Introduction
Die Blut-Hirn - Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von 1 bis 3. Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS 2,4 - 6 und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS 7 ermöglicht - 9.
In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB 2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden 9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung 13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo 19 nachzuahmen - 25. In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften 26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden.
TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E - Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS) und Echtzeit - Zellanalyse 15,28 - 30. TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie 27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt.
Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung 32 System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. 37 - solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun - Enzephalomyelitis 33 beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung 1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T - Zellen geben.
Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 + T - Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden.
Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T - Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.
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Protocol
Für alle Versuche wurden die Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der zentralen Tieranlage an der Universität Münster, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien des Tierversuchsethikkommission durchgeführt und von den örtlichen Behörden des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) zugelassen.
1. MBMEC Isolierung und Kultur
HINWEIS: Isolieren MBMECs wie zuvor im Detail 14 mit den folgenden Modifizierungen beschrieben:
- Sacrifice 20 erwachsenen C57BL / 6 - Mäuse (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen ihr Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen.
- Spülen Sie die Maus mit 70% Ethanol und enthaupten es Schere; Entfernen Sie die Kopfhaut einer Pinzette und Schere. Machen Einschnitte auf der linken und rechten Seite des Schädels, vom Foramen Magnum beginnen. Heben Sie den Schädel von seinem Schwanz Seite und takE das Gehirn mit einer Pinzette aus.
- Unter einem Laminar-Flow-Haube, sterile Pinzette das Gehirn in einer Petrischale zu legen und den Hirnstamm, Kleinhirn und Thalamus, halten nur die Rinde entfernen.
HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroskops ist nicht erforderlich, für jeden dieser Schritte. - Legen Sie die Rinde auf ein Stück sterile Western-Blot-Papier und rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette bis Meningen sind nicht mehr sichtbar.
- Nach der mechanischen und enzymatischen Verdau (nach dem Protokoll 14) sammeln Endothelzellen aus der Dichtegradient durch einen langen, sterile Nadel und einen 5 ml Kolben verwendet wird . Endothelial Zellen erscheinen als eine trübe Schicht über dem roten Ring mit Erythrozyten. Transfer 20-25 ml dieser Schicht in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen; ganz oben auf der Röhre mit DMEM auf.
- Nach zwei Runden der Wasch 14, Resuspendieren der Zellen in 6 ml MBMEC Medium , das Puromycin (4 & mgr; g / ml) und sie auf sechs beschichteten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen Samen; lassen Sie sie in einem GewebeKulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 (bezeichnet als "Inkubator" von hier an) für drei Tage.
HINWEIS: Details der MBMEC Beschichtungslösung, siehe Materialien Tabelle. - Ändern Sie das Medium durch Zugabe von 1 ml zu jeder Vertiefung von frischem MBMEC Medium ohne Puromycin; legte die Platte wieder bei 37 ° C und 5% CO 2 für zwei weitere Tage.
2. Ernte MBMECs
- Am Tag fünf nach MBMEC Isolation Lösung Precoat-durchlässige Einsätze mit MBMEC Beschichtung: 80 ul Lösung pro Einsatz hinzufügen und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Stunden verlassen.
- Pipette vorsichtig die Beschichtungslösung und die Einsätze der Luft trocknen für 30 Minuten lassen. 2 ml Raumtemperatur (RT) PBS in jede Vertiefung der Platte, MBMECs mit dem Medium zu waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt. In 0,05% Trypsin-EDTA (300 & mgr; l pro Vertiefung) und lassen Sie die Platte in den Inkubator für 5-10 min.
- 2 ml MBMEC Medium zu jeder Vertiefung zu stoppenTrypsinierung. Übertragung der gesammelten Zellen auf eine 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sie bei 700 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml MBMEC Medium ohne Puromycin.
- Zählen Sie die Zellen; 10 ul der Zellsuspension mischen mit 90 & mgr; l 0,04% Trypan-Blau (10x Verdünnung der Zellen). Je 10 ul dieser Mischung zwischen der Glasabdeckung und die Zellzählung Kammer (Hämozytometer). Zählen Trypan Blau-freien Zellen in allen vier Quadranten der Kammer (N) und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der gezählten Zellen (N ') wie folgt: N' = N / 4 ist.
- Berechnen der Zellkonzentration (in 10 & sup6 ; Zellen / ml) mit der folgenden Formel: C = N 'x 10 4 x 10, wobei 10 4 durch die Abmessungen des Hämozytometer gegeben und 10 ist der Verdünnungsfaktor aus Schritt 2.4.
- Seed 2 x 10 4 Zellen in einem Volumen von 260 & mgr; l pro Platte. In 810 ul MBMEC mittleren bis unteren Fach jeder Vertiefung. Legen Sie die Platte mit Einsätzen in den Inkubator, bis sie bereit mit Abschnitt 4 fortzufahren.
HINWEIS: Die Volumina für die obere und untere Fach sind einsatzspezifisch und funktionieren nicht für alle 24-Well-Formate.
