा मानक (प्रत्येक रन (माप के लिए दिए गए तीर और सीसीएल मूल्यों के साथ, प्रत्येक को दोहराने के अनुसार क्रमबद्ध)): सह संस्कृति से पहले अंतिम समय बिंदु के सेट तीर और सीसीएल मूल्यों 100% करने के लिए और अन्य सभी के लिए तदनुसार मूल्यों को बदलने रन, '100%' रन के सापेक्ष।
  6. पसंद का एक सॉफ्टवेयर के लिए सामान्यीकृत डेटा कॉपी एक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए, अलग-अलग कुओं का उपयोग और प्रत्येक उपचार के समूह के लिए मतलब की मानक त्रुटि प्रदर्शित।
  7. पीकई तुलना के लिए एक Bonferroni सुधार के साथ erform दो तरह से एनोवा सांख्यिकीय परीक्षण, चुनाव के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर।

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Representative Results

चित्रा 1 टी कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल में इन विट्रो बीबीबी मॉडल की एक सामान्य अवलोकन प्रदान करता है। प्रयोग के तीन प्रमुख चरणों के होते हैं। पहले कदम के मस्तिष्क cortices से प्राथमिक MBMECs के अलगाव, और पांच दिनों के लिए उनकी संस्कृति है। जब वे सेल संस्कृति की थाली में संगम तक पहुँचने, MBMECs trypsinized और पारगम्य सम्मिलित करता है, जो तब तीर साधन में रखा जाता है पर reseeded रहे हैं। तीर और MBMECs की सीसीएल लगातार मापा जाता है और तीन से पांच दिन की अवधि में निगरानी कर रहे हैं। इस बीच में, टी कोशिकाओं से अलग-थलग, उत्तेजित (चरण 2), और दो से पांच दिन, प्रकार और प्रोत्साहन की शक्ति के लिए सुसंस्कृत हैं। चरण 3 में, टी कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं और MBMECs के साथ सह सुसंस्कृत जब सीसीएल एक स्थिर निम्न स्तर पर है और Teer इसकी अधिकतम स्तर पर है। सह संस्कृति जब तीर इसकी पठार पर अब भी है के लिए इस समय बिंदु का चयन सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैपूरे माप की। इस प्रकार, यह बेहद जरूरी है कि टी सेल अलगाव और उत्तेजना के लिए समय बिंदु को ध्यान से चुना जाता है, तो यह है कि टी कोशिकाओं ईसीएस के लिए उनके अलावा के समय तक सक्रियण के वांछित स्तर तक पहुँचने। टी कोशिकाओं को जोड़ने के बाद, माप एक और दिन के लिए फिर से शुरू है और परिणामों का विश्लेषण कर रहे हैं।

प्रारंभिक पांच दिवसीय संस्कृति के बाद, MBMECs आसानी विशेषता धुरी के आकार आकृति विज्ञान (चित्रा 2A, बाएं पैनल) दिखाने के लिए और इस तरह के PECAM -1 और Claudin -5 (2A चित्रा, मध्य और सही पैनल) के रूप में endothelial सेल विशिष्ट मार्करों व्यक्त करते हैं। बहरहाल, यह अकेले उनकी पूरी संगम और उचित बाधा अखंडता के लिए पर्याप्त सबूत नहीं प्रदान करता है। मुक़ाबला स्पेक्ट्रोस्कोपी, दूसरे हाथ पर, monolayer अखंडता का एक अच्छा अनुमान देता है और अच्छी तरह से एक कार्यात्मक परख के प्रदर्शन से पहले प्रत्येक के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। चित्रा 2 बी में, के सबसेकुओं MBMECs जिसका सीसीएल मूल्यों स्थिर और कम थे निहित है, और उनके तीर मानों एक पठार पर पहुंच गया। इन कुओं बाद सह संस्कृति प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया। वे इस तरह के भीतर और समूहों के बीच विचरण कि टी कोशिकाओं (चित्रा -2) जोड़ने से पहले कम से कम था में वर्गीकृत किया गया। कुओं जिसका Teer मूल्यों बाकी (जैसे नीला वक्र चित्रा 2 बी में संकेत के रूप में) से काफी भिन्न है, इस्तेमाल नहीं किया गया, क्योंकि वे अस्पष्ट परिणाम या डेटा की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व करेंगे।

