Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ل Published: December 8, 2016 doi: 10.3791/54592
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, *1, *1
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster
* These authors contributed equally

Introduction

حاجز الدم في الدماغ يفصل جهاز الدورة الدموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1-3. وهو يوفر حاجز مادي أن يمنع حرية حركة الخلايا وانتشار الجزيئات القابلة للذوبان في الماء ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض والمواد الضارة المحتملة. بالإضافة إلى وظيفة الجدار العازل، وBBB تمكن من إيصال الأوكسجين والمواد المغذية لحمة الدماغ، والتي تضمن حسن سير العمل في الأنسجة العصبية. الخصائص الفنية للBBB درجة عالية من التنظيم من قبل المكونات الخلوية وديكي لها، مع درجة عالية من التخصص ECS كونها العنصر الهيكلي الرئيسي. تتميز ECS من BBB من وجود تقاطع ضيق (TJ) المجمعات، وعدم وجود fenestrations، النشاط pinocytic منخفضة للغاية، وآليات النقل نشطة بشكل دائم. مكونات أخرى من BBB الغشاء القاعدي EC، pericytes تضمين البطانة، قدم نهاية نجمي و= المرتبطة قدم المساواةenchymal الغشاء القاعدي أيضا أن تسهم في تطوير وصيانة وظيفة من BBB 2،4 - 6 و، جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، تشكل وحدة وعائية عصبية (NVU)، والتي تمكن حسن سير العمل في الجهاز العصبي المركزي 7-9.

في مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية، مثل الاعصاب، والأمراض الالتهابية أو المعدية، وظيفة BBB للخطر 2،5،10. ديسريغولاتيون من TJ المجمعات وآليات النقل الجزيئية يؤدي إلى زيادة نفاذية BBB، تسرب الكريات البيض، والتهاب وتلف الخلايا العصبية. من أجل دراسة خصائص BBB في ظل هذه الظروف المرضية، وقد وضعت مختلف في المختبر نماذج BBB 9،11،12. معا كانوا قد قدموا معلومات قيمة حول التغييرات النزاهة الحاجز، نفاذية وكذلك آليات النقل. هذه النماذج تستخدم الخلايا البطانية من البشر، الجرذان والفئران، الخنزير أو بالأغنام أصل 13-18. الخلايا البطانية الأولية أو خطوط الخلايا يتم استزراع إما الأحادية أو جنبا إلى جنب مع pericytes و / أو الخلايا النجمية لتحاكي بشكل وثيق BBB في الجسم الحي 19-25. في السنوات الأخيرة، أصبح قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) أداة مقبولة على نطاق واسع لتقييم خصائص حاجز غشائي 26،27.

يعكس طير مقاومة لتدفق الأيونات عبر أحادي الطبقة الخلية ويوفر انخفاضه مقياس حساسية للخطر سلامة حاجز غشائي، وبالتالي زيادة نفاذية. وقد وضعت العديد من أنظمة قياس طير، بما في ذلك طلائي Voltohmmeter (EVOM)، الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS)، وتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي 15،28 - 30. يعكس طير المقاومة لتدفق الأيونات بين ECS المجاورة (paracellular الطريق) وهو يتناسب طرديا معسلامة الحاجز. في مقاومة الطيفي 27،31، يتم قياس مقاومة الإجمالية المعقدة (Z)، الذي يوفر معلومات إضافية حول سلامة الحاجز عن طريق قياس جنة علم المناخ. لجنة علم المناخ يتعلق بالسعة الحالية من خلال غشاء الخلية (الطريق العابر لل): طبقة الخلايا تتصرف مثل مكثف في الدائرة الكهربائية ما يعادلها، فصل رسوم على جانبي الغشاء وهي عكسيا يتناسب مع سلامة الحاجز. عندما نمت على إدراج قابلة للاختراق، ECS الالتزام بها وتتكاثر وتنتشر على غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. هذا يقاوم الخلفية بالسعة الحالية للإدراج (الذي في حد ذاته يتصرف مثل مكثف) ويؤدي إلى انخفاض في السعة حتى يصل إلى مستوى الحد الأدنى. ويعقب ذلك من خلال إنشاء مجمعات TJ أن ختم قبالة الفضاء بين ECS المجاورة. وهذا يحد من تدفق الأيونات عبر الطريق paracellular، وطير يزيد حتى يصل إلى هضبة لها. في ظل ظروف التهابات، ومع ذلك، فإن endotheliتم المساس آل الحاجز: طير يتناقص مجمعات TJ الحصول على تعطلت ولجنة علم المناخ يزيد باعتبارها العنصر بالسعة من إدراج يرتفع مرة أخرى.

يستخدم قياس طير لدينا نظام آلي مراقبة الخلية 32: يترتب على مبدأ التحليل الطيفي مقاومة وتمتد تطبيقاته السابقة. هنا، نحن تصف في المختبر نموذج BBB التي تمكن من دراسة خصائص الحاجز، بما فيها تفاعل بطانة الدماغ مع الخلايا المناعية. ولا سيما تنشيط خلايا تي. ولوحظت هذه الظروف المرضية في أمراض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي، مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي في 33-37. هنا، خطوة حاسمة هي التهجير من دماغي المنشأ، وخلايا T-المايلين محددة عبر BBB. ويتبع ذلك تنشيط في الحيز المحيط بالأوعية ودخول حمة الدماغ، حيث تجنيد الخلايا المناعية الأخرى، وليالتهاب diate ولاحق إزالة الميالين 1،35،38. ومع ذلك، الآليات الجزيئية للتفاعل بين هذه الخلايا التائية والخلايا البطانية، والمكونات الرئيسية من بي بي بي، ليست مفهومة جيدا. ويهدف بروتوكول لدينا لملء هذه الفجوة وإعطاء رؤى جديدة في العواقب على الخلايا البطانية (أي سلامة الحاجز والنفاذية) عند الاتصال بهم مباشرة وتفاعل معقد مع تنشيط خلايا تي.