3. CD4 + T - Zell - Isolierung und Stimulation
- CD4 + T - Zell - Isolation
- Sacrifice einer erwachsenen Maus (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen seinen Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einer sauberen Dissektion Bord und spülen Sie ihn mit 70% Ethanol; Verwenden einer sterilen Schere und Pinzette das Peritoneum zu öffnen und die Milz und Lymphknoten (Leisten, Achsel, brachial und Gebärmutterhalskrebs) zu entfernen; Schließlich übertragen die Gewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, die 5 ml PBS auf Eis.
- Unter laminaren Strömungshaube, übertragen das Gewebe durch PBS mit dem Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70 & mgr; m Zellsieb auf Dekantierung; homogenisierendas Gewebe durch sie mit einer 1 ml Kolben durch das Sieb zu drücken.
- 30 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml FACS-Puffer. Filtern Sie die Suspension durch eine 40 um Zelle Sieb, fügen Sie eine weitere 20 ml FACS-Puffer auf das Rohr.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 500 & mgr; l FACS-Puffer.
- In 20 ul Maus-CD4 magnetischen Mikrokügelchen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. 25 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C.
- In der Zwischenzeit legen Sie eine LS-Trennsäule in den Magneten und spülen Sie ihn mit 3 ml FACS-Puffer. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml FACS-Puffer.
- Hinzufügen von Zellen an die Säule. Die Säule wird mit 3 ml FACS dreimal puffern. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie es auf eine neue 15 ml centrifugation Rohr. 5 ml FACS-Puffer, spülen Sie die markierten Zellen mit dem Säulenkolben und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min 4 ° C.
- Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml T-Zellmedium. Zählen Sie die Zellen wie in 2.4 und Samen 1 x 10 5 Zellen in 100 ul Medium pro Vertiefung.
- CD4 + T - Zell - Stimulation
- Polyklonale CD4 + T - Zell - Stimulation
- Pre-coat eine Rundboden 96-Napf-Platte mit gereinigtem anti-Maus-CD3-Antikörper (Klon 145-2C11) in PBS, bei einer gewünschten Endkonzentration. Zum Beispiel, vor der Beschichtung der volle Platte mit α-CD3 bei 1 & mgr; g / ml, mischen 10 ul der Antikörper (Stammkonzentration = 0,5 mg / ml) mit 5 ml PBS, Wirbel und 50 ul der Mischung jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
- Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 3 Stunden. Nachdem die T-Zellen zu isolieren, waschen Sie die vorgezogene Platte zweimal mit PBS. Hinzufügen gereinigter anti-CD28-Antikörper (Clon37,51) auf isolierte T - Zellen in einer Endkonzentration gewünschte (beispielsweise bei 1 & mgr; g / ml); gut mischen. Samen der T-Zellen und lassen sie in den Inkubator für zwei bis drei Tage.
- Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit dendritischen Zellen (DCs)
HINWEIS: Wenn DCs als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen:- Bevor die Milz Homogenisieren, injizieren sie mit 1 ml Kollagenase Typ IA in PBS bei 0,5 mg / ml und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Inkubieren im Wasserbad bei 37 ° C für 15 min. Nach Waschen mit PBS, das Pellet in FACS-Puffer resuspendiert und 20 ul Maus CD11c magnetische Microbeads, anstelle von CD4 Microbeads hinzuzufügen.
- Verwenden Sie eine MS Trennsäule und die entsprechenden Volumina: Spülen der Säule mit 1 ml FACS-Puffer; Die Zellen in 1 ml FACS-Puffer und wasche die Säule mit 1 ml FACS-Puffer dreimal.
- Anzeiged Antigen der Wahl zu DCs (zB Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) aa 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-Bottom Gut.
- 1 x 10 5 T - Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Rundboden-gut am Ende, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben.
- Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit B - Zellen
HINWEIS: Wenn B-Zellen als APCs verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen:- Verwenden Milzen aus transgenen Mäusen , deren B - Zellen sind Antigen-spezifische ( zum Beispiel IgH MOG (Th) Mäuse, deren B - Zellen spezifisch erkennen MOG 35-55).
- Verwenden antigen-spezifischen T - Zellen (zB von TCR MOG (2D2) -Mäuse). In 20 ul Maus CD19 magnetischen Mikrokügelchen anstelle von CD4-Mikrokügelchen.
- Fügen Sie das Antigen der Wahl an die B cells (zB MOG 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 & mgr; l der B - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut.
- 1 x 10 5 T - Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben.
- Polyklonale CD4 + T - Zell - Stimulation
4. Einrichten und Durchführen TEER Mess
- Legen Sie die 24-Well-Modul des TEER Instrument unter der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und Platz Einsätze mit MBMECs im Gerät mit einer Pinzette.
- Pipette 810 ml frisches Medium zu der unteren Kammer des Moduls Brunnen: fügen Sie es sorgfältig zwischen dem Einsatz und der Wand des Moduls gut.
- Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an seinem Computer; schalten Sie die Gerätesteuerung und die Software öffnen.
- Wählen Sie "neue Messung" im Pop-up-Fenster. Check 'show TEER "und" show CCL-Boxen; und drücken Sie dann "Start". Nach der ersten Messung abgeschlossen, wählen Sie "überprüfen Sie alle Brunnen" in der Registerkarte "Ergebnisse" alle TEER und Ccl Werte zu sehen.
- Speichern Sie die Datei: Datei> Speichern unter> 'den Namen der Datei'.
HINWEIS: Als TEER und Ccl kontinuierlich in einer automatisierten Weise gemessen werden, deren Werte über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen zu überwachen. Mediumwechsel ist nicht erforderlich, es sei denn, die Lebensfähigkeit der Zellen suboptimal ist, wie durch eine fehlende Zunahme in TEER visualisiert. - Wählen Sie den Zeitpunkt zu Kokultur MBMECs mit Zellen T , wenn Ccl stabil ist und weniger als 1 & mgr; F / cm 2 und TEER seinen Maximalpegel erreicht.
- inspizieren sorgfältig absolute TEER und Ccl Werte und schließen Sie die Vertiefungen, in denen MBMECs nicht konfluent genug Monolayern von unchecking solche Brunnen entwickelt haben.
- Gruppe der Rest aus den Brunnen der rechten Maustaste auf ein gut und wählen Sie "Add gut an neue durchschnittlich gut". Name es in dem Pop-up-Fenster; das gleiche für alle einzelnen Vertiefungen zu gruppieren.
- Überprüfen Sie alle durchschnittlichen Brunnen, um zu bestätigen, dass sie alle haben die gleichen Ausgangsbedingungen vor der Co-Kultur. Wenn einige signifikant unterschiedliche absolute TEER-Werte haben oder TEER abfällt, oder die Standardfehler zu groß sind, wiederholen Sie die Gruppierung.
HINWEIS: Die optimale Gruppierung von Brunnen bietet minimale Variation in TEER-Werte, sowohl innerhalb als auch zwischen den Versuchsgruppen. - Im "Experiment" Registerkarte, drücken Sie "Pause", trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Deckel unter der Laminar-Flow-Haube.
- Vorbereitung voraktiviert und / oder naiven T-Zellen, mit oder ohne spezifische Cytokine, Antikörper oder andere Substanzen, wie gewünscht: Zum Beispiel: gereinigtes mischen NA / LE Ratten-anti-Maus-IFN-γ-Antikörper (Klon XGM1.2) mit vorbereiteten T Zellen bei 20 & mgr; g / ml pro Vertiefung des TEER Instruments.
HINWEIS: Wenn Substanzen wie Granzym B-Inhibitor verwendet werden, sind sie einzu T Zellkultur dded zu Beginn der T - Zell - Stimulation: zB Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) in einer Endkonzentration von 10 uM in DMSO mit isolierten T - Zellen gemischt. Siehe Materialien und Geräte für weitere Details. - Entfernen einen Teil des Mediums aus dem Einsatz (das obere Fach gut): zB vorsichtig pipettiert aus 150 ul (Entfernen all das Medium vermieden werden sollten , da sie die MBMEC einschichtigen stören könnte).
- Hinzufügen T - Zellen zu MBMECs durch vorsichtiges Pipettieren von 150 ul Medium , enthaltend 2 x 10 5 Zellen / Insert.
HINWEIS: Bei der Pre-aktivierte T-Zellen zu ernten, zählen nur Strahlen, Trypanblau-freien Zellen. - Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät ein und drücken Sie "Resume Messung". Nach 24 Stunden, drücken Sie "Stop" in der "Experiment" Registerkarte und speichern Sie die Datei (Datei> Speichern).
5. Datenexport und statistische Analyse
- Exportieren Sie die Ergebnisse, indem Sie Datei> Exportieren.
- In der Registerkarte "Einstellungen" des Pop-up-Fenster, wählen Sie ".dot" in der "Dezimaltrennzeichen" -Option und "Tabulator" in der "Feldtrennzeichen" -Option.
- In der "Exportergebnisse" Registerkarte benennen Sie die Datei, überprüfen Sie alle Brunnen exportiert werden, und überprüfen Sie die "TEER" und "Ccl" Boxen im "wählen Daten" aus.
- Drücken Sie auf "Exportieren von Daten", öffnen Sie die exportierte Datei, und die Daten in eine Tabelle kopieren.
- Normalisieren die exportierten Daten (durch jede Wiederholung sortiert, mit TEER und Ccl Werte für jeden Lauf (Messung gegeben)): Set TEER und Ccl Werte der letzten Zeitpunkt vor der Co-Kultur zu 100% und ändern entsprechend die Werte für alle anderen Läufe, bezogen auf die '100%' laufen.
- Kopieren normalisierten Daten in eine Software der Wahl eines Graphen zu generieren, indem die einzelnen Vertiefungen und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Behandlungsgruppe anzeigt.
