Introduction
La barriera emato-encefalica separa la circolazione sistemica del sistema nervoso centrale (CNS) 1 - 3. Esso fornisce una barriera fisica che inibisce la libera circolazione delle cellule e la diffusione delle molecole idrosolubili e protegge il cervello da agenti patogeni e sostanze potenzialmente nocive. Oltre alla sua funzione di barriera, la BBB consente la fornitura di ossigeno e nutrienti al parenchima cerebrale, che garantisce il corretto funzionamento del tessuto neuronale. Proprietà funzionali del BBB sono altamente regolamentati dai suoi componenti cellulari e acellulari, con EC altamente specializzato essendo il suo elemento strutturale principale. EC della BBB sono caratterizzati dalla presenza di giunzioni strette (TJ) complessi, la mancanza di finestrature, estremamente bassa attività pinocytic, e meccanismi di trasporto permanentemente attivi. Altri componenti della BBB membrana basale CE, periciti incorporamento l'endotelio, i piedi di fascia astrocitari e = par associatienchymal membrana basale contribuiscono allo sviluppo, la manutenzione e la funzione della BBB 2,4 - 6 e, insieme con i neuroni e microglia, formano l'unità neurovascolare (NVU), che permette il corretto funzionamento del CNS 7 - 9.
In una varietà di malattie neurologiche, come neurodegenerative, malattie infiammatorie o infettive, la funzione della BBB è compromessa 2,5,10. Disregolazione di TJ complessi e meccanismi di trasporto molecolari porta ad un aumento della permeabilità BBB, leucociti stravaso, infiammazione e danno neuronale. Al fine di studiare le proprietà di BBB in tali condizioni fisiopatologiche, vari modelli BBB in vitro sono stati stabiliti 9,11,12. Insieme hanno fornito preziose informazioni sui cambiamenti di integrità della barriera, la permeabilità così come meccanismi di trasporto. Questi modelli utilizzano cellule endoteliali di umano, topo, ratto, suina o bovina 13 - 18; cellule endoteliali primarie o linee cellulari sono coltivate sia come monocoltura o insieme con periciti e / o astrociti in modo da imitare più da vicino la BBB in vivo 19 SpA - 25. Negli ultimi anni, la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) è diventato uno strumento ampiamente accettata per valutare le proprietà barriera endoteliale 26,27.
TEER riflette l'impedenza al flusso di ioni attraverso il monostrato cellulare e la sua diminuzione fornisce una misura sensibile compromissione dell'integrità barriera endoteliale e quindi aumento della permeabilità. Sono stati sviluppati diversi sistemi di misurazione Teer, tra cui epiteliale Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato elettrico impedenza di rivelazione (ECIS), e l'analisi delle cellule in tempo reale 15,28 - 30. TEER riflette la resistenza al flusso di ioni tra EC adiacenti (percorso paracellulare) ed è direttamente proporzionale allaintegrità della barriera. In spettroscopia di impedenza 27,31, impedenza totale complesso (Z) è misurata, che fornisce ulteriori informazioni sulla integrità della barriera misurando Ccl. Ccl riferisce alla corrente capacitiva attraverso la membrana cellulare (percorso transcellulare): lo strato di cellule agisce come un condensatore nel circuito elettrico equivalente, separando le cariche su entrambi i lati della membrana ed è inversamente proporzionale alla integrità della barriera. Quando coltivate su inserti permeabili, EC aderire, proliferano e si sviluppa su la membrana microporosa. Questa resiste alla corrente capacitiva sfondo dell'inserto (che si comporta come un condensatore) e porta ad una diminuzione della capacità fino a raggiungere il livello minimo. Questo è seguito dalla istituzione di TJ complessi che sigillare lo spazio tra EC adiacenti. Questo limita il flusso di ioni attraverso il percorso paracellulare, e TEER aumenta fino a raggiungere il plateau. In condizioni infiammatorie, tuttavia, il endotheliAl barriera è compromessa: TEER diminuisce come complessi TJ ottenere perturbato e Ccl aumenta la componente capacitiva dell'inserto sale nuovamente.
La nostra misura TEER utilizza il sistema automatizzato di monitoraggio cella 32: segue il principio della spettroscopia di impedenza ed estende le sue applicazioni precedenti. Qui, descriviamo un modello in vitro BBB che consente lo studio delle proprietà barriera, compresa l'interazione di endotelio cervello con cellule immunitarie; in particolare le cellule T attivate. Tali condizioni fisiopatologiche sono osservate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale, come la sclerosi multipla e il suo modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale 33-37. Qui, un passo fondamentale è la trasmigrazione delle cellule T specifiche per mielina encefalitogenici in tutto il BBB. Questo è seguito dal loro riattivazione nello spazio perivascolare e l'ingresso nel parenchima cerebrale, ove reclutano altre cellule immunitarie e mediato infiammazione e conseguente demielinizzazione 1,35,38. Tuttavia, i meccanismi molecolari dell'interazione tra tali cellule T e le cellule endoteliali, i costituenti principali della BBB, non sono ben compresi. Il nostro protocollo ha lo scopo di colmare questa lacuna e dare nuove intuizioni le conseguenze sulle cellule endoteliali (vale a dire, l'integrità barriera e permeabilità), al loro contatto diretto e complessa interazione con le cellule T attivate.