बशर्ते कि MBMEC संस्कृति और टी सेल उत्तेजना के लिए प्रारंभिक जरूरतें पूरी नहीं की है, प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी टी सेल-चुनाव आयोग बातचीत में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि दे सकते हैं। के रूप में चित्रा 3 ए और 3 बी में दिखाया गया Teer माप, इस तरह के एक बातचीत के लिए प्राथमिक readout और टी सेल की मध्यस्थता चुनाव आयोग में शिथिलता का एक उपाय के रूप में काम कर सकते हैं। इस मामले में, MBMECs micropores 0.4 के साथ सम्मिलित करता है पर हो रहे हैंव्यास में माइक्रोन, जो टी कोशिकाओं डालने झिल्ली के माध्यम से पारित करने की अनुमति नहीं है। चित्रा 3 ए से पता चलता है कि केवल प्रेरित किया, लेकिन जैसा कि सीसीएल में Teer में कमी और वृद्धि से निर्धारित नहीं भोले टी कोशिकाओं, चुनाव आयोग में शिथिलता उत्प्रेरण के लिए सक्षम हैं। भोले टी कोशिकाओं को इस तरह भोले टी कोशिकाओं को अपनी प्रारंभिक स्तर पर रहने के साथ सह-संस्कृति के दौरान, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं तीर और सीसीएल के बाद से। अपवाद (कोशिकाओं से थोड़ा अलग तापमान और पीएच मान हो सकता है के साथ नए माध्यम को जोड़ने, और पलकों को बंद करने, पलकों उठाने) के सह-संस्कृति, साधन से निपटने की वजह के बहुत शुरुआत में चोटी है। यह विरूपण साक्ष्य Teer माप के सभी प्रकार के साथ प्रकट होता है और विश्लेषण के दौरान नजरअंदाज कर दिया है। समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स IFN-γ और (100-500 यू / एमएल) पर TNF-α, जो चुनाव आयोग सूजन उत्प्रेरण के लिए सक्षम होने के लिए जाना जाता है के अलावा, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 3 में, MOG 35-55 विशिष्ट सीडी 4 है (जैसे, शुद्ध विरोधी माउस CD3 और CD28 एंटीबॉडी के साथ) (चित्रा 3 बी)। इधर, प्रोत्साहन की लंबाई, और इसके परिणामस्वरूप टी सेल सक्रियण के स्तर पर, विविध था। टी कोशिकाओं α-CD3 और α-CD28 एंटीबॉडी का एक ही राशि से प्रेरित थे, और लोगों को तीन दिनों के लिए सुसंस्कृत टी कोशिकाओं केवल दो दिनों के लिए सुसंस्कृत की तुलना में बाधा विघटन के लिए एक बड़ा प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया।

आदेश में वर्णित MBMEC monolayer विघटन के तंत्र की जांच करने के लिए, विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा -3 सी में परिणाम बताते हैं कि उत्तेजित टी कोशिकाओं, लेकिन उनके supernatants MBMECs के लिए एक बड़ा नुकसान होता है, यह दर्शाता है कि टी कोशिकाओं और MBMECs के बीच सीधा संपर्क बाधा विघटन के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक निष्क्रिय α-मैं के अलावाTeer माप के दौरान एफ एन γ एंटीबॉडी केवल थोड़ा सुधार MBMEC बाधा गुण, सुझाव है कि IFN-γ इस व्यवधान के प्राथमिक कारण नहीं हो सकता। दूसरी ओर, उनका कहना है granzyme बी एफडीए द्वितीय टी सेल संस्कृति के लिए (चित्रा 3 डी) एक बड़ी हद तक MBMEC अखंडता बहाल, MBMEC नुकसान और Teer में बाद में कमी के कारण में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी के रूप में इस cytolytic अणु की ओर इशारा करते।

