Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

אבחון טרום לידתי הוא כלי קליני חשוב להעריך מחלות גנטיות (סטיות כרומוזומליות כלומר, monogenetic או polygenetic / מחל מולטיפקטוריאלית) ו מומים מולדים (כלומר מולד בקע סרעפתי, נגעי ריאות פיברוזיס, exomphalos, gastroschisis). מי שפיר (AF) תאים הם פשוט להשיג מנהלים מתוכננים באופן שגרתי במהלך השליש השני של הריון (כלומר מי שפיר ו amnioreduction) או ניתוחים קיסריים 1, 2. הזמינות של תאי AF מחולים טרום לידתי או בילוד מספק את האפשרות של שימוש מקור זה עבור רפואה רגנרטיבית, וכמה החוקרים בדקו את האפשרות לטיפול נזקים ברקמות שונות או מחלות באמצעות האוכלוסייה בתאי גזע שבודדו 3 AF, 4, 5, 67, 8, 9, 10, 11, 12. האפשרות של קבלה בקלות תאי AF מחולים חולים, בחלון הזמן בו המחלה היא לעתים קרובות נייחת, פותחת את הדרך אל הרעיון של שימוש מקור התא הזה למטרות תכנות מחדש. ואכן, גזע מושר (iPS) תאים שמקורם בתאי AF יכולים להיות מובחנים בתאים של ריבית עבור בדיקות סמים במבחנה או גישות הנדסת רקמות, כדי להכין טיפול למטופל ספציפי נאות לפני הלידה. מחקרים רבים כבר הוכיחו את יכולתם של תאי AF כדי לתכנת מחדש בדיל לתוך מגוון רחב של סוגי תאי 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

מאז גילויו על ידי טקהאשי יאמאנאקה 28 תאים סומטיים לתכנות מחדש דרך הביטוי הכפוי של ארבעה גורמי שעתוק (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4), הושג התקדמות בתחום של תכנות מחדש. בהתחשב בשיטות שונות, אנו יכולים להבחין בין גישות ויראלי ולא ויראלי. הראשון מצפה השימוש של וקטורים ויראליים (רטרווירוסים ו lentiviruses), אשר יש יעילות גבוהה, אך בדרך כלל השתקה שלמה של transgene retroviral, הוא עם התוצאה של שורת תאים לתכנות מחדש באופן חלקי את הסיכוןinsertional mutagenesis 29, 30, 31. השיטה הלא-ויראלי משתמשת באסטרטגיות שונות: פלסמידים כלומר, וקטורים, mRNA, חלבון, transposons. על הגזרה של תאי iPS ללא רצפים מהונדסים שואפת לעקוף את השפעות מזיקי ביטוי transgene דולף mutagenesis insertional. בין כל האסטרטגיות הלא-ויראלי הנ"ל, את PiggyBac (PB) מערכת transposon / transposase דורשת חוזרת מסוף ההפוך רק חובק transgene ו ביטוי חולף של אנזים transposase לזרז אירועי כניסה או כריתה 32. היתרון בשימוש transposons על פני שיטות אחרות לייצור תאי שב"ס הוא האפשרות לקבל תאי iPS ללא וקטור עם גישת וקטור שאינו ויראלי שמראה אותה היעילות של וקטורי retroviral. זה אפשרי על ידי כריתת עקבות-פחות של קידוד transposon המשולב עבור reprogramming גורמים הבאים ביטוי חולף חדש של transposase בתאי שב"ס 33. בהתחשב בכך PB הוא יעיל בסוגי תאים שונים 34, 35, 36, 37, הוא מתאים יותר עבור גישה קלינית ביחס וקטורים ויראליים, ומאפשר את ייצור תאי iPS ללא קסנו בניגוד פרוטוקולי ייצור ויראלי הנוכחיים משתמשות xenobiotic תנאים, מערכת זו משמשת להשיג תאי שב"ס מן בעכברים AF.

