Protocol
Toutes les souris sont élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques et tous les protocoles de souris sont menées en conformité avec les directives du Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels.
1. Préparation des tampons et réactifs
- Préparer toutes les Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyenne (10% de sérum inactivé par la chaleur de fœtus bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 UI / ml) / streptomycine (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoéthanol ).
- Préparer 20x solution saline équilibrée (BSS) Stock 1 et 2 Stock, séparément.
- Préparer 20x BSS stock 1 (111 mM dextrose, phosphate de potassium 8,8 mM, 26,7 mM phosphate disodique dans 1 litre d'eau stérile) et ajouter 40 ml 0,5% Phénol Red 20x BSS stock 1 avant ajustement de volume final. Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C.
- Préparer 20x BSS stock 2 (25,8 mM de chlorure de calcium dihydraté, 107 mM de chlorure de potassium, ch 2,73 M de sodiumLoride, 19,6 mM de chlorure de magnésium hexahydraté, 16,6 mM de sulfate de magnésium dans 1 litre d'eau stérile). Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C.
- Pour préparer 1x BSS pour une utilisation expérimentale, diluer 50 ml BSS stock 1 et 50 ml BSS stock 2, séparément, dans 400 ml d'eau stérile chacun. Combiner les deux solutions diluées, ajuster le pH à 7, et ajouter 20 ml de FBS (2%). Top à 1 L avec de l'eau stérile et filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um.
REMARQUE: Les solutions de stock BSS doivent être préparés séparément, car le mélange des stocks BSS concentrées directement pourrait entraîner des précipitations.
- Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer
- Pour préparer le tampon de lyse RBC, mélanger 9 parties de chlorure stock ammonium (155 mM de chlorure d'ammonium dans l'eau stérile) à 1 partie disponible Tris-base (130 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane dans l'eau stérile, pH 7,65) avant utilisation.
NOTE: Magasin de solutions mères stériles de chlorure d'ammonium et Tris-base à 4 ° C. Préparer la lyse buffer frais pour assurer une lyse efficace des globules rouges.
- Pour préparer le tampon de lyse RBC, mélanger 9 parties de chlorure stock ammonium (155 mM de chlorure d'ammonium dans l'eau stérile) à 1 partie disponible Tris-base (130 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane dans l'eau stérile, pH 7,65) avant utilisation.
2. Génération de Lymphocytes Suspension de Spleen ou les ganglions lymphatiques
NOTE: Il est important de préparer tous les réactifs et le matériel requis pour l'expérience avant l'euthanasie de la souris et de générer des suspensions de cellules isolées de lymphocytes le plus tôt possible pour maintenir les viabilités cellulaires élevées.
- Euthanasier souris expérimentales par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie.
NOTE: A partir de cette étape en avant, toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées de manière aseptique. - Trempez la totalité de la souris dans 70% d'éthanol avant de faire des incisions. Retirer la rate et les ganglions lymphatiques aseptique 8, et les placer dans 15 ml tubes séparés contenant 5 ml glacée RPMI / FBS (RPMI avec 2% de FBS) ou BSS / FBS (de l' étape 1.2.3).
NOTE: Depuis BSS empêche efficacement la lyse RBC, utilisez RPMI pour la préparation de la suspension de cellules spléniques et passer à BSS AFTElyse r RBC. - Pour générer une suspension de cellules isolées à partir de ganglions lymphatiques spléniques ou, placer l'organe (s) entre deux morceaux de stériles 100 um cellule crépine maille dans une boîte de Pétri contenant 2 ml glacé RPMI / FBS ou BSS / FBS. En utilisant le piston d'une seringue de 1 ml, écrasez l'organe (s) jusqu'à ce qu'il ait été déchiré en morceaux très fins.
- Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et laver le filtre cellulaire en filet avec de la glace à froid RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recueillir la suspension cellulaire restante, ajouter dans le même tube de 15 ml, et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
NOTE: Re-suspendre les cellules granulées en tapotant le tube avec les doigts avant d'ajouter RBC tampon de lyse ou moyenne dans les étapes suivantes. - Préparer la température ambiante tampon de lyse (RT) RBC pendant la centrifugation de la suspension cellulaire (voir l'étape 1.3.). Après la granulation des cellules et élimination du surnageant, remettre en suspension les cellules avec 1 ml de tampon de lyse RBC pour 10 8 cellules. Incubate la réaction de lyse à température ambiante pendant 3-4 min.
- Arrêtez lyse RBC avec 14 ml glacée BSS / FBS et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C.
3. Purification de B et cellules T
- La purification des cellules B
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Re-suspendre jusqu'à 10 8 cellules spléniques dans 300 ul BSS / FBS et ajouter 50 ul anti-CD43 microbilles magnétiques 9,10. Pour éliminer les cellules mortes, ajouter 30 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min.
- Purification des cellules T
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Remettre en suspension jusqu'à 10 8 cellules non-T , l' anticorps de déplétion des cellules cocktail (anticorps biotinylés contre CD19, B220, Gr-1, le TCR γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 et CD4 ou CD8 en fonction de la population cellulaire cible être purifié), dilué à 1: 200 dans 200 ul de BSS / FBS 4,5. Faire incuber la suspension de cellules dans un4 ° C réfrigérateur pendant 15 min.
- Après incubation, ajouter 10 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 165 ul BSS / FBS avec 30 ul microbilles de streptavidine et 15 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min.
REMARQUE: Pour assurer même l'étiquetage avec les microbilles magnétiques, incuber les cellules avec des microbilles pendant 15 min, puis mélanger doucement la suspension cellulaire en tapotant le tube de 15 ml et incuber encore 15 minutes lors de l'étape 3.1.1. ou 3.2.2.
- Préparation de la colonne de séparation pour cellulaire Purification
- Préparer une colonne de séparation utilisé pendant l'étiquetage de microbilles des cellules (étape 3.1.1. Ou 3.2.2.). Préchauffer BSS (sans FBS) à température ambiante et utiliser 2 ml pour laver et équilibrer la colonne aseptique. Après équilibration avec BSS, lavé la colonne ne doit pas être autorisé à sécher.
NOTE: Nous utilisons les LS cOLONNE au lieu de la colonne de LD recommandée en raison de sa réutilisation (voir étape 3.4.). - Après marquage avec les billes magnétiques, ajouter 14 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1-3 ml RT BSS.
- Fixer une aiguille 21 G stérile à la pointe de la colonne afin de réduire le débit au cours du processus de purification. Charger la suspension cellulaire sur la colonne équilibrée et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées.
REMARQUE: Évitez d'introduire des bulles dans la colonne pendant le chargement. - Laver la colonne une fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Recharger la colonne avec de l'écoulement à travers encore une fois. Recueillir l'écoulement à travers le deuxième après le chargement dans le même tube de 15 ml.
- Laver la colonne 3 fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Par la suite, ajouter 5 ml BSS / FBS à the colonne, et avec un piston, rincer les cellules marquées magnétiquement hors de la colonne dans un nouveau tube de 15 ml.
- Vérifier la pureté des cellules recueillies par cytométrie de flux en utilisant des anticorps qui se lient à des antigènes de surface de B ou des lymphocytes T purifiés 4,5.
- Préparer une colonne de séparation utilisé pendant l'étiquetage de microbilles des cellules (étape 3.1.1. Ou 3.2.2.). Préchauffer BSS (sans FBS) à température ambiante et utiliser 2 ml pour laver et équilibrer la colonne aseptique. Après équilibration avec BSS, lavé la colonne ne doit pas être autorisé à sécher.
- Réutiliser la colonne de séparation
NOTE: La colonne LS peut être réutilisé jusqu'à 4 fois sans affecter l'efficacité de purification.- Laver la colonne 3 fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 3 fois avec 5 ml d'eau distillée à partir du haut à l'aide du piston.
- Laver la colonne avec 5 ml 70% d'éthanol et sécher la colonne extensive en utilisant une prise d'air pour éviter l'accumulation de rouille dans la colonne.