चुनाव आयोग monolayer अखंडता पर टी कोशिकाओं के प्रभाव के लिए एक प्राथमिक readout के रूप में इसके उपयोग के अलावा, Teer माप भी बाधा अखंडता ऐसी टी-सेल स्थानांतरगमन परख के रूप में अन्य assays, करने से पहले की एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, सम्मिलित व्यास में 3 माइक्रोन की micropores के साथ किया जाता है। चित्रा 3E में, Teer माप क्रम में प्रदर्शन किया गया था कि यह सुनिश्चित करने MBMEC monolayer बाद transmigratio के लिए टी कोशिकाओं के अलावा पहले सभी कुओं में ईमानदारी का एक ही स्तर की थीn परख। इस उपकरण कुओं की कम डिब्बे से टी कोशिकाओं की कटाई के बाद किया गया, α-सीडी 4 एंटीबॉडी और प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ टी कोशिकाओं धुंधला हो जाना, सेल गिनती मनकों का उपयोग transmigrated टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए; चित्रा 3E में दिखाया गया है, मध्य और दाएं)। ध्यान दें कि स्थानांतरगमन के लिए इस्तेमाल किया Teer में काफी कमी का कारण नहीं था टी कोशिकाओं को प्रेरित किया, हालांकि वे चित्रा 3 ए में के रूप में पूर्व सक्रिय थे। यह transcellular मार्ग प्रतिरक्षा कोशिकाओं स्थानांतरगमन के दौरान उपयोग कर सकते हैं प्रतिबिंबित के रूप में पहले 39 देखा गया है हो सकता है। चित्रा 3F में, MBMECs के साथ कुओं के आधे IFN-γ और TNF-α (बनाम। सूजन uninflamed) के साथ सूजन थे, और बाद में, भोले टी कोशिकाओं transmigratory गतिविधि के आकलन के लिए जोड़ा गया था। इस मामले में, Teer माप के रूप में एक सुराग प्रदान की कैसे मजबूत साइटोकिन्स के साथ सूजन थी और जब टी कोशिकाओं transmigratio के लिए जोड़ा जाना चाहिएएन।

चित्रा 4 कि तीर परिणामों की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सबसे आम स्थितियों का कुछ पता चलता है। चित्रा -4 ए में, उदाहरण के लिए, नहीं सभी MBMECs एक ही समय में एक पूरी तरह से मिला हुआ monolayer विकसित की है। समूह ( 'भोले टी कोशिकाओं - बाहर रखा गया') में से एक MBMECs जिसका टी जे परिसरों सिर्फ टी कोशिकाओं के अलावा पहले अन्य समूहों की तुलना में एक अलग दर पर परिपक्व हो रहे थे निहित। इस समूह फलस्वरूप प्रयोग के दौरान 100% ऊपर तीर मूल्यों विकसित की है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया था। इस प्रकार, प्रयोग से पहले Teer वक्र (टी जे परिपक्वता की दर) की ढलान उचित डेटा की व्याख्या के लिए पूर्ण Teer मूल्यों के रूप में महत्वपूर्ण है। चित्रा 4 बी कि सह संस्कृति शुरू न केवल बहुत जल्दी लेकिन यह भी बहुत देर हो चुकी झूठी परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं पता चलता है। इधर, दोनों उत्तेजित टी कोशिकाओं के साथ समूह और नकारात्मक नियंत्रण समूह में (मध्यम चांगई), तीर मूल्यों को पहले से ही उनकी पठार बीत चुके हैं और प्रयोगात्मक हालत से स्वतंत्र रूप से कम करने के लिए शुरू कर दिया है, इसलिए पहले और प्रयोग के दौरान सबऑप्टिमल संस्कृति की स्थिति का संकेत है। इस तरह के समूहों विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए। अंत में, हालांकि तीर और सीसीएल आमतौर पर इस तरह है कि तीर में एक बड़ी कमी सीसीएल में एक बड़ी वृद्धि के साथ है में उनके मूल्यों को बदलने के लिए, यह हमेशा मामला नहीं हो सकता। चित्रा 4C में, उत्तेजित टी कोशिकाओं बी Teer में एक बड़ी कमी है, लेकिन उत्तेजित टी कोशिकाओं को एक किया था की तुलना में सीसीएल में एक छोटे वृद्धि का कारण बना।

