Introduction
Den blod-hjärnbarriären separerar den systemiska cirkulationen från det centrala nervsystemet (CNS) 1 - 3. Det ger en fysisk barriär som hämmar den fria rörligheten av celler och spridning av vattenlösliga molekyler och skyddar hjärnan från patogener och potentiellt skadliga ämnen. Förutom dess barriärfunktion, den BBB möjliggör leverans av syre och näringsämnen till hjärnparenkymet, som säkerställer en väl fungerande neuronal vävnad. Funktionella egenskaper hos BBB är starkt reglerad av dess cellulära och acellulära komponenter, med högspecialiserad EC är dess huvudsakliga konstruktionselement. EC av BBB kännetecknas av närvaron av tight junction (TJ) komplex, bristen på fenestrationer, extremt låg pinocytic aktivitet, och permanent aktiva transportmekanismer. Andra komponenter i BBB EG basalmembranet, pericyter inbäddning endotelet, astrocytiska slut fötter och = tillhörande parenchymal basalmembranet också bidra till utveckling, underhåll och funktion BBB 2,4 - 6 och, tillsammans med neuroner och mikroglia, utgör neurovaskulära enheten (NVU), som gör det möjligt för en väl fungerande CNS 7-9.
I en mängd olika neurologiska sjukdomar, såsom neurodegenerativa, inflammatoriska eller infektionssjukdomar, är funktionen hos BBB äventyras 2,5,10b. Dysreglering av TJ-komplex och molekylära transportmekanismer leder till ökad BBB permeabilitet, leukocyter extravasering, inflammation och nervskada. För att studera BBB: egenskaper under sådana patofysiologiska tillstånd, har olika in vitro BBB: modeller etablerats 9,11,12. Tillsammans har de gett värdefulla insikter i de förändringar av barriär integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Dessa modeller använder endotelceller från människa, mus, råtta, gris eller bfår ursprung 13-18; primära endotelceller eller cellinjer odlas antingen som en monokultur eller tillsammans med pericyter och / eller astrocyter, för att efterlikna mer noggrant BBB in vivo 19-25. Under de senaste åren, har mätning av transendotelial elektrisk resistans (TEER) blivit en allmänt accepterad verktyg för att bedöma endotelial barriäregenskaper 26,27.
TEER speglar impedansen till jonflödet över cellmonoskiktet och dess minskning ger en känsligt mått på nedsatt endotelial barriär integritet och därmed ökad permeabilitet. Olika Teer mätsystem har utvecklats, bland annat Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), och realtidscellanalys 15,28 - 30. TEER avspeglar motståndet mot jonflöde mellan angränsande ECS (paracellulär väg) och är direkt proportionell mot denbarriärintegritet. I impedansspektroskopi 27,31, är komplex totala impedansen (Z) mäts, vilket ger ytterligare information om barriär integritet genom att mäta Ccl. Ccl avser den kapacitiva strömmen genom cellmembranet (transcellulär väg): cellskiktet fungerar som en kondensator i den ekvivalenta elektriska kretsen, separation av laddningar på båda sidor av membranet och är omvänt proportionell mot barriärintegritet. När odlas på permeabla skär, EC följa, föröka sig och spridas över det mikroporösa membranet. Detta motstår bakgrunden kapacitiv ström av insatsen (som i sig fungerar som en kondensator) och leder till en minskning i kapacitansen tills den når sin minimala nivå. Detta följs av inrättandet av TJ komplex som tätar av utrymmet mellan intilliggande EC. Detta begränsar jonflödet genom paracellulära vägen, och TEER ökar tills den når sin platå. Under inflammatoriska tillstånd emellertid den endothelial barriären äventyras: TEER minskar då TJ komplexen få störs och Ccl ökar när den kapacitiva komponenten av insatsen ökar igen.
Vår TEER mätning använder automatiserade cell övervakning 32-systemet: det följer principen om impedansspektroskopi och sträcker sina tidigare ansökningar. Här beskriver vi en in vitro-BBB modell som gör studiet av barriäregenskaperna, inklusive interaktion av hjärn endotel med immunceller; i synnerhet aktiverade T-celler. Sådana patofysiologiska tillstånd observeras i autoimmuna sjukdomar i CNS, såsom multipel skleros och dess djurmodell experimentell autoimmun encefalomyelit 33-37. Här är ett avgörande steg i trans av encefalitogena, myelinspecifika T-celler över BBB. Detta följs av deras reaktivering i perivaskulära utrymmet och inträde i hjärnparenkymet, där de rekryterar andra immunceller och migdiate inflammation och efterföljande demyelinisering 1,35,38. Emellertid molekylära mekanismer av interaktionen mellan sådana T-celler och endotelceller, de huvudsakliga beståndsdelarna i BBB, är inte väl förstådd. Vår protokoll syftar till att fylla denna lucka och ge nya insikter i konsekvenserna för endotelceller (dvs barriär integritet och permeabilitet) vid sin direktkontakt och komplext samspel med aktiverade T-celler.