כאן אנו מציעים פרוטוקול מפורט לאחר עבודה שכבר פורסם להראות לייצור שיבוטי שב"ס פלוריפוטנטיים מתאי AF עכבר (תאי iPS-AF) 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים היו בהתאם לחוק האיטלקי. דגימות Murine AF נבצרו מעכברים בהריון 13.5 ימים לאחר coitum (DPC) מ C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J עכברים בשם GFP.

1. ייצור transposon

הערה: וקטורי ביטוי transposon נוצרו באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים. ה- DNA פלסמיד עבור transfection בתאי עכבר AF הוכן באמצעות ערכות מסחריות.

  1. מערבבים 10 ng של DNA פלסמיד עם 50 μl של חיידקים DH5α צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. דגירת צינור microcentrifuge על קרח למשך 20 דקות.
  2. הלם חום על 42 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות.
  3. מניחים צינור microcentrifuge על קרח במשך 2 דקות.
  4. הוסף 250 μl של טרום התחמם (37 ° C) lysogeny מרק (LB) מרק. Shake (300 סל"ד) בשעה 37 ° C למשך 30 דקות.
  5. מורחים 30 μl של כל שינוי לצלחות LB עם 0.1 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. אפשר הצלחות להתייבש דגירה הפוכה ב 37 ° C overnight.
  6. למחרת, בשעות אחר הצהריים, לקחת 3 מושבות, באמצעות סטרילי 200 טיפים μl, מכל שינוי ולהעביר על 0.1 מ"ג / אמפר מ"ל LB.
  7. Shake (300 סל"ד) חיידקים לילה בשעה 37 ° C.
  8. עבור טיהור פלסמיד לשימוש ערכות מסחריות. פלסמידים המניה ב -20 ° C.

2. פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תרבות

  1. ציפוי של צלחות 6-היטב עם ג'לטין 0.1%
    1. מעיל צלחות מתחת למכסה המנוע הוספת 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין סטרילי כל אחד מששת בארות. תנו ג'לטין לפלמר על אינקובטור (37 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1.
    2. מחק את העודף, ולייבש את הצלחות במשך שעה 1.
    3. השתמש parafilm לאטום וצלחות ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. איון של MEF עם mitomycin C
    1. להפשיר בקבוקון של 4 x 10 6 תאים MEF באמצעות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס.
    2. זרעי MEF בשכונה על צלחת פטרי (150 מ"מ) עם מדיום MEF.
    3. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    4. (זהירות) הוסף C mitomycin (5 מ"ג / מ"ל) כשתאים ומחוברות.
    5. המקום התאים לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) למשך 3 שעות.
    6. הסר בינוני עם mitomycin ג לשטוף תאים שלוש פעמים עם חיץ מלוחים פוספט 1x (PBS).
    7. הוסף 2 מ"ל של תאים טריפסין ומקום מסחרי לתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות. לאחר, להוסיף 18 מ"ל של חסימת בינוני כדי לעצור את התגובה טריפסין.
    8. ספירת התאים באמצעות תא'שודד גופות' על פי הפרוטוקול של היצרן.
    9. תאי צנטריפוגה ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant.
    10. זרע 60,000 תאים / 2 ס"מ של MEF מומת על צלחות מצופה ג'לטין 0.1%.
    11. טפחו את התאים למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לפני זריעת AF ו / או תאי iPS-AF.