- Pour préparer une colonne LS utilisé pour une expérience de purification séparée, laver la colonne de bas en haut avec 5 ml 70% d'éthanol en utilisant l'adaptateur de seringue. Ensuite, laver la colonne de bas en haut à deux reprises avec 5 ml de PBS stérile, puis 5 ml de PBS, une fois dans la partie supérieure de la colonne. Ajouter 2ml RT BSS pour équilibrer la colonne, puis procéder au chargement de la colonne avec des cellules marquées.
4. CFSE Étiquetage et Stimulation
REMARQUE: Les cellules purifiées peuvent être soumises à divers essais in vitro et in vivo , des essais fonctionnels. Ici, nous utilisons des cellules T purifiées afin de déterminer la capacité des véhicules blindés 5 de stimulation des lymphocytes T.
- solution de pré-marquage chaud (0,1% de FBS dans du PBS) à 37 ° C avant chargement CFSE.
REMARQUE: L'utilisation d'un faible pourcentage de FBS dans du PBS réduit la mort cellulaire pendant le chargement CFSE et minimise la perte de cellules lors de la centrifugation. Cependant, trop de FBS peuvent interférer avec CFSE chargement. - Laver les cellules purifiées deux fois avec une solution d'étiquetage, puis remis en suspension à 2 x 10 7 cellules / ml dans une solution d'étiquetage préchauffé dans un tube de 15 ml.
- Préparer 10 solution de CFSE uM (dilution 1: 500 de 5 mM CFSE solution mère) dans une solution d'étiquetage préchauffé. solution CFSE devraitêtre fraîchement préparé chaque fois pour réaliser l'étiquetage optimal.
- Pour charger les cellules avec CFSE, ajouter la suspension cellulaire 1 partie à 1 partie 10 solution uM de CFSE dans un tube de 15 ml et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 37 ° C. Une concentration finale de 5 pM de CFSE est utilisé pour marquer 1 x 10 7 cellules / ml.
- Inverser le tube toutes les 2 min pour assurer un mélange homogène de cellules CFSE pendant le chargement.
- Pour arrêter la réaction, ajouter plusieurs volumes de milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Après avoir réussi à CFSE chargement, le culot cellulaire apparaît jaunâtre.
- Wash CFSE cellules chargé une fois de plus avec un milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C avant d' utiliser pour la culture in vitro ou in vivo la stimulation.
5. stimulation in vitro
- Préparer une solution 2x stock de stimuli (2x stimuli stock solution) immédiatement avant l'utilisation de telle sorte que 100 pl de 2x solution stimuli de stock peut être ajouté à 100 pi de cellules à un volume final de 200 pi par puits dans une plaque à 96 puits.
- Si une plaque revêtue de stimuli (IgM ou CD40 pour des cellules B ou CD3 et CD28 pour les lymphocytes T) est nécessaire, on dilue les stimuli dans du PBS et de pré-enduire la plaque de culture à 4 ° C jusqu'au lendemain. En variante, la plaque de culture peut être revêtu à 37 ° C pendant 1 heure, le jour de l'expérience. Laver la plaque revêtue à deux reprises avec du PBS (Ne pas laisser sécher la plaque à tout moment).
| Pour les cellules B | |
| Stimuli | La concentration finale |
| F (ab ') 2 de chèvre anti-IgM de souris | 0,6 à 2,4 pg / ml |
| Anti-souris CD40 mAb | 0,5 à 2 pg / ml |
| recombinantsouris IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolysaccharide | 0,1 à 10 pg / ml |
| (LPS) de E. coli sérotype 055: B5 | |
| Pour les lymphocytes T | |
| Stimuli | La concentration finale |
| Anti-CD3 (coated plate) | 2 à 10 pg / ml |
| (50 ul / puits pour le revêtement) | |
| Anti-CD28 (coated plate) | 2 pg / ml |
| IL-2 recombinante | 40 U / ml |
| PDBu (ester de phorbol) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (Calcium ionophore) | 250 ng / ml |
Tableau 1: Concentration de stimuli utilisés pour stimuler les lymphocytes en culture in vitro.