Il protocollo qui descritto fa uso di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo primaria, coltivate come un monostrato su inserti permeabili con membrane microporose. Le cellule endoteliali sono co-coltura con cellule T CD4 +, che può essere pre-attivati sia policlonale o in maniera antigene-specifica. Co-cultura MBMECs con cellule pre-attivate, ma non naive T induce una diminuzione TEER e un aumento Ccl, che fornisce una misura quantitativa della MBMEC erettile e barriera interruzione. La tecnicanon è invasivo: utilizza built-in, invece di elettrodi bacchette, che impediscono principali disturbi del monostrato CE; esso può essere utilizzato per monitorare funzione barriera senza l'uso di marcatori cellulari. Rende misurazioni continue in modo automatico e consente una valutazione indipendente dei due parametri barriera (Teer e CCL) contemporaneamente nel corso del tempo. Il metodo è anche abbastanza sensibile per distinguere tra diversi livelli di attivazione delle cellule T e gli effetti di tali cellule T su EC.
Esso può essere utilizzato in una vasta gamma di saggi funzionali: diverse citochine e / o chemochine implicati in processi infiammatori possono essere aggiunti al co-coltura delle MBMECs e le cellule T; bloccanti anticorpi contro molecole di adesione cellulare su entrambi CE o parte delle cellule T possono essere utilizzati; e inibitori di marcatori di attivazione delle cellule T o delle loro proprietà citolitica possono essere aggiunti durante il priming di cellule T o la loro co-coltura con cellule endoteliali. Il saggio è utile anche per la trasmigrazione cellule Tsaggi, come può servire come un controllo di qualità dell'integrità monostrato MBMEC prima dell'aggiunta di cellule T. Tutto questo rende questo metodo uno strumento versatile e affidabile per studiare la BBB in vitro, con una particolare attenzione per l'effetto delle cellule T attivate sull'integrità monostrato CE. Questo è di particolare importanza per la comprensione dei meccanismi della perturbazione BBB nella patogenesi delle malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla e il suo modello animale EAE, dove, le cellule T encefalitogenici autoreattive attraversare la BBB e causano infiammazione e danno neuronale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Per tutti gli esperimenti, i topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni nella struttura animali centrale presso l'Università di Münster, secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato etico degli animali sperimentali e approvati dalle autorità locali del Nord Reno-Westfalia, Germania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolamento e la coltura
NOTA: isolare MBMECs come precedentemente descritto in dettaglio 14 con le seguenti modifiche:
- Sacrificio 20 adulti C57BL 6 topi / (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la loro morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio.
- Risciacquare il mouse con il 70% di etanolo e decapitare usando le forbici; rimuovere il cuoio capelluto con pinze e forbici. Fare incisioni sul lato destro e sinistro del cranio, partendo dal foro occipitale. Sollevare il cranio dal suo lato caudale e takvia e fuori il cervello con una pinza.
- Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare pinze sterili per posizionare il cervello in una capsula di Petri e rimuovere il tronco cerebrale, cervelletto, e talamo, mantenendo solo la corteccia.
NOTA: L'uso di un microscopio non è necessario per uno di questi passaggi. - Posizionare la corteccia su un pezzo di carta assorbente sterile occidentale e rotolare delicatamente con una pinza fino meningi non sono più visibili.
- Dopo la digestione enzimatica e meccanica (seguendo il protocollo 14), raccogliere le cellule endoteliali dal gradiente di densità utilizzando un lungo ago sterile ed uno stantuffo 5 ml. Le cellule endoteliali appaiono come uno strato torbido sopra l'anello rosso con eritrociti. Trasferimento 20-25 ml di questo strato in un nuovo tubo 50 ml centrifugazione; rabboccare il tubo con DMEM.
- Dopo due turni di lavaggio 14, sospendere nuovamente le cellule in 6 ml di mezzo MBMEC contenente puromicina (4 mg / ml) e seminare su sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti; lasciarli in un tessutocultura incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 (indicato come 'incubatore' da qui in) per tre giorni.
NOTA: Per i dettagli della soluzione di rivestimento MBMEC, vedi Materiali Tavolo. - Modificare il medium con l'aggiunta di 1 ml a ciascun pozzetto di mezzo fresco MBMEC senza puromicina; mettere la piastra posteriore a 37 ° C e 5% CO 2 per altri due giorni.
2. La raccolta MBMECs
- Al quinto giorno dopo l'isolamento MBMEC, pre-coat inserti permeabili con soluzione di rivestimento MBMEC: aggiungere 80 ml di soluzione per inserto e li lasciano a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3 ore.
- pipetta con attenzione la soluzione di rivestimento e lasciare che il inserti asciugare per 30 minuti. Aggiungere 2 ml di temperatura ambiente (RT) PBS a ciascun pozzetto della piastra, utilizzando MBMECs per lavare il mezzo; ripetere questo passaggio. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA (300 ml per pozzetto) e lasciare la piastra nell'incubatore per 5-10 min.
- Aggiungere 2 ml di terreno MBMEC a ciascun pozzetto per arrestaretripsinizzazione. Trasferire le cellule raccolte in una provetta da 15 ml centrifugazione e centrifugare a 700 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno MBMEC senza puromicina.