بروتوكول الموصوفة هنا يجعل من استخدام الماوس الأساسي خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية، كما نمت أحادي الطبقة على إدراج نفاذية الأغشية مع الصغيرة التي يسهل اختراقها. وشارك في تربيتها الخلايا البطانية مع خلايا CD4 + T، التي يمكن أن تكون مرحلة ما قبل تفعيلها إما polyclonally أو بطريقة مستضد معين. شارك في ثقافة MBMECs مع خلايا T قبل تفعيلها، ولكن ليس ساذجا يؤدي الى انخفاض في طير وزيادة في لجنة علم المناخ، والذي يقدم مقياسا كميا لMBMEC الخلل وحاجز انقطاع. التقنيةهو غير الغازية: ويستخدم في البناء بدلا من الأقطاب الكهربائية عود، التي تحول دون اضطراب كبير من أحادي الطبقة EC. أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وظيفة الحاجز من دون استخدام علامات الخلية. يجعل القياسات المستمرة بطريقة آلية وتمكن تقييم مستقل من المعلمات حاجز اثنين (طير ولجنة علم المناخ) في وقت واحد مع مرور الوقت. هذه الطريقة أيضا حساسة بما يكفي للتمييز بين مستويات مختلفة من تنشيط الخلايا T وآثار هذه الخلايا التائية على ECS.

ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الفنية: السيتوكينات مختلفة و / أو كيموكينات المتورطين في عمليات التهابات يمكن أن تضاف إلى ثقافة مشتركة من MBMECs وخلايا تي. منع الأجسام المضادة ضد جزيئات التصاق الخلية على أي من المفوضية الأوروبية أو الجانب تي خلية يمكن استخدامها. ومثبطات تي علامات تنشيط الخلايا أو ممتلكاتهم لحل الخلايا يمكن أن تضاف خلال فتيلة تي خلية أو زملائهم في الثقافة مع ECS. الفحص مفيد أيضا للهجرة خلايا Tالمقايسات، لأنها يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جودة MBMEC سلامة أحادي الطبقة السابقة لإضافة خلايا تي. كل هذا يجعل هذه الطريقة أداة مرنة وموثوق بها لدراسة BBB في المختبر، مع التركيز على تأثير تنشيط خلايا تي في المفوضية الأوروبية سلامة أحادي الطبقة. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم آليات تعطل BBB في التسبب في أمراض المناعة الذاتية، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تعبر، وخلايا T دماغي المنشأ ذاتية التفاعل بي بي بي وتسبب التهاب وتلف الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لجميع التجارب، كانت ولدت الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان المركزي في جامعة مونستر، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية لرعاية الحيوانات. تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الحيوان الأخلاق التجريبية والموافقة عليها من قبل السلطات المحلية في شمال الراين وستفاليا، ألمانيا (LANUV، AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC العزلة والثقافة

ملاحظة: عزل MBMECs كما هو موضح سابقا بالتفصيل 14 مع إجراء التعديلات التالية:

  1. تضحية 20 الكبار C57BL / 6 الفئران (6-8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وتأكيد وفاتهم قبل التأكد من توقف القلب والتنفس.
  2. شطف الفأر مع الايثانول 70٪ وقطع رأس باستخدام مقص. إزالة فروة الرأس باستخدام ملقط ومقص. جعل شقوق على الجانب الأيسر والأيمن من الجمجمة، بدءا من ماغنوم الثقبة. رفع الجمجمة من جانبها الذيلية وتاكالبريد خارج الدماغ مع ملقط.
  3. تحت غطاء تدفق الصفحي، استخدام ملقط معقم لوضع الدماغ في طبق بيتري وإزالة جذع الدماغ، المخيخ، والمهاد، وحفظ فقط القشرة.
    ملاحظة: استخدام المجهر ليس من الضروري لأي من هذه الخطوات.
  4. وضع قشرة على قطعة من ورق نشاف معقمة الغربية ولفة برفق مع ملقط حتى السحايا لم تعد مرئية.
  5. بعد الهضم الميكانيكي والأنزيمية (بعد بروتوكول 14)، وجمع الخلايا البطانية من التدرج الكثافة باستخدام طويلة، إبرة معقمة والغطاس 5 مل. تظهر الخلايا البطانية على شكل طبقة ضبابية فوق الحلبة الحمراء مع الكريات الحمراء. نقل 20-25 مل من هذه الطبقة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي الجديدة. ملأ أنبوب مع DMEM.
  6. بعد جولتين من غسل 14، resuspend الخلايا في 6 مل من المتوسط MBMEC تحتوي على بوروميسين (4 ميكروغرام / مل)، والبذور منها على ست آبار المغلفة من 24 لوحة جيدا. تركها في نسيجحاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (المشار إليها باسم "حاضنة" من هنا) لمدة ثلاثة أيام.
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل MBMEC حل طلاء، انظر المواد الجدول.
  7. تغيير المتوسطة وذلك بإضافة 1 مل إلى كل بئر المتوسطة MBMEC جديدة دون بوروميسين. وضع لوحة الظهر عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة يومين آخرين.

2. حصاد MBMECs

  1. في اليوم الخامس بعد MBMEC العزلة، قبل معطف إدراج قابلة للاختراق مع MBMEC حل طلاء: إضافة 80 ميكرولتر من الحل في إدراج وترك لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة.
  2. ماصة بعناية الحل طلاء، والسماح للإدراج الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. إضافة 2 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني على كل بئر من لوحة، وذلك باستخدام MBMECs لغسل المتوسطة. كرر هذه الخطوة. إضافة 0.05٪ التربسين-EDTA (300 ميكرولتر لكل بئر) وترك لوحة في الحاضنة لمدة 5-10 دقيقة.
  3. إضافة 2 مل من MBMEC المتوسطة إلى كل بئر لوقفtrypsinization. نقل الخلايا التي تم جمعها لأنبوب 15 مل الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لهم في 700 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 1 مل من MBMEC وسيط وبدون بوروميسين.
  4. عد الخلايا. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية مع 90 ميكرولتر من 0.04٪ التريبان الأزرق (10X التخفيف من الخلايا). ماصة 10 ميكرولتر من هذا المزيج بين الغطاء الزجاجي وغرفة عد الخلايا (عدادة الكريات). عد التريبان خلايا الأزرق خالية في جميع الأرباع الأربعة للغرفة (N) وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا عدها (N ') على النحو التالي: N' = N / 4.
  5. حساب تركيز الخلية (في 10 6 خلية / مل) باستخدام الصيغة التالية: C = N '× 10 4 × 10، حيث يتم إعطاء 10 4 من أبعاد عدادة الكريات و 10 هو عامل التخفيف من الخطوة 2.4.
  6. البذور 2 × 10 4 خلايا في حجم 260 ميكرولتر في إدراج. إضافة 810 ميكرولتر من MBMEC المتوسطة إلى المقصورة أقل من كل جانب. وضع لوحة مع تدرج في الحاضنة حتى على استعداد للشروع في القسم 4.
    ملاحظة: وحدات التخزين لمقصورة العلوية والسفلية هي إدراج محددة ولا تعمل لجميع أشكال و24-جيدا.