- Pour les cellules B CFSE marqués, re-suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans un milieu RPMI complet et de la culture en triple exemplaire , avec 3 x 10 5 cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond plat pour 72 h.
- Pour les cellules T CFSE marqués, re-suspension à 0,5-3 x 10 6 cellules / ml dans un milieu RPMI complet et culture en triple avec 0,5-3 x 10 5 cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond rond pour 48 ou 72 heures .
6. La stimulation in vivo
- Pour la stimulation in vivo, le transfert de manière adoptive 4 x 10 6 cellules T marquées au CFSE par souris ( par voie intraveineuse (iv) dans 200 ul de PBS) dans chaque souris receveuse MHC assorti.
NOTE: Dans ce protocole, les cellules T CFSE-marquées peuvent être transférées en utilisant adoptivement veine de la queue ou par injection rétro-orbital, car ces cellules seront à la maison lymphoïdes organes tels que les ganglions lymphatiques et la rate. - Récuser les souris receveuses un jour plus tard avec l'antigène.
REMARQUE:Dans cet exemple, on utilise l'ovalbumine (protéine OVA, 50 ug / souris) comme antigène en raison spécifiques de l'OVA, le récepteur des cellules T (TCR) des cellules T -transgenic ont été transférés de manière adoptive chez des souris receveuses. Préparer la protéine OVA dans du PBS stérile et injecter 100 pi de OVA protéine / PBS ou le contrôle PBS, par injection sous - cutanée (si), dans chaque souris receveuse 5. - La récolte et de générer des suspensions individuelles de cellules à partir des organes lymphoïdes (ganglions lymphatiques et la rate) des souris receveuses 3 jours après l'immunisation avec la protéine OVA ou du PBS. ganglions lymphatiques séparés dans proximales des ganglions lymphatiques (PLN), qui comprend axillaire, brachial et les ganglions lymphatiques cervicaux superficiels) et distales des ganglions lymphatiques (DLN), qui comprend mésentérique, poplitée, inguinale, lombaire, et les ganglions lymphatiques caudales. cellules Stain utilisant les anticorps FACS appropriés pour vérifier T la prolifération cellulaire.
NOTE: Dans cette expérience, la cellule de suivi de CFSE, CFSE marqué les cellules T provenant de souris témoins PBS injecté établir une fluorescence de base pour les non-diViding cellules. Divisions cellulaires de prolifération, cellules CFSE marqués stimulés par un antigène sont visualisés par la mesure des pics de fluorescence 12,13. Avec le contrôle PBS, le nombre de divisions cellulaires de prolifération, les cellules T CFSE marquées peut être déterminée 12,13. - Analyser les données de prolifération de cellules CFSE marqué en comparant le nombre de divisions cellulaires ou des pics entre les échantillons (figures 1 et 2).
REMARQUE: par exemple, CFSE marqué, des cellules T spécifiques de l' OVA par transfert adoptif dans des souris receveuses recevant l'antigène OVA feront l' objet d'une prolifération active par rapport aux souris témoins PBS injecté 5,12. En outre, il est remarquable de souligner qu'il existe de nombreuses façons d'analyser les données de prolifération des cellules CFSE, comme démontré par Hawkins et ses collègues 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
la purification magnétique des cellules de lymphocytes permet de purifier une population de cellules cibles dans un temps relativement court laps de temps. En utilisant notre protocole d'épuisement, nous avons été en mesure d'augmenter le pourcentage de cellules T CD8 (OT-I dans la recombinaison activant le gène-1 (RAG-1) souris ayant un déficit) de 72,8% (avant purification) à 94,2% (après purification; La figure 1A) 4,5. Ces lymphocytes purifiés peuvent ensuite être utilisés pour des tests fonctionnels en aval pour déterminer la prolifération des lymphocytes et la transduction du signal à 4,5. Par exemple, nous pouvons étudier in vivo T capacité de stimulation des cellules dans des TTB en transférant CFSE marqués, des lymphocytes T spécifiques de l' antigène dans de type sauvage (WT) et mutante (MT) souris immunisées avec l' antigène approprié 5.