- Contare le cellule; mescolare 10 ml di sospensione cellulare con 90 ml di 0,04% Trypan Blue (10x diluizione delle cellule). Pipettare 10 ml di questo mix tra la copertura in vetro e la camera di conteggio delle cellule (emocitometro). Contare le cellule blu-libere Trypan nei quattro quadranti della camera (N) e determinare il numero medio di cellule contate (N ') come segue: N' = N / 4.
- Calcolare la concentrazione cellulare (10 6 cellule / ml), utilizzando la seguente formula: C = N 'x 10 4 x 10, dove 10 4 è dato dalle dimensioni del emocitometro e 10 è il fattore di diluizione dal punto 2.4.
- Seed 2 x 10 4 cellule in un volume di 260 microlitri per inserto. Aggiungere 810 pl di mezzo MBMEC al vano inferiore di ogni pozzetto. Posizionare la piastra con inserti in incubatrice fino al momento di procedere con la sezione 4.
NOTA: I volumi per il vano superiore e inferiore sono specifici di inserimento e non funzionano per tutti i formati da 24 pozzetti.
3. CD4 + T cellule Isolamento e stimolazione
- L'isolamento delle cellule T CD4 +
- Sacrificare un topo adulto (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la sua morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio.
- Posizionare il mouse sul dorso su una tavola di dissezione pulito e risciacquare con etanolo al 70%; usare le forbici e pinze sterili per aprire il peritoneo e rimuovere i milza e nei linfonodi inguinali (, ascellare, brachiale e cervicale); infine, trasferire il tessuto in una provetta da 15 ml centrifugazione contenente 5 ml di PBS in ghiaccio.
- Sotto la cappa a flusso laminare, trasferire il tessuto per decantazione PBS con il tessuto in un tubo di centrifugazione 50 ml con un filtro 70 micron cella sopra; omogeneizzareil tessuto premendo con un pistone 1 ml attraverso il filtro.
- Aggiungere 30 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone FACS. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cella 40 micron, aggiungere altri 20 ml di tampone FACS al tubo.
- Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di tampone FACS.
- Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD4, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Aggiungere 25 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Nel frattempo, posizionare una colonna di separazione LS nel magnete e sciacquarlo con 3 ml di tampone FACS. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di tampone FACS.
- Aggiungere cellule alla colonna. Lavare la colonna con 3 ml di tampone FACS per tre volte. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarlo su un nuovo 15 ml Centritubo fugation. Aggiungere 5 ml di tampone FACS, scovare le cellule marcate con lo stantuffo della colonna e centrifugare è a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di terreno delle cellule T. Contare le cellule come descritto in 2.4 e sementi 1 x 10 5 cellule in 100 microlitri di terreno per pozzetto.
- T CD4 + cellule Stimolazione
- La stimolazione delle cellule T CD4 policlonale +
- Pre-coat una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo con purificato anticorpo anti-topo CD3 (clone 145-2C11) in PBS ad una concentrazione finale desiderata. Ad esempio, per pre-coat il piatto pieno con α-CD3 a 1 mg / ml, mescolare 10 ml di anticorpi (magazzino di concentramento = 0,5 mg / ml) con 5 ml di PBS, vortice e aggiungere 50 ml di mix di ogni pozzetto con una pipetta multicanale.
- Lasciare la piastra nell'incubatore per 3 ore. Dopo isolare le cellule T, lavare la piastra pre-rivestita due volte con PBS. Aggiungere purificato anticorpo anti-CD28 (clone37.51) alle cellule T isolate ad una concentrazione finale desiderata (ad esempio, a 1 mg / ml); mescolare bene. Seme le cellule T e lasciarli in incubatrice per due o tre giorni.
- La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule dendritiche (DC)
NOTA: se le DC sono utilizzati come cellule presentanti l'antigene (APC), seguire il protocollo per l'isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni:- Prima di omogeneizzare la milza, iniettarla con 1 ml di Collagenasi tipo IA in PBS a 0,5 mg / ml e trasferirlo ad un tubo di centrifugazione 15 ml.
- Incubare a bagnomaria a 37 ° C per 15 min. Dopo il lavaggio con PBS, risospendere il pellet in tampone FACS e aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche del mouse CD11c, invece di microsfere CD4.
- Utilizzare una colonna di separazione MS ei volumi appropriati: lavare la colonna con 1 ml di tampone FACS; Risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS e lavare la colonna con 1 ml di FACS buffer di tre volte.
- Anno Dominid antigene di scelta ai PVS (ad esempio, la mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) aa 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T a 96-round-bottom bene.
- Aggiungere 1 x 10 5 cellule T in 100 ml di mezzo di coltura cellulare T per 96-round-bottom-bene alla fine, come descritto nel protocollo per T isolamento delle cellule.
- La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule B
NOTA: se le cellule B sono usati come APC, seguire il protocollo per l'isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni:- Utilizzare la milza di topi transgenici le cui cellule B sono l'antigene-specifica (ad esempio, IgH MOG (Th) i topi, le cui cellule B specificamente riconoscere MOG 35-55).
- Utilizzare cellule T antigene-specifiche (ad esempio, da TCR MOG (2D2) topi). Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD19 invece di microsfere CD4.
- Aggiungere l'antigene di scelta al cel BLS (ad esempio, MOG 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di B mezzo di coltura cellulare per 96-round-bottom-bene.
- Aggiungere 1 x 10 5 T cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T per 96-round-bottom-bene, come descritto nel protocollo per l'isolamento delle cellule T.