3. CD4 + T عزل الخلايا وتحفيز

  1. CD4 + T عزل الخلايا
    1. التضحية الماوس شخص بالغ واحد (6-8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وتأكيد وفاته لالتأكد من توقف القلب والتنفس.
    2. ضع الماوس على ظهرها على لوحة تشريح نظيفة وشطفه مع 70٪ من الإيثانول. استخدام مقص العقيمة وملقط لفتح الغشاء البريتوني وإزالة الطحال والغدد الليمفاوية (الاربية، الإبطين، العضدية وسرطان عنق الرحم)؛ أخيرا، نقل الأنسجة في أنبوب 15 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد.
    3. تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، ونقل الأنسجة عن طريق الصب في برنامج تلفزيوني مع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع 70 ميكرومتر مصفاة الخلية على القمة. جانس يجعله متجانساالأنسجة عن طريق الضغط عليه مع المكبس 1 مل من خلال مصفاة.
    4. إضافة 30 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 10 مل من FACS العازلة. تصفية تعليق من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، إضافة 20 مل أخرى من العازلة FACS إلى أنبوب.
    5. أجهزة الطرد المركزي لذلك في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من FACS العازلة.
    6. إضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD4 ميكروبيدات المغناطيسية، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إضافة 25 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. في غضون ذلك، وضع عمود الفصل LS إلى المغناطيس وشطفه مع 3 مل من FACS العازلة. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 3 مل من FACS العازلة.
    8. إضافة الخلايا إلى العمود. غسل العمود مع 3 مل من FACS العازلة ثلاث مرات. إزالة عمود من المغناطيس وضعه على جديدة 15 مل centriأنبوب fugation. إضافة 5 مل من FACS العازلة، طرد الخلايا المسمى مع المكبس عمود وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية.
    9. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 3 مل من T المتوسطة الخلية. عد الخلايا كما هو موضح في 2.4 والبذور 1 × 10 5 خلايا في 100 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر.
  2. CD4 + T تحفيز الخلية
    1. تحفيز الخلايا بولكلونل CD4 + T
      1. قبل معطف جولة القاع لوحة 96-جيدا مع تنقيته لمكافحة فأر CD3 الأجسام المضادة (استنساخ 145-2C11) في برنامج تلفزيوني، بتركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال، إلى ما قبل معطف لوحة كاملة مع α-CD3 في 1 ميكروغرام / مل، مزيج 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز الأسهم = 0.5 ملغ / مل) مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، دوامة وإضافة 50 ميكرولتر من مزيج ل كل بئر مع ماصة الأقنية.
      2. ترك لوحة في الحاضنة لمدة 3 ساعات. بعد عزل الخلايا T، وغسل لوحة ما قبل المغلفة مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة تنقية الأجسام المضادة لمكافحة CD28 (استنساخ37.51) إلى خلايا تي المعزولة في التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال، في 1 ميكروغرام / مل). اخلط جيدا. البذور الخلايا T وتركهم في الحاضنة لمدة 2-3 أيام.
    2. التحفيز محددة مستضد خلايا CD4 + T مع الخلايا الجذعية (DCS)
      ملاحظة: إذا تم استخدام البلدان النامية كما الخلايا المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة)، اتبع بروتوكول تي العزلة الخلية، مع هذه الاستثناءات:
      1. قبل المجانسة الطحال، وضخ مع 1 مل من كولاجيناز نوع IA في برنامج تلفزيوني على 0.5 ملغ / مل وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      2. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، resuspend الكرية في المخزن FACS وإضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD11c وميكروبيدات المغناطيسية، بدلا من ميكروبيدات CD4.
      3. استخدام عمود الفصل MS وأحجام مناسبة: شطف العمود مع 1 مل من FACS العازلة. خلايا resuspend في 1 مل من العازلة FACS وغسل العمود مع 1 مل من العازلة FACS ثلاث مرات.
      4. ميلاديد مستضد من خيار بالنسبة للبلدان النامية (على سبيل المثال، المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري (MOG) أأ 35-55 في 20 ميكروغرام / مل)، تخلط جيدا والبذور 5 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة من الأسفل حسنا.
      5. إضافة 1 × 10 5 خلايا تي في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة القاع جيدا في النهاية، كما هو موضح في بروتوكول تي زنزانة انفرادية.
    3. تحفيز خلايا CD4 + T محددة المستضد مع الخلايا البائية
      ملاحظة: إذا تم استخدام الخلايا البائية كما ناقلات الجنود المدرعة، اتبع بروتوكول تي العزلة الخلية، مع هذه الاستثناءات:
      1. استخدام الطحال من الفئران المعدلة وراثيا التي هي مستضد محددة (على سبيل المثال، IGH MOG (ث) الفئران، التي الخلايا ب التعرف على وجه التحديد MOG 35-55) الخلايا البائية.
      2. استخدام خلايا T مستضد معين (على سبيل المثال، من TCR MOG (2D2) الفئران). إضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD19 ميكروبيدات المغناطيسي بدلا من ميكروبيدات CD4.
      3. إضافة مستضد الاختيار إلى سل بليرة سورية (على سبيل المثال، MOG 35-55 في 20 ميكروغرام / مل)، تخلط جيدا والبذور 5 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر من B مستنبت الخلية في 96 جولة من أسفل جيدا.
      4. إضافة 1 × 10 5 خلايا تي في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة من أسفل جيدا، كما هو موضح في بروتوكول تي العزلة الخلية.