3. בידוד תא עכבר AF

  1. הגדרת הזדווגויות מתוזמן ולבדוק plu הנרתיקgs אחרי 24 שעות של דיור שיתוף.
  2. שימו לב עד 13.5 DPC ולהקריב הסכר בהריון באמצעות פריקה צוואר הרחם.
  3. נקה את דופן הבטן של החיה באמצעות אתנול 70%.
  4. בעזרת מספריים, לבצע פיום בטן קו האמצע חריטה אורך של דופן הבטן כדי לקבל גישה אל תוך חלל הבטן.
  5. לחשוף את הרחם באמצעות מלקחיים. הסר את הרחם באמצעות מספריים ולהעביר לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ מלא סטרילי 1x PBS ממוקם על הקרח.
  6. השתמש stereomicroscope כדי לאסוף את AF בהגדלה 10X.
  7. החזק את הרחם עם מלקחיים ולהסיר את דופן הרחם במספריים. היזהר, כדי למנוע כל נזק ממברנות העובר דליפת מי שפיר הסוגר.
  8. אסוף עוברים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ מלא PBS 1x סטרילי ומניחים על קרח.
  9. אחוז השליה של עובר אחד עם מלקחי נקודה משובחים ומניחה בצלחת פטרי 100 מ"מימ נקיה.
  10. הסר את שק חלמון באמצעות מלקחיים נקודת בסדר.
  11. לאחר איסוף AF, לשטוף כל עובר עם PBS 1x סטרילי השלים עם 1% בסרום שור עוברי (FBS) ולאסוף לתוך 15 מיליליטר צינור חרוטים המכיל את AF.
  12. צנטריפוגה AF ב 145 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant מתחת למכסה המנוע וזרעי התאים AF pelleted.

4. תרבית תאי העכבר AF

  1. זריעה של תאי AF העכבר
    1. יום אחד לפני הזריעה, להכין צלחת 0.1% ג'לטין מצופה 6-גם עם mitomycin C שטופל MEF.
    2. לאחר איסוף AF, זרע התאים המתקבלים דיקור מי שפיר (כ 1 x 10 7 תאים המתקבלים 6 עובר) על MEF mitotically מומת באמצעות מדיום תרבות AF.
    3. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, שינוי המדיום פעם ביומיים.
    4. לאחר 7 ימים של תרבות, טרנסתאי AF fect הנוהל המתואר להלן.

5. Transfection, נייד דור שב"ס-AF ותרבות

הערה: תאי AF העכבר היו transfected עם הפלסמיד transposon PB-tetO2-IRES-OKMS, בשיתוף עם פלסמיד ביטוי transposase (mPBase) ועם transactivator טטרציקלין ההפוך (PB-CAG-rtTA) פלסמיד transposon. כל פלסמידים נמסרו על ידי פרופ 'אנדרש Nagy 33.