- La stimolazione delle cellule T CD4 policlonale +
4. Configurazione ed esecuzione di misura TEER
- Posizionare il modulo 24 pozzetti dello strumento TEER sotto cappa a flusso laminare. Togliere i coperchi e luogo inserti con MBMECs nello strumento con pinze.
- Pipettare 810 ml di mezzo fresco al vano inferiore dei pozzetti modulo: inserirlo attenzione tra l'inserto e la parete del modulo bene.
- Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento in incubatrice. Collegare lo strumento al suo calcolatore; accendere il controllore strumento e aprire il software.
- Seleziona 'nuova misura' nella finestra pop-up. Check 'show TEER' e scatole di 'show Ccl'; quindi premere 'start'. Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare 'controllare tutti i pozzetti' nella scheda 'risultati' per vedere tutti i valori Teer e CCL.
- Salvare il file: File> Salva con nome> 'il nome del file'.
NOTA: Come TEER e Ccl sono continuamente misurati in modo automatico, monitorare i loro valori per un periodo di tre-cinque giorni. Cambiando il mezzo non è necessario, a meno vitalità cellulare è ottimale, come visualizzato dalla mancanza di aumento TEER. - Scegliere il punto di tempo di co-coltura con cellule T MBMECs quando Ccl è stabile e inferiore a 1 mF / cm 2 e TEER ha raggiunto il livello massimo.
- Ispezionare con cura valori assoluti Teer e CCL ed escludere i pozzi in cui MBMECs non hanno sviluppato confluenti abbastanza monostrati deselezionando tali pozzi.
- Gruppo il resto dei pozzi: tasto destro del mouse su un pozzo e selezionare 'aggiungere ben al nuovo pozzo media'. Namvia e nella finestra pop-up; fare lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare.
- Controllare tutti i pozzetti medi per confermare che tutti hanno le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura. Se alcuni hanno significativamente diversi valori assoluti TEER o TEER piste, o gli errori standard sono troppo grandi, rifare il raggruppamento.
NOTA: Il raggruppamento ottimale dei pozzi fornisce minima variazione nei valori Teer, sia all'interno che tra i gruppi sperimentali. - Nella scheda 'esperimento', premere 'pausa', scollegare lo strumento e portarlo fuori dell'incubatore. Rimuovere i coperchi sotto cappa a flusso laminare.
- Preparare pre-attivato e / o di cellule T naive, con o senza specifiche citochine, anticorpi o altre sostanze, se lo desideri: Per esempio: Mix purificato NA / Le Rat anticorpi anti-topo IFN-γ (XGM1.2 clone) con preparato T cellule, a 20 ug / ml per pozzetto dello strumento TEER.
NOTA: Se si utilizzano sostanze come inibitore granzima B, sono undded di coltura cellulare T all'inizio di stimolazione delle cellule T: ad esempio, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) viene mescolato con le cellule T isolate ad una concentrazione finale di 10 mM in DMSO. Vedi Materiali e attrezzature per maggiori dettagli. - Rimuovere alcuni del mezzo dall'inserto (vano ben superiore): per esempio, con attenzione pipetta fuori 150 ml (rimuovendo tutto il supporto deve essere evitata in quanto potrebbe disturbare il monostrato MBMEC).
- Aggiungere cellule T di MBMECs pipettando con cautela 150 ml di mezzo contenente 2 x 10 5 cellule / inserto.
NOTA: quando la raccolta delle cellule pre-attivate T, contare solo brillamento, le cellule Trypan Blue-free. - Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento per l'incubatore. Ricollegare lo strumento e premere 'la misura di ripresa'. Dopo 24 ore, premere il tasto 'stop' nella scheda 'esperimento' e salvare il file (File> Salva).
5. Esporta dati e l'analisi statistica
- Esportare i risultati scegliendo File> Esporta.
- Nella scheda "Impostazioni" della finestra pop-up, selezionare "dot" nell'opzione "separatore decimale" e "tabulatore" nell'opzione "campo delimitatore".
- Nella scheda "risultati di esportazione", il nome del file, controllare tutti i pozzi da esportare, e selezionare le caselle "Ccl" "TEER" e l'opzione "scegliere i dati".
- Premere il tasto "i dati di esportazione", aprire il file esportato, e copiare i dati in un foglio di calcolo.
- Normalizzare i dati esportati (ordinati per ogni replica, con Teer e CCL valori dati per ogni ciclo (di misura)): i valori Set Teer e CCL dell'ultimo punto di tempo prima che il co-coltura al 100% e modificare di conseguenza i valori per tutti gli altri piste, relative al periodo '100%'.
- Copiare dati normalizzati ad un software di scelta per generare un grafico, utilizzando singoli pozzetti e visualizzando l'errore standard della media per ciascun gruppo di trattamento.