- Perform Zwei-Wege-ANOVA statistischen Test mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche, die Statistik-Software der Wahl.
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Representative Results
Abbildung 1 gibt eine allgemeine Übersicht über die in vitro - Modell BBB die Wechselwirkung zwischen T - Zellen und Endothel - Zellen zu untersuchen verwendet. Das Experiment besteht aus drei Hauptschritten. Der erste Schritt ist die Isolierung von primären MBMECs aus Gehirnrinden, und ihre Kultur für fünf Tage. Wenn sie Konfluenz in der Zellkulturplatte zu erreichen, werden auf MBMECs permeablen Einsätzen trypsinisiert und reseeded, die in der TEER Instrument dann platziert werden. Die TEER und Ccl von MBMECs kontinuierlich gemessen und über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen überwacht. In der Zwischenzeit sind T-Zellen isoliert, stimuliert (Schritt 2), und kultiviert für zwei bis fünf Tage, Art und Stärke des Reizes. In Schritt 3 werden T-Zellen zugegeben und co-kultiviert mit MBMECs wenn Ccl auf einem stabilen niedrigen Niveau ist und die TEER auf seinem maximalen Pegel ist. Die Auswahl dieser Zeitpunkt für die Co-Kultur, wenn die TEER noch an seinem Plateau ist von entscheidender Bedeutung für den Erfolgder gesamten Messung. Somit ist es äußerst wichtig, dass der Zeitpunkt für die T-Zell-Isolierung und Stimulation wird sorgfältig gewählt, so dass die T-Zellen das gewünschte Niveau der Aktivierung durch den Zeitpunkt der Zugabe zu dem ECs erreichen. Nach der Zugabe von T-Zellen, wird die Messung für einen Tag wieder aufgenommen, und die Ergebnisse werden analysiert.
Nach dem ersten Fünf-Tage - Kultur zeigen MBMECs leicht charakteristische spindelförmige Morphologie (2A, linkes Feld) und endotheliale zellspezifische Marker wie PECAM-1 und Claudin-5 (2A, mittlere und rechte Platten) auszudrücken. Allerdings liefert diese allein nicht genügend Beweise für ihre vollständigen Konfluenz und richtige Barriere Integrität. Impedanzspektroskopie, andererseits gibt eine gute Schätzung der einschichtigen Integrität und dient als Qualitätskontrolle von jeder Vertiefung vor der Durchführung eines funktionellen Assays. In 2B sind die meisten derWells enthielten MBMECs deren Ccl Werte waren stabil und niedrig, und ihre TEER-Werte ein Plateau erreicht. Diese Vertiefungen wurden für die nachfolgende Co-Kulturexperimente verwendet. Sie wurden so gruppiert , dass die Varianz innerhalb und zwischen den Gruppen minimal war , bevor T - Zellen (2C) Zugabe. Die Vertiefungen , deren TEER - Werte unterschieden sich signifikant von dem Rest (wie die blaue Kurve in 2B angegeben) wurden nicht verwendet, da sie zu mehrdeutigen Ergebnissen oder Fehlinterpretation der Daten führen würde.
Vorausgesetzt, dass die ersten Anforderungen für MBMEC Kultur und Zellstimulation T erfüllt sind, kann der Impedanzspektroskopie wertvolle Einblicke in die T-Zell-EG-Interaktion geben. TEER Messung kann als die primäre Anzeige für eine solche Interaktion und ein Maß der T - Zell-vermittelten EC Dysfunktion dienen, wie in 3A und 3B gezeigt. In diesem Fall werden MBMECs auf Einsätze mit Mikro gewachsen 0,4um im Durchmesser, die T-Zellen nicht erlaubt, durch den Einsatz Membran passieren. 3A zeigt , dass nur stimuliert, aber nicht naiven T - Zellen in der Lage sind EC Dysfunktion induzierende, wie durch eine Abnahme der TEER und Zunahme in CCl bestimmt. Naiver T-Zellen kann somit als negative Kontrolle, da TEER und Ccl während der Co-Kultur dienen mit naiven T-Zellen bleiben an ihren Ausgangsniveaus. Die Ausnahme ist die Spitze am Beginn der Co-Kultur, die durch die Instrumentenführung (die Deckel anheben, das Hinzufügen neuer Mediums mit Zellen, die geringfügig verschiedenen Temperaturen und pH-Werten, und Schließen der Deckel aufweisen kann). Dieses Artefakt wird mit allen Arten von TEER-Messungen und bei der Analyse ignoriert. Die Zugabe der pro-inflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α (bei 100-500 U / ml), die zur Induzierung EC Entzündung geeignet bekannt sind, können als Positivkontrolle verwendet werden. In 3A, MOG 35-55 -spezifische CD4
Um können die Mechanismen der beschriebenen MBMEC einschichtigen Störung, verschiedene Ansätze verwendet werden, zu untersuchen. Ergebnisse in 3C zeigen , dass die T - Zellen stimuliert, nicht jedoch deren Überstände eine erhebliche Schädigung der MBMECs verursacht, was darauf hinweist , dass ein direkter Kontakt zwischen T - Zellen und MBMECs für Schrankenstörung kritisch ist. Außerdem ist die Zugabe eines neutralisierenden α-IFN-γ-Antikörpers bei der Messung TEER nur geringfügig MBMEC Barriereeigenschaften verbessert, was darauf hindeutet, dass IFN-γ nicht die primäre Ursache dieser Störung sein kann. Auf der anderen Seite, das Hinzufügen von Granzym B Inhibitor II zu T - Zellkultur (3D) wiederhergestellt MBMEC Integrität in einem größeren Ausmaß, indem er auf dieses zytolytischen Molekül als wichtiger Akteur bei der Entstehung von MBMEC Schaden und anschließender Abnahme der TEER.