4. إعداد وإجراء قياس طير

  1. وضع وحدة 24-جيدا الصك طير تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة الأغطية وإدراج مكان مع MBMECs في الصك باستخدام ملقط.
  2. ماصة 810 ميكرولتر من متوسطة جديدة إلى مقصورة أقل من الآبار وحدة: إضافته بعناية بين إدراج وجدار وحدة جيدا.
  3. إغلاق الأغطية ووضع أداة في الحاضنة. قم بتوصيل أداة لجهاز الكمبيوتر فيه؛ تشغيل وحدة تحكم وأداة لفتح البرنامج.
  4. اختر "قياس جديد 'في نافذة منبثقة. تشيالمسيخ 'تظهر طير "وصناديق' تظهر لجنة علم المناخ؛ ثم اضغط على 'بداية'. بعد الانتهاء من القياس الأول، اختر 'تحقق من كل الآبار في علامة التبويب "النتائج" لتشاهد كل القيم طير ولجنة علم المناخ.
  5. حفظ الملف: ملف> حفظ باسم> 'اسم الملف'.
    ملاحظة: كما يتم قياس طير ولجنة علم المناخ باستمرار بطريقة آلية، مراقبة القيم على مدى فترة من 3-5 أيام. تغيير المتوسطة ليس من الضروري، ما لم بقاء الخلية هي دون المستوى الأمثل، كما تصور بسبب عدم وجود زيادة في طير.
  6. اختيار نقطة زمنية للمشاركة في ثقافة MBMECs مع خلايا T عندما علم المناخ غير مستقر وأقل من 1 μF / سم 2 وطير قد وصل إلى أقصى مستوى لها.
  7. تفتيش دقيق القيم طير ولجنة علم المناخ المطلقة واستبعاد الآبار التي MBMECs لم تتطور متموجة ما يكفي من الطبقات الوحيدة عن طريق إلغاء هذه الآبار.
  8. المجموعة بقية الآبار: انقر بزر الماوس الأيمن على بئر واختر "إضافة جيدة إلى متوسط ​​البئر الجديد". نامالبريد في نافذة منبثقة. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لجميع الآبار الفردية ليتم تجميعها.
  9. تحقق من كل متوسط ​​الآبار للتأكد من أن كل منهم لديهم نفس الشروط الأولية قبل الثقافة المشتركة. إذا بعضها اختلافا كبيرا القيم طير المطلقة أو طير المنحدرات، أو الأخطاء القياسية هي كبيرة جدا، وإعادة التجميع.
    ملاحظة: التجمع الأمثل للآبار يوفر الحد الأدنى من الاختلاف في القيم طير، داخل وبين المجموعات التجريبية على حد سواء.
  10. في علامة التبويب "التجربة" و، اضغط على "وقفة"، قطع الصك واخراجه من الحاضنة. إزالة الأغطية تحت غطاء تدفق الصفحي.
  11. إعداد ما قبل تفعيلها و / أو خلايا تي ساذجة، مع أو بدون السيتوكينات محددة، والأجسام المضادة أو غيرها من المواد، كما هو مطلوب: على سبيل المثال: مزيج تنقية NA / LE الفئران لمكافحة فأر الإنترفيرون جاما الأجسام المضادة (استنساخ XGM1.2) مع استعداد T الخلايا، في 20 ميكروغرام / مل لكل بئر من الصك طير.
    ملاحظة: إذا تم استخدام مواد مثل المانع باء granzyme، فهيdded لزراعة الخلايا T في بداية الخلايا التائية التحفيز: على سبيل المثال، جرانزيم B المانع الثاني (Calbiochem) يتم خلط مع خلايا تي المعزولة بتركيز نهائي من 10 ميكرومتر في DMSO. انظر المواد والمعدات اللازمة لمزيد من التفاصيل.
  12. إزالة بعض المتوسطة من إدراج (حجرة جيدا العليا): على سبيل المثال، ماصة بعناية 150 ميكرولتر (إزالة ينبغي تجنب كل المتوسطة لأنها يمكن أن تعكر صفو أحادي الطبقة MBMEC).
  13. إضافة خلايا T لMBMECs قبل pipetting بعناية 150 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على 2 × 10 5 خلية / إدراج.
    ملاحظة: عند حصاد تنشيط خلايا تي مسبقا، الاعتماد فقط التفجير، وخلايا التريبان الأزرق خالية.
  14. إغلاق الأغطية ووضع صك العودة إلى الحاضنة. إعادة الصك واضغط على "قياس استئناف '. بعد 24 ساعة، اضغط على "وقف" في علامة التبويب "التجربة" ووحفظ الملف (ملف> حفظ).

5. تصدير البيانات والتحليل الإحصائي

  1. تصدير النتائج عن طريق اختيار ملف> تصدير.
  2. في "إعدادات" علامة التبويب من النافذة المنبثقة، حدد ".DOT" في الخيار "فاصل عشري" و "الجدوال" في خيار "محدد الحقل".
  3. في علامة التبويب "تصدير النتائج"، اسم الملف، والتحقق من جميع الآبار التي يتم تصديرها، والتحقق من "طير" ومربعات "لجنة علم المناخ" في الخيار "اختيار البيانات".
  4. اضغط على "تصدير البيانات" فتح الملف الذي تم تصديره، ونسخ البيانات إلى جدول بيانات.
  5. تطبيع البيانات التي تم تصديرها (مرتبة حسب كل تكرار، مع طير ولجنة علم المناخ القيم المعطاة لكل شوط (قياس)): القيم مجموعة طير ولجنة علم المناخ من نقطة زمنية الأخيرة قبل الثقافة المشتركة إلى 100٪ وتتغير وفقا لقيم سائر أشواط، نسبة إلى تشغيل '100٪'.
  6. نسخ البيانات تطبيع إلى البرنامج المفضل لتوليد الرسم البياني، وذلك باستخدام الآبار الفردية وعرض الخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل مجموعة العلاج.
  7. Perform اتجاهين أنوفا الاختبار الإحصائي مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة، وذلك باستخدام البرنامج الإحصائي للاختيار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج BBB في المختبر تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا T والخلايا البطانية. وتتكون هذه التجربة من ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى هي عزل MBMECs الابتدائي من القشور الدماغ، وثقافتهم لمدة خمسة أيام. عندما تصل إلى نقطة التقاء في لوحة زراعة الخلايا، وtrypsinized MBMECs وreseeded على إدراج قابلة للاختراق، والتي وضعت بعد ذلك في صك طير. يتم قياس طير ولجنة علم المناخ من MBMECs باستمرار وترصد على مدى فترة من 3-5 أيام. في هذه الأثناء، وخلايا تي هي معزولة، وحفز (الخطوة 2)، وتربيتها لمدة 2-5 أيام، نوع وقوة التحفيز. في الخطوة 3، يتم إضافة خلايا T لوشارك مثقف مع MBMECs عندما علم المناخ هو عند مستوى منخفض مستقر وطير هو في أقصى مستوى لها. اختيار هذه النقطة الزمنية للثقافة مشتركة عندما طير لا يزال في هضبة لها أمر بالغ الأهمية لنجاحالقياس كله. وبالتالي، فمن المهم للغاية أن نقطة زمنية لتي عزل الخلايا والتحفيز والتي يتم اختيارها بعناية، بحيث خلايا T تصل إلى المستوى المطلوب من التنشيط بواسطة الوقت من أجل إضافتها إلى ECS. بعد إضافة خلايا تي، يتم استئناف قياس ليوم واحد ويتم تحليل النتائج.