आकृति 1
चित्रा 1: तकनीक का सिंहावलोकन। प्रारंभिक संस्कृति के बाद, MBMECs पारगम्य सम्मिलित करता है पर reseeded और स्वचालित सेल की निगरानी में रखा जाता है; तीर और सीसीएल 4-5 दिन के लिए हर घंटे मापा जाता है। इस बीच में, टी कोशिकाओं इन विट्रो में सक्रिय कर रहे हैं 40 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: MBMECs इन विट्रो बीबीबी मॉडल के लिए उपयुक्त एक मिला हुआ monolayer का विकास। (ए) धुरी के आकार आकृति विज्ञान (बाएं) और PECAM-1 (मध्य) और Claudin -5 (दाएं) MBMEC अलगाव के बाद पांच दिन की immunofluorescent धुंधला। (बी और सी) तीर और सीसीएल मूल्यों से पहले (बी) और बाद में (सी) व्यक्तिगत कुओं के समूह, पूर्व टीटी कोशिकाओं की ओ अलावा। के बाद से इस कुएं में MBMECs Teer अन्य कुओं में के रूप में उच्च विकसित नहीं किया है (बी) में नीले रंग की अवस्था है, प्रयोग के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहा है। (सी) डेटा दिखाएं ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिनिधि परिणाम है। (ई) टी कोशिकाओं के साथ बातचीत पर MBMEC शिथिलता के एक प्राथमिक उपाय के रूप में Teer में परिवर्तन। (ए) MOG विशेष टी कोशिकाओं पांच दिनों के लिए MOG 35-55 पेप्टाइड की उपस्थिति में MOG-विशिष्ट बी कोशिकाओं से सक्रिय थे। भोले टी कोशिकाओं और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स IFN-γ और TNF-α (100 यू / एमएल पर दोनों) क्रमश: एक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। (बी) टी कोशिकाओं, α-CD3 और α-CD28 एंटीबॉडी (1 माइक्रोग्राम / एमएल प्रत्येक) दो या तीन दिनों के लिए, के रूप में संकेत के साथ प्रेरित कर रहे थे उन्हें MBMECs में जोड़ने से पहले। (सी) टी कोशिकाओं ((A के रूप में पूर्व सक्रिय)) या उनके supernatants, α-IFN-γ एंटीबॉडी या इसी निर्धारण नियंत्रण की उपस्थिति में। (डी) टी कोशिकाओं दो दिनों के लिए ((बी) के रूप में पूर्व सक्रिय) granzyme बी अवरोध द्वितीय या अपनी मंदक DMSO की उपस्थिति में। (ई और एफ) केवल बाधा अखंडता टी सेल स्थानांतरगमन से पहले के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया Teer माप। MBMECs व्यास में 3 माइक्रोन के छिद्रों के साथ सम्मिलित करता है पर बड़े हो रहे थे। (ई) टी कोशिकाओं (ए) में वर्णित के रूप में प्रेरित किया, 18 घंटा (बाएं) के लिए बसना करने के लिए करते थे। इसके बाद, वे काटा गया, α-सीडी 4 एंटीबॉडी (क्लोन RM4-4) के लिए दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण, सेल गिनती मोती (मध्य और दाएं) का उपयोग कर। (एफ)MBMEC monolayer अखंडता की निगरानी IFN-γ और TNF-α, और स्थानांतरगमन परख के लिए टी कोशिकाओं के बाद इसके लिए उचित समय बिंदु को चुनने के साथ उत्तेजना पर। (वायुसेना) परिणाम तकनीकी triplicates दिखाने के लिए और तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रत्येक के प्रतिनिधि हैं। डेटा दिखाने का मतलब ± SEM। (ई, दाएं) unpaired, दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण। **, पी <0.01। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: व्यावहारिक दृष्टिकोण और डेटा की व्याख्या। (क) एक प्रयोगात्मक समूह (लाल वक्र) से MBMECs, विश्लेषण से बाहर रखा गया है उनके जंक्शनल परिसरों की परिपक्वता की दर के बाद से विभिन्न अन्य जीआर की तुलना में थाoups। (बी) बहुत देर हो चुकी टी कोशिकाओं को जोड़ने का एक उदाहरण है, जो MBMEC रोग का उचित मूल्यांकन रोका। (सी) विघटन करने पर उत्तेजित टी कोशिकाओं 'ए' से (काले वक्र), MBMECs की सीसीएल मूल्यों से Teer में सहवर्ती कमी एक ही टी कोशिकाओं की वजह से उम्मीद की होगी एक और नाटकीय वृद्धि देखी गई। (एसी) टी कोशिकाओं दो दिनों के लिए α-CD3 साथ प्रेरित किया गया और α-CD28 एंटीबॉडी (1 माइक्रोग्राम / एमएल प्रत्येक)। परिणाम तकनीकी triplicates दिखाने के लिए और तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रत्येक के प्रतिनिधि हैं। डेटा दिखाने का मतलब ± SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल के कई कदम एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक हैं। प्रारंभिक MBMEC अलगाव और संस्कृति के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि काम कवक spores या बैक्टीरिया के साथ सेल संस्कृति के प्रदूषण को रोकने के लिए, जितना संभव हो उतना बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है। आदेश ईसीएस का एक शुद्ध संस्कृति को प्राप्त करने के लिए, यह जो ईसीएस के अस्तित्व के लिए सक्षम बनाता है एक मध्यम पहले तीन दिनों के लिए puromycin युक्त है, लेकिन नहीं अन्य कोशिकाओं प्रकार (विशेष रूप से pericytes) 41,42 का उपयोग करने की सिफारिश की है। एक और महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने योग्य पूर्व सक्रिय टी कोशिकाओं को जोड़ने के लिए सही समय बिंदु की पहचान है। Teer माप MBMECs के पहले 48 घंटे के दौरान पारगम्य सम्मिलित करता है पर पैदा करना और एक दूसरे के बीच अंतराल को बंद कर दें। अत: सीसीएल कम हो जाती है जब तक यह एक स्थिर और निम्न स्तर (करीब 0.6 μF / 2 सेमी) तक पहुँचता है। यह एक मिला हुआ चुनाव आयोग monolayer का पहला संकेत है, लेकिन अभी तक एक तंग बाधा का एक संकेत नहीं है। के बाद हीसीसीएल एक स्थिर स्तर Teer बढ़ाने के लिए शुरू करता पहुँच गया है। टी जे परिसरों पूरी तरह का गठन कर रहे हैं और चुनाव आयोग बाधा पूरी तरह से बंद कर दिया जाता है, तीर अपने अधिकतम स्तर तक पहुँचता है। इस पठार आम तौर पर ईसीएस reseeding के बाद तीन से पांच दिन तक पहुँच जाता है और एक और 24 से 36 घंटे के लिए बनाए रखा है। टी कोशिकाओं को जोड़ने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु पठार की शुरुआत है, जो यह सुनिश्चित करता है कि ईसीएस अभी भी पर्याप्त सह सुसंस्कृत टी कोशिकाओं के साथ किया जा करने के लिए व्यवहार्य हैं पर है। टी सेल सक्रियण सह संस्कृति के लिए इष्टतम समय बिंदु सुरक्षित रूप से भविष्यवाणी की जा सकती से पहले शुरू किए जाने की जरूरत है, यह इस समय के लचीलेपन को बढ़ाने के लिए दो अलग अलग दिनों पर टी कोशिकाओं के दो बैचों को प्रोत्साहित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। अंत में, MBMECs करने के लिए टी कोशिकाओं को जोड़ने से पहले व्यक्ति को दोहराने के कुओं के समूह है कि इस तरह के भीतर और समूहों के बीच परिवर्तनशीलता कम है में किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करता है कि प्रारंभिक स्थितियों टी कोशिकाओं और MBMECs के सह संस्कृति के दौरान सभी समूहों के बीच बराबर हैं। हमारी प्रोटोकॉल पूर्व सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं के साथ प्राथमिक माउस मस्तिष्क ईसीएस के सह-संस्कृति के दौरान Teer माप का वर्णन है। इसका सरल फार्म वैज्ञानिक जरूरतों के अनुसार, कई संशोधनों के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, प्रकार, शक्ति, और प्रोत्साहन की अवधि अलग किया जा सकता है। विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4+ टी कोशिकाओं उपयुक्त प्रतिजन कोशिकाओं पेश (APCs) की उपस्थिति में, उनके आत्मीय प्रतिजन से सक्रिय किया जा सकता है; वैकल्पिक रूप से, टी कोशिकाओं polyclonally α-CD3 और α-CD28 एंटीबॉडी से सक्रिय किया जा सकता है। टी सेल सक्रियण स्थिति विभिन्न साइटोकिन्स द्वारा संग्राहक जा सकता है, एंटीबॉडी अवरुद्ध अवरोधकों। Endothelial सेल लाइनों के साथ प्राथमिक मस्तिष्क ईसीएस की जगह की सिफारिश की है, लेकिन नहीं, के रूप में यह है कि कम प्रतिबंधात्मक बाद के शो टी जे परिसरों और उच्च पारगम्यता प्राथमिक कोशिकाओं 43 की तुलना में जाना जाता है। Teer प्राथमिक readout के रूप में मापने के अलावा, इस प्रोटोकॉल चुनाव आयोग monolay की एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता हैएर अखंडता टी सेल स्थानांतरगमन परख (चित्रा 3E, एफ) से पहले। ध्यान से, तीर मूल्यों जरूरी MBMECs (3E चित्रा) के पार टी कोशिकाओं की स्थानांतरगमन के दौरान कमी नहीं हो सकता है: यह, transcellular मार्ग प्रतिरक्षा कोशिकाओं स्थानांतरगमन के दौरान उपयोग कर सकते हैं प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जैसा कि पहले 39,44 देखा गया है।