Neben seiner Verwendung als eine primäre Anzeige für die Wirkung von T-Zellen auf EC-Monoschicht Integrität kann TEER Messung auch als Qualitätskontrolle der Barrierenintegrität vor anderen Assays, wie beispielsweise T-Zell-Transmigrationsassay verwendet werden. In diesem Fall fügt mit Mikroporen von 3 & mgr; m im Durchmesser verwendet werden. In 3E wurde TEER - Messung durchgeführt , um sicherzustellen , dass MBMEC Monoschicht aus dem gleichen Maß an Integrität war in allen Vertiefungen vor der Zugabe von T - Zellen für die nachfolgende transmigration-Test. Dies wurde durch die Ernte von T-Zellen aus dem unteren Fach der Instrumenten Brunnen gefolgt, T-Zellen mit α-CD4-Antikörper-Färbung und durchflusszytometrische Analyse, Zellzählung Perlen mit absoluten Zahlen von transmigrierten T-Zellen zu bestimmen; gezeigt in 3E, in der Mitte und rechts). Man beachte , dass T - Zellen für die Transmigrations verwendet stimuliert hatte keine wesentliche Abnahme der TEER verursachen, obwohl sie , wie in 3A voraktiviert wurden. Dies könnte die trans Weg Immunzellen widerspiegeln , die in der Transmigrations verwenden, wie zuvor 39 beobachtet worden. In 3F wird die Hälfte der Vertiefungen mit MBMECs wurden mit IFN-γ und TNF-α (uninflamed vs. Entzündetes) entzündet, und später wurden naive T - Zellen für die Beurteilung der Transmigratory Aktivität hinzugefügt. In diesem Fall vorgesehen TEER Messung einen Hinweis darauf, wie stark die Entzündung mit Zytokinen war und wann sollte T-Zellen für die transmigratio hinzugefügt werdenn.
Abbildung 4 zeigt einige der häufigsten Situationen , die zu Fehlinterpretationen von TEER Ergebnissen führen kann. In 4A beispielsweise nicht alle MBMECs entwickelte eine vollständig konfluenten Monoschicht in der gleichen Zeit. Eine der Gruppen ( "naive T cells - ausgeschlossen ') enthalten, deren MBMECs TJ-Komplexe wurden mit einer anderen Rate Reifung im Vergleich zu den anderen Gruppen nur vor der Zugabe von T-Zellen. Diese Gruppe konsequent weiterentwickelt TEER-Werte über 100% während des Experiments und wurde von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Somit ist die Steigung der Kurve TEER (Rate von TJ Reifung) vor dem Experiment so wichtig wie absolute TEER-Werte für die richtige Interpretation der Daten. 4B zeigt , dass die Co-Kultur beginnt nicht nur zu früh , sondern auch zu spät zu falschen Ergebnissen führen kann. Hier sowohl in der Gruppe mit stimulierten T-Zellen und der negativen Kontrollgruppe (mittel change) wurden TEER-Werte bereits bestanden ihre plateau und begann unabhängig von der experimentellen Bedingungen zu verringern, damit anzeigt suboptimal Kulturbedingungen vor und während des Experiments. Solche Gruppen sollten nicht in die Analyse einbezogen werden. Schließlich, obwohl TEER und Ccl Regel ihre Werte derart zu ändern, dass eine stärkere Abnahme der TEER um einen größeren Anstieg in CCl begleitet wird, dies nicht immer der Fall sein. In 4C, stimulierten T - Zellen B eine größere Abnahme in TEER verursacht, aber eine geringere Zunahme in CCl als T - Zellen stimuliert A hat.
Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über die Technik. Nach der anfänglichen Kultur, MBMECs werden auf durchlässigen Einsätzen reseeded und in den automatisierten Zell Monitor platziert; TEER und Ccl werden jede Stunde gemessen für 4-5 Tage. In der Zwischenzeit werden T - Zellen in vitro aktiviert 40. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: MBMECs eine konfluente einschichtige entwickeln geeignet für eine In - vitro - Modell BBB. (A) Spindelform Morphologie (links) und Immunfluoreszenzanfärbung von PECAM-1 (Mitte) und Claudin-5 (rechts) fünf Tage nach MBMEC Isolation. (B und C) und TEER Ccl Werte vor (B) und nach (C) Gruppierung von einzelnen Vertiefungen vor to Zugabe von T-Zellen. Die blaue Kurve in (B) ist nicht für das Experiment verwendet, da MBMECs in diesem gut sind wie in den anderen Brunnen nicht entwickelt TEER so hoch. Daten in (C) zeigen Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse. (AD) Veränderungen in TEER als primäre Maßnahme der MBMEC Dysfunktion bei Wechselwirkung mit T - Zellen. (A) MOG-spezifischen T - Zellen wurden für fünf Tage durch MOG-spezifische B - Zellen in Gegenwart von MOG 35-55 Peptid aktiviert. Naiver T-Zellen und pro-inflammatorische Zytokine IFN-γ und TNF-α (beide bei 100 U / ml) dienten als negative und positive Kontrolle, respectively. (B) T - Zellen wurden mit α-CD3 und α-CD28 - Antikörper stimuliert (1 & mgr; g / ml jeweils) für zwei oder drei Tage, wie angedeutet, bevor sie an MBMECs Zugabe. (C) T - Zellen (voraktivierten wie in (A)) oder deren Überständen in Gegenwart von α-IFN-γ - Antikörper oder dem entsprechenden Isotyp - Kontrolle. (D) T - Zellen (voraktivierten wie in (B)) für zwei Tage in Gegenwart von Granzym B - Inhibitor II oder dessen Verdünnungsmittel DMSO. (E und F) TEER Messung nur als Qualitätskontrolle für Integrität der Barriere vor der T-Zell - Transmigrations verwendet. MBMECs wurden auf Einsätze mit Poren von 3 um im Durchmesser wachsen gelassen. (E) T - Zellen stimuliert , wie in (A) beschrieben wurde , lassen wurden 18 Stunden (links) bis transmigrieren. Anschließend wurden sie durch Flusszytometrie geerntet, gebeizt für α-CD4-Antikörper (Klon RM4-4) und analysiert, Zellzählung Kügelchen (mittlere und rechte) verwendet wird. (F)Überwachung der MBMEC einschichtigen Integrität bei Stimulierung mit IFN-γ und TNF-α und die entsprechende Zeitpunkt für nachfolgende Zugabe von T-Zellen für die Transmigrationsassay wählen. (AF) Die Ergebnisse zeigen , technische Triplikaten und sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente je. Die Daten zeigen, Mittelwert ± SEM. (E, rechts) Ungepaarte, Student t - Test-two tailed. ** P <0,01. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Praktische Überlegungen und die Interpretation der Daten. (A) MBMECs von einer Versuchsgruppe (rote Kurve) wurden von der Analyse ausgeschlossen, da die Geschwindigkeit der Reifung ihrer junctional Komplexe wurde anders im Vergleich zu anderen groups. (B) Ein Beispiel von T - Zellen zu spät Zugabe, die richtige Beurteilung der MBMEC Dysfunktion verhindert. (C) Nach der Unterbrechung durch stimulierte T - Zellen "A" (schwarze Kurve) CCl Werte MBMECs zeigte einen dramatischen Anstieg als es aus der gleichzeitigen Abnahme der TEER durch die gleichen T - Zellen verursacht zu erwarten. (AC) T - Zellen wurden für zwei Tage mit α-CD3 und α-CD28 - Antikörper (1 & mgr; g / ml jeweils) stimuliert. Die Ergebnisse zeigen, technische Triplikaten und sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente je. Die Daten zeigen, Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Mehrere Schritte des beschriebenen Protokolls sind unerlässlich für ein erfolgreiches Experiment. Während der anfänglichen MBMEC Isolierung und Kultur, ist es entscheidend, dass Arbeiten unter sterilen Bedingungen, so viel wie möglich durchgeführt, um die Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen oder Bakterien zu verhindern. Um eine reine Kultur von ECs zu erhalten, wird empfohlen , ein Medium , das Puromycin für die ersten drei Tage zu verwenden, die das Überleben von ECs ermöglicht, nicht aber andere Zelltypen (vor allem pericytes) 41,42. Ein weiterer wichtiger Schritt, die besondere Aufmerksamkeit verdient, ist die Identifizierung des richtigen Zeitpunkts für das Hinzufügen von Pre-aktivierten T-Zellen. Während der ersten 48 Stunden der Messung MBMECs TEER wuchern auf durchlässigen Einsätzen und schließen die Lücken zwischen einander. Daher nimmt Ccl , bis sie einen stabilen und niedrigen Niveau (rund 0,6 uF / cm 2) erreicht. Dies ist das erste Zeichen einer konfluenten Monoschicht EC, ist aber noch nicht ein Zeichen für eine dichte Barriere. Nur nachDas