بعد ثقافة الأولية لمدة خمسة أيام، MBMECs تظهر بسهولة مميزة التشكل على شكل مغزل (الشكل 2A، غادر لوحة) والتعبير عن علامات خلية محددة البطانية مثل PECAM-1 وClaudin 5 (الشكل 2A والمتوسطة ولوحات اليمين). ولكن هذا وحده لا يوفر ما يكفي من الأدلة للالتقاء بهم الكامل وسلامة حاجز المناسبة. مقاومة التحليل الطيفي، من ناحية أخرى، ويعطي تقدير جيد على سلامة أحادي الطبقة وبمثابة مراقبة الجودة في كل جانب قبل أداء الاختبار الوظيفي. في الشكل 2B، أكثر منالآبار الواردة MBMECs التي كانت مستقرة ومنخفضة القيم لجنة علم المناخ، وبلغت قيم طير من هضبة. واستخدمت هذه الآبار للتجارب ثقافة مشتركة لاحقة. تم تجميعها في مثل هذه الطريقة كان ذلك التباين داخل وبين المجموعات الحد الأدنى قبل إضافة خلايا T (الشكل 2C). وكان الآبار التي تختلف بشكل كبير عن بقية (مثل المنحنى الأزرق هو مبين في الشكل 2B) القيم طير لا تستخدم، لأنها من شأنها أن تؤدي إلى نتائج غامضة أو سوء تفسير البيانات.

شريطة أن تم تلبية الاحتياجات الأولية للثقافة MBMEC وتحفيز الخلايا التائية، يمكن مقاومة الطيفي تعطي معلومات قيمة حول تفاعل الخلايا التائية-EC. قياس طير يمكن أن تكون قراءات الأولية لمثل هذا التفاعل ومقياس T-الخلية بوساطة ضعف EC، كما هو مبين في الشكل 3A و 3B. في هذه الحالة، وتزرع MBMECs على إدراج مع micropores 0.4ميكرون في القطر، والتي لا تسمح للخلايا T بالمرور عبر غشاء إدراج. ويبين الشكل 3A التي حفزت فقط، ولكن خلايا T لا الساذجة هي القادرة على إحداث خلل EC، على النحو الذي يحدده انخفاض في طير والزيادة في لجنة علم المناخ. وبالتالي يمكن أن خلايا ساذجة T بمثابة سيطرة سلبية، منذ طير ولجنة علم المناخ خلال الثقافة المشتركة مع خلايا T ساذجة البقاء عند مستوياتها الأولية. والاستثناء هو الذروة في البداية من الثقافة المشتركة، والناجمة عن التعامل مع أداة (رفع الأغطية، مضيفا الوسيلة الجديدة مع الخلايا التي قد يكون لها درجات حرارة مختلفة قليلا والقيم ودرجة الحموضة، وإغلاق الجفن). ويبدو أن هذه الأداة مع كل أنواع القياسات طير وتجاهلت أثناء التحليل. إضافة السيتوكينات الموالية للالتهابات IFN-γ وTNF-α (على 100-500 U / مل)، والتي هي معروفة لتكون قادرة على إحداث التهاب EC، ويمكن استخدام مراقبة إيجابية. في الشكل 3A، MOG 35-55 CD4 -specific سبيل المثال، مع تنقيته لمكافحة فأر CD3 والأجسام المضادة CD28) (الشكل 3B). هنا، طول التحفيز، وبالتالي في تنشيط الخلايا T، ومتنوعة. وحفز خلايا T من نفس الكمية من α-CD3 والأجسام المضادة α CD28، ومنها تربيتها لمدة ثلاثة أيام عرضت ميلا أكبر لتعطيل حاجز بالمقارنة مع خلايا T تربيتها لمدة يومين فقط.

من أجل التحقيق في آليات MBMEC أحادي الطبقة التعطيل وصفها، الطرق المختلفة يمكن استخدامها. النتائج في الشكل 3C تظهر أن خلايا T حفز، ولكن لا تسبب supernatants بهم ضرر كبير لMBMECs، مشيرا إلى أن الاتصال المباشر بين الخلايا T وMBMECs هو أمر حاسم لتعطيل الحاجز. وعلاوة على ذلك، إضافة تحييد ألفا-IFN-γ الأجسام المضادة خلال قياس طير تحسنت بشكل طفيف خصائص الحاجز MBMEC، مما يوحي بأن الإنترفيرون γ قد لا تكون السبب الرئيسي لهذا الاضطراب. من ناحية أخرى، مضيفا باء granzyme المانع الثاني لزراعة الخلايا T (الشكل 3D) استعادة سلامة MBMEC إلى حد كبير، لافتا إلى هذا الجزيء لحل الخلايا كلاعب مهم في إحداث الضرر MBMEC وانخفاض لاحق في طير.

وبالاضافة الى استخدامه كمادة قراءات الأولية للتأثير خلايا T على EC سلامة أحادي الطبقة، يمكن قياس طير أن تستخدم أيضا لمراقبة الجودة من سلامة الحاجز قبل فحوصات أخرى مثل فحص خلايا T التهجير. في هذه الحالة، يدرج مع تستخدم micropores من 3 ميكرون في القطر. في الشكل 3E، تم إجراء قياس طير من أجل ضمان أن MBMEC أحادي الطبقة كانت من نفس المستوى من النزاهة في جميع الآبار قبل إضافة خلايا T للtransmigratio اللاحقةن الفحص. وأعقب ذلك حصاد الخلايا التائية من مقصورة أقل من الآبار الصك، تلطيخ الخلايا T مع α-CD4 الأجسام المضادة وتحليل تدفق cytometric، وذلك باستخدام الخرز عد الخلايا لتحديد الأعداد المطلقة للخلايا T transmigrated. هو مبين في الشكل 3E والمتوسطة واليمين). علما بأن تحفز خلايا تي المستخدمة لالتهجير لم يسبب انخفاضا كبيرا في طير، على الرغم من أنها كانت قبل تفعيلها كما في الشكل 3A. وهذا يمكن أن تعكس الطريق العابر للقد تستخدم الخلايا المناعية أثناء التهجير، كما لوحظ سابقا 39. في الشكل 3F، وقد ألهبت نصف الآبار مع MBMECs مع الإنترفيرون γ وTNF-α (uninflamed مقابل. ملتهبة)، وفي وقت لاحق، تم إضافة خلايا T ساذجة لتقييم النشاط transmigratory. في هذه الحالة، شريطة قياس طير دليل على مدى قوة والتهاب مع السيتوكينات ومتى يجب أن تضاف خلايا T للtransmigratioن.