सक्रिय टी कोशिकाओं सह संस्कृति के दौरान चुनाव आयोग में शिथिलता के लिए प्रेरित किया है, Teer एक स्थिर, उम्मीद के मुताबिक कमी, एक ही शर्तों के साथ प्रयोगों भर तुलनीय पता चलता है। Teer में एक बड़ी कमी आमतौर पर सीसीएल में अधिक से अधिक सहवर्ती वृद्धि के साथ है। दुर्लभ अवसरों पर, तथापि, सीसीएल में वृद्धि और अधिक स्पष्ट तीर (चित्रा 4C) में इसी कमी से उम्मीद होगी की तुलना में हो सकता है। इस विसंगति को चुनाव आयोग monolayer व्यवधान के विभिन्न पहलुओं को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। ईसीएस बाधा व्यवधान के दौरान गठित अंतराल बंद करने की कोशिश के रूप में, वे में गतिशील परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैंआकृति विज्ञान और इस तरह के उभार के गठन और उनके कुल सतह क्षेत्र है, जो सभी सीसीएल में एक नाटकीय और तेजी से वृद्धि करने के लिए योगदान कर सकते हैं वृद्धि के रूप में गतिशीलता। इस सीसीएल में परिवर्तन कम, उम्मीद के मुताबिक Teer में परिवर्तन की तुलना में आता है। इस प्रकार, Teer में कमी का स्तर समझौता बाधा अखंडता का सबसे विश्वसनीय और प्रतिनिधि के उपाय बनी हुई है।