CCL hat ein stabiles Niveau erreicht hat der TEER zu erhöhen beginnen. Wenn TJ-Komplexe ist voll ausgebildet, und die EG-Barriere vollständig abgedichtet, erreicht TEER seinen maximalen Pegel. Dieses Plateau ist in der Regel erreicht drei bis fünf Tage nach der ECs Nachsaat und ist für eine weitere 24 bis 36 h gehalten. Der beste Zeitpunkt für die Zugabe der T-Zellen zu Beginn des Plateaus, die dafür sorgt, dass die ECs noch lebensfähig genug sind, um mit den T-Zellen co-kultiviert werden. Da die T-Zell-Aktivierung vor der optimale Zeitpunkt für die Co-Kultur eingeleitet werden muss, kann sicher vorhergesagt werden kann, kann es vorteilhaft sein, zwei Chargen von T-Zellen zu stimulieren, an zwei verschiedenen Tagen, um die Flexibilität dieses Timing zu erhöhen. Schließlich Gruppierung von einzelnen Wiederholungsvertiefungen vor T-Zellen zu den MBMECs Zugabe muss so durchgeführt werden, dass die Variabilität innerhalb und zwischen den Gruppen ist minimal. Dadurch wird sichergestellt, dass die Anfangsbedingungen bei allen Gruppen während der Co-Kultur von T-Zellen und MBMECs gleich sind. Unser Protokoll beschreibt TEER Messung während der Co-Kultur von primären Mausgehirn ECs mit voraktivierten CD4 + T - Zellen. Seine einfache Form ermöglicht, dass mehrere Modifikationen, entsprechend den wissenschaftlichen Anforderungen. Zum Beispiel kann die Art, Stärke und Dauer des Stimulus variiert werden. Antigen-spezifische CD4 + T - Zellen können durch ihre zugehöriges Antigen, in Gegenwart von geeigneten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) aktiviert werden; Alternativ können T-Zellen polyklonal durch α-CD3 und α-CD28-Antikörpern aktiviert werden. Die T-Zell-Aktivierungsstatus kann durch verschiedene Zytokine moduliert werden, Antikörper, Inhibitoren blockieren. Ersetzen primären Gehirn ECs mit endothelialen Zelllinien ist nicht zu empfehlen, aber, wie es , dass diese Show weniger restriktive TJ Komplexe und höhere Permeabilität zu den primären Zellen 43 im Vergleich bekannt ist. Zusätzlich TEER als primäre Anzeige zu messen, bietet dieses Protokoll eine gute Qualitätskontrolle der EG monolayer Integrität vor der T-Zell - Transmigrationsassay (3E, F). Bemerkenswert ist , kann TEER - Werte nicht unbedingt während der Seelenwanderung von T - Zellen über die MBMECs (Abbildung 3E) verringern: dies die transzellularen Route Immunzellen während Trans verwenden widerspiegeln könnten, wie zuvor 39,44 beobachtet.
Als aktivierte T-Zellen EC Dysfunktion während der Co-Kultur induzieren, zeigt TEER eine stetige, berechenbare Abnahme, vergleichbar über Experimente mit den gleichen Bedingungen. Eine stärkere Abnahme der TEER wird üblicherweise durch eine größere gleichzeitige Zunahme in CCl begleitet. In seltenen Fällen kann eine Erhöhung in CCl jedoch ausgeprägter sein , als aus der entsprechenden Abnahme in TEER (4C) zu erwarten wäre. Diese Diskrepanz kann verschiedene Aspekte der EG einschichtigen Störung widerspiegeln. Als ECs versuchen, die Lücken bei der Schrankenstörung gebildet zu schließen, können sie dynamische Veränderungen unterliegen inMorphologie und Motilität, wie beispielsweise Vorsprünge und die Erhöhung ihrer Gesamtoberfläche, welche alle dazu beitragen können zu einer dramatischen und schnellen Anstieg in CCl bilden. Dies macht Änderungen in CCl weniger vorhersagbar, im Vergleich zu Veränderungen in TEER. Somit bleibt der Grad der Abnahme der TEER die verlässlichste und repräsentative Maß beeinträchtigt Barriere Integrität.
Dieser Test kann durch andere Techniken ergänzt werden endothelialen Barriere-Eigenschaften zu untersuchen. Es kann durch eine Durchlässigkeit Assay verfolgt werden, die die Menge von Molekülen unterschiedlicher Größe misst , die durch die EC - Monoschicht gestört 44 diffundieren. Zu diesem Zweck können fluoreszierend markiertes Dextran-Konjugate, wie zB Fluorescein und Texas Red verwendet werden; anderen molekularen Tracer sind ebenfalls erhältlich (zB Saccharose, Mannit, Albumin, Evans Blue und Meerrettich - Peroxidase) 26. Weiterhin kann die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Veränderungen in der Proteinexpression zu untersuchen,und die zelluläre Lokalisation von TJ und Zelladhäsionsmoleküle. Obwohl die präsentierten BBB-Modell ist sehr einfach, die damit erzielten Ergebnisse können für weitere Tests unter mehr physiologischen Bedingungen wertvolle Orientierung. Solche Tests umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) TEER Messung unter statischen Bedingungen und in vivo - Assay in vitro Permeabilität Scherströmung Assay zur Ergänzung erhaltenen Mäuse mit Evans Blue Injektion in lebende für die volle Komplexität der BBB zu berücksichtigen.