Protokollet som beskrivs här utnyttjar primär mushjärna mikrovaskulära endotelceller, som odlats som ett monolager på släppliga insatser med mikroporösa membran. Endotelceller samodlas med CD4 + T-celler, vilket kan vara pre-aktiverade antingen polyklonalt eller på ett antigenspecifikt sätt. Co-kultur av MBMECs med föraktiverade, men inte naiva T-celler inducerar en minskning av TEER och en ökning av Ccl, som ger ett kvantitativt mått på MBMEC dysfunktion och barriärstörningen. teknikenär icke-invasiv: det använder inbyggd i stället för chopstick elektroder, som förhindrar större störning i EG monoskiktet; den kan användas för att övervaka barriärfunktion utan användning av cellmarkörer. Det gör kontinuerliga mätningar i ett automatiserat sätt och möjliggör en oberoende bedömning av de två spärrparametrar (Teer och CCL) samtidigt över tiden. Metoden är också tillräckligt känsliga för att skilja mellan olika nivåer av T-cellsaktivering och effekterna av sådana T-celler på EC.
Den kan användas i ett brett spektrum av funktionella analyser: olika cytokiner och / eller kemokiner är inblandade i inflammatoriska processer kan läggas till co-kultur MBMECs och T-celler; blockerande antikroppar mot celladhesionsmolekyler på antingen EG eller T-cell-sidan kan användas; och hämmare av T-cellsaktivering markörer eller deras cytolytiska egenskaper kan tillsättas under T-cells priming eller deras co-kultur med EC. Analysen är också användbar för T-celltransmigrationanalyser, eftersom det kan fungera som en kvalitetskontroll av MBMEC monoskikt integritet före tillsatsen av T-celler. Allt detta gör denna metod ett mångsidigt och tillförlitligt verktyg för att studera BBB in vitro, med fokus på effekten av aktiverade T-celler på EG monoskikt integritet. Detta är särskilt viktigt för att förstå mekanismerna i BBB störningar i patogenesen av autoimmuna sjukdomar, såsom MS och dess djurmodell EAE, där självreaktiva, encefalitogena T-celler över BBB och orsaka inflammation och nervskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För alla experiment, möss uppfödda och hölls under specifika patogenfria förhållanden i centrala djuranläggning vid universitetet i Münster, enligt tyska riktlinjer för djurvård. Alla experiment utfördes enligt riktlinjerna i djurexperimentella etikkommitté den och godkänts av de lokala myndigheterna i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolering och kultur
OBS: Isolera MBMECs såsom tidigare beskrivits i detalj 14 med följande modifikationer:
- Sacrifice 20 vuxna C57BL / 6 möss (6-8 veckor gamla) av CO 2 inandning och bekräfta deras död genom att fastställa hjärt- och andningsstillestånd.
- Skölj musen med 70% etanol och halshugga den med sax; ta bort hårbotten med hjälp av pincett och sax. Göra snitt på vänster och höger sida av skallen, med början från foramen magnum. Lyft skallen från sin kaudala sida och take ut hjärnan med pincett.
- Under ett dragskåp med laminärt flöde, använda steril pincett för att placera hjärnan i en petriskål och ta bort hjärnstammen, cerebellum och talamus, behöll endast cortex.
OBS: Användning av ett mikroskop är inte nödvändigt för någon av dessa steg. - Placera cortex på en bit av steril Western läskpapper och rulla den försiktigt med pincett tills hjärnhinnorna inte längre syns.
- Efter mekanisk och enzymatisk digerering (enligt det protokoll som 14), samla endotelceller från densitetsgradient med hjälp av en lång, steril nål och en 5 ml kolv. Endotelceller visas som en skumma lager ovanför den röda ringen med erytrocyter. Överföring 20-25 ml detta skikt i en ny 50 ml centrifugeringsrör; fylla röret med DMEM.
- Efter två rundor av tvättning 14, resuspendera cellerna i 6 ml MBMEC medium innehållande Puromycin (4 | j, g / ml) och utsäde dem på sex belagda brunnar i en 24-brunnars platta; lämna dem i en vävnadkultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 (kallad inkubator "från och med nu) under tre dagar.
OBS: För mer information om MBMEC beläggningslösningen, se Material tabell. - Ändra mediet genom att tillsätta 1 ml till varje brunn av färskt MBMEC medium utan Puromycin; sätta plattan tillbaka vid 37 ° C och 5% CO2 under ytterligare två dagar.
2. Skörd MBMECs
- På dag fem efter MBMEC isolering, pre-coat genomträngliga skär med MBMEC beläggningslösning: tillsätt 80 ul lösning per insats och lämna dem vid 37 ° C och 5% CO2 under 3 timmar.
- Noggrant pipettera ut beläggningslösningen och låt skär lufttorka i 30 min. Tillsätt 2 ml rumstemperatur (RT) PBS till varje brunn i plattan, med hjälp MBMECs att tvätta mediet; upprepa detta steg. Lägg 0,05% Trypsin-EDTA (300 fil per brunn) och lämna plattan i inkubatorn under 5-10 min.
- Tillsätt 2 ml av MBMEC medium till varje brunn för att stoppatrypsinering. Överföra de uppsamlade cellerna till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera dem vid 700 xg under 8 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml MBMEC medium utan Puromycin.