ويبين الشكل 4 بعض الحالات الأكثر شيوعا التي قد تؤدي إلى سوء تفسير النتائج طير. في الشكل 4A، على سبيل المثال، وضعت ليس كل MBMECs أحادي الطبقة متموجة بشكل كامل في نفس الوقت. الواردة MBMECs الذين النضج بمعدل مختلفة بالمقارنة مع المجموعات الأخرى قبل إضافة خلايا T المجمعات TJ - واحدة من المجموعات ( 'استبعاد الخلايا التائية الساذجة'). وضعت هذه المجموعة وبالتالي القيم طير فوق 100٪ خلال التجربة واستبعادها من مزيد من التحليل. وهكذا، المنحدر من منحنى طير (معدل TJ النضج) قبل التجربة لا يقل أهمية عن القيم طير المطلقة لتفسير البيانات المناسبة. ويبين الشكل 4B أن البدء في ثقافة مشتركة ليس فقط في وقت مبكر للغاية ولكن أيضا في وقت متأخر جدا يمكن أن تؤدي إلى نتائج خاطئة. هنا، في كل مجموعة مع خلايا T حفز والسيطرة على المجموعة السلبية (المتوسطة تشانغه)، لقد مرت القيم طير بالفعل الهضبة، وبدأ في الانخفاض بشكل مستقل عن حالة تجريبية، وبالتالي تشير إلى الظروف ثقافة دون المستوى الأمثل قبل وأثناء التجربة. لا ينبغي أن تدرج هذه المجموعات في التحليل. وأخيرا، على الرغم من طير ولجنة علم المناخ عادة تغيير القيم في مثل هذه الطريقة التي يترافق انخفاض أكبر في طير عن طريق زيادة أكبر في لجنة علم المناخ، قد لا يكون هذا هو الحال دائما. في الشكل 4C، وحفز خلايا T تسبب ب انخفاض أكبر في طير، ولكن زيادة أقل في لجنة علم المناخ من خلايا تي حفز وفعلت.