- Perfo rm a due vie test statistico ANOVA con una correzione di Bonferroni per confronti multipli, utilizzando il software statistico di scelta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 fornisce una panoramica generale del modello in vitro di BBB utilizzato per studiare l'interazione tra cellule T e le cellule endoteliali. L'esperimento consiste di tre fasi principali. Il primo passo è l'isolamento di MBMECs primari da cortecce cerebrali, e la loro cultura per cinque giorni. Quando raggiungono confluenza nella piastra di coltura cellulare, MBMECs vengono tripsinizzate e reseeded su inserti permeabili, che sono successivamente poste nello strumento TEER. Il TEER e Ccl di MBMECs vengono costantemente misurati e monitorati per un periodo di tre-cinque giorni. Nel frattempo, le cellule T sono isolate, stimolata (step 2), e coltivate per due a cinque giorni, il tipo e la forza dello stimolo. Nel passaggio 3, le cellule T vengono aggiunti e co-coltura con MBMECs quando Ccl è a un livello basso e stabile il TEER è al suo livello massimo. La scelta di questo punto di tempo per la co-coltura, quando il TEER è ancora al suo altopiano è cruciale per il successodell'intera misura. Pertanto, è estremamente importante che il punto di tempo per l'isolamento delle cellule T e stimolazione è scelto con cura, in modo che le cellule T raggiungere il livello desiderato di attivazione al momento del loro inserimento EC. Dopo aver aggiunto cellule T, la misurazione viene ripreso per un altro giorno ei risultati vengono analizzati.
Dopo la coltura iniziale di cinque giorni, MBMECs mostrano prontamente morfologia caratteristica a forma di fuso (Figura 2A, pannello di sinistra) ed esprimono marcatori specifici delle cellule endoteliali, come (pannelli di destra Figura 2A, medio e) PECAM-1 e Claudin-5. Tuttavia, questo da solo non fornisce prove sufficienti della loro confluenza completa e corretta integrità della barriera. spettroscopia di impedenza, d'altra parte, dà una buona stima dell'integrità monostrato e serve come un controllo di qualità di ciascun pozzetto prima dell'esecuzione di un saggio funzionale. In Figura 2B, la maggior parte delpozzi conteneva MBMECs cui valori Ccl erano stabili e bassi, ed i loro valori TEER ha raggiunto un plateau. Questi pozzi sono stati usati per successivi esperimenti di co-coltura. Essi sono stati raggruppati in modo tale che la varianza all'interno e tra i gruppi era minimo prima di aggiungere le cellule T (Figura 2C). I pozzetti cui valori TEER differivano significativamente dal resto (come la curva blu indicato nella figura 2B) non sono stati utilizzati, come sarebbero condurre a risultati ambigui o errata interpretazione dei dati.
A condizione che i requisiti iniziali per la cultura MBMEC e la stimolazione delle cellule T sono state soddisfatte, spettroscopia di impedenza può dare preziose informazioni l'interazione delle cellule T-CE. Misurazione TEER può servire come lettura principale per un tale interazione e una misura di T cellulo-mediata disfunzione CE, come mostrato nella Figura 3A e 3B. In questo caso, MBMECs sono coltivate su inserti con micropori 0,4micron di diametro, che non consente cellule T di passare attraverso la membrana inserto. La figura 3A mostra che solo stimolato, ma le cellule T non naive sono in grado di indurre disfunzioni CE, come determinato da una diminuzione TEER e aumento Ccl. le cellule T naive possono quindi servire come controllo negativo, dal momento che TEER e Ccl durante la co-coltura con cellule T naive rimanere al loro livelli iniziali. L'eccezione è il picco proprio all'inizio della co-coltura, causata dalla manipolazione dello strumento (le palpebre, aggiungendo mezzo con cellule che possono avere leggermente diverse temperature e valori di pH, e la chiusura delle palpebre). Questo artefatto appare con tutti i tipi di misurazioni Teer e viene ignorato durante l'analisi. L'aggiunta delle citochine pro-infiammatorie IFN-y e TNF-alfa (a 100-500 U / ml), che sono noti per essere in grado di indurre infiammazione CE, può essere utilizzato come controllo positivo. Nella Figura 3A, MOG 35-55 CD4 SPECIFICI
Per studiare i meccanismi del descritto MBMEC monostrato interruzione, vari approcci possono essere utilizzati. Risultati in Figura 3C mostrano che le cellule T stimolate, ma non i loro surnatanti causato un danno considerevole per l'MBMECs, indicando che il contatto diretto tra cellule T e MBMECs è fondamentale per la barriera di interruzione. Inoltre, l'aggiunta di un neutralizzante α-Ianticorpo FN-γ durante la misurazione TEER solo leggermente migliorato MBMEC proprietà barriera, suggerendo che IFN-γ, non può essere la causa principale di questa interruzione. D'altra parte, l'aggiunta granzyme B Inhibitor II coltura cellulare T (Figura 3D) ripristinato integrità MBMEC in misura maggiore, indicando questa molecola citolitica come un giocatore importante nel causare danni MBMEC e conseguente diminuzione TEER.