इस परख endothelial बाधा गुणों की जांच करने के लिए अन्य तकनीकों से पूरित किया जा सकता है। यह एक पारगम्यता परख है, जो विभिन्न आकारों कि बाधित चुनाव आयोग monolayer 44 के माध्यम से फैलाना के अणुओं की मात्रा के उपाय के द्वारा पीछा किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, इस तरह Fluorescein और टेक्सास लाल के रूप में fluorescently लेबल dextran conjugates, इस्तेमाल किया जा सकता है; अन्य आणविक ट्रेसर भी उपलब्ध हैं (जैसे, सूक्रोज, mannitol, एल्बुमिन, इवांस ब्लू और हॉर्सरैडिश peroxidase) 26। इसके अलावा, immunofluorescence माइक्रोस्कोपी प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताऔर टी जे और सेल आसंजन अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण। हालांकि प्रस्तुत बीबीबी मॉडल बहुत सरल है, इसके साथ प्राप्त परिणामों अधिक शारीरिक शर्तों के तहत आगे assays के लिए बहुमूल्य उन्मुखीकरण प्रदान कर सकते हैं। ऐसे assays शामिल हैं (लेकिन सीमित नहीं हैं) इन विट्रो कतरनी प्रवाह परख Teer माप रहने वाले चूहों बीबीबी की पूरी जटिलता के लिए खाते में स्थिर शर्तों के तहत और इवांस ब्लू इंजेक्शन के साथ विवो पारगम्यता परख में प्राप्त करने के लिए पूरक।

