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Developmental Biology

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

Eine vorgeburtliche Diagnostik ist ein wichtiges klinisches Werkzeug , um genetische Krankheiten zu bewerten (dh Chromosomenaberrationen, monogenetische oder polygenetische / multifaktoriellen Erkrankungen) und angeborene Fehlbildungen (zB Zwerchfellhernie, zystische Lungenläsionen, Exomphalos, gastroschisis). Nachwasser (AF) Zellen sind einfach von routinemäßig geplanten Prozeduren während des zweiten Trimesters der Schwangerschaft (dh Amniozentese und amnioreduction) oder Kaiserschnitte 1, 2 zu erhalten. Die Verfügbarkeit von AF - Zellen aus der pränatalen oder Neugeborenen Patienten bietet die Möglichkeit , diese Quelle für die regenerative Medizin und mehrere Forscher untersuchten die Möglichkeit , verschiedene Gewebeschäden oder Krankheiten zu behandeln , um eine Stammzellpopulation mit getrennt von AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Die Möglichkeit, leicht AF-Zellen aus erkrankten Patienten erhalten wird, in einem Zeitfenster, in dem die Krankheit oft stationär ist, öffnet den Weg für die Idee der Verwendung dieser Zellquelle für eine Neuprogrammierung Zwecke. Tatsächlich induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus AF - Zellen abgeleiteten Zellen könnten für in vitro Drogentests oder für das Tissue Engineering Ansätze in den Zellen von Interesse unterschieden werden, um eine ausreichende patientenspezifischen Therapie vor der Geburt vorzubereiten. Viele Studien haben bereits die Fähigkeit der AF - Zellen nachgewiesen , in einem weiten Bereich von Zelltypen 13, 14, 15, 16, 17 und umprogrammiert zu unterscheiden </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Seit der Entdeckung von Takahashi und Yamanaka 28 reprogrammierter somatischen Zellen durch die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) wurden Fortschritte auf dem Gebiet der Reprogrammierung gemacht. die verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung, können wir zwischen viralen und nicht-viralen Methoden unterscheiden. Die erste erwartet, dass die Verwendung von viralen Vektoren (Retroviren und Lentiviren), die einen hohen Wirkungsgrad besitzen, aber in der Regel unvollständige silencing des retroviralen Transgen, sowohl mit der Folge einer teilweise umprogrammiert Zelllinie und das Risiko vonInsertionsmutagenese 29, 30, 31. Die nicht-virale Verfahren verwendet verschiedene Strategien: dh Plasmide, Vektoren, mRNA, Protein, Transposons. Die Ableitung von iPS-Zellen frei von transgenen Sequenzen zielt darauf ab, die potenziell schädlichen Auswirkungen von undichten Transgen-Expression und Insertionsmutagenese zu umgehen. Unter all den oben genannten nicht-viralen Strategien, die PiggyBac (PB) Transposon / Transposase System benötigt nur die invertierten terminalen Wiederholungen ein Transgen und eine transiente Expression der Transposase - Enzym flankieren 32 Insertion oder Exzision Ereignisse zu katalysieren. Der Vorteil in Transposons gegenüber anderen Verfahren für iPS Zellgeneration Verwendung ist die Möglichkeit des Erhalts vektorfreien iPS-Zellen mit einem nicht-viralen Vektor Ansatz, der die gleiche Effizienz von retroviralen Vektoren zeigt. Dies ist möglich durch die Spur-less Exzision des integrierten Transposons Codierung für die reprogramming Faktoren nach einer neuen transiente Expression der Transposase in den iPS - Zellen 33. Da PB in verschiedenen Zelltypen effizient 34, 35, 36, 37, ist besser geeignet für einen klinischen Ansatz bezüglich viraler Vektoren und erlaubt die Herstellung von xeno freien iPS - Zellen im Gegensatz zu derzeitigen Protokolle virale Produktion , die xenobiotischen verwenden Bedingungen wird dieses System verwendet iPS-Zellen aus Maus-AF zu erhalten.

Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll folgende bereits veröffentlichten Arbeiten die Herstellung von pluripotenten iPS - Klone zu zeigen , von der Maus AF - Zellen (iPS-AF - Zellen) 38.

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Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem italienischen Gesetz. Murine AF-Proben wurden von schwangeren Mäusen bei 13,5 Tage nach coitum (DPC) von C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-Mäuse genannt GFP geerntet.

1. Transposon Produktion

HINWEIS: Transposon-Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren erzeugt. Die Plasmid-DNA für Maus AF-Zellen Transfektion wurde mit kommerziellen Kits bereit.

  1. Mischungs 10 ng der Plasmid-DNA mit 50 ul DH5a Bakterien in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 20 min.
  2. Hitzeschock bei 42 ° C für 40 sec.
  3. Legen Sie Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 2 min.
  4. Nach Eintragen von 250 & mgr; l vorgewärmtes (37 ° C) LB-Medium (LB) Brühe. Schütteln (300 rpm) bei 37 ° C für 30 min.
  5. Verbreiten 30 ul jeder Transformation auf LB-Platten mit 0,1 mg / ml Ampicillin. Platten erlauben zu trocknen und inkubieren bei 37 ° C ov invertierternight.
  6. Am nächsten Tag, am Nachmittag, Pick 3 Kolonien mit sterilen 200 ul-Tipps, von jeder Transformation und Übertragung auf 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Schütteln (300 rpm) Bakterien über Nacht bei 37 ° C.
  8. Für Plasmidaufreinigung kommerzielle Kits verwenden. Stock Plasmiden bei -20 ° C.

2. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Kultur

  1. Die Beschichtung der 6-Well - Platten mit 0,1% Gelatine
    1. Coat Platten unter der Haube Zugabe von 1 ml steriler 0,1% Gelatine auf jede der sechs Bohrungen. Lassen Sie die Gelatine auf dem Inkubator (37 ° C) für 1 h polymerisieren.
    2. Entsorgen Sie das überschüssige, und trocknen Sie die Platten für 1 Stunde.
    3. Verwenden Parafilm abgedichtet und Speicherplatten bei Raumtemperatur.
  2. Die Inaktivierung von MEF mit Mitomycin C
    1. Tauen Sie ein Fläschchen mit 4 x 10 6 MEF - Zellen ein 37 ° C - Bad verwenden.
    2. Seed MEF in der Haube auf einer Petrischale (150 mm) mit MEF Medium.
    3. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2.
    4. (Vorsicht) hinzufügen Mitomycin C (5 mg / ml), wenn die Zellen konfluent sind.
    5. Ortszellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für 3 h.
    6. Entfernen Mittel mit Mitomycin C. Wasche die Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    7. 2 ml der kommerziellen Trypsin und Ortszellen in das 37 ° C-Inkubator für 5 min. Nach dem Fügen Sie 18 ml Medium der Blockierung der Trypsin Reaktion zu stoppen.
    8. Zähle die Zellen mit einem Burker-Kammer unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
    9. Zentrifuge Zellen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen.
    10. Seed 60.000 Zellen / cm 2 von inaktivierten MEF auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten.
    11. Kultivieren Zellen für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2, vor der Aussaat AF und / oder iPS-AF - Zellen.

3. Maus AF Zellisolierung

  1. Richten Sie timed Paarungen und prüfen vaginale plugs nach 24 h co-Gehäuse.
  2. Beachten Sie, bis 13,5 dpc und Opfer schwanger Damm durch Genickbruch.
  3. Reinigen Sie die Bauchdecke des Tieres unter Verwendung von 70% igem Ethanol.
  4. Mit einer Schere, führen Sie eine Mittellinie Laparotomie die Länge der Bauchdecke Einschneiden Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen.
  5. Setzen Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Gebärmutter Schere und Transfer in eine 100 mm Petrischale mit gefüllt mit sterilem 1x PBS auf Eis gestellt.
  6. Verwenden Sie ein Stereomikroskop die AF bei 10-facher Vergrößerung zu sammeln.
  7. Halten Sie die Gebärmutter mit einer Zange und entfernen Sie die Gebärmutterwand mit einer Schere. Seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung der fötalen Membranen und damit Fruchtwasser Leckage zu vermeiden.
  8. Sammeln Sie Föten in eine 100 mm Petrischale gefüllt mit sterilem 1x PBS und auf Eis.
  9. Fassen Sie die Plazenta eines Fötus mit einer feinen Spitze Zange und in einem sauberen 100 mm Petrischale.
  10. Entfernen Sie den Dottersack feinen Spitze einer Pinzette.
  11. Nach AF Sammlung, wasche jeden Fetus mit sterilem 1x PBS, ergänzt mit 1% fötalem Rinderserum (FBS) und zu sammeln in die 15 ml konischen Röhrchen die AF enthält.
  12. Zentrifuge AF bei 145 xg für 5 min. Entfernen Sie den Überstand unter der Haube und das Seeding von pelletierten AF-Zellen.

4. Maus AF Zellkultur

  1. Seeding von Maus - AF - Zellen
    1. Einen Tag vor der Aussaat vorbereiten eine 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platte mit Mitomycin C-behandelten MEF.
    2. Nach dem AF - Sammlung, Samen , die von einer Amniozentese gewonnenen Zellen auf die mitotisch inaktivierten MEF unter Verwendung von AF - Kulturmedium (etwa 1 x 10 7 Zellen aus 6 Föten gewonnen).
    3. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, Ändern des Mediums jeden zweiten Tag.
    4. Nach 7 Tagen Kultur, transfekt AF-Zellen nach dem unten beschriebenen Verfahren.

5. Transfektion, iPS-AF Zellgeneration und Kultur

HINWEIS: Mouse AF-Zellen wurden mit dem PB-tetO2-IRES-OKMS Transposon-Plasmid transfiziert, in Verbindung mit einem Transposase-Expressionsplasmid (mPBase) und mit dem Rückwärts Tetracyclin-Transaktivator (PB-CAG-rtTA) Transposon-Plasmid. Alle Plasmide wurden von Professor Andras Nagy 33 zur Verfügung gestellt.

  1. Mix 1 & mgr; g PB-tetO2-IRES-OKMS mit 0,5 ug mPBase und 0,5 & mgr; g PB-CAG-rtTA (Gesamt DNA: 2 & mgr; g) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Verdünne die DNA auf 100 & mgr; l mit serumfreiem Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium - DMEM).
  3. Aus 8 & mgr; l des Transfektionsreagenz (zB Fugene) (im Verhältnis von Plasmid - DNA: Transfektionsmittel von 2 & mgr; g (DNA) bis 8 & mgr; l Transfektionsmittel) in die 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen , das DNA.
  4. Inkubieren Transfektionsreagenz / DNA Gemisch 15 min bei Raumtemperatur.
  5. Tropfenweise 100 ul des Transfektionsreagenz / DNA-Gemisch pro Vertiefung einer 6-Well-Platte mit AF-Zellen der Maus und verteilen leicht schwenken, mit einem Gesamtvolumen von 2 ml / Vertiefung. Lassen Sie für 24 Stunden.
  6. Am Tag danach induzieren die Expression des Yamanaka Faktoren (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2), indem die Zellen mit frischem iPS-AF-Medium mit 1,5 ug / ml Doxycyclin (2 ml Medium für jede Vertiefung) ergänzt Fütterung.
  7. Feed-Zellen jeden Tag, ohne Durchgang, mit frischen Dox-haltiges Medium (halten Zellen in Medien, ergänzt mit Doxycyclin, bis der Punkt 5.13).
  8. Beobachten Zellen innerhalb von 24 h für mCherry Expression und täglich für die Koloniebildung (Kolonien erscheinen typischerweise zwischen 20 und 30 Tage nach der Transfektion).
  9. Einen Tag vor der Kolonie Kommissionierung, bereiten eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit Mitomycin C-behandelten MEF.
  10. Wählen Sie einzelne Kolonien in 50 ul Volumen usinga 200 ul Pipette, und übertragen sie nacheinander in eine 96-Well-Platte in den einzelnen Vertiefungen.
  11. Am Tag nach distanzieren jede Kolonie in einzelne Zellen von 50 & mgr; l des kommerziellen Trypsin Zugabe und für 5 min bei 37 ° C inkubiert.
  12. Pipette nach oben und unten die Kolonie aufzuschlüsseln.
  13. Transfer 50 ul des Trypsins das dissoziierte Kolonie in eine neue gut mit inaktivierten MEF auf einem 0,1% Gelatine 96 Well-Platte mit 100 & mgr; l frischem iPS-AF-Medium, ergänzt mit Doxycyclin gefüllt beschichtet enthält.
  14. Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, aufgeteilt in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
  15. Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, geteilt 1: 2 bis zwei Brunnen, eine mit Doxycyclin und das andere ohne Doxycyclin, um zu überprüfen, ob Kolonien auch in dem Zustand ohne Doxycyclin erscheinen.
  16. Weiter iPS-AF-Klone zu erhalten, Doxycyclin unabhängig, auf inaktivierten MEF in der iPS-AF Medium.
  17. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, CHtäglich Anging Medium.

6. Alkalische Phosphatase-Färbung

  1. Führen alkalischen Phosphatase-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers, wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF-Zellen ist.

7. Immunofluoreszenz

  1. Immer , wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF - Zellen, 150.000 Zellen / cm 2 auf eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit inaktivierten MEF Samen und wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. (Vorsicht) Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 300 & mgr; l pro Vertiefung von 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Hinzufügen von 300 ul 0,1% NP-40-Zellen zu permeabilisieren.
  4. Spülen Sie die Zellen mit 300 ul 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Hinzufügen von 300 & mgr; l Blockierungspuffer (10% Pferdeserum in 1x PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  6. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) und SSEA1 (1:80). Verdünnte SSEA1 mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,3 M Glycin in 0,1% PBS-Tween-20. Verdünne alle anderen Antikörper mit 10% Pferdeserum in 1x PBS.
  7. Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
  8. Spülen Sie mit 300 ul 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Verwenden Sie die Sekundär in 10% Pferdeserum verdünnt Antikörper in 1x PBS: Alexa594-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Ziege IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Kaninchen-IgG (1: 200), Alexa568-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgM (1: 200). Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
  10. Spülen Sie mit 1x PBS.
  11. Stain Kerne mit Hoechst-Lösung (1: 10.000) in 1x PBS.

8. In - vitro - Zelldifferenzierung

  1. hängenden Tropfen Embryoidkörpern (EVG) zu bilden, einzelne Tropfen (2000 Zellen / 20 ul) auf den Deckel der Petrischalen, mit dem Differenzierungsmedium kultivieren.
  2. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° Cund 5% CO 2 für 4 Tage.
  3. Übertragen EBs in 100 mm Bakterien-Grade-Gerichte in der Suspensionskultur für 3 Tage in Differenzierungsmedium.
  4. Platte EBs in 24-Well-Platten mit Basalmembranmatrix beschichtet (1:10 verdünnt in DMEM) für weitere 14 Tage.
  5. Für die Immunfluoreszenzanalysen verwenden primäre Antikörper: T (1: 100), αfp (1: 200) und Tubb3 (1: 500) 37.

9. In Vivo Teratoma Formation

  1. Injizieren von 100 & mgr; l 1x PBS , enthaltend 1 x 10 6 iPS-AF - Zellen in den Muskel der Hinterlauf von Rag2 - / - yc - / - Mäusen.
  2. Sacrifice Mäuse durch Genickbruch 6 Wochen nach der Zellinjektion.
  3. Entfernen Sie die Tumormassen, die sich durch ihre Größe von der hinteren Gliedmaßen der Mäuse für die folgenden Analysen.
  4. Schneiden Sie 7-10 um dicke Querschnitte des Isopentan gefrorenen Tumor unter Verwendung eines Kryostats.
  5. Für Hämatoxylin eind Eosin (HE) Stain:
    1. Fleck mit HE das Tumorgewebe Zusammensetzung zu bewerten, nach dem Protokoll des Herstellers.
  6. Für Immunperoxidase Stain:
    1. Fix Teratom Abschnitte mit 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur.
    2. Permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100.
  7. Inkubieren mit den folgenden Antikörpern: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) und αSMA (1: 100) in 1x PBS in 1% BSA verdünnt. Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C (für Tubb3) oder über Nacht bei 4 ° C (für die anderen Antikörper).
  8. Block-Peroxidase unter Verwendung von 100% Methanol für 20 min.
  9. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C mit sekundären Antikörper anti-Maus-HRP-konjugiertem (1: 150).
  10. Spülen Sie mit 1x PBS.
  11. Inkubieren mit Peroxidase (HRP) -Substrat (siehe Materialien Table) für 5 min.
  12. Spülen mit Leitungswasser für 5 min.
  13. Fleck mit Hämatoxylin QS für 9 Sek.
  14. Spülen mit Leitungswasser.
    15. 10. RNA-Extraktion aus Zellen

    1. Verwenden Sie einen kommerziellen RNA-Extraktions-Kits gemäß der empfohlenen Protokoll des Herstellers.

    11. RNA-Extraktion aus Teratoma

    1. Homogenisieren teratoma einen Stößel und Mörser und flüssigem Stickstoff unter Verwendung der Probe zu vermeiden Auftauen.
    2. Wiegen 25 mg Gewebe.
    3. 1 ml handelsüblicher Reagenzien zur RNA-Extraktion und 200 & mgr; l Chloroform.
    4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
    5. Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 15 min.
    6. Übertragung der geklärte Überstand in ein neues Röhrchen.
    7. Zur Reinigung verwenden Sie die RNA eine kommerzielle RNA-Extraktions-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers.

    12. Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion-Analyse

    1. Synthetisieren der Erststrang-cDNA, die eine reverse Transkriptase für die reverse Transkription (RT) -Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Oligo (dT) unter Verwendung according dem Protokoll des Herstellers, 50 ng / & mgr; l cDNA zu erhalten. Verdünnte cDNA mit RNase-freiem Wasser bei einer Konzentration von 10 ng / & mgr; l.
    2. Führen RT-PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll unter Verwendung von 1 ng / & mgr; l cDNA.

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Representative Results

Zur Auswertung wurden die Kapazität der Reprogrammierung, Maus AF-Zellen aus Föten von GFP-Mäusen gesammelt. Zellen wurden mit dem kreisförmigen Transposon-Plasmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfiziert, die die Yamanaka Faktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) drückt auf die mCherry fluoreszierendes Protein gebunden in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise und Tetracyclin-Transaktivator-reverse (PB- CAG-rtTA) Plasmide zusammen mit dem Transposaseexpression Plasmid (mPBase). Maus - AF - Zellen wurden mit Oct4, Klf4, cMyc und Sox2 nach 1 Woche in vitro - Expansion über einen MEF Feeder - Schicht transfiziert. Für die Expression der exogenen Faktoren wurde Doxycyclin am Tag nach der Transfektion mit einer Konzentration von 1,5 ug / ml, zugegeben , wie zuvor beschrieben 39. Die Expression des mCherry sichtbar war nach 24 h aus dem Doxycyclin hinaus anzeigt Transfektion. Die ersten Kolonien mit einem ES-ähnliche Morphologie erschien 20 Tage nach Doxycycline Induktion und wurden 30 Tage nach der Transfektion geerntet. Diese Kolonien wurden auf inaktivierten Fibroblasten-Feeder-Schichten ausgesät. Nach der Kommissionierung wurden die überlebenden Klone in Medium mit Doxycyclin für einige Passagen ergänzt gehalten , bis Doxycyclin unabhängige 33 in replizierten Brunnen erwiesen.

Maus iPS-AF-Klone wurden für verschiedene Parameter ausgewertet: mCherry Ausdruck, alkalische Phosphatase-Färbung, die Proteinexpression der Pluripotenz Marker Oct4, Sox2, Klf4, Nanog und SSEA1, Expression von exogenen und endogenen Pluripotenz-Gene (Oct4, Klf4, cMyc und Sox2) , in vitro (EVG) und in vivo (Teratom - Assay) Differenzierung. Sie erfüllt alle Kriterien bewertet , um ihre Pluripotenz zu validieren, wie 1 in der Abbildung zusammengefasst.

Abbildung 1
Abbildung 1: Reprogrammierung von Maus AF GFP + Zellen. (A) Doxycyclin unabhängige Kolonien von iPS-AF GFP + Zellen waren negativ für die Expression von mCherry und positiv für die alkalische Phosphatase (ALP) Färbung. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m und 100 & mgr; m. (B) Repräsentative Bilder von stabilen Doxycyclin unabhängigen iPS-AF GFP + Zellen exprimieren Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 und SSEA1. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (C) RT-PCR - Analyse für die Expression exogener (vektorbasierte Grundierungen, Tg) und endogenes (Oct4, Klf4, cMyc und Sox2) -Gene. Beta-2-Mikroglobulin (B2M) wurde als Housekeeping - Gen betrachtet. (-) (96 h) von Doxycyclin umprogrammiert Zelllinien wurden in Gegenwart (+) oder Abwesenheit gezüchtet. R1 ES-Zellen wurden als Kontrolle verwendet. (PCR - Panel wurde von Bertin et al modifiziert worden ist . 38 (D) Brutto Auftreten von teratoma erhalten 6 Wochen nach der Injektion von iPS-AF GFP + Zellen in die Hinterbeine von Rag2 - / - yc - / - Maus. (E) Teratoma Histologie und Immunfärbung bestätigt Zelldifferenzierung in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm). αfetoprotein (AFP-, Endoderm), αsmooth Muskelactin (αSMA, Mesoderm) und β3 Tubulin (Tubb3, Ektoderm) wurden in Tumormassen erfasst. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (F) RT-PCR - Analyse von EBs und Teratom (Te). C +, positive Kontrolle; NTC, Nicht-Template-Steuerung. Vimentin (Vim, Mesoderm), αfetoprotein (AFP-, Entoderm) und β3 Tubulin (Tubb3, Ektoderm). (PCR - Panel wurde von Referenz 38 modifiziert). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen thFigur.

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Discussion

Die gewählte Methode, die Induktion von Pluripotenz zu erhalten, ist relevant für die Zell klinische Sicherheit in Bezug auf langfristige Transplantation. Heutzutage gibt es mehrere Verfahren geeignet für die Umprogrammierung. Unter den nicht-integrative Verfahren wird die virale Sendai (SeV) Vektor ist ein RNA - Virus , das große Mengen an Protein 40 ohne die Integration in den Zellkern der infizierten Zellen produzieren kann und könnte eine Strategie sein , um iPS - Zellen erhalten. SeV-Vektoren könnte ein attraktiver Kandidat für die Erzeugung von Translations-grade iPS Zellen sein, aber es weist einige Mängel auf. Die virale Replikase ist empfindlich gegenüber der Art der transgenen Sequenzen. Da SeV Vektoren konstitutiv replizieren, können sie schwierig sein , aus den Wirtszellen zu eliminieren, auch wenn verschiedene Strategien verwendet werden , diesen Aspekt 41, 42 zu verbessern. Sie erfordert eine spezielle Handhabung, wie beispielsweise eine Stufe 2 biologischen Sicherheitsschrank. Da ichgibt nur einen kommerziellen Anbieter zur Verfügung. Es gibt einen aktuellen Mangel an klinisch-Grad SeV für eine Neuprogrammierung und es gibt hohe Kosten von iPS-Zellproduktion.

Aufgrund dieser Aspekte kann das Transposon-System ein besserer Ansatz bezüglich SeV Vektoren betrachtet werden, und hier stellen wir, dass dieses System zum Umprogrammieren Maus AF-Zellen mit verschiedenen Vorteilen eine geeignete Methode ist. Es ermöglicht die Herstellung von xenofree iPS-Zellen im Gegensatz zu aktuellen viralen Produktionsprotokolle, die xenobiotic Bedingungen. Es hat keine offensichtliche Speziesbarriere und hat ein Transgen Frachtkapazität größer als Viren. Es ermöglicht eine einfache und sichere Lieferung von Plasmid Transposons durch die Verwendung von Standard-Zell-Transfektionsverfahren, die sich leicht in jedem Labor mit einem Level 1 biologischen Sicherheitsschrank ausgestattet durchgeführt werden kann. Transposase Wieder-Expression ermöglicht die Entfernung von PB-Elemente mit daraus folgenden Erzeugung von Fußabdruck freie Maus und Mensch iPS-Zellen, wie sie in verschiedenen ce demonstriertll Leitungen 32, 34, 35. Verschiedene Studien haben gezeigt , dass das Transposon in Systemen Targeting nahe Krebs in Zusammenhang stehenden Genen und weniger Verzerrung in aktive Gene Targeting Vergleich zu viral-basierenden Vektoren 43, 44, 45, 46, 47 eine niedrigere Frequenz anzuzeigen. Umprogrammierung basierend auf Transposons abhängig von der Liefermethode ausgewählt, und dies ist eine Begrenzung durch den Widerstand oder die Toxizität im Zusammenhang mit DNA-Transfektionsverfahren (Lipofektion, Elektroporation oder Nukleofektion). Hier haben wir eine nicht-liposomale Formulierung entwickelt, DNA zu transfizieren, die gut mit der Maus AF-Zellen gearbeitet. Wenn andere Zellen verwendet werden, werden Tests erforderlich sein, die beste Methode im Hinblick auf die hohe Effizienz und niedrige Toxizität zu verwenden. Summarisch wird die PB Transposon Methode, um sicher ein betrachtetd niedrigen Kosten, aber mit einer geringeren Effizienz im Vergleich zu SeV Vektoren.

Hinsichtlich des Verfahrens Maus AF-Zellen zu erhalten, ist es wichtig, schwangere weibliche Mäuse zur Verfügung zu haben. Als solches ist es erforderlich, eine ausreichende Anzahl von Paarungen einzurichten (mindestens sechs Frauen mit zwei Weibchen pro Männchen).

Weitere Experimente könnten speziell auf die menschliche AF-Zellen durchgeführt werden, um iPS-Zellen von gesunden und kranken Föten produzieren. In Anbetracht der Vielzahl von angeborenen Erkrankungen, die durch die Pränataldiagnostik erkannt werden kann, von der AF während der Schwangerschaft erhaltenen Zellen stellen die beste Quelle iPS - Zellen für beide das Studium der Krankheit 48 und auch für die Planung eines regenerativen Medizin Ansatz im Falle von Gewebedefekten ableiten wie Herz- oder Skelettmuskel 49, 50.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

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References

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Entwicklungsbiologie Heft 120 Nachwasser Zellen induzierte pluripotente Stammzellen PiggyBac Transposon regenerative Medizin Neuprogrammierung Maus.
Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden
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Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

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