- Räkna cellerna; Blanda 10 pl av cellsuspensionen med 90 | il 0,04% trypanblått (10x utspädning av celler). Pipett 10 ul av denna blandning mellan glaslocket och cellräkning kammaren (hemocytometer). Räkna trypanblått-fria celler i alla fyra kvadranter hos kammaren (N) och fastställa den genomsnittliga antalet räknade celler (N ') enligt följande: N' = N / 4.
- Beräkna cellkoncentrationen (i 10 6 celler / ml) med användning av följande formel: C = N 'x 10 4 x 10, där 10 4 ges av dimensionerna på hemocytometer och 10 är utspädningsfaktorn från steg 2,4.
- Utsäde 2 x 10 4 celler i en volym av 260 | j, l per skär. Lägg 810 pl MBMEC medium till det nedre utrymmet av varje brunn. Placera plattan med insatser i inkubatorn tills redo att gå vidare med avsnitt 4.
OBS: Volymerna för övre och nedre kammaren är insatsspecifika och fungerar inte för alla 24 brunnar format.
3. CD4 + T-cell Isolering och Stimulering
- CD4 + T-cell Isolering
- Offra en vuxen mus (6-8 veckor gamla) av CO 2 inandning och bekräfta sin död genom att fastställa hjärt- och andningsstillestånd.
- Placera musen på rygg på en ren dissektion styrelse och skölj den med 70% etanol; Använd steril sax och pincett för att öppna bukhinnan och avlägsna mjälte och lymfkörtlar (inguinal, armhålan, brachialis och livmoderhalscancer); slutligen överföra vävnaden till ett 15 ml centrifugrör innehållande 5 ml PBS på is.
- Under huv med laminärt flöde, överföra vävnaden genom dekantering PBS med vävnaden i ett 50 ml centrifugeringsrör med en 70 | im cellfilter ovanpå; homogeniseravävnaden genom att trycka på den med en 1 ml kolv genom silen.
- Tillsätts 30 ml FACS-buffert och centrifugera det vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och resuspendera cellerna i 10 ml FACS-buffert. Filtrera suspensionen genom ett 40 | im cellfilter, tillsätt ytterligare 20 ml FACS-buffert till röret.
- Centrifugera den vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 | il FACS-buffert.
- Tillsätt 20 | il av mus-CD4-magnetiska mikropärlor, blanda väl och inkubera i 15 min vid 4 ° C. Tillsätt 25 ml FACS-buffert och centrifugera det vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Under tiden, placera en LS separationskolonn i magneten och skölj den med 3 ml FACS buffert. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 3 ml FACS buffert.
- Lägg celler till kolonnen. Tvätta kolonnen med 3 ml FACS-buffert tre gånger. Ta kolonnen från magneten och placera den på en ny 15 ml centrifugation röret. Tillsätt 5 ml FACS-buffert, spola ut de märkta cellerna med kolonnen kolven och centrifugera det vid 500 xg under 5 min 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml T-cellmedium. Räkna cellerna som beskrivs i 2,4 och utsäde 1 x 10 5 celler i 100 pl medium per brunn.
- CD4 + T-cellstimulering
- Polyklonala CD4 + T-cellsstimulering
- Förbeläggning en rundbottnad 96-brunnsplatta med renad anti-mus CD3-antikropp (klon 145-2C11) i PBS, vid en önskad slutlig koncentration. Till exempel, att i förväg belägga hela plattan med α-CD3 vid en ^ g / ml, blanda 10 | il av antikroppen (stamkoncentration = 0,5 mg / ml) med 5 ml PBS, virvel och tillsätt 50 | il av blandningen till varje brunn med en multikanalpipett.
- Lämnar plattan i inkubatorn under 3 h. Efter isolering av T-celler, tvätta pre-belagda plattan två gånger med PBS. Lägga renad anti-CD28-antikropp (klon37,51) till isolerade T-celler vid en önskad slutlig koncentration (t.ex., vid 1 | ig / ml); blanda väl. Seed T-cellerna och lämna dem i inkubatorn i två till tre dagar.
- Antigenspecifika CD4 + T-cell stimulering med dendritiska celler (DC)
OBS: Om DC används som antigenpresenterande celler (APC), följer protokollet för T-cell isolering, med dessa undantag:- Innan homogenisering av mjälten, injicera den med 1 ml kollagenas typ IA i PBS vid 0,5 mg / ml och överför den till en 15 ml centrifugrör.
- Inkubera i vattenbad vid 37 ° C under 15 min. Efter tvättning med PBS, resuspendera pelleten i FACS-buffert och tillsätt 20 | il av mus CD11c magnetiska mikropärlor, i stället för CD4 mikropärlor.
- Använd en MS separationskolonn och lämpliga volymer: Skölj kolonnen med 1 ml FACS-buffert; Resuspendera cellerna i 1 ml FACS-buffert och tvätta kolonnen med 1 ml FACS-buffert tre gånger.
- A.dd antigen val till utvecklingsländerna (t.ex. myelin oligodendrocyt glykoprotein (MOG) aa 35-55 vid 20 mikrogram / ml), blanda väl och frö 5 x 10 4 celler i 100 pl T-cellkulturmedium per 96-round-botten- väl.