हालांकि संवेदनशील और विश्वसनीय, विधि यहाँ वर्णित कुछ सीमाएं कि विशेष ध्यान देने लायक है। हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में मापा अधिकतम Teer मूल्यों 35-40 के मूल्यों Ωcm 2 तक पहुँचता है। ये तीर मूल्यों विवो, जहां विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और अकोशिकीय घटकों बीबीबी की अखंडता के लिए योगदान की तुलना में बहुत कम कर रहे हैं, लेकिन वे भी रूप में उच्च के रूप में Teer कुछ अन्य में इन विट्रो बीबीबी मॉडल में हासिल मूल्यों को नहीं हैं <sup> 26,45,46। 49 - यह चुनाव आयोग माध्यम है, जो स्पष्ट रूप से बाधा गुण 27,47 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है करने के लिए hydrocortisone के अलावा द्वारा सुधार किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के पदार्थों के उपयोग - विरोधी भड़काऊ और immunosuppressive प्रभाव के लिए जाना जाता है - सभी कार्यात्मक assays के लिए उपयुक्त नहीं है। इस विशेष प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित बाधा अखंडता पर चुनाव आयोग टी सेल बातचीत के परिणामों पर है, व्याख्या hydrocortisone के अलावा द्वारा बाधा उत्पन्न किया जाएगा। यहां इस प्रकार प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रेरित टी कोशिकाओं का सच भड़काऊ संभावित चुनाव आयोग बाधा रोग पैदा करने के लिए के आकलन के लिए सक्षम बनाता है। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि साहित्य में रिपोर्ट अलग Teer मूल्यों का प्रत्यक्ष तुलना सावधानी के साथ किया जाना चाहिए लायक है। इस तरह के मूल्यों प्रयोगात्मक स्थापना पर बहुत निर्भर कर रहे हैं, वे विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्राप्त कर रहे हैं, सेल घनत्व, मीडिया, सेल के विकास के क्षेत्रों, और तीर मापने सिस्टम बोने (जैसे </ Em>, डिजाइन और इलेक्ट्रोड के आकार)।