  1. מערבבים 1 מיקרוגרם של PB-tetO2-IRES-OKMS עם 0.5 מיקרוגרם של mPBase ו -0.5 מיקרוגרם של PB-CAG-rtTA (DNA סה"כ: 2 מיקרוגרם) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  2. לדלל את ה- DNA עד 100 μL עם סרום ללא בינוני (Medium הנשר שונה של Dulbecco - DMEM).
  3. הוסף 8 μL של מגיב transfection (למשל, Fugene) (לפי יחס של DNA פלסמיד: סוכן transfection של 2 מיקרוגרם (DNA) לסוכן transfection 8 μL) לתוך DNA המכיל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  4. דגירה תערובת מגיב transfection / DNA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף dropwise 100 μL של התערובת transfection מגיב / DNA לכל היטב צלחת 6-היטב עם תאים AF העכבר ולהפיץ ידי מתערבל עדין, עם נפח סופי של 2 מ"ל / היטב. השאר למשך 24 שעות.
  6. למחרת, להשרות את הביטוי של גורמים של יאמאנאקה (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) על ידי האכלה התאים עם מדיום חדש שב"ס-AF השלימו עם 1.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של דוקסיציקלין (2 מ"ל של התקשורת לכל היטב).
  7. Feed תאים בכל יום, ללא מעבר, עם מדיום המכיל-DOX טרי (לשמור תאי תקשורת השלימה עם דוקסיציקלין עד נקודת 5.13).
  8. שימו לב תאים בתוך 24 שעות עבור ביטוי mCherry ויומיומי עבור היווצרות המושבה (מושבות מופיעות בדרך כלל בין 20 ל -30 ימים לאחר transfection).
  9. יום אחד לפני הקטיף המושבה, להכין צלחת בתרבית רקמה 96-היטב עם mitomycin C שטופלו MEF.
  10. פיק מושבות יחידות 50 μL של usin נפחפיפטה ga 200 μL, ולהעבירם ברצף לתוך צלחת 96-גם בבארות בודדות.
  11. למחרת, לנתק כל מושבה לתוך תאים בודדים על ידי הוספת 50 μl של טריפסין המסחרי ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  12. פיפטה מעלה ומטה כדי disaggregate המושבה.
  13. העברת 50 μL של טריפסין המכיל המושבה ניתקה לתוך באר חדשה עם MEF מומת על ג'לטין 0.1% מצופים 96 היטב צלחת מלאה 100 μL של מדיום שב"ס-AF הטרי בתוספת דוקסיציקלין.
  14. כאשר התאים מגיעים 60-70 מפגש%, לפצל לתוך באר של צלחת 24 באר.
  15. כאשר התאים מגיעים 60-70 מפגש%, לפצל 1: 2 עד שתי בארות, אחד עם דוקסיציקלין והשני ללא דוקסיציקלין, כדי לוודא אם המושבות מופיעים גם במצב ללא דוקסיציקלין.
  16. המשך לשמור על שיבוטי שב"ס-AF, דוקסיציקלין עצמאי, על MEF מומת במדיום שב"ס-AF.
  17. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, פרקanging בינוני יומי.

6. אלקליין phosphatase מכתים

  1. בצע מכתים phosphatase אלקליין הבא של פרוטוקול היצרן בכל פעם שיש ההופעה העצמאי דוקסיציקלין תאי iPS-AF.

7. Immunofluorescence

  1. בכל פעם שיש הופעת עצמאית דוקסיציקלין שב"ס-AF תאים, זרע 150,000 תאים / 2 ס"מ על באר של צלחת 24 גם עם MEF מומת, ולגדול תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. (זהירות) תקן את התאים על ידי הוספת 300 μl לכל גם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוספת 300 μl של 0.1% NP-40 permeabilize תאים.
  4. יש לשטוף את התאים עם 300 μl של 0.1% PBS-Tween 20.
  5. הוספת 300 μl של חיץ החסימה (סרום סוס 10% ב 1x PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  6. השתמש נוגדנים העיקריים הבאים: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (01:100) ו SSEA1 (1:80). לדלל SSEA1 עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 10% בסרום עז נורמלי, 0.3 מ 'גליצין ב 0.1% PBS-Tween-20. לדלל כל נוגדנים אחרים עם סרום סוס 10% ב 1x PBS.
  7. דגירת נוגדני הלילה ב 4 ° C..
  8. לשטוף עם 300 μl של 0.1% PBS-Tween-20.
  9. השתמש נוגדנים משני מדולל סרום סוס 10% ב 1x PBS: Alexa594 מצומדות עז נגד העכבר IgG (1: 200), Alexa594 מצומדות IgG נגד עז עוף (1: 200), IgG נגד ארנב עוף Alexa594 מצומדות (1: 200), Alexa568 מצומדות עז נגד העכבר IgM (1: 200). דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף עם 1x PBS.
  11. גרעיני כתם עם פתרון Hoechst (1: 10,000) ב- PBS 1x.

8. התמיינות תאים במבחנה

  1. כדי ליצור תלויים גופי embryoid ירידה (EBS), לטפח טיפות יחידות (2,000 תאים / 20 μl) על המכסה של צלחות פטרי, באמצעות מדיום הבידול.
  2. דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוסו 5% CO 2 למשך 4 ימים.
  3. העבר EBS לתוך 100 מ"מ צלחות חיידקי כיתה בתרבות ההשעיה למשך 3 ימים במדיום בידול.
  4. EBS פלייט 24 היטב הצלחות מצופות מטריצת קרום במרתף (בדילול 1:10 ב DMEM) במשך 14 ימים נוספים.
  5. עבור immunofluorescence מנתח, השתמש נוגדנים ראשוניים: T (1: 100), αfp (1: 200) ו Tubb3 (1: 500) 37.