Oltre al suo uso come lettura primaria per l'effetto delle cellule T sull'integrità monostrato CE, misura TEER può anche essere usato come un controllo di qualità di integrità della barriera prima altri test, come test trasmigrazione T-cellule. In questo caso, inserti con vengono utilizzati micropori di 3 micron di diametro. Nella Figura 3E, misurazione TEER stata eseguita al fine di garantire che MBMEC monostrato era dello stesso livello di integrità in tutti i pozzetti prima dell'aggiunta di cellule T per la successiva transmigration saggio. Questo è stato seguito dalla raccolta delle cellule T dal compartimento inferiore dei pozzetti strumento, colorazione delle cellule T con l'anticorpo α-CD4 e analisi citofluorimetrica, utilizzando conteggio sfere cella per determinare numero assoluto di linfociti T trasmigrato; mostrato in figura 3E, centrale e destra). Notare che stimola le cellule T utilizzati per la trasmigrazione non ha causato una sostanziale diminuzione TEER, anche se sono stati pre-attivati come nella Figura 3A. Ciò potrebbe riflettere il percorso transcellulare cellule immunitarie possono utilizzare durante la trasmigrazione, come è stato osservato in precedenza 39. Nella figura 3F, la metà dei pozzi con MBMECs stati infiammato con IFN-γ e TNF-α (uninflamed vs. Infiammata), e più tardi, sono stati aggiunti le cellule T naive per la valutazione delle attività di trasmigratori. In questo caso, la misura TEER fornito un indizio di quanto sia forte l'infiammazione con citochine è stato e quando le cellule T devono essere aggiunti per la transmigration.
La figura 4 mostra alcune delle situazioni più comuni che possono portare alla errata interpretazione dei risultati teer. In Figura 4A, per esempio, non tutti MBMECs sviluppato un monostrato completamente confluenti allo stesso tempo. Uno dei gruppi ( 'cellule T naive - esclusi ») conteneva MBMECs i cui complessi TJ erano in scadenza ad un ritmo diverso rispetto agli altri gruppi appena prima l'aggiunta di cellule T. Questo gruppo di conseguenza sviluppato valori TEER superiori al 100% durante l'esperimento ed è stato escluso da ulteriori analisi. Così, la pendenza della curva TEER (tasso di TJ di maturazione) prima dell'esperimento è importante come valori assoluti TEER per una corretta interpretazione dei dati. La figura 4B mostra che a partire il co-cultura, non solo troppo presto, ma anche troppo tardi può portare a risultati falsi. Qui, sia nel gruppo con cellule T stimolati e il gruppo di controllo negativo (media change), valori Teer hanno già superato il plateau e ha iniziato a diminuire indipendentemente dalla condizione sperimentale, quindi indica condizioni di coltura ottimali prima e durante l'esperimento. Tali gruppi non dovrebbero essere inclusi nell'analisi. Infine, anche se TEER e Ccl solito cambiano i loro valori in modo che una maggiore diminuzione TEER è accompagnato da un maggiore aumento Ccl, questo non può essere sempre il caso. Nella Figura 4C, stimolate le cellule T B hanno causato un calo più grande in TEER, ma un minore aumento Ccl di cellule T stimolato un fatto.
Figura 1: panoramica generale della tecnica. Dopo la cultura iniziale, MBMECs sono reseeded su inserti permeabili e collocati nel monitor delle cellule automatizzato; TEER e Ccl sono misurati ogni ora per 4-5 giorni. Nel frattempo, le cellule T vengono attivate in vitro 40. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: MBMECs sviluppano un monostrato confluente adatto ad un modello in vitro BBB. (A) del mandrino a forma di morfologia (a sinistra) e la colorazione di immunofluorescenza di PECAM-1 (al centro) e Claudin-5 (a destra) cinque giorni dopo l'isolamento MBMEC. (B e C) Teer e CCL valori prima (B) e dopo (C) raggruppamenti di singoli pozzetti, prima to aggiunta di cellule T. La curva blu (B) non viene utilizzato per l'esperimento, dal MBMECs in questo pozzo non hanno sviluppato TEER alto come negli altri pozzetti. Dati in (C) mostrano media ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: I risultati rappresentativi. (AD) Variazione TEER come misura primaria di disfunzione MBMEC su interazione con le cellule T. Le cellule T specifiche per MOG (A) sono stati attivati da cellule B MOG-specifiche in presenza di MOG 35-55 peptide per cinque giorni. le cellule T naive e citochine pro-infiammatorie IFN-gamma e TNF-alfa (entrambi a 100 U / ml) è servito come controllo negativo e positivo, rispettivamente. (B) le cellule T sono state stimolate con α-CD3 e CD28 anticorpi α-(1 mg / ml ciascuna) per due o tre giorni, come indicato, prima di aggiungerli al MBMECs. Cellule (C) T (pre-attivati come in (A)) o loro surnatanti, in presenza di anticorpo α-IFN-γ o il controllo isotipico corrispondente. Cellule (D) T (pre-attivati come in (B)) per due giorni, in presenza di inibitore granzima B II o suo DMSO diluente. (E e F) Misura TEER utilizzato solo come un controllo di qualità per l'integrità barriera prima di trasmigrazione delle cellule T. MBMECs sono state coltivate su inserti con pori di 3 micron di diametro. Cellule (E) T, stimolati come descritto in (A), sono state lasciate trasmigrare per 18 ore (a sinistra). Successivamente, sono state raccolte, macchiato di α-CD4 anticorpi (clone RM4-4) ed analizzate mediante citometria di flusso, utilizzando il conteggio sfere cellulare (centro e destra). (F)Monitoraggio dell'integrità monostrato MBMEC dopo stimolazione con IFN-γ e TNF-α, e scegliendo il punto di momento opportuno per la successiva aggiunta di cellule T per il saggio trasmigrazione. (AF) I risultati mostrano triplicato tecniche e sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti ciascuno. I dati mostrano media ± SEM. (E, a destra) non abbinato, due code test t di Student. ** P <0,01. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Considerazioni pratiche e l'interpretazione dei dati. (A) MBMECs da un gruppo sperimentale (curva rossa) sono stati esclusi dall'analisi, dal momento che il tasso di maturazione dei loro complessi giunzionali era diverso rispetto ad altri grOups. (B) Un esempio di aggiunta di cellule T troppo tardi, che ha impedito una corretta valutazione della disfunzione MBMEC. (C) Su interruzione da 'A' le cellule T stimolate (curva nera), i valori di Ccl MBMECs ha mostrato un aumento più drammatico quanto ci si aspetterebbe dal concomitante diminuzione in TEER causato dalle stesse cellule T. Cellule (AC) T sono state stimolate con α-CD3 ed anticorpi α-CD28 (1 mg / ml ciascuna) per due giorni. I risultati mostrano triplicato tecniche e sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti ciascuno. I dati mostrano media ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diverse fasi del protocollo descritto sono essenziali per un esperimento riuscito. Durante l'isolamento MBMEC iniziale e cultura, è essenziale che il lavoro viene effettuato in condizioni sterili per quanto possibile, per evitare la contaminazione della coltura cellulare con spore fungine o batteri. Per ottenere una coltura pura di EC, si raccomanda di utilizzare un supporto contenente puromicina per i primi tre giorni, che consente la sopravvivenza di cellule endoteliali, ma non altri tipi di cellule (in particolare periciti) 41,42. Un altro passo fondamentale che merita particolare attenzione è l'identificazione del punto di tempo corretto per l'aggiunta di cellule T pre-attivati. Durante la prima 48 ore di teer MBMECs misura proliferare su inserti permeabili e colmare i divari tra loro. Quindi, Ccl diminuisce fino a raggiungere un livello stabile e basso (circa 0,6 mF / cm 2). Questo è il primo segno di un confluenti CE monostrato, ma non è ancora un segno di una barriera a tenuta. Solo dopoil Ccl ha raggiunto un livello stabile fa il TEER inizia ad aumentare. Quando complessi di TJ sono completamente formate e la barriera CE è completamente sigillate, TEER raggiunge il suo livello massimo. Questo altopiano è di solito raggiunto da tre a cinque giorni dopo la risemina EC e viene mantenuta per un altro 24 a 36 ore. Il punto di tempo per l'aggiunta di cellule T è all'inizio del plateau, che assicura che la CE devono ancora vitale abbastanza per essere co-coltura con le cellule T. Poiché l'attivazione delle cellule T deve essere avviata prima del punto di tempo ottimale per co-coltura può essere previsto in modo sicuro, può essere vantaggioso per stimolare due lotti di cellule T in due giorni diversi per aumentare la flessibilità della temporizzazione. Infine, raggruppamento di singoli pozzetti repliche prima di aggiungere le cellule T ai MBMECs deve essere fatto in modo tale che la variabilità all'interno e tra i gruppi è minima. Questo assicura che le condizioni iniziali sono uguali tra tutti i gruppi durante la co-coltura delle cellule T e MBMECs. Il nostro protocollo descrive la misura TEER durante la co-coltura di cervello principale del mouse EC con le cellule pre-attivate T CD4 +. La sua forma semplice consente più modifiche, secondo le esigenze scientifiche. Per esempio, il tipo, resistenza e durata dello stimolo può essere variata. Cellule T CD4 + antigene-specifiche possono essere attivate dal loro antigene cognate, in presenza di opportuni cellule presentanti l'antigene (APC); in alternativa, le cellule T possono essere policlonale attivati da α-CD3 ed anticorpi α-CD28. Lo stato di attivazione delle cellule T può essere modulata da varie citochine, anticorpi bloccanti, inibitori. Sostituzione EC cerebrali primari con linee di cellule endoteliali non è raccomandato, tuttavia, come è noto che quest'ultimo spettacolo meno restrittiva complessi TJ e superiori permeabilità rispetto ai 43 cellule primarie. Oltre a misurare TEER come la lettura primaria, questo protocollo fornisce un buon controllo di qualità del monolay CEer integrità prima del test trasmigrazione cellule T (Figura 3E, F). Da segnalare, valori Teer non necessariamente diminuire durante la trasmigrazione delle cellule T attraverso le MBMECs (Figura 3E): ciò potrebbe riflettere il percorso transcellulare cellule immunitarie possono utilizzare durante la trasmigrazione, come è stato osservato in precedenza 39,44.
Come le cellule T attivate inducono disfunzione CE durante la co-coltura, TEER mostra una costante, diminuzione prevedibile, comparabili tra gli esperimenti con le stesse condizioni. Una maggiore diminuzione TEER è di solito accompagnata da un maggiore aumento concomitante Ccl. In rare occasioni, tuttavia, un aumento del Ccl può essere più pronunciato quanto ci si aspetterebbe dal corrispondente diminuzione TEER (Figura 4C). Questa discrepanza può riflettere diversi aspetti del monostrato interruzione CE. ECS cercare di colmare le lacune che si formano durante l'interruzione barriera, essi possono subire cambiamenti dinamici nellamorfologia e motilità come formando sporgenze e aumentando la loro superficie totale, ognuno dei quali può contribuire ad un aumento drammatico e rapido Ccl. Questo rende cambiamenti nella Ccl meno prevedibile, rispetto alle variazioni di TEER. Pertanto, il livello di diminuzione TEER rimane la misura più affidabile e rappresentativo di integrità della barriera compromessa.