شكل 1
الشكل 1: لمحة عامة عن هذه التقنية. بعد ثقافة الأولية، وreseeded MBMECs على إدراج قابلة للاختراق وضعها في رصد خلية الآلي. يتم قياس طير ولجنة علم المناخ في كل ساعة لمدة 4-5 أيام. في هذه الأثناء، يتم تنشيط خلايا T في المختبر 40. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: MBMECs تطوير أحادي الطبقة متموجة مناسبة لفي المختبر نموذج BBB. (A) المغزل شكل التشكل (يسار) ومناعي تلطيخ PECAM-1 (وسط) وClaudin 5 (يمين) بعد خمسة أيام من MBMEC العزلة. (B و C) طير ولجنة علم المناخ القيم قبل (ب) وبعد (C) تجميع الآبار الفردية، تي مسبقس إضافة خلايا تي. لم يتم استخدام المنحنى الأزرق في (B) للتجربة، منذ MBMECs في هذه البئر لم تتطور طير عالية كما هو الحال في الآبار الأخرى. البيانات في (C) تظهر يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: ممثل النتائج. (م) التغييرات في طير كإجراء أساسي من اختلال وظيفي MBMEC على التفاعل مع خلايا تي. تم تفعيلها (أ) الخلايا T-MOG محدد من الخلايا البائية MOG محددة في وجود MOG 35-55 الببتيد لمدة خمسة أيام. خلايا T ساذجة والسيتوكينات الموالية للالتهابات IFN-γ وTNF-α (سواء في 100 U / مل) كانت بمثابة سيطرة سلبية وإيجابية، على التوالي. (ب) وحفز خلايا T مع α-CD3 والأجسام المضادة α-CD28 (1 ميكروغرام / مل لكل منهما) لمدة يومين أو ثلاثة أيام، كما أشار، قبل إضافتها إلى MBMECs. خلايا (C) T (ما قبل تفعيلها كما في الفقرة (أ)) أو supernatants بهم، في ظل وجود الأجسام المضادة α الإنترفيرون جاما أو isotype السيطرة المقابلة. الخلايا (D) T (ما قبل تفعيلها كما في (ب)) لمدة يومين، بحضور باء granzyme المانع الثاني أو DMSO مخفف لها. (E و F) قياس طير تستخدم فقط كوسيلة لمراقبة الجودة لسلامة الحاجز قبل هجرة الخلايا التائية. وقد نمت MBMECs على إدراج مع المسام من 3 ميكرون في القطر. الخلايا (E) T، حفز على النحو المبين في الفقرة (أ)، والسماح لtransmigrate لمدة 18 ساعة (يسار). بعد ذلك، أنها كانت تحصد، الملون لα-CD4 الأجسام المضادة (استنساخ RM4-4) وتحليلها من قبل التدفق الخلوي، وذلك باستخدام الخرز عد الخلايا (وسط ويمين). (F)رصد MBMEC سلامة أحادي الطبقة على التحفيز مع الإنترفيرون γ وTNF-α، واختيار نقطة زمنية مناسبة لإضافة لاحقة من خلايا T لفحص التهجير. وتشير (AF) نتائج يثلث التقنية وهي ممثل لثلاث تجارب مستقلة لكل منهما. تظهر البيانات يعني ± SEM. (E، يمين) أونبايريد، ثنائي الطرف اختبار ر الطالب. **، P <0.01. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الاعتبارات العملية وتفسير البيانات. (أ) تم استبعاد MBMECs من المجموعة التجريبية واحد (المنحنى الأحمر) من التحليل، إذ وصلت نسبة نضوج المجمعات صلي كان مختلفا بالمقارنة مع غيرها من غرامoups. (ب) مثال على إضافة خلايا T في وقت متأخر جدا، الأمر الذي حال دون تقييم سليم للضعف MBMEC. (ج) عند حدوث مشاكل التي كتبها 'A' حفز خلايا T (المنحنى الأسود)، وأظهرت القيم لجنة علم المناخ من MBMECs زيادة أكثر دراماتيكية مما كان متوقعا من الانخفاض المصاحب في طير الناجمة عن خلايا T نفسها. وحفز الخلايا (AC) T مع α-CD3 والأجسام المضادة α-CD28 (1 ميكروغرام / مل لكل منهما) لمدة يومين. وأظهرت النتائج يثلث التقنية وهي ممثل لثلاث تجارب مستقلة لكل منهما. تظهر البيانات يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عدة خطوات من بروتوكول صفها ضرورية لإجراء تجربة ناجحة. خلال العزلة MBMEC الأولية والثقافة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ العمل تحت ظروف معقمة قدر الإمكان، لمنع التلوث من ثقافة الخلية مع الجراثيم الفطرية أو البكتيريا. من أجل الحصول على ثقافة نقية من ECS، فمن المستحسن استخدام المتوسط تحتوي على بوروميسين في الأيام الثلاثة الأولى، والتي تمكن من البقاء على قيد الحياة ECS، ولكن ليس غيرها من أنواع الخلايا (وخاصة pericytes) 41،42. خطوة أخرى الحرجة التي تستحق اهتماما خاصا هي تحديد نقطة زمنية الصحيحة لإضافة خلايا T قبل تفعيلها. خلال ساعة 48 الأولى من MBMECs قياس طير تتكاثر على إدراج قابلة للاختراق وإغلاق الفجوات بين بعضها البعض. وبالتالي، يقلل جنة علم المناخ حتى يصل إلى مستوى ثابت ومنخفض (حوالي 0.6 μF / سم 2). وهذا هو أول علامة من متكدسة EC أحادي الطبقة، ولكن ليس بعد علامة على وجود حاجز ضيق. فقط بعدوصلت لجنة علم المناخ على مستوى مستقر يفعل طير تبدأ في زيادة. عندما تتشكل المجمعات TJ بالكامل وحاجز المفوضية الأوروبية أغلقت كليا عن العالم، طير تصل إلى أقصى مستوى لها. وعادة ما وصلت هذه الهضبة 3-5 أيام بعد البذر وECS وحافظت على آخر 24 إلى 36 ساعة. نقطة أفضل وقت لإضافة خلايا تي هي في بداية الهضبة، والتي تضمن أن ECS لا تزال قابلة للحياة بما يكفي لتكون شارك في تربيتها مع الخلايا التائية. كما يحتاج تفعيل الخلايا التائية أن يبدأ قبل نقطة الوقت الأمثل لثقافة مشتركة يمكن التنبؤ بشكل آمن، يمكن أن يكون مفيدا لتحفيز مجموعتين من الخلايا T على يومين مختلفة من أجل زيادة المرونة في هذا التوقيت. وأخيرا، يحتاج تجميع الآبار تكرار الفردية قبل إضافة خلايا T إلى MBMECs الذي يتعين القيام به في مثل هذه الطريقة التي التباين داخل وبين المجموعات هو الحد الأدنى. هذا يضمن أن الظروف الأولية على قدم المساواة بين جميع الفئات خلال ثقافة مشتركة من الخلايا T وMBMECs. يصف بروتوكول لدينا قياس طير خلال ثقافة مشتركة من الماوس الرئيسي الدماغ ECS مع خلايا CD4 + T تفعيلها مسبقا. يسمح لها نموذج بسيط للتعديلات متعددة، وفقا لاحتياجات العلمية. على سبيل المثال، ونوع وقوة ومدة التحفيز يمكن أن تختلف. خلايا CD4 + T محددة مستضد يمكن تفعيلها من خلال المستضد بهم وما شابه ذلك، في ظل وجود الخلايا المقدمة للمستضد مناسبة (ناقلات الجنود المدرعة)؛ بدلا من ذلك، وخلايا T يمكن تفعيلها polyclonally التي كتبها α-CD3 والأجسام المضادة α-CD28. في حالة تنشيط خلايا T ويمكن عن طريق التضمين مختلف السيتوكينات، ومنع الأجسام المضادة، مثبطات. استبدال ECS الدماغ الأولية مع خطوط الخلايا البطانية لا ينصح، لكن، وكما هو معروف أن المعرض الأخير أقل تقييدا المجمعات TJ وارتفاع النفاذية مقارنة مع الخلايا الأولية 43. بالإضافة إلى قياس طير كما قراءات الأولية، ويوفر هذا البروتوكول لمراقبة نوعية جيدة من monolay ECسلامة إيه السابقة لفحص خلايا T التهجير (الشكل 3E، F). من المذكرة، والقيم طير قد لا تقلل بالضرورة أثناء التهجير من خلايا T عبر MBMECs (الشكل 3E)، وهذا قد يعكس الطريق العابر للقد تستخدم الخلايا المناعية أثناء التهجير، كما لوحظ سابقا 39،44.

كما تنشيط خلايا تي تحفز ضعف EC خلال ثقافة مشتركة، طير يظهر مطرد، وانخفاض يمكن التنبؤ به، مقارنة عبر التجارب مع نفس الشروط. ويرافق انخفاض أكبر في طير عادة يصاحب ذلك زيادة أكبر في لجنة علم المناخ. في مناسبات نادرة، ومع ذلك، وزيادة في لجنة علم المناخ يمكن أن يكون أكثر وضوحا مما هو متوقع من انخفاض مماثل في طير (الشكل 4C). قد يعكس هذا التناقض مختلف جوانب EC أحادي الطبقة التعطيل. كما ECS محاولة لإغلاق الفراغات المتكونة أثناء تعطل الحاجز، فإنها يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية فيالتشكل والحركة مثل تشكيل نتوءات وزيادة منطقتهم المساحة الإجمالية، والتي يمكن أن تسهم في زيادة كبيرة وسريعة في لجنة علم المناخ. وهذا يجعل التغييرات في لجنة علم المناخ أقل قابلية للتنبؤ، مقارنة مع التغييرات في طير. وهكذا، فإن مستوى الانخفاض في طير يبقى المقياس الأكثر موثوقية وتمثيلية من سلامة حاجز للخطر.