9. גיבוש in vivo teratoma

  1. להזריק 100 μl של PBS 1x המכיל 1 x 10 6 תאים iPS-AF לתוך השריר של hindlimb של Rag2 - / - γc - / - עכברים.
  2. קורבן עכברים באמצעות נקע בצוואר רחם 6 שבועות לאחר הזרקת תא.
  3. הסר את המוני גידול, מאופיינים גודלם, מן hindlimb של העכברים עבור הניתוחים שלאחר מכן.
  4. חותכי 7-10 מיקרומטר חלקים רוחביים עבים של הגידול איזופנטאן בהקפאה באמצעות cryostat.
  5. לקבלת Haematoxylinכתם ד Eosin (HE):
    1. כתם עם HE להעריך את רכב רקמת גידול, בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
  6. לקבלת כתם אימונו:
    1. תקן סעיפים teratoma עם 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. Permeabilize עם 0.1% Triton X-100.
  7. דגירה עם נוגדנים הבאים: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ו αSMA (1: 100) מדולל BSA 1% ב 1x PBS. דגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C (Tubb3) או לילה ב 4 ° C (עבור נוגדנים אחרים).
  8. peroxidase בלוק באמצעות מתנול 100% במשך 20 דקות.
  9. דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם HRP-מצומדות אנטי עכבר נוגדנים משני (1: 150).
  10. לשטוף עם 1x PBS.
  11. דגירה עם מצע peroxidase (HRP) (ראה לוח חומרים) במשך 5 דקות.
  12. יש לשטוף במי ברז במשך 5 דקות.
  13. הכתם עם Haematoxylin QS עבור 9 שניות.
  14. יש לשטוף במי ברז.
    15. הפקת RNA 10. מתאי

    1. השתמש ערכת חילוץ מסחרית RNA לפי הפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן.

    הפקת RNA 11. מן teratoma

    1. Homogenize teratoma באמצעות עלי וחנקן מרגמה הנוזלי כדי למנוע הפשרת המדגם.
    2. לשקול 25 מ"ג של רקמת גוף.
    3. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט מסחריים להפקת RNA ו -200 μL של כלורופורם.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    5. צנטריפוגה ב 13,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    6. מעבירים את supernatant פינה לצינור חדש.
    7. כדי לטהר את RNA להשתמש ערכת חילוץ מסחרי RNA על פי פרוטוקול של היצרן.

    ניתוח תגובת שרשרת 12. הפוך תמלול-פולימראז

    1. לסנתז את cDNA הראשון גדיל באמצעות transcriptase הפוכה עבור שעתוק לאחור (RT) תגובת שרשרת -polymerase (PCR) אוליגו (DT) אקורדינג פרוטוקול של היצרן, כדי להשיג 50 ng / μL של cDNA. לדלל cDNA עם מים RNase ללא בריכוז של 10 ng / μL.
    2. בצע RT-PCR באמצעות פולימראז ה- DNA על פי פרוטוקול של היצרן, ניצול 1 ng / μL של cDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להעריך את היכולת של תכנות מחדש, בתאי עכבר AF נאספו מעוברים של עכברים GFP. התאים היו transfected עם הפלסמיד transposon עגול PB-tetO2-IRES-OKMS, המבטא את הגורמים יאמאנאקה (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4) צמוד חלבון פלואורסצנטי mCherry באופן דוקסיציקלין-מושרה, הפוכה transactivator טטרציקלין (PB- CAG-rtTA) פלסמידים יחד עם הפלסמיד ביטוי transposase (mPBase). תאי עכבר AF היו transfected עם Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2 לאחר שבוע 1 של הרחבת במבחנה מעל שכבת מזין MEF. על מנת לתת ביטוי של גורמים אקסוגניים, דוקסיציקלין נוספה היום לאחר transfection בריכוז של 1.5 מיקרוגרם / מ"ל, כפי שתואר לעיל 39. הביטוי של mCherry היה גלוי לאחר 24 שעות מתוספת דוקסיציקלין, המציין transfection. המושבות הראשונות עם מורפולוגיה ES דמוית הופיעו 20 ימים לאחר DOXאינדוקציה ycycline ונאספו 30 ימים-transfection פוסט. מושבות אלה היו זורעים על שכבות מזין פיברובלסטים מומתות. לאחר קטיף, שיבוטים לשרוד היו מתוחזקים במדיום השלים עם דוקסיציקלין קטעים מסוימים עד שיימצא דוקסיציקלין העצמאי בבארות משוכפלות 33.