Questo test può essere integrata da altre tecniche per studiare le proprietà di barriera endoteliale. Esso può essere seguito da un test di permeabilità, che misura la quantità di molecole di dimensioni diverse che diffondono attraverso il monostrato CE perturbato 44. A questo scopo, fluorescente coniugati destrano, come fluoresceina e Texas Red possono essere utilizzate; altri traccianti molecolari sono inoltre disponibili (ad esempio, saccarosio, mannitolo, albumina, Blu di Evans e perossidasi di rafano) 26. Inoltre, immunofluorescenza microscopia può essere usato per studiare le variazioni di espressione proteicae la localizzazione cellulare di molecole di adesione cellulare e TJ. Anche se il modello BBB presentato è molto semplice, i risultati ottenuti con esso possono fornire orientamento prezioso per ulteriori test in condizioni più fisiologiche. Tali test includono (ma non sono limitati a) test di flusso di taglio in vitro per completare la misurazione TEER ottenuti in condizioni statiche e in test di permeabilità vivo con iniezione Blu di Evans in topi che vivono per conto della complessità della BBB.
Sebbene sensibile ed affidabile, il metodo qui descritto presenta alcuni limiti che meritano particolare attenzione. I valori massimi misurati Teer nel nostro setup sperimentale raggiunge valori di 35-40 Ωcm 2. Questi valori TEER sono molto inferiori in vivo, in cui differenti tipi di cellule e componenti acellulari contribuiscono all'integrità della BBB, ma non sono anche alto come TEER valori realizzato in altro in vitro modelli BBB <sup> 26,45,46. Questo potrebbe essere migliorata con l'aggiunta di idrocortisone al mezzo CE, che ha dimostrato di migliorare notevolmente le proprietà di barriera 27,47 - 49. Tuttavia, l'utilizzo di tali sostanze - noti per avere effetti anti-infiammatori e immunosoppressivi - non è adatto per tutti i test funzionali. Dato che lo scopo di questo particolare protocollo è sulle conseguenze di interazioni delle cellule EC-T sulla integrità della barriera, l'interpretazione verrebbe ostacolata con l'aggiunta di idrocortisone. Utilizzando il protocollo qui presentata in tal modo consente la valutazione del vero potenziale infiammatorio delle cellule T stimolate a causare la disfunzione barriera CE. E 'anche importante notare che il confronto diretto dei diversi valori teer riportati in letteratura deve essere fatto con cautela. Tali valori sono altamente dipendente dal setup sperimentale, sono ottenuti con diversi tipi di cellule, semina densità cellulari, mezzi di comunicazione, aree di crescita delle cellule, e sistemi di misura Teer (ad esempio </ Em>, la forma e le dimensioni degli elettrodi).
Per simulare la situazione in vivo più da vicino, complesso modelli BBB vitro sono stati stabiliti, dove EC sono co-coltura con periciti sul lato opposto della membrana inserto, o dove periciti e astrociti crescono sul fondo dei pozzetti 12,25,50 - 52. In tali sistemi co-coltura, cross-talk tra diversi tipi di cellule consente più forte inasprimento della barriera, con triple co-colture di essere il migliore in simile situazione in vivo e di fornire i più alti valori teer così. La complessità di questi sistemi, invece, pone un limite al loro utilizzo più ampio come modelli BBB in vitro.
Un'altra limitazione di questo modello è la mancanza di sforzo di taglio, che ha dimostrato di migliorare integrità della barriera 53,54. Per superare questo problema, sono stati recentemente introdotti nuovi modelli BBB dinamici: ECs sono coltivate in fibre cave e sottoposti a condizioni di flusso pulsatile, imitando più da vicino microcircolo in vivo 55,56.
In sintesi, questo protocollo descrive un modello in vitro della BBB basato su spettroscopia di impedenza. Concentrare sull'interazione delle cellule endoteliali cervello di topo primaria con cellule T attivate, il metodo consente di studiare le proprietà di barriera durante tale contatto diretto. Questo è di particolare importanza per comprendere le fasi cruciali per lo sviluppo di malattie infiammatorie del SNC come la sclerosi multipla e il suo modello animale EAE, in cui la BBB viene compromessa durante un'interazione di EC con le cellule T encefalitogenici. Il dosaggio descritta consente l'indagine delle conseguenze di una modulazione mirata di tale interazione utilizzando un'ampia gamma di sostanze, quali il blocco anticorpi, citochine e inibitori di attivazione delle cellule T. Il metodo è sensibile, affidabile e non invasivamisure nd di TEER e Ccl vengono eseguiti in modo automatico. Tutto questo lo rende uno strumento utile e versatile che aggiunge un nuovo livello per il corpo ricco di modelli BBB. Può specificamente espandere la nostra conoscenza sulle proprietà BBB in condizioni fisiopatologiche osservati in malattie autoimmuni come la sclerosi multipla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Siamo grati a Annika Engbers e Frank Kurth per il loro eccellente supporto tecnico e il Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) per le discussioni utili per quanto riguarda le misure teer. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 progetto A03 di HW e LK, CRC TR128, progetti A08; Z1 e B01 LK e HW, e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (Facoltà di Medicina di Münster) codice di autorizzazione KL2 / 2015/14 a LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