- Lägg 1 x 10 5 T-celler i 100 ^ T-cellkulturmedium per 96-rundbottnad-brunn vid slutet, såsom beskrivs i protokollet för T-cellisolering.
- Antigenspecifika CD4 + T-cellsstimulering med B-celler
OBS: Om B-celler används som APC, följer protokollet för T-cell isolering, med dessa undantag:- Använd mjältar från transgena möss vars B-celler är antigenspecifik (t.ex. IgH MOG (Th) möss, vars B-celler specifikt känner igen MOG 35-55).
- Använda antigenspecifika T-celler (t.ex. från TCR MOG (2D2) möss). Tillsätt 20 pl mus CD19 magnetiska mikrokulor istället för CD4 mikropärlor.
- Tillsätt antigen val till B cells (t.ex., MOG 35-55 vid 20 | ig / ml), blanda väl och utsäde 5 x 10 4 celler i 100 | il av B-cellkulturmedium per 96-rundbottnad-brunn.
- Lägg 1 x 10 5 T-celler i 100 ^ T-cellkulturmedium per 96-rundbottnad brunnar, såsom beskrivs i protokollet för T-cellisolering.
- Polyklonala CD4 + T-cellsstimulering
4. Installera och Performing TEER Mätning
- Placera 24-brunnars modulen i TEER instrumentet under huv med laminärt flöde. Ta bort locken och göra insatser med MBMECs i instrumentet med pincett.
- Pipett 810 il färskt medium till det nedre utrymmet av modul brunnarna: lägga den försiktigt mellan insatsen och väggen av modulen väl.
- Stäng locken och placera instrumentet i inkubatorn. Anslut instrumentet till dess dator; slå på instrumentstyrenheten och öppna programvaran.
- Välj "ny mätning" i pop-up fönster. Check "show TEER" och "show Ccl" lådor; Tryck sedan på "start". Efter att ha avslutat den första mätningen, välj "kontrollera alla brunnar" i fliken "resultat" för att se alla Teer och CCL värden.
- Spara filen: Arkiv> Spara som> "namnet på filen".
OBS: Som TEER och Ccl mäts kontinuerligt på ett automatiserat sätt, övervaka sina värden under en period av tre till fem dagar. Byte av medium är inte nödvändigt, om inte cellviabilitet är suboptimal, som visualiseras genom en brist på ökning av TEER. - Välj tidpunkten för samodling MBMECs med T-celler när Ccl är stabil och lägre än en iF / cm2 och TEER har nått sin maximala nivå.
- Noggrant inspektera absoluta Teer och CCL värden och omfattar alla brunnarna där MBMECs inte har utvecklat sammanflytande tillräckligt monolager genom att avmarkera dessa brunnar.
- Grupp resten av brunnarna: högerklicka på en brunn och välj "lägg väl till nya genomsnittliga bra". name det i popup-fönster; göra samma sak för alla enskilda brunnar som ska grupperas.
- Kontrollera alla genomsnittliga brunnar för att bekräfta att alla av dem har samma ursprungliga villkoren innan samodling. Om någon har väsentligt olika absoluta Teer värden eller TEER backar, eller standardfelen är för stora, göra om grupperingen.
OBS: Den optimala gruppering av brunnar ger minimal variation i Teer värden, både inom och mellan försöksgrupper. - I "experiment" fliken, tryck på "paus", koppla ur instrumentet och ta ut den ur inkubatorn. Ta bort locken under huv med laminärt flöde.
- Förbereda föraktiverade och / eller naiva T-celler, med eller utan specifika cytokiner, antikroppar eller andra substanser, om så önskas: Till exempel: blanda renat NA / LE rått-anti-mus-IFN-γ-antikropp (klon XGM1.2) med förberedda T celler, vid 20 mikrogram / ml per brunn av TEER instrumentet.
OBS: Om substanser såsom granzym B-hämmare används, de är endded till T-cellkultur i början av T-cellstimulering: t.ex., är Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) blandat med isolerade T-celler vid en slutkoncentration av 10 pM i DMSO. Se Material och utrustning för mer detaljer. - Ta del av mediet från insatsen (den övre väl utrymmet): t.ex. noggrant pipett ut 150 pl (ta bort alla mediet bör undvikas eftersom det kan störa MBMEC monolager).
- Lägg T-celler till MBMECs genom att försiktigt pipettera 150 l medium innehållande 2 x 10 5 celler / insats.
OBS: Vid skörd pre-aktiverade T-celler, räkna bara sprängning, trypanblått-fria celler. - Stäng locken och placera instrumentet tillbaka till inkubatorn. Anslut instrumentet och tryck på "återuppta mätningen. Efter 24 timmar, tryck "stopp" i "experiment" fliken och spara filen (Arkiv> Spara).
5. Data Export och statistisk analys
- Exportera resultatet genom att välja Arkiv> Exportera.
- I "Inställningar" -fliken av popup-fönster, välj ".dot" i "decimal" och "tabulator" i "fältavgränsare" alternativet.
- Under fliken "exportresultat", namnge filen, kontrollera alla brunnar som ska exporteras, och kontrollera "TEER" och "Ccl" rutorna i "välja data" alternativet.
- Tryck på "exportera data," öppna den exporterade filen och kopiera data till ett kalkylblad.