עכבר שיבוטים שב"ס-AF הוערכו על פרמטרים שונים: ביטוי mCherry, מכתים phosphatase אלקליין, ביטוי החלבון של סמנים pluripotency Oct4, Sox2, Klf4, Nanog ו SSEA1, הביטוי של גנים pluripotency אקסוגניים אנדוגני (Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2) , במבחנה (EBS) וב בידול (assay תפלצת רוחנית) vivo. הם מילאו את כל הקריטריונים העריכו לאמת pluripotency שלהם, כמו סיכם את איור 1.

איור 1
איור 1: תכנות מחדש של העכבר AF GFP + תאים. (א) מושבות עצמאיות דוקסיציקלין של שב"ס-AF GFP + תאים היו שליליות על מנת לתת ביטוי mCherry וחיובית עבור phosphatase אלקליין מכתים (ALP). ברי סולם = 250 מיקרומטר ו -100 מיקרומטר. (ב) נציג תמונות של שב"ס-AF דוקסיציקלין עצמאי יציבת תא GFP + להביע Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 ו SSEA1. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) ניתוח RT-PCR על מנת לתת ביטוי אקסוגני (פריימרים מבוססי וקטור, TG) ו אנדוגני (Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2) גנים. Beta-2-microglobulin (b2m) נחשב כמו גן משק. שורות תאים לתכנות מחדש גדלו בנוכחות (+) או העדרה (-) (96 שעות) של דוקסיציקלין. תאים R1 ES שימשו כביקורת. (פאנל PCR יש הבדל בין ואח ברטין. 38 (ד) המראה ברוטו של teratoma השיג 6 שבועות לאחר ההזרקה של שב"ס-AF GFP + תאים לתוך הגפיים האחוריות של Rag2 - / - γc - / - עכבר. (E) היסטולוגיה teratoma והתמיינות התאים אישר immunostaining לכל שלוש שכבות הנבט (האאקטודרם, mesoderm ו endoderm). αfetoprotein (AFP, endoderm), αsmooth יקטין שריר (αSMA, המזודרם), ו טובולין β3 (Tubb3, האאקטודרם) אותרו המוני גידול. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (F) RT-PCR ניתוח של EBS ו teratoma (Te). C +, בקרה חיובית; NTC, שליטה הלא תבנית. Vimentin (Vim, המזודרם), αfetoprotein (AFP, endoderm) ו טובולין β3 (Tubb3, האאקטודרם). (פאנל PCR יש הבדל בין התייחסות 38). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה שנבחרה כדי להשיג את האינדוקציה של pluripotency רלוונטית לבטיחות קלינית תא ביחס השתלה לטווח ארוכה. כיום, קיימות מספר שיטות מתאימות תכנות מחדש. בין השיטות הלא-אינטגרטיבי יותר, ויראלי סנדאי (SEV) הווקטור הוא וירוס RNA אשר יכול לייצר כמויות גדולות של חלבון ללא להשתלב בגרעין של התאים הנגועים 40 ויכולה להיות אסטרטגיה כדי להשיג תאי שב"ס. וקטורי sev יכולים להיות מועמד אטרקטיבי עבור הדור של תאי שב"ס translational כיתה, אך הוא מציג כמה חסרונות. רפליקז ויראלי הוא רגיש לאופי הרצפים המהונדסים. מאז וקטורי sev constitutively לשכפל, הם יכולים להיות קשים להיפטר מתאי המארח, גם אם אסטרטגיות שונות משמשות לשיפור היבט זה 41, 42. זה דורש טיפול מיוחד, כגון ארון בטיחות ביולוגית רמה 2. שם אניזה רק הספק מסחרי אחד זמין. קיים חוסר נוכחי של sev קליני כיתה לתכנות מחדש ויש עלויות גבוהות של ייצור תאי שב"ס.