Dans notre expérience représentative, nous avons transféré purifié, CFSE marqué, l'ovalbumine (OVA) spécifique OT-I CD8 T caunes dans le contrôle (WT) et des souris mutantes (MT) et immunisées ces souris un jour plus tard avec la protéine OVA. Trois jours après l'immunisation, nous avons récolté les ganglions lymphatiques (proximale et distale) et dans la rate et analysé les cellules T par cytométrie en flux. CD45 formes alléliques peuvent être utilisés pour mieux séparer la séparation, CFSE marqué, des cellules donneuses OT-I CD8 de cellules receveuses non marquées, T CD8. Dans cet exemple, les cellules du donneur et du receveur sont de CD45.1 et CD45.2 souris, respectivement (figure 1B). Les niveaux CFSE de survivant, les cellules OT-I T non stimulées à ce point de temps sont utilisés pour définir le pic pour les cellules non-proliférantes (figure 1C, la ligne en pointillés). Lors de la stimulation, l'intensité des niveaux CFSE dans les cellules OT-I T va réduire de moitié à chaque division. Prolifération des cellules T peut ainsi être déterminée en comptant le nombre de pics de 6,12 CFSE. Dans nos résultats représentatifs, nous ne voyons pas les différences dans les capacités cross-présentation de WT et MT (TTBFigure 1C, lignes continues), étant donné que les cellules T prolifèrent à des taux similaires dans les souris.
Dans une expérience séparée, nous avons effectué un [3 H] -thymidine incorporation de dosage pour étudier la prolifération cellulaire des commandes activées et des cellules T MT. Des cellules purifiées WT et MT T ont été stimulées avec divers stimuli pendant 48 heures et puisées avec de la [3H] -thymidine pendant les 8 h finale. La prolifération des cellules dans la phase S du cycle cellulaire comprendra nucléotide radiomarqué, la [3 H] -thymidine en acide désoxyribonucléique nouvellement synthétisé (ADN), par conséquent, en utilisant le comptage par scintillation liquide, la prolifération cellulaire peut être mesurée en [3 H] absorption -thymidine. Le nombre de coups par minute (cpm) en corrélation directe avec la quantité de [3 H] -thymidine absorption dans la prolifération des cellules T. Dans nos résultats représentatifs, le nombre réduit de cpm obtenus à partir de cellules MT T lors de la stimulation par rapport à counts à partir de cellules T WT indique une capacité de prolifération des cellules MT compromis T (figure 1D).
Pour déterminer la capacité des cellules B prolifératif, nous avons purifié des cellules spléniques B en utilisant la stratégie décrite à déplétion. Après purification, nous avons été en mesure d'augmenter le pourcentage de cellules B220 B (souris WT) de 63,9% (avant purification) à 98,4% (après purification; Figure 2A) 4. Semblable à purifier les cellules T, les lymphocytes B spléniques purifiées peuvent également être utilisées pour des tests fonctionnels en aval pour évaluer la prolifération des lymphocytes et la transduction du signal 4. Par la suite, on a marqué des cellules B purifiées WT spléniques avec CFSE et stimulé ces cellules in vitro en utilisant des plaques revêtues avec des anticorps anti-CD40 est complétée par la cytokine IL-4. Trois jours après la stimulation, nous avons analysé viables, les cellules B activées par cytométrie de flux. Les niveaux CFSE de survivant, les cellules B non stimulées à ce point de temps sont utilisés pourdéfinir le pic pour les cellules non-proliférantes (figure 2B, ligne pointillée). Semblables aux cellules T, l'intensité des niveaux CFSE des cellules B va réduire de moitié à chaque division 6,12.
Figure 1: profils CFSE de adoptivement cellules transférées purifiées OT-I T après l' immunisation (A) CD4 et CD8 coloration des cellules isolées à partir de OT-I;. souris RAG-1-deficient avant (panneau supérieur) et après (panneau inférieur) non-T déplétion des cellules. (B) parcelles FACS représentatifs de cellules T de la rate (Sp), les ganglions proximaux lymphatiques (PLN) et les ganglions lymphatiques distales (RAD). Les cellules donneuses OT-I T CD8 sont CD45.1 positive. Profils (C) représentant CFSE de transférés, des cellules CFSE marqué OT-I donateurs T de la rate (Sp), les ganglions lymphatiques proximaux (PLN) et distales des ganglions lymphatiques (DLN) du WT (courbes ombrée) etMT (traits pleins) les souris receveuses 3 jours après l'immunisation avec la protéine d'OVA et de LPS. La ligne pointillée indique les cellules de souris receveuses WT OT-I T sans vaccination (PBS injecté). (D) La prolifération des cellules de contrôle activé ou des cellules MT T telle que mesurée par la [3H] -thymidine essai d'absorption. Les résultats sont présentés en coups par minute (cpm). contrôle Purifié (open bar) ou MT (bar fermé) des cellules T ont été incubées pendant 48 heures dans un milieu uniquement (moyen) ou en présence de la plaque liée anti-CD3 ou anti-CD3, plus anti-CD28 avec ou sans IL- recombinant 2. L' activation des cellules polyclonaux a été déclenchée par PMA (ester de phorbol) et A23 (ionophore de calcium). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: profil de CFSELes cellules B lors de la stimulation in vitro. (A) B220 et CD3 coloration des cellules spléniques isolées de souris WT avant (panneau supérieur) et après (panneau inférieur) non-B déplétion des cellules. (B) représentant le profil CFSE des WT CFSE marqué (courbe hachurée) des cellules B spléniques après 3 jours de stimulation in vitro avec des plaques revêtues d'anti-CD40 et IL- 4. La ligne pointillée indique les cellules WT B CFSE marquées sans stimulation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce protocole, nous démontrons une procédure pour la purification de lymphocytes provenant d'organes lymphoïdes. purification cellulaire utilisant bille magnétique tri est une méthode simple et rapide qui donne des cellules cibles viables et hautement purifiés.
Étapes critiques dans le Protocole
La viabilité cellulaire et le rendement des cellules
Le maintien de la viabilité des cellules de la lignée hématopoïétiques in vitro est essentielle pour assurer des expériences réussies et reproductibles. Réactifs chimiques et biologiques, des conditions expérimentales sous-optimales ou mauvaises conditions de stockage des organes excisés peuvent affecter la viabilité des cellules. Lors de l'excision de la souris, les organes lymphoïdes doivent être stockés sur la glace et des suspensions monocellulaires préparées le plus tôt possible. centrifugation à grande vitesse de suspensions cellulaires devraient également être évités. En outre, les culots cellulaires doivent être desserrées en tapotant les tubes avec les doigts après le retrait du surnageant. Ce n'est pasrecommandé de remettre en suspension des pastilles directement avec de grandes quantités de milieu par pipetage.
Environ 2-4 x 10 7 cellules B spléniques et 2 x 10 7 cellules T de tous les grands ganglions lymphatiques peuvent être isolés à partir de 8-10 semaines une souris âgée de WT. réduction du nombre de cellules T (en dessous de la valeur attendue) B purifié et indique les conditions sous-optimales, comme mentionné précédemment.
Pureté cellulaire
La pureté moyenne de cellules isolées en utilisant ce protocole se situe dans la plage de 90 à 95%, ce qui est suffisamment pur pour la suite in vitro ou in vivo dans des expériences (figure 1A). Il est conseillé de ne pas surcharger la colonne de séparation avec un nombre excessif de cellules au cours du processus de séparation car cela peut compromettre la pureté des cellules en raison de la capacité de liaison limitée de la colonne.
Qualité de FBS
lela qualité de FBS utilisé pour compléter le milieu de culture est essentielle pour la survie in vitro des lymphocytes. FBS à partir de différentes sources et les lots peuvent varier dans leur capacité à supporter des réponses des lymphocytes in vitro. Par conséquent, il est important de tester différents types de FBS pour trouver celle qui donne la réponse spécifique à haut à faible bruit de fond. Un nombre important de bouteilles doit alors être réservé comme un stock.