- Normalisera exporterade data (sorterade efter varje replikat, med Teer och CCL värden som anges för varje körning (mätning)): Ställ Teer och CCL värden för sista tidpunkten innan samodling till 100% och förändras i enlighet värden för alla andra körningar, i förhållande till "100%" run.
- Kopiera normaliserade data till en programvara val för att generera en graf med hjälp av enskilda brunnar och visa standardfelet av medelvärdet för varje behandlingsgrupp.
- Perform Tvåvägs ANOVA statistiskt test med en Bonferroni korrigering för multipla jämförelser med hjälp av statistisk programvara val.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 ger en allmän översikt över in vitro BBB modell som används för att studera interaktionen mellan T-celler och endotelceller. Experimentet består av tre viktiga steg. Det första steget är isolering av primära MBMECs från hjärn cortex, och deras kultur i fem dagar. När de når sammanflytning i cellkulturplattan, är MBMECs trypsineras och såddes på permeabla skär, vilka därefter placeras i TEER instrumentet. Den TEER och Ccl av MBMECs mäts kontinuerligt och övervakas under en period av tre till fem dagar. Under tiden, T-celler isoleras, stimuleras (steg 2), och odlades under två till fem dagar, typ och styrka av stimulus. I steg 3, är T-celler läggs till och samodlades med MBMECs när Ccl är en stabil låg nivå och TEER är på den högsta nivån. Att välja denna tidpunkt för co-kultur när TEER är fortfarande på sin platå är avgörande för framgångenav hela mätningen. Således är det ytterst viktigt att tidpunkten för T-cellisolering och stimulering är noggrant utvalda, så att T-celler når den önskade nivån av aktivering vid tiden för tillsatsen till EC. Efter tillsats av T-celler, är mätningen återupptas för ytterligare en dag och resultaten analyseras.
Efter den inledande fem dagars odling, MBMECs visar lätt karakteristiska spolformad morfologi (Figur 2A, vänstra panelen) och uttrycker endotelceller cellspecifika markörer såsom PECAM-1 och Claudin-5 (figur 2A, mellersta och höger sida). Men enbart detta inte ger tillräckliga bevis för deras fullständiga sammanflöde och ordentlig barriär integritet. Impedansspektroskopi, å andra sidan, ger en god uppskattning av monoskiktet integritet och tjänar som en kvalitetskontroll av varje brunn innan utförandet av en funktionell analys. I Figur 2B, de flesta av debrunnar innehöll MBMECs vars Ccl värdena var stabila och låga, och deras Teer värden nått en platå. Dessa brunnar användes för efterföljande sam-kulturexperiment. De grupperades på ett sådant sätt att variansen inom och mellan grupper var minimal före tillsats T-celler (figur 2C). Brunnarna vars TEER värden skilde sig markant från resten (såsom den blå kurvan visas i figur 2B) inte användas eftersom de skulle leda till tvetydiga resultat eller feltolkning av data.
Under förutsättning att de första kraven på MBMEC kultur och T-cellsstimulering har uppfyllts, kan impedansspektroskopi ge värdefulla insikter i T-cell EG interaktion. TEER mätning kan användas som det primära avläsning för en sådan interaktion och ett mått på T-cellmedierad EG dysfunktion, såsom visas i fig 3A och 3B. I detta fall är MBMECs odlas på skär med mikroporer 0,4^ m i diameter, som inte tillåter T-celler att passera genom inlägget membranet. Figur 3A visar att endast stimuleras, men inte naiva T-celler är kapabla att inducera EG dysfunktion, såsom bestäms av en minskning i TEER och ökning av Ccl. Naiva T-celler kan fungera som en negativ kontroll, eftersom TEER och Ccl under samodling med naiva T-celler stanna på sina ursprungliga nivåer. Undantaget är toppen i början av co-kultur, som orsakas av hantering av instrumentet (lyfta locken, lägga nytt medium med celler som kan ha något olika temperaturer och pH-värden, och stänga locken). Denna artefakt visas med alla typer av Teer mätningar och ignoreras under analysen. Tillsatsen av pro-inflammatoriska cytokiner IFN-y och TNF-a (vid 100-500 U / ml), som är kända för att kunna framkalla EG inflammation, kan användas som positiv kontroll. I figur 3A, MOG 35-55 specifika CD4
För att undersöka mekanismerna för den beskrivna MBMEC mono störningar, kan olika metoder användas. Resultaten i fig 3C visar att de stimulerade T-cellerna, men inte deras supernatanter orsakade en avsevärd skada på MBMECs, vilket tyder på att direktkontakt mellan T-celler och MBMECs är avgörande för barriär störningar. Dessutom tillsats av en neutraliserande α-IFN-γ antikropp under TEER mätningen endast något förbättrad MBMEC barriäregenskaper, vilket tyder på att IFN-γ inte kan vara den primära orsaken till denna störning. Å andra sidan, lägga granzym B Inhibitor II till T-cellkultur (Figur 3D) restaurerade MBMEC integritet i större utsträckning, som pekar på detta cytolytisk molekyl som en viktig aktör i att orsaka MBMEC skador och efterföljande minskning av TEER.