आदेश में और अधिक बारीकी से vivo स्थिति नकल करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल में जटिल है, स्थापित किया गया है जहां ईसीएस डालने झिल्ली की ओर से विरोध pericytes के साथ सह-सुसंस्कृत हैं, या जहां pericytes और astrocytes कुओं के तल पर हो रहे हैं 12,25,50 - 52। इस तरह के सह संस्कृति प्रणालियों में, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच परस्पर बात बाधा के मजबूत कस, ट्रिपल सह संस्कृतियों vivo स्थिति जैसी है और इस प्रकार उच्चतम Teer मूल्यों प्रदान करने में सबसे अच्छा होने के साथ सक्षम बनाता है। इन प्रणालियों की जटिलता, दूसरे हाथ पर, इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में उनके व्यापक उपयोग करने के लिए एक सीमा बन गया है।

इस मॉडल की एक और सीमा कतरनी तनाव है, जो बाधा अखंडता 53,54 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है की कमी है। इस समस्या को दूर करने के लिए, नया गतिशील बीबीबी मॉडल ने हाल ही में शुरू किया गया है: ईसीएस खोखला फाइबर में सुसंस्कृत और गुणवाला प्रवाह की स्थिति के अधीन हैं, और अधिक बारीकी से नकल उतार microvasculature में विवो 55,56।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल बीबीबी की इन विट्रो मॉडल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के आधार पर वर्णन करता है। सक्रिय टी कोशिकाओं के साथ प्राथमिक माउस मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की बातचीत पर केंद्रित है, विधि इस तरह के सीधे संपर्क के दौरान बाधा गुण के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इस तरह के एकाधिक काठिन्य और उसके पशु मॉडल EAE, जिसमें बीबीबी encephalitogenic टी कोशिकाओं के साथ ईसीएस के एक बातचीत के दौरान समझौता किया है के रूप में भड़काऊ सीएनएस रोगों के विकास में महत्वपूर्ण कदम को समझने के लिए विशेष महत्व का है। वर्णित परख ऐसे एंटीबॉडी, साइटोकिन्स और टी सेल सक्रियण के अवरोधकों को अवरुद्ध करने के रूप में पदार्थ की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके एक ऐसी बातचीत का एक लक्षित मॉडुलन के परिणामों की जांच के लिए सक्षम बनाता है। विधि, संवेदनशील विश्वसनीय और गैर इनवेसिव एक हैतीर और सीसीएल के एन डी माप एक स्वचालित फैशन में प्रदर्शन कर रहे हैं। यह सब यह है कि BBB मॉडल की समृद्ध शरीर के लिए एक नई परत कहते हैं एक उपयोगी और बहुमुखी उपकरण बनाती है। यह विशेष रूप से इस तरह के एमएस के रूप में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों में मनाया pathophysiological शर्तों के तहत बीबीबी गुणों के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार कर सकते हैं।

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Acknowledgments

हम Teer माप के बारे में उपयोगी विचार विमर्श के लिए Annika Engbers और उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए फ्रैंक कुर्थ और डॉ मार्कस Schäfer (nanoAnalytics GmbH) के आभारी हैं। यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था, HW और लालकृष्ण, सीआरसी TR128, को SFB1009 परियोजना A03 A08 परियोजनाओं; Z1 और B01 लालकृष्ण और HW, और क्लीनिकल रिसर्च के लिए अंतःविषय केंद्र (हैम्बर्ग के मेडिकल संकाय) अनुदान संख्या Kl2 / 2015/14 लालकृष्ण करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts - pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

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Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H. J., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

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