Obwohl empfindlich und zuverlässig, das hier beschriebene Verfahren hat gewisse Einschränkungen, die besondere Aufmerksamkeit verdienen. Die maximalen TEER - Werte in unserem Versuchsaufbau gemessen erreicht Werte von 35 bis 40 & Omega; cm 2. Diese TEER - Werte sind viel niedriger als in vivo, in denen verschiedene Zelltypen und azellulären Komponenten auf die Integrität der BHS beitragen, aber sie sind auch nicht so hoch wie TEER in einem anderen in vitro - Modelle BBB erreichten Werte <sup> 26,45,46. Dies könnte durch die Zugabe von Hydrocortison auf die EC - Medium verbessert werden, was deutlich gezeigt wurde , Barriereeigenschaften verbessern 27,47 - 49. Jedoch Verwendung solcher Substanzen - bekannt, entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkungen haben - nicht geeignet für alle funktionellen Assays. Da der Schwerpunkt dieses besonderen Protokoll über die Folgen der EC-T-Zell-Interaktionen auf Integrität der Barriere ist, würde Interpretation durch die Zugabe von Hydrocortison behindert werden. hier so präsentiert das Protokoll, das ermöglicht die Bewertung des wahren Entzündungspotential der stimulierten T-Zellen EC Barriere Dysfunktion verursachen. Es ist auch erwähnenswert, dass ein direkter Vergleich verschiedener TEER-Werte in der Literatur berichtet, sollte mit Vorsicht erfolgen. Solche Werte auf den Versuchsaufbau stark abhängig sind, werden sie mit unterschiedlichen Zelltypen erhalten wird , Zelldichten Säen, Medien, Zellwachstumsbereiche und TEER Messsysteme (zB </ Em>, die Gestaltung und Größe der Elektroden).
Um die in vivo - Situation näher, komplex in vitro BBB Modellen nachzubilden wurden eingerichtet, wo ECs mit Perizyten auf der gegenüberliegenden Seite des Einsatzes Membran co-kultiviert werden, oder in denen Perizyten und Astrozyten sind auf dem Boden der Vertiefungen gezüchtet 12,25,50 - 52. In einem solchen Co-Kultursystemen, Übersprechen zwischen verschiedenen Zelltypen ermöglicht stärkere Straffung der Barriere, dreifach mit Co-Kulturen ähnlich der in vivo Situation das Beste zu sein und somit die höchsten TEER - Werte bereitstellt. Die Komplexität dieser Systeme, andererseits stellt eine Beschränkung auf ihre breitere Verwendung als in vitro - Modelle BBB.
Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist der Mangel an Scherspannung, der gezeigt wurde , Barrierenintegrität 53,54 zu verbessern. Zur Überwindung dieses Problems, neue dynamische BBB-Modelle vor kurzem eingeführt: ECs werden kultiviert in Hohlfasern und zu pulsierender Strömungsbedingungen ausgesetzt, genauer microvasculature in vivo 55,56 nachahmt.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll ein in vitro - Modell der BHS basierend auf der Impedanzspektroskopie. Die sich auf die Wechselwirkung von primären Mausgehirn-Endothelzellen mit aktivierten T-Zellen, ermöglicht das Verfahren zur Untersuchung der Sperreigenschaften während einer solchen direkten Kontakt. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der entscheidenden Schritte bei der Entwicklung von entzündlichen ZNS-Erkrankungen wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell EAE, wobei die BBB während einer Interaktion von ECs mit enzephalitogenen T-Zellen beeinträchtigt wird. Der beschriebene Test ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen einer gezielten Modulation einer solchen Wechselwirkung durch eine Vielzahl von Substanzen Verwendung wie blockierende Antikörper, Zytokine und Inhibitoren der T-Zell-Aktivierung. Das Verfahren ist empfindlich, zuverlässig und nicht-invasive and Messungen der TEER und Ccl werden in einer automatisierten Weise durchgeführt. All dies macht es ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, das eine neue Ebene zu den reichen Körper von BBB-Modelle erstellt. Es kann insbesondere das Wissen um BBB Eigenschaften unter pathophysiologischen Bedingungen beobachtet bei Autoimmunerkrankungen wie MS erweitern.
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Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Annika Engbers und Frank Kurth für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Markus Schäfer (nanoanalytics GmbH) für hilfreiche Diskussionen über TEER-Messungen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, SFB1009 Projekt A03 bis HW und LK, CRC TR128, Projekte A08; Z1 und B01 bis LK und HW, und das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (Medizinische Fakultät Münster) Gewährungsnummer Kl2 / 2015/14 bis LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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