Förutom dess användning som en primär avläsning för effekten av T-celler på EG monolager integritet, kan TEER mätning också användas som en kvalitetskontroll av barriär integritet före andra analyser, såsom T-cellstrans analys. I detta fall infogar med mikroporer med 3 | j, m i diameter används. I fig 3E, var TEER mätning utförs för att säkerställa att MBMEC monoskiktet var av samma nivå av integritet i alla brunnar före tillsats av T-celler för efterföljande transmigration analys. Detta följdes av skörd av T-celler från det nedre utrymmet av de instrument brunnar, färgning T-celler med α-CD4-antikropp och flödescytometrisk analys, med användning av cellräknings pärlor för att bestämma absoluta antalet transmigrated T-celler; visas i fig 3E, mitten och höger). Observera att stimulerade T-celler som används för trans inte orsaka en betydande minskning av TEER, trots att de i förväg aktiveras i figur 3A. Detta kan återspegla den transcellulära vägen immunceller kan använda under själa, som har observerats tidigare 39. I figur 3F, var hälften av brunnarna med MBMECs inflammerad med IFN-γ och TNF-α (icke inflammerat vs. Inflammerad) och senare, naiva T-celler tillsattes för bedömning av transmigratory aktivitet. I det här fallet, TEER mätning gav en aning om hur stark inflammationen med cytokiner var och när T-celler bör läggas för transmigration.
Figur 4 visar några av de vanligaste situationer som kan leda till feltolkning av Teer resultat. I figur 4A, till exempel, inte alla MBMECs utvecklat en helt sammanflytande monoskikt på samma gång. En av grupperna ( "naiva T-celler - uteslutna") innehöll MBMECs vars TJ komplex mognar i olika takt jämfört med de andra grupperna strax före tillsatsen av T-celler. Denna grupp utvecklade därför Teer-värden över 100% under försöket och uteslöts från vidare analys. Således, är lika viktigt som absoluta Teer värden för korrekt tolkning av data lutningen på TEER kurvan (hastighet av TJ mognad) före försöket. Figur 4B visar att start av samodling inte bara för tidigt, utan också för sent kan leda till felaktiga resultat. Här, i både gruppen med stimulerade T-celler och den negativa kontrollgruppen (medium change) har Teer värden redan passerat sin platå och började sjunka oberoende av experimentella tillstånd, därmed indikerar suboptimala odlingsbetingelser före och under försöket. Sådana grupper bör inte ingå i analysen. Slutligen, även TEER och Ccl ändra vanligtvis sina värderingar på ett sådant sätt att en större minskning av TEER åtföljs av en större ökning i Ccl, kan detta inte alltid vara fallet. I figur 4C, stimulerade T-celler B orsakade en större minskning i TEER, men en mindre ökning av Ccl än stimulerade T-cellerna A gjorde.
Figur 1: Allmän översikt över tekniken. Efter den initiala kulturen, är MBMECs reseeded på permeabla skär och placeras i den automatiserade cellmonitor; TEER och Ccl mäts varje timme under 4-5 dagar. Under tiden, T-celler aktiveras in vitro 40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MBMECs utveckla en sammanflytande monolager som lämpar sig för ett in vitro BBB modell. (A) Spindel form morfologi (till vänster) och immunofluorescerande färgning av PECAM-1 (mitten) och Claudin-5 (till höger) fem dagar efter MBMEC isolering. (B och C) TEER och CCL-värden före (B) och efter (C) gruppering av individuella brunnar, före to tillsats av T-celler. Den blå kurvan i (B) inte användes för experimentet, eftersom MBMECs i detta väl inte har utvecklat TEER så hög som i de andra brunnarna. Data i (C) show medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat. (AD) Förändringar i TEER som en primär mått på MBMEC dysfunktion vid interaktion med T-celler. (A) MOG-specifika T-celler aktiverades genom MOG-specifika B-celler i närvaro av MOG 35-55 peptid i fem dagar. Naiva T-celler och pro-inflammatoriska cytokiner IFN-y och TNF-a (båda vid 100 U / ml) tjänade som en negativ och en positiv kontroll, respektive. (B) T-celler stimulerades med α-CD3 och α-CD28 antikroppar (1 mikrogram / ml vardera) för två eller tre dagar, såsom anges, innan du lägger dem till MBMECs. (C) T-celler (föraktiverade som i (A)), eller deras supernatanter, i närvaro av α-IFN-γ-antikropp eller motsvarande isotypkontroll. (D) T-celler (föraktiverade som i (B)) i två dagar, i närvaro av granzym B-hämmare II eller dess utspädnings DMSO. (E och F) TEER mätning endast användas som en kvalitetskontroll för barriär integritet före T-cell trans. MBMECs odlades på skär med porer på 3 ^ m i diameter. (E) T-celler, stimulerade såsom beskrivits i (A), var låt att transmigrate under 18 timmar (till vänster). Därefter tillsattes de skördades, färgades för α-CD4-antikropp (klon RM4-4) och analyserades genom flödescytometri, med användning av cellräknings pärlor (mitten och höger). (F)Övervakning av MBMEC monolager integritet vid stimulering med IFN-γ och TNF-α, och välja lämplig tidpunkt för efterföljande tillsats av T-celler för trans analys. (AF) Resultaten visar tekniska triplikat och är representativa för tre oberoende experiment vardera. Data visar medelvärde ± SEM. (E, höger) oparat, två-tailed Students t-test. **, P <0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Praktiska överväganden och tolkning av data. (A) MBMECs från en försöksgrupp (röd kurva) uteslöts från analysen, eftersom graden av mognad av deras Junktional komplexen annorlunda jämfört med andra grOj då. (B) Ett exempel på att lägga till T-celler för sent, vilket förhindrade korrekt bedömning av MBMEC dysfunktion. (C) Vid störningar av stimulerade T-celler "A" (svart kurva), Ccl värden för MBMECs visade en mer dramatisk ökning än vad som skulle förväntas från åtföljande minskning i TEER orsakas av samma T-celler. (AC) T-celler stimulerades med α-CD3 och α-CD28-antikroppar (1 pg / ml vardera) under två dagar. Resultaten visar tekniska tre exemplar och är representativa för tre oberoende försök vardera. Data visar medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera steg av den beskrivna protokollet är väsentliga för ett lyckat experiment. Under den initiala MBMEC isolering och odling, är det avgörande att arbetet utförs under sterila förhållanden så mycket som möjligt, för att förhindra kontaminering av cellkulturen med svampsporer eller bakterier. För att erhålla en ren kultur av EC, är det rekommenderat att använda ett medium innehållande Puromycin för de första tre dagarna, vilket möjliggör överlevnad EC, men inte andra celltyper (särskilt pericyter) 41,42. En annan avgörande steg som förtjänar särskild uppmärksamhet är att identifiera rätt tidpunkt för att lägga till pre-aktiverade T-celler. Under de första 48 h av Teer mätnings MBMECs föröka på genomsläppliga insatser och minska klyftorna mellan varandra. Hence, Ccl minskar tills den når en stabil och låg nivå (ca 0,6 | iF / cm 2). Detta är det första tecknet på ett sammanflytande monoskikt EG, men är ännu inte ett tecken på en tät barriär. Bara efterCCL har nått en stabil nivå gör TEER börja öka. När TJ komplex fullt utvecklade och EG barriären är helt täckt, TEER når sin maximala nivå. Denna platå uppnås vanligen tre till fem dagar efter återsådd ECS och upprätthålls under ytterligare 24 till 36 timmar. Den bästa tiden poäng för att lägga till T-cellerna är i början av platån, vilket säkerställer att den EC fortfarande livskraftiga nog att samodlas med T-cellerna. Eftersom T-cellaktivering måste initieras innan den optimala tidpunkten för samodlingen säkert kan förutsägas, kan det vara fördelaktigt att stimulera två satser av T-celler på två olika dagar för att öka flexibiliteten hos denna timing. Slutligen måste gruppering av individuella replikatbrunnar före tillsats T-celler att de MBMECs göras på ett sådant sätt att variabiliteten inom och mellan grupperna är minimal. Detta säkerställer att de första villkoren är lika bland alla grupper under samodling av T-celler och MBMECs. Vår protokoll beskriver TEER mätning under samodlingen av primär mushjärna EC med pre-aktiverade CD4 + T-celler. Dess enkla formen gör för flera ändringar, i enlighet med de vetenskapliga behov. Till exempel kan typen, styrka och varaktighet av stimulus varieras. Antigenspecifika CD4 + T-celler kan aktiveras genom deras besläktade antigen, i närvaro av lämpliga antigen-presenterande celler (APC); Alternativt kan T-celler polyklonalt aktiveras genom α-CD3 och α-CD28-antikroppar. Aktiveringsstatus T-cell kan moduleras genom olika cytokiner, blockerande antikroppar, inhibitorer. Byte av primära hjärn EC med endotelceller cellinjer rekommenderas inte, men eftersom det är känt att den senare visa mindre restriktiv TJ komplex och högre permeabilitet jämfört med de primära cellerna 43. Förutom att mäta TEER som primär avläsning, ger detta protokoll en god kvalitetskontroll av EG monolayer integritet före T-celltransmigration assay (Figur 3E, F). Notera får Teer värden inte nödvändigtvis minska under trans av T-celler över MBMECs (Figur 3E): detta skulle kunna spegla transcellulära vägen immunceller kan använda under själa, som har observerats tidigare 39,44.
Som aktiverade T-celler inducerar EG dysfunktion under samodling, visar TEER en stadig, förutsägbar minskning, jämförbar mellan experiment med samma villkor. En större minskning av TEER brukar åtföljas av en större samtidig ökning av CCL. I sällsynta fall kan emellertid en ökning av Ccl vara mer uttalad än vad som förväntas från motsvarande minskning av TEER (Figur 4C). Denna skillnad kan återspegla olika aspekter av EG monolager störningar. Som EC försöker stänga gapen som bildas under barriär störningar, kan de genomgå dynamiska förändringar imorfologi och motilitet såsom bildande utsprång och öka deras totala yta, som alla kan bidra till en dramatisk och snabb ökning av Ccl. Detta gör ändringar i Ccl mindre förutsägbart, jämfört med förändringar i TEER. Således, nivån på minskningen av TEER fortfarande den mest tillförlitliga och representativa mått på nedsatt barriär integritet.
Denna analys kan kompletteras med andra tekniker för att undersöka endotelceller barriäregenskaper. Den kan följas av en permeabilitetsanalys, som mäter mängden av molekyler av olika storlek som diffunderar genom den avbrutna EG monoskiktet 44. För detta ändamål, kan fluorescensmärkta dextran-konjugat, såsom fluorescein och Texas Red användas; andra molekylära spårämnen finns också tillgängliga (t.ex., sackaros, mannitol, albumin, Evans Blue och pepparrotsperoxidas) 26. Vidare kan immunfluorescensmikroskopi användas för att undersöka förändringar i proteinuttryckoch den cellulära lokaliseringen av TJ och celladhesionsmolekyler. Även om den presenterade BBB-modellen är mycket enkel, kan de resultat som erhållits med det ge värdefull vägledning för ytterligare analyser under mer fysiologiska förhållanden. Sådana analyser innefattar (men är inte begränsat till) in vitro skjuvning analysflöde för att komplettera TEER mätning som erhållits under statiska förhållanden och in vivo permeabilitetsanalys med Evans Blue injektion i levande möss att ta hänsyn till hela komplexiteten i BBB.
Även känslig och tillförlitlig, den metod som beskrivs här har vissa begränsningar som förtjänar särskild uppmärksamhet. De högsta Teer värden som uppmätts i vår experimentuppställning når värden av 35-40 Qcm 2. Dessa TEER värden är mycket lägre än in vivo, där olika celltyper och acellulära komponenter bidrar till integriteten av BBB, men de är inte heller så hög som TEER-värden uppnås på något annat in vitro BBB: modeller <sup> 26,45,46. Detta skulle kunna förbättras genom tillsats av hydrokortison till EG-medium, som har visat sig markant förbättra barriäregenskaper 27,47 - 49. Men användningen av sådana ämnen - är inte lämplig för alla funktionella analyser - känd för att ha anti-inflammatoriska och immunsuppressiva effekter. Som fokus för denna protokoll är om konsekvenserna av EG-T-cellsinteraktioner på barriär integritet skulle tolkning hämmas genom tillsats av hydrokortison. Använda Protokollet presenteras här möjliggör således en bedömning av den verkliga inflammatorisk potential stimulerade T-celler för att orsaka EG barriärfunktion. Det är också värt att notera att en direkt jämförelse av olika Teer värden som rapporterats i litteraturen bör göras med försiktighet. Sådana värden är starkt beroende av experimentuppställning, de erhålls med olika celltyper, sådd celldensiteter, media, celltillväxtområden, och Teer mätsystem (t.ex. </ Em>, utformning och storlek av elektroderna).
För att efterlikna in vivo-situationen närmare, komplex in vitro BBB: modeller har etablerats, där EC är samodlade med pericyter på den motstående sidan av insatsen membranet, eller där pericyter och astrocyter odlas på botten av brunnarna 12,25,50 - 52. I sådana co-odlingssystem, överhörning mellan olika celltyper möjliggör starkare åtstramning av barriären, med tredubbla samodlingar att vara bäst i liknar situationen in vivo och därmed ger de högsta Teer värden. Komplexiteten hos dessa system, å andra sidan, innebär en begränsning till bredare användning som in vitro-BBB: modeller.
En annan begränsning av denna modell är bristen på skjuvspänning, vilket har visat sig förbättra barriär integritet 53,54. För att övervinna detta problem har nya dynamiska BBB: modeller nyligen införts: ECs odlas i ihåliga fibrer och utsattes för pulserande strömningsförhållanden, härma närmare mikrovaskulaturen in vivo 55,56.
Sammanfattningsvis, detta protokoll beskriver en modell in vitro av BBB baserad på impedans spektroskopi. Fokuserar på interaktionen av primär mushjärna endotelceller med aktiverade T-celler, tillåter metoden för att studera de barriäregenskaper under en sådan direkt kontakt. Detta är särskilt viktigt för att förstå de avgörande stegen i utvecklingen av inflammatoriska CNS-sjukdomar såsom multipel skleros och dess djurmodell EAE, varvid BBB äventyras under en interaktion av EC med encefalitogena T-celler. Den beskrivna analysen möjliggör undersökningen av konsekvenserna av en målinriktad modulering av en sådan interaktion genom att använda ett brett spektrum av substanser, såsom blockerande antikroppar, cytokiner och inhibitorer av T-cellaktivering. Metoden är känslig, tillförlitlig och icke-invasiv ennd mätningar av TEER och Ccl utförs på ett automatiserat sätt. Allt detta gör det till ett användbart och mångsidigt verktyg som adderar ett nytt lager till den rika kroppen av BBB: modeller. Det kan särskilt öka vår kunskap om BBB: egenskaper under patofysiologiska tillstånd observerats vid autoimmuna sjukdomar som MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Annika Engbers och Frank Kurth för deras utmärkta teknisk support och Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) för hjälp diskussioner om Teer mätningar. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 till HW och LK, CRC TR128, projekt A08; Z1 och B01 till LK och HW, och tvärvetenskapligt center för klinisk forskning (medicinska fakulteten i Münster) licensnummer KL2 / 2015/14 till LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