Modifications et dépannage
Conditions d'étiquetage CFSE
Même si l'étiquetage CFSE travaille en RPMI, nous avons constaté que l'aide d'un faible pourcentage de FBS dans du PBS réduit la mort cellulaire au cours du processus de chargement, sans compromettre l'efficacité de l'étiquetage. En outre, la présence de FBS minimise la perte de cellules lors de la centrifugation.
Un aspect important de l'étiquetage CFSE est d'assurer même l'étiquetage des cellules afin de visualiser le pic distincts qui représentent la division cellulaire. La surcharge du CFSE peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire in vitro ou une mauvaise récupération de cellules marquées in vivo. D'autre part, l' étiquetage CFSE insuffisante ou une hétérogénéité dans la suspension de cellules cibles pendant le processus de marquage peut entraîner une faible résolution des pics 12 CFSE. Par conséquent, il est important d'optimiser les conditions d'étiquetage CFSE. La quantité de CFSE utilisé pour le marquage doit être maintenue aussi faible que possible pour réduire les effets toxiques potentiels de surcharge, mais toujours obtenir l'étiquetage suffisant pour détecter des pics bien résolus lors de la stimulation dans le laps de temps expérimental. En outre, pour éviter les pics mal résolus, amas de cellules doivent être retirées de suspensions de cellules isolées avant CFSE chargement.
Amas de cellules et la perte de cellules
Il est essentiel de veiller à ce que les cellules sont entièrement remis en suspension avant de passer à l'étape suivante parce que le remova perpétuell d'amas cellulaires au cours de l'expérience, réduit considérablement le nombre de cellules. amas cellulaires sont habituellement associés à la viabilité cellulaire réduite ou insuffisante remise en suspension du culot cellulaire.
CFSE et le chevauchement des spectres d'émission
cellules CFSE marqué peuvent encore être définis avec des anticorps fluorophores conjugué après un jour de culture, cependant, ces cellules CFSE marqué restent fluorescentes brillamment après une journée dans la culture. En utilisant des combinaisons d'anticorps conjugués à des fluorophores lumineuses avec des quantités minimales de spectres d'émission se chevauchent avec CFSE, comme la phycoérythrine (PE) et phycoérythrine-cyanine 7 (PeCy7), fournit des résultats optimaux de coloration. Cependant, la compensation pour réduire les spectres d'émission de chevauchement est toujours nécessaire. En outre, en raison de la forte intensité du signal de CFSE (FL-1 canal) qui se déverse dans le canal FL-2, le canal FL-2 doit être compensée en déduisant le pourcentage élevé de FL-2 valeur pour obtenir un optprofil imal CFSE. On peut se référer au document publié par Quah et al., Qui fournit des solutions pour l' étiquetage et l' analyse des résultats 12 dépannage CFSE.
Alternatives à CFSE
Le spectre d'émission de CFSE limite l'utilisation des combinaisons de CFSE avec des dérivés de fluorescéine tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à des anticorps. Il y a, cependant, d'autres colorants cellulaires disponibles dans le commerce avec une intensité aussi élevée de fluorescence et une faible toxicité cellulaire en violet (CTV, excitation / émission: 405/450 nm), jaune (CTY, 555/580 nm), rouge lointain (CFTR, 630 / 661 nm ou CPD670, 647/670 nm) et rouge (PKH26, 551/567 nm). Utilisation de colorants de marquage cellulaire avec différents spectres d'émission offre une flexibilité dans la conception expérimentale. D'autre part, tous les colorants de marquage des cellules décrites ci-dessus peut générer des pics distincts de la division cellulaire. Une étude comparative réalisée à l'aidedivers colorants de marquage cellulaire ont conclu que CTV est un meilleur remplacement pour CFSE car CTV permet la détection d'un nombre plus élevé de pics clairement définis de la division cellulaire 13.
Limites
La principale limite de tri cellulaire magnétique est qu'il ne convient que pour le tri cellulaire simple. Dans notre exemple, nous pourrions utiliser CD43 pour épuiser toutes les cellules non-B de la rate; cependant, nous ne serions pas en mesure de séparer les cellules folliculaires B à partir de cellules de la zone marginale B. Ces sous-populations ne peuvent être définies avec plusieurs marqueurs de surface. Bien qu'il soit possible de sélectionner positivement les cellules en utilisant la cellule magnétique tri basées sur plusieurs marqueurs de surface, elle est dépendante spécialement préparés, des réactifs disponibles dans le commerce qui permettent la libération des microbilles par les cellules cibles après le premier tour de tri avant de passer au deuxième marqueur. Ainsi, l'utilisateur serait totalement dépendante des kits disponibles dans le commerce. Dans un tel cas, FACS is beaucoup plus avantageux pour séparer des populations de cellules raffinées.
Importance de la Technique
Le tri cellulaire des approches à base d'anticorps, tels que le tri cellulaire magnétique et FACS, sont la cellule la plus fiable des techniques de tri à ce jour 15. D' autres méthodes de séparation des cellules existent, y compris des techniques basées sur la densité et sur la base d' adhérence, cependant, les lymphocytes sont des cellules mal adhérentes et leurs sous - populations sont relativement similaires dans la densité, ainsi adherence- et techniques sont soit sans objet basé sur la densité ou sont très inefficaces 15 .
Comme mentionné dans l'introduction, rapide, simple viabilité cellulaire, haute, et indépendante de tout matériel sophistiqué sont les caractéristiques gagnantes de la cellule de tri magnétique sur FACS. En particulier, l'épuisement négatif en utilisant la cellule de tri magnétique des étiquettes et épuise cellules indésirables en utilisant une colonne de séparation magnétique, tout en isolant les cellules cibles avec modificatio minimalens à la surface des cellules et le maintien de l'état naïf.
Les futures applications
Les lymphocytes hautement enrichis, viables et naïves purifiées en utilisant cette technique de purification magnétique à base peuvent être soumis à divers essais fonctionnels du comportement des lymphocytes et des mécanismes de signalisation in vitro et in vivo. Dans ce protocole, nous avons démontré en utilisant deux tests de prolifération de cellules différentes - [3 H] dosage d'incorporation de thymidine et CFSE essai de prolifération cellulaire - pour enquêter sur les cellules capacités prolifératives des lymphocytes activés.
Le choix entre le [3 H] -thymidine un dosage d'incorporation et CFSE essai de prolifération cellulaire dépend largement de la taille de l' échantillon et les conditions expérimentales. En utilisant le [3 H] dosage d'incorporation de thymidine dans des expériences avec des échantillons de grande taille génère des données de prolifération cellulaire à haut débit. Afin d'assurer optimal [<sup> 3 H] -thymidine l' absorption et la reproductibilité des résultats, la [3 H] -thymidine doit être ajouté à la culture , si la majorité des cellules sont en division active. Optimisation du protocole de marquage est requis pour différents types de cellules et les stimuli. En outre, en raison de la nature radioactive de [3 H] -thymidine, ce test d'incorporation ne peut être effectuée in vitro, à la différence de marquage CFSE des cellules, qui peuvent être activées in vitro (figure 2B) ou par transfert adoptif dans des souris receveuses (figure 1B et 1C).
Le dosage de la prolifération des cellules CFSE, d'autre part, offre de plus amples informations sur la prolifération cellulaire de [3 H] -thymidine incorporation. Etant donné que l'intensité de CFSE dans les cellules CFSE marqué diminue de moitié à chaque division cellulaire, on peut déterminer le nombre de divisions cellulaires et la proportion de cellules à chaque division en comptant le nombre et la taille des pics
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
L'étude est soutenue par le Ministère de l'Education, Singapour (ACRF Tier1-RG40 / 13 et Tier2-MOE2013-T2-2-038). Le manuscrit a été édité par Amy Sullivan de Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