هذا الاختبار يمكن أن تستكمل من خلال تقنيات أخرى للتحقيق في خصائص حاجز غشائي. ويمكن أن يتبعه فحص النفاذية، والذي يقيس كمية من جزيئات مختلفة الأحجام التي تنتشر من خلال أحادي الطبقة EC تعطلت 44. لهذا الغرض، fluorescently المسمى تقارن ديكستران، مثل فلوريسئين وتكساس الأحمر يمكن استخدامها. استشفاف الجزيئية أخرى متوفرة أيضا (على سبيل المثال، والسكروز، مانيتول، الزلال، ايفانز الأزرق والبيروكسيديز الفجل) 26. وعلاوة على ذلك، المناعي المجهري يمكن استخدامها لتحقيق التغييرات في تعبير البروتينوتوطين الخلوية من TJ والتصاق الخلايا الجزيئات. على الرغم من أن النموذج BBB عرض بسيط للغاية، فإن النتائج يمكن الحصول عليها مع أن توفر التوجه قيما لمزيد من الفحوص تحت أكثر الظروف الفسيولوجية. وتشمل هذه المقايسات (ولكن لا تقتصر على) في المختبر القص تدفق فحص لاستكمال قياس طير تم الحصول عليها تحت ظروف ثابتة وفي فحص النفاذية المجراة مع حقن ايفانز الأزرق في الفئران الحية لحساب التعقيد الكامل للBBB.

وعلى الرغم من حساسية وموثوق بها، والطريقة الموصوفة هنا ديه بعض القيود التي تستحق اهتماما خاصا. قيم طير القصوى المقاسة في الإعداد التجريبية لدينا تصل قيم 35-40 Ωcm 2. هذه القيم طير هي أقل بكثير مما كانت عليه في الجسم الحي، حيث تساهم أنواع مختلفة من الخلايا والمكونات ديكي لسلامة BBB، ولكنها أيضا ليست مرتفعة كما طير القيم التي تحققت في بعض الدول الاخرى في المختبر نماذج BBB <سوب> 26،45،46. يمكن تحسين هذا من خلال إضافة الهيدروكورتيزون إلى متوسطة EC، وهو ما ثبت لتعزيز ملحوظ خصائص حاجز 27،47 - 49. ومع ذلك، واستخدام هذه المواد - المعروف أن لها تأثيرات مضادة للالتهابات ومناعة - ليست مناسبة للجميع المقايسات الفنية. والتركيز على هذا البروتوكول معين على عواقب التفاعلات الخلية EC-T على سلامة الحاجز، قد يعوقه تفسير إضافة الهيدروكورتيزون. باستخدام بروتوكول المعروضة هنا وبالتالي تمكن من تقييم قدرة التهابات الحقيقية للخلايا T حفز أن يسبب EC حاجز العجز. ومن الجدير بالذكر أيضا أن المقارنة المباشرة من القيم طير مختلفة عنها في الأدبيات ينبغي بذل بحذر. هذه القيم هي تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد التجريبية، التي يتم الحصول عليها مع أنواع مختلفة من الخلايا وزرع البذور كثافة الخلايا، ووسائل الإعلام، ومناطق نمو الخلايا، ونظم قياس طير (على سبيل المثال </ م>، وتصميم وحجم الأقطاب).

من أجل تحاكي الوضع في الجسم الحي عن كثب، وقد تم إنشاء المجمع في المختبر نماذج BBB، حيث ECS هي المشارك مثقف مع pericytes على الجانب الآخر من الغشاء إدراج، أو التي تزرع فيها pericytes والخلايا النجمية على الجزء السفلي من الآبار 12،25،50 - 52. في مثل هذه الأنظمة شارك في الثقافة، عبر الحديث بين أنواع مختلفة من الخلايا يمكن تشديد أقوى من الجدار، مع الثلاثي المشترك الثقافات كونه أفضل في تشبه الوضع في الجسم الحي، وبالتالي توفير أعلى مستوى من القيم طير. تعقيد هذه الأنظمة، من ناحية أخرى، يشكل وجود قيود على استخدامها على نطاق أوسع كما في المختبر نماذج BBB.

الحد آخر من هذا النموذج هو عدم وجود إجهاد القص، وهو ما ثبت لتحسين سلامة حاجز 53،54. للتغلب على هذه المشكلة، وقد تم مؤخرا عرض نماذج BBB ديناميكية جديدة: Eخدمات العملاء هي مثقف في الألياف المجوفة ويتعرضون لظروف تدفق نابض، ومحاكاة عن كثب الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي 55،56.

وباختصار، يصف هذا البروتوكول نموذجا في المختبر من BBB على أساس التحليل الطيفي مقاومة. التركيز على تفاعل الماوس الأساسي الخلايا البطانية المخ مع تنشيط خلايا تي، يسمح طريقة لدراسة خصائص الحاجز خلال هذا الاتصال المباشر. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم خطوات حاسمة في تطور أمراض الجهاز العصبي المركزي التهابات مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تم المساس بي بي بي خلال تفاعل ECS مع خلايا T دماغي المنشأ. مقايسة وصفها تمكن التحقيق من النتائج المترتبة على تعديل المستهدفة من مثل هذا التفاعل باستخدام مجموعة واسعة من المواد مثل منع الأجسام المضادة، السيتوكينات ومثبطات تفعيل الخلايا التائية. طريقة حساسة وموثوق بها وغير الغازيةيتم تنفيذ القياسات الثانية من طير ولجنة علم المناخ بطريقة آلية. كل هذا يجعل منه أداة مفيدة ومتعددة الاستعمالات التي تضيف طبقة جديدة إلى مجموعة غنية من النماذج BBB. انها قد توسع بشكل خاص معرفتنا حول خصائص BBB في ظل ظروف الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في أمراض المناعة الذاتية مثل مرض التصلب العصبي المتعدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لأنيكا Engbers وفرانك كورث حصول على الدعم الفني الممتاز والدكتور ماركوس شافر (nanoAnalytics GmbH ل) لإجراء مناقشات مفيدة بشأن القياسات طير. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، SFB1009 مشروع A03 إلى الأب وLK، CRC TR128، مشاريع A08. Z1 وB01 لوقا والأب، ومركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (كلية الطب في مونستر) عدد المنح Kl2 / 2015/14 لوقا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts - pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Tags

علم المناعة، العدد 118، مقاومة التحليل الطيفي، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير)، طبقة الخلايا السعة (لجنة علم المناخ)، حاجز، التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي، خلايا تي، الخلايا البطانية الماوس الدماغ الأولية، منعطفات ضيقة، والتهاب الدم في الدماغ والهجرة عبر الحدود
ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuzmanov, I., Herrmann, A. M.,… More

Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H. J., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter