Introduction
Le diagnostic prénatal est un outil clinique important d'évaluer les maladies génétiques (ie des aberrations chromosomiques, des maladies monogéniques ou polygéniques / multifactorielle) et des malformations congénitales (hernie diaphragmatique congénitale ie, lésions pulmonaires kystiques, omphalocèle, gastroschisis). Cellules de liquide amniotique (AF) sont simples à obtenir des procédures régulièrement programmées au cours du deuxième trimestre de la grossesse (c. -à- amniocentèse et amnioreduction) ou césariennes 1, 2. La disponibilité des cellules AF de patients prénatales ou néonatales offre la possibilité d'utiliser cette source pour la médecine régénérative, et plusieurs chercheurs ont étudié la possibilité de traiter les dommages ou les maladies des tissus différents en utilisant une population de cellules souches isolées à partir AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilité d'obtenir facilement les cellules AF chez des patients malades, dans une fenêtre de temps dans lequel la maladie est souvent fixe, ouvre la voie à l'idée d'utiliser cette source de cellules à des fins de reprogrammation. En effet, souches pluripotentes induites (iPS) des cellules dérivées de cellules AF pourraient être différenciés dans les cellules d'intérêt pour les tests in vitro de médicaments ou pour les approches d'ingénierie tissulaire, afin de préparer une thérapie adéquate spécifique au patient avant l' accouchement. De nombreuses études ont déjà démontré la capacité des cellules AF à être reprogrammé et différenciées dans un large éventail de types de cellules 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Depuis la découverte par Takahashi et Yamanaka 28 des cellules somatiques reprogrammées par l'expression forcée de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, cmyc et Klf4), des progrès ont été accomplis dans le domaine de la reprogrammation. Compte tenu des différentes méthodes, on peut distinguer entre les approches virales et non virales. Le premier attend l'utilisation de vecteurs viraux (rétrovirus et lentivirus), qui ont un rendement élevé, mais silencieux généralement incomplète du transgène rétroviral, à la fois la conséquence d'une lignée de cellules partiellement reprogrammée et le risque deinsertionnelle mutagenèse 29, 30, 31. La méthode non virale utilise des stratégies différentes: à savoir les plasmides, les vecteurs, les ARNm, les protéines, les transposons. La dérivation de cellules iPS libres de séquences transgéniques vise à contourner les effets potentiellement nocifs de l'expression du transgène qui fuit et la mutagenèse insertionnelle. Parmi toutes les stratégies non viraux mentionnés ci - dessus, le PiggyBac (PB) du système de transposon / transposase ne nécessite que les répétitions terminales inversées qui flanquent un transgène et de l' expression transitoire de l'enzyme transposase pour catalyser l' insertion ou l' excision d' événements de 32. L'avantage d'utiliser transposons sur les autres méthodes pour iPS génération de cellules est la possibilité d'obtenir des cellules sans vecteur-iPS avec une approche de vecteur non viral qui montre la même efficacité des vecteurs rétroviraux. Ceci est possible en trace-moins excision du codage de transposon intégré pour la reprogrammation facteurs suite à une nouvelle expression transitoire de la transposase dans les cellules iPS 33. Étant donné que le PB est efficace dans différents types de cellules 34, 35, 36, 37, est plus approprié pour une approche clinique en ce qui concerne les vecteurs viraux, et permet la production de cellules iPS libre xéno-contrairement aux protocoles de production viraux actuels qui utilisent des xénobiotiques conditions, ce système est utilisé pour obtenir des cellules iPS à partir AF murin.
Ici , nous proposons un protocole détaillé qui suit les travaux déjà publiés pour montrer la production de iPS pluripotentes clones à partir de cellules de souris AF (cellules iPS-AF) 38.
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Protocol
Toutes les procédures étaient conformes à la loi italienne. échantillons murin AF ont été récoltées à partir de souris enceintes à 13,5 jours après le coït (dpc) à partir de C57BL / 6-Tg souris (UBC-GFP) 30Scha / J appelé GFP.
1. transposon production
REMARQUE: transposon des vecteurs d'expression ont été générés en utilisant des procédures de clonage standard. L'ADN plasmidique pour la transfection des cellules de souris AF a été préparé à l'aide de kits commerciaux.
- Mélanger 10 ng d'ADN plasmidique avec 50 ul de bactéries DH5a dans un tube de 1,5 ml. Laisser incuber le microtube sur la glace pendant 20 min.
- Le choc thermique à 42 ° C pendant 40 secondes.
- Placez microtube sur la glace pendant 2 min.
- Ajouter 250 pi de (37 ° C) de bouillon de lysogénie (LB) de bouillon préchauffé. Agiter (300 tours par minute) à 37 ° C pendant 30 min.
- Étaler 30 pi de chaque transformation sur des plaques LB avec 0,1 mg / ml d'ampicilline. Laisser les plaques sécher et incuber inversées à 37 ° C overnight.
- Le lendemain, dans l'après-midi, ramasser 3 colonies, en utilisant stériles 200 conseils ul, de chaque transformation et transfert sur 0,1 mg / ml LB amp.
- Agiter (300 rpm) bactéries pendant une nuit à 37 ° C.
- Pour la purification plasmidique utiliser des kits commerciaux. plasmides de stock à -20 ° C.
2. Souris Embryonic Fibroblast (MEF) Culture
- Revêtement des 6 puits Plaques avec 0,1% Gélatine
- Plaques de manteau sous le capot en ajoutant 1 ml de gélatine à 0,1% stérile à chacun des six puits. Laissez la gélatine polymériser sur l'incubateur (37 ° C) pendant 1 h.
- Jeter l'excès, et sécher les plaques pendant 1 h.
- Utilisez parafilm pour sceller et plaques de magasin à la température ambiante.
- Inactivation du MEF avec mitomycine C
- Décongelez un flacon de 4 x 10 6 cellules MEF utilisant un bain à 37 °.
- Graine MEF dans la hotte sur une boîte de Pétri (150 mm) avec un milieu MEF.
- Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- (ATTENTION) Ajouter mitomycine C (5 mg / ml) lorsque les cellules sont confluentes.
- Placer les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO2) pendant 3 h.
- Éliminer le milieu avec les cellules de la mitomycine C. Laver trois fois avec une solution saline de tampon phosphate 1X (PBS).
- Ajouter 2 ml de cellules de trypsine et de placer dans le commerce 37 ° C incubateur pendant 5 min. Après, ajouter 18 ml de blocage moyen pour arrêter la réaction de la trypsine.
- Compter les cellules à l'aide d'une chambre de Burker selon le protocole du fabricant.
- Centrifuger les cellules à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Seed 60.000 cellules / cm 2 de inactivé MEF sur 0,1% gélatine plaques revêtues.
- Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, avant le semis AF et / ou cellules iPS-AF.
3. Souris AF cellule d'isolement
- Mettre en place des accouplements chronométrés et vérifier plu vaginalegs après 24 h de co-logement.
- Observer jusqu'à 13,5 dpc et sacrifier barrage enceinte par dislocation cervicale.
- Nettoyer la paroi abdominale de l'animal en utilisant 70% d'éthanol.
- En utilisant des ciseaux, réaliser une laparotomie médiane inciser la longueur de la paroi abdominale pour accéder à la cavité abdominale.
- Exposer l'utérus en utilisant une pince. Retirer l'utérus à l'aide de ciseaux et de transfert dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stérile 1x PBS placé sur la glace.
- Utilisez un stéréomicroscope pour recueillir l'AF au grossissement 10X.
- Tenir l'utérus avec une pince et enlever la paroi utérine avec des ciseaux. Faites attention à ne pas endommager les membranes fœtales et une fuite de liquide amniotique conséquente.
- Collecter les fœtus dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stériles 1x PBS et placer sur la glace.
- Saisir le placenta d'un foetus avec une pince fine de point et les placer dans un endroit propre 100 mm boîte de Pétri.
- Retirer le jaune sac en utilisant pince fine de point.
- Après la collecte AF, laver chaque fœtus 1x stérile PBS supplémenté avec du sérum de 1% de veau fœtal (FBS) et de recueillir dans les 15 ml tube conique contenant l'AF.
- Centrifugeuse AF à 145 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant sous le capot et épépiner les cellules AF granulées.
4. Souris AF Culture cellulaire
- Ensemencement des cellules AF souris
- Un jour avant le semis, préparer une gélatine à revêtement plaque de 6 puits 0,1% avec MEF mitomycine C-traitée.
- Après la collecte AF, ensemencer les cellules obtenues à partir d' une amniocentèse (environ 1 x 10 7 cellules obtenues à partir de 6 fœtus) sur le MEF mitotique inactivé en utilisant un milieu de culture AF.
- Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en changeant le milieu tous les deux jours.
- Après 7 jours de culture, transcellules fet AF suivant la procédure décrite ci-dessous.
5. Transfection, iPS-AF cellulaire Génération et culture
REMARQUE: Les cellules AF souris ont été transfectées avec le plasmide transposon PB-tetO2-IRES-OKMS, en liaison avec un plasmide d'expression de la transposase (mPBase) et avec le transactivateur de tetracycline inverse (PB-ACG-rtTA) transposon plasmide. Tous les plasmides ont été fournis par le professeur Andras Nagy 33.
- Mélanger 1 pg de PB-tetO2-IRES-OKMS avec 0,5 pg de mPBase et 0,5 pg de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 pg) dans un tube de 1,5 ml.
- Diluer l'ADN à 100 ul avec du milieu sans sérum (milieu de Eagle modifié par Dulbecco - DMEM).
- Ajouter 8 ul du réactif de transfection (par exemple, FUGENE) (au rapport de l' ADN plasmidique: agent de transfection de 2 ug (ADN) à 8 ul agent de transfection) dans l'ADN contenant 1,5 ml microtube.
- Laisser incuber le mélange réactif / ADN de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.
- Ajouter goutte à goutte 100 ul du mélange réactif de transfection / ADN par puits dans une plaque à 6 puits avec des cellules de souris AF et à distribuer par tourbillonnement doux, avec un volume final de 2 ml / puits. Laisser pendant 24 h.
- Le lendemain, induisent l'expression des facteurs de la Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) en alimentant les cellules avec du milieu frais iPS-AF complété avec 1,5 pg / ml de doxycycline (2 ml de milieu pour chaque puits).
- Nourrir les cellules tous les jours, sans passage, avec un milieu contenant de dox-frais (maintenir les cellules dans des milieux supplémentés avec de la doxycycline jusqu'au point de 5.13).
- Observer les cellules dans les 24 h pour une expression mCherry et quotidiennement pendant la formation de colonies (colonies apparaissent typiquement entre 20 et 30 jours après la transfection).
- Un jour avant la cueillette colonie, préparer une plaque à 96 puits de culture tissulaire avec MEF mitomycine C-traitée.
- Choisissez des colonies isolées dans 50 pi de volume de usinga 200 ul pipette, et de les transférer séquentiellement dans une plaque de 96 puits dans des puits individuels.
- Le lendemain, toutes les colonies se dissocient en cellules individuelles en ajoutant 50 pi de la trypsine commerciale et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C.
- Pipeter haut et bas pour désagréger la colonie.
- Transférer 50 ul de la trypsine contenant la colonie dissociée dans un nouveau puits avec inactivé MEF sur une gélatine de 0,1% revêtu 96 plaques à puits rempli de 100 pi de milieu frais iPS-AF complété avec de la doxycycline.
- Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, répartis dans un puits d'une plaque de 24 puits.
- Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, divisé 1: 2 à deux puits, l'une avec la doxycycline et l'autre sans doxycycline, afin de vérifier si les colonies apparaissent également dans la condition sans doxycycline.
- Continuer à maintenir des clones iPS-AF, doxycycline indépendant, sur inactivé MEF dans le milieu iPS-AF.
- Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, CHAnging moyenne quotidienne.
6. phosphatase alcaline Staining
- Effectuer alcaline phosphatase coloration suivant le protocole du fabricant chaque fois qu'il ya l'apparition de cellules iPS-AF indépendantes doxycycline.
7. immunofluorescence
- Chaque fois qu'il ya l'apparition de doxycycline cellules indépendantes iPS-AF, semences 150.000 cellules / cm2 sur un puits d'une plaque de 24 puits avec inactivé MEF, et faire croître les cellules pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- (ATTENTION) Fixer les cellules en ajoutant 300 ul par puits de 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 300 ul de 0,1% NP-40 cellules pour perméabiliser.
- Rinçage des cellules avec 300 pi de 0,1% de PBS-Tween 20.
- Ajouter 300 pi de tampon de blocage (sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
- Utilisez les anticorps primaires suivants: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) et SSEA1 (1:80). Diluer SSEA1 avec 1% d'albumine de sérum bovin (BSA), 10% de sérum de chèvre normal, 0,3 M de glycine à 0,1% de PBS-Tween-20. Diluer tous les autres anticorps avec 10% de sérum de cheval dans du PBS 1x.
- Incuber anticorps nuit à 4 ° C.
- Rincer avec 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20.
- Utiliser les anticorps secondaires dilués dans du sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS: chèvre Alexa594 conjugué IgG anti-souris (1: 200), l'IgG de poulet anti-chèvre Alexa594 conjugué (1: 200), le poulet anti-lapin Alexa594 conjugué IgG (1: 200), de chèvre conjugué à Alexa568-IgM anti-souris (1: 200). Incuber pendant 2 heures à la température ambiante.
- Rincer avec PBS 1x.
- noyaux de taches avec une solution Hoechst (1: 10,000) dans PBS 1x.
8. In Vitro Différenciation Cellulaire
- Pour former suspendus goutte corps embryoïdes (EbS), cultiver simples gouttes (2.000 cellules / 20 ul) sur le couvercle de boîtes de Pétri, en utilisant le moyen de différenciation.
- Incuber les plats à 37 ° Cet 5% de CO 2 pendant 4 jours.
- Transférer EB 100 mm dans des plats de qualité bactérienne dans la culture en suspension pendant 3 jours dans un milieu de différenciation.
- EBs des plaques à 24 puits dans des plaques revêtues de la matrice de membrane basale (dilué à 1:10 dans du DMEM) pendant 14 jours.
- Pour les analyses immunofluorescence, utiliser des anticorps primaires: T (1: 100), αfp (1: 200) et Tubb3 (1: 500) 37.
Formation 9. In Vivo Teratoma
- Injecter 100 ul de 1 x PBS contenant 1 x 10 6 cellules iPS-AF dans le muscle de la patte arrière de RAG2 - / - - / - Yc souris.
- Sacrifiez les souris par dislocation cervicale 6 semaines après l'injection de cellules.
- Retirer les masses tumorales, qui se distinguent par leur taille, à partir de la patte arrière de la souris pour les analyses suivantes.
- Couper 7-10 um d'épaisseur des sections transversales de la tumeur en isopentane congelé à l'aide d'un cryostat.
- Pour Hématoxyline uned éosine (HE) Tache:
- Colorer avec HE pour évaluer la composition de tissu tumoral, en suivant le protocole du fabricant.
- Pour Stain immunoperoxydase:
- Fixer les sections de tératome avec 4% de PFA pendant 15 min à température ambiante.
- Perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100.
- Laisser incuber avec les anticorps suivants: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) et αSMA (1: 100) dilué dans 1% de BSA dans PBS 1x. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C (pour Tubb3) ou une nuit à 4 ° C (pour les autres anticorps).
- peroxydase de bloc à l'aide de méthanol à 100% pendant 20 minutes.
- Incuber pendant 45 min à 37 ° C avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (1: 150) anti-souris.
- Rincer avec PBS 1x.
- Incuber avec de la peroxydase (HRP) substrat (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min.
- Rincer à l'eau du robinet pendant 5 min.
- Colorer avec Hématoxyline QS pendant 9 sec.
- Rincer à l'eau du robinet. 10. Extraction de l'ARN à partir de cellules
- Utiliser un kit d'extraction d'ARN du commerce, selon le protocole recommandé par le fabricant.
- Homogénéiser le tératome aide d'un pilon et d'azote mortier et liquide pour éviter la décongélation de l'échantillon.
- Peser 25 mg de tissu.
- Ajouter 1 mL de réactif commercial pour l'extraction de l'ARN et 200 pi de chloroforme.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 15 min.
- Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube.
- Pour purifier l'ARN utilise un kit d'extraction d'ARN du commerce, selon le protocole du fabricant.
- Synthétiser le premier brin d'ADNc en utilisant une transcriptase inverse pour la transcription inverse (RT) réaction en chaîne de -polymerase (PCR) et oligo (dT) according le protocole du fabricant, pour obtenir 50 ng / ul d'ADNc. Diluer ADNc avec de l'eau sans RNase à une concentration de 10 ng / ul.
- Effectuer une RT-PCR en utilisant la polymerase d'ADN selon le protocole du fabricant, en utilisant 1 ng / pl d'ADNc.
11. Extraction de l'ARN à partir de Teratoma
12. Transcription inverse-polymérase Analyse Chain Reaction
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Representative Results
Pour évaluer la capacité de reprogrammation, les cellules AF souris ont été prélevés sur des foetus de souris GFP. Les cellules ont été transfectées avec le plasmide transposon circulaire PB-tetO2-IRES-OKMS, qui exprime les facteurs Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc et Klf4) liés à la protéine fluorescente mCherry d'une manière doxycycline inductible, et inverse la tetracycline transactivateur (PB- ACG rtTA) plasmides conjointement avec le plasmide d'expression de la transposase (mPBase). Cellules AF souris ont été transfectées avec Oct4, Klf4, cMyc et Sox2 après 1 semaine d'expansion in vitro sur une couche nourricière MEF. Pour l'expression des facteurs exogènes, la doxycycline a été ajouté au lendemain de la transfection à une concentration de 1,5 pg / ml, 39 comme décrit précédemment. L'expression de la mCherry était visible après 24 h de l'addition de doxycycline, indiquant la transfection. Les premières colonies avec une morphologie ES-like sont apparus 20 jours après doxinduction ycycline et ont été prélevés 30 jours après la transfection. Ces colonies ont été inoculées sur des couches nourricières de fibroblastes inactivés. Après la cueillette, les clones survivants ont été maintenus dans un milieu supplémenté avec de la doxycycline pour certains passages jusqu'à jugée doxycycline indépendante dans les puits répliqués 33.
Les clones de souris iPS-AF ont été évaluées pour différents paramètres: l'expression mCherry alcaline coloration à la phosphatase, l'expression des protéines des marqueurs de la pluripotence Oct4, Sox2, Klf4, Nanog et SSEA1, l'expression des gènes de pluripotence exogènes et endogènes (Oct4, Klf4, cMyc et Sox2) , in vitro (EbS) et in vivo (test de tératome) différenciation. Ils ont accompli tous les critères évalués pour valider leur pluripotence, comme le résume le Figure 1.
Figure 1: Reprogrammation de la souris AF GFP + cellules. (A) Doxycycline colonies indépendantes de iPS-AF cellules GFP + ont été négatifs pour l'expression de mCherry et positif pour la coloration de la phosphatase alcaline (ALP). Les barres d'échelle = 250 um et 100 um. (B) images représentatifs de cellules iPS-AF doxycycline indépendante stables GFP + exprimant Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 et SSEA1. Barre d'échelle = 100 um. (C) Analyse par RT-PCR pour l'expression exogène (amorces à base de vecteurs, Tg) et les gènes endogènes (Oct4, Klf4, et cMyc Sox2). Beta-2-microglobuline (B2M) a été considéré comme un gène de ménage. des lignées de cellules reprogrammées ont été cultivées en présence (+) ou absence (-) (96 h) de la doxycycline. R1 cellules ES ont été utilisées comme témoin. (Panneau PCR a été modifié depuis Bertin et al. 38 (D) d'aspect brut de tératome obtenu 6 semaines après l'injection de iPS-AF cellules GFP + dans les membres postérieurs de Rag2 - / - Yc - / - souris. (E) histologie Teratoma et la différenciation des cellules immunocoloration confirmé dans les trois couches germinales (ectoderme, le mésoderme et l' endoderme). αfetoprotein (Afp, endoderme), αsmooth actine musculaire (αSMA, mésoderme), et β3 tubuline (Tubb3, ectoderme) ont été détectés dans des masses tumorales. Barre d'échelle = 100 um. (F) Analyse RT-PCR de ballasts électroniques et tératome (Te). C +, contrôle positif; NTC, le contrôle non-template. Vimentine (Vim, mésoderme), αfetoprotein (Afp, endoderme) et β3 tubuline (Tubb3, ectoderme). (Panneau PCR a été modifié de la référence 38). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de thest la figure.
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Discussion
La méthode choisie pour obtenir l'induction de la pluripotence est pertinente pour la sécurité clinique cellule par rapport à la greffe à long terme. De nos jours, il existe plusieurs méthodes appropriées pour la reprogrammation. Parmi les méthodes non-intégration, le viral (SeV) vecteur Sendai est un virus à ARN qui peut produire de grandes quantités de protéines sans intégrer dans le noyau des cellules infectées 40 et pourrait être une stratégie pour obtenir des cellules iPS. vecteurs SeV pourrait être un candidat intéressant pour la génération de cellules translationnelle grade iPS, mais il présente quelques lacunes. La réplicase virale est sensible à la nature des séquences transgéniques. Depuis des vecteurs SeV répliquent constitutivement, ils peuvent être difficiles à éliminer des cellules hôtes, même si différentes stratégies sont utilisées pour améliorer cet aspect 41, 42. Il nécessite un traitement spécial, comme une enceinte de sécurité biologique de niveau 2. Il is un seul fournisseur disponible dans le commerce. Il y a un manque actuel de SeV de qualité clinique pour la reprogrammation et il y a des coûts élevés de production de cellules iPS.
En raison de ces aspects, le système de transposon peut être considéré comme une meilleure approche en ce qui concerne les vecteurs Sev, et ici nous établir que ce système est un procédé approprié pour la reprogrammation de cellules AF souris avec divers avantages. Il permet la production de cellules iPS xenofree contraires aux protocoles de production virales actuelles qui utilisent des conditions xénobiotiques. Il n'a pas de barrière des espèces apparente et a une capacité de chargement d'un transgène plus grand que les virus. Il permet la livraison simple et sûre de transposons plasmidiques par l'utilisation de la méthode de transfection de cellules standard, qui peut être facilement effectuée dans chaque laboratoire équipé d'une enceinte de sécurité biologique de niveau 1. Transposase ré-expression permet la suppression d'éléments de PB avec la génération conséquente de cellules de souris et iPS humaines sans empreinte, comme l'a démontré dans divers CElignes ll 32, 34, 35. Différentes études ont montré que les systèmes de transposons présentent une fréquence plus basse dans le ciblage de gènes à proximité liés au cancer et moins de biais dans le ciblage de gènes actifs par rapport aux vecteurs viraux à base de 43, 44, 45, 46, 47. Reprogrammant sur la base de transposons dépend de la méthode d'administration choisie, ce qui est une limitation en raison de la résistance ou de la toxicité liée à des procédés de transfection d'ADN (lipofection, l'électroporation ou nucléofection). Ici, nous avons utilisé une formulation liposomale non conçu pour transfecter l'ADN qui fonctionne bien avec des cellules de souris AF. Si d'autres cellules sont utilisées, les tests seront nécessaires pour utiliser la meilleure méthode de livraison en termes de rendement élevé et une faible toxicité. Sommairement, le procédé transposon PB est considéré comme un coffre-fortd faible coût, mais avec une efficacité moindre par rapport aux vecteurs SeV.
En ce qui concerne la procédure pour obtenir des cellules AF de la souris, il est essentiel d'avoir des souris femelles enceintes disponibles. En tant que tel, il est nécessaire de mettre en place un nombre suffisant d'accouplements (au moins six femelles avec deux femelles par mâle).
D'autres expériences pourraient être effectuées spécifiquement sur les cellules AF humaines pour produire des cellules iPS à partir de fœtus sains et malades. Compte tenu de la vaste gamme de maladies congénitales qui peuvent être détectés par le diagnostic prénatal, les cellules obtenues à partir de l'AF pendant la gestation représentent la meilleure source pour obtenir des cellules iPS à la fois l' étude de la maladie 48 et aussi pour la planification d' une approche de la médecine régénératrice en cas de défauts de tissus tels que cardiaque ou le muscle squelettique 49, 50.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
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