בשל ההיבטים הללו, מערכת transposon יכולה להיחשב גישה טובה יותר ביחס וקטורי sev, וכאן אנו קובעים כי מערכת זו היא שיטה מתאימה תכנות מחדש תאי עכבר AF עם יתרונות שונים. היא מאפשרת את ייצור תאי xenofree שב"ס בניגוד פרוטוקולי ייצור ויראלי הנוכחיים המשתמשים תנאי xenobiotic. אין לו מחסום מינים לכאורה ויש לו קיבולת מטען transgene גדולה יותר וירוסים. היא מאפשרת משלוח פשוט ובטוח של transposons פלסמיד באמצעות השימוש בשיטת transfection תאים סטנדרטית, אשר יכול להתבצע בקלות בכל מעבדה מצוידת עם ארון בטיחות ביולוגי 1 רמה. מחדש ביטוי Transposase מתיר הגריעה של רכיבי PB עם דור סוגר של עכבר טביעה ללא ושב"ס אדם תאים, כפי שמודגם ce השונהקווי ll 32, 34, 35. מחקרים שונים הראו כי מערכות transposon להציג בתדירות נמוכה יותר מיקוד ליד גנים והטיית פחות מסרטן מיקוד גנים פעילים לעומת וקטורים ויראליים מבוסס 43, 44, 45, 46, 47. תכנות מחדש על בסיס transposons תלוי בשיטת המשלוח שנבחר, וזה מגבלה בשל התנגדות או רעילות הקשורים לשיטות transfection DNA (lipofection, electroporation או nucleofection). כאן השתמשנו ניסוח שאינו liposomal נועד transfect DNA אשר עבד היטב עם תאי AF העכבר. אם תאים אחרים מועסקים, בדיקות תהיינה צורך להשתמש בשיטת המסירה הטובה ביותר במונחים של יעילות גבוהות רעילות נמוכה. על סף, שיטת transposon PB נחשבת וכספתעלות נמוכה ד אך עם יעילות נמוכה לעומת וקטורי sev.

לגבי ההליך להשיג תאי העכבר AF, זה קריטי שיהיה זמינים עכברות הרות. ככזה, יש צורך להגדיר מספר מספיק של הזדווגויות (לפחות שש נקבות עם שתי נקבות לכל זכר).

עוד ניסויים יכול להתבצע באופן ספציפי על תאי AF האדם לייצר תאי iPS מעוברים בריאים וחולים. בהתחשב במגוון הרחב של מחלות מולדות כי ניתן לאתר דרך לאבחון טרום לידתי, תאים המתקבלים AF במהלך ההריון מייצג את המקור הטוב ביותר כדי להפיק תאי iPS הוא בלימוד המחלה 48 וגם לתכנון גישת רפואת רגנרטיבית במקרה של פגמי רקמות כמו לב או שריר שלד 49, 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 120 תאי מי שפיר תאי גזע מושרים transposon PiggyBac רפואה רגנרטיבית תכנות מחדש העכבר.
את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter