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Developmental Biology

माउस एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन के एक transposon प्रणाली का प्रयोग

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

प्रसव पूर्व निदान आनुवंशिक रोगों (यानी गुणसूत्र aberrations, monogenetic या multifactorial polygenetic / बीमारियों) और जन्मजात विकृतियों (यानी जन्मजात diaphragmatic हर्निया, पित्ताशय फेफड़ों के घावों, exomphalos, gastroschisis) का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण है। एमनियोटिक द्रव (वायुसेना) कोशिकाओं गर्भावस्था की दूसरी तिमाही के दौरान नियमित रूप से अनुसूचित प्रक्रियाओं से प्राप्त करने के लिए सरल (यानी amniocentesis और amnioreduction) या शल्यक्रिया वर्गों 1, 2 हैं। जन्म के पूर्व या नवजात रोगियों से वायुसेना कोशिकाओं की उपलब्धता पुनर्योजी चिकित्सा के लिए इस स्रोत का उपयोग करने की संभावना प्रदान करता है, और कई शोधकर्ताओं ने विभिन्न ऊतकों को नुकसान या बीमारियों एक स्टेम सेल वायुसेना 3, 4, 5, 6 से पृथक आबादी का उपयोग कर इलाज के लिए संभावना की जांच, 7, 8, 9, 10, 11, 12। आसानी से रोगग्रस्त रोगियों से वायुसेना कोशिकाओं को प्राप्त करने, एक समय खिड़की में जो बीमारी अक्सर स्थिर है की संभावना है, reprogramming प्रयोजनों के लिए इस सेल के स्रोत का उपयोग करने के विचार के लिए रास्ता खुल जाता है। दरअसल, प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं वायुसेना कोशिकाओं से व्युत्पन्न, इन विट्रो दवा के परीक्षण के लिए या ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण के लिए ब्याज की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सका आदेश बच्चे के जन्म से पहले एक पर्याप्त रोगी विशेष चिकित्सा तैयार करने में। कई अध्ययनों से पहले ही दिखा दिया है वायुसेना कोशिकाओं की क्षमता reprogrammed और भेदभाव किया जा करने के लिए सेल प्रकार 13, 14, 15, 16, 17 <की एक विस्तृत श्रृंखला में/ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27।

चार प्रतिलेखन कारक (Oct4, Sox2, cMyc और Klf4) के लिए मजबूर अभिव्यक्ति के माध्यम से ताकाहाशी और reprogrammed दैहिक कोशिकाओं के यामानाका 28 से खोज के बाद से, प्रगति reprogramming के क्षेत्र में किया गया है। विभिन्न तरीकों को देखते हुए, हम वायरल और गैर-वायरल दृष्टिकोणों के बीच भेद कर सकते हैं। पहले वायरल वैक्टर (रेट्रोवायरस और lentiviruses) है, जो उच्च दक्षता लेकिन दोनों एक आंशिक रूप से reprogrammed सेल लाइन का परिणाम और के जोखिम के साथ रेट्रोवायरल transgene की आमतौर पर अधूरा मुंह बंद करने, राशि के उपयोग की उम्मीदइन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस 29, 30, 31। यानी plasmids, वैक्टर, mRNA, प्रोटीन, transposons: गैर वायरल विधि विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करता है। आईपीएस कोशिकाओं ट्रांसजेनिक दृश्यों का नि: शुल्क की व्युत्पत्ति टपकाया transgene अभिव्यक्ति और इन्सर्शनल mutagenesis के हानिकारक प्रभावों को दरकिनार करने के लिए करना है। उपर्युक्त सभी गैर वायरल रणनीतियों के अलावा, PiggyBac (पंजाब) transposon / Transposase प्रणाली एक transgene और Transposase एंजाइम की क्षणिक अभिव्यक्ति प्रविष्टि या छांटना घटनाओं 32 उत्प्रेरित करने flanking केवल उल्टे टर्मिनल दोहराता की आवश्यकता है। आईपीएस सेल पीढ़ी के लिए अन्य तरीकों पर transposons का उपयोग करने में लाभ एक गैर वायरल वेक्टर दृष्टिकोण है कि रेट्रोवायरल वैक्टर का एक ही दक्षता से पता चलता है के साथ वेक्टर मुक्त आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने की संभावना है। इस reprogr के लिए एकीकृत transposon एन्कोडिंग का पता लगाने के कम छांटना द्वारा ही संभव हैआईपीएस कोशिकाओं 33 में Transposase की एक नई क्षणिक अभिव्यक्ति निम्नलिखित कारकों amming। यह देखते हुए कि पंजाब विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 34, 35, 36, 37 में कुशल है, वायरल वैक्टर के लिए सम्मान के साथ एक नैदानिक दृष्टिकोण के लिए अधिक उपयुक्त है, और वर्तमान वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल है कि जीनोबायोटिक का उपयोग करने के विपरीत Xeno मुक्त आईपीएस कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है शर्तों, इस प्रणाली murine वायुसेना से आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

यहाँ हम पहले से ही प्रकाशित काम के बाद माउस वायुसेना कोशिकाओं (आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं) 38 से pluripotent आईपीएस क्लोन के उत्पादन को दिखाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं इतालवी कानून के अनुसार में थे। Murine वायुसेना के नमूने 13.5 दिनों के बाद coitum (डीपीसी) C57BL / 6-टीजी (यूबीसी GFP) 30Scha / जम्मू चूहों से GFP नामक स्थान पर गर्भवती चूहों से काटा गया।

1. transposon उत्पादन

नोट: transposon अभिव्यक्ति वैक्टर मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग उत्पन्न किया गया। माउस वायुसेना कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड डीएनए वाणिज्यिक किट का उपयोग कर तैयार किया गया था।

  1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में DH5α बैक्टीरिया के 50 μl के साथ प्लास्मिड डीएनए के 10 एनजी मिक्स। 20 मिनट के लिए बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब सेते हैं।
  2. 40 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका।
  3. 2 मिनट के लिए बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब रखें।
  4. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Lysogeny शोरबा (पौंड) शोरबा के 250 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला (300 आरपीएम)।
  5. 0.1 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग प्लेटों पर प्रत्येक परिवर्तन के 30 μl बिखरा हुआ है। प्लेटों को सुखाने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस ov पर उल्टे सेते की अनुमति देंernight।
  6. अगले दिन, दोपहर में, 3 कालोनियों बाँझ 200 μl युक्तियों का उपयोग प्रत्येक परिवर्तन से उठा, और 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर लेग amp पर स्थानांतरित।
  7. शेक (300 आरपीएम) रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया।
  8. प्लाज्मिड शुद्धि के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर plasmids।

2. माउस भ्रूण fibroblast (MEF) संस्कृति

  1. 0.1% जिलेटिन के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें की कोटिंग
    1. हुड छह कुओं में से प्रत्येक के लिए बाँझ 0.1% जिलेटिन के 1 मिलीलीटर जोड़ने के तहत कोट प्लेटों। जिलेटिन 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) पर भाजन करते हैं।
    2. अतिरिक्त त्यागें, और 1 घंटे के लिए प्लेटें सूखी।
    3. कमरे के तापमान पर स्टोर प्लेटें सील करने के लिए और parafilm का प्रयोग करें।
  2. Mitomycin सी के साथ MEF की निष्क्रियता
    1. 4 x 10 6 MEF एक 37 डिग्री सेल्सियस स्नान का उपयोग कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना।
    2. MEF मध्यम साथ एक पेट्री डिश (150 मिमी) पर हुड में MEF बीज।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 कोशिकाओं खेती।
    4. (चेतावनी) mitomycin सी (5 मिलीग्राम / एमएल) जब कोशिकाओं मिला हुआ हैं जोड़ें।
    5. एक मशीन में प्लेस कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) 3 घंटे के लिए।
    6. mitomycin सी धो कोशिकाओं के साथ मध्यम निकालें 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार।
    7. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वाणिज्यिक trypsin और जगह कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें। के बाद, मध्यम अवरुद्ध trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए की 18 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक burker कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    9. 5 मिनट के लिए 145 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    10. बीज 60,000 कोशिकाओं / 0.1% जिलेटिन लेपित प्लेटों पर निष्क्रिय MEF के 2 सेमी।
    11. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं खेती, वायुसेना और / या आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं बोने से पहले।

3. माउस वायुसेना सेल अलगाव

  1. समय पर matings सेट अप और योनि Plu जाँचसह-आवास के 24 घंटे के बाद जी एस।
  2. जब तक 13.5 डीपीसी का निरीक्षण करें और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से गर्भवती बांध बलिदान।
  3. पशु 70% इथेनॉल का उपयोग कर के पेट की दीवार को साफ करें।
  4. कैंची का प्रयोग, एक midline laparotomy पेट की दीवार की लंबाई incising उदर गुहा में पहुँच प्राप्त करने के लिए करते हैं।
  5. गर्भाशय संदंश का उपयोग बेनकाब। एक 100 मिमी पेट्री के साथ बाँझ 1x पीबीएस बर्फ पर रखा भरा डिश में गर्भाशय कैंची और हस्तांतरण का उपयोग कर निकालें।
  6. 10X बढ़ाई वायुसेना इकट्ठा करने के लिए एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  7. संदंश के साथ गर्भाशय पकड़ो और कैंची से गर्भाशय की दीवार को हटा दें। भ्रूण झिल्ली और फलस्वरूप एमनियोटिक द्रव रिसाव के किसी भी नुकसान से बचने के लिए सावधान रहें।
  8. बाँझ 1x पीबीएस के साथ भरा एक 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण लीजिए और बर्फ पर जगह है।
  9. एक स्वच्छ 100 मिमी पेट्री डिश में एक अच्छी बात संदंश और जगह के साथ एक भ्रूण की नाल समझ।
  10. अच्छी बात संदंश का उपयोग थैली की जर्दी निकालें।
  11. वायुसेना संग्रह के बाद, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक बाँझ 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक भ्रूण धोने और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में वायुसेना युक्त ट्यूब इकट्ठा।
  12. 5 मिनट के लिए 145 XG पर अपकेंद्रित्र वायुसेना। हुड के नीचे सतह पर तैरनेवाला निकालें और pelleted वायुसेना कोशिकाओं बीज।

4. माउस वायुसेना सेल संस्कृति

  1. माउस वायुसेना प्रकोष्ठों के सीडिंग
    1. एक दिन बोने से पहले, mitomycin सी का इलाज MEF के साथ एक 0.1% जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं।
    2. वायुसेना संग्रह के बाद, वायुसेना संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर (लगभग 1 10 x 7 कोशिकाओं 6 भ्रूण से प्राप्त) mitotically निष्क्रिय MEF पर कोशिकाओं एक amniocentesis से प्राप्त बीज।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 कोशिकाओं पर खेती, हर दूसरे दिन मध्यम बदल रहा है।
    4. बाद संस्कृति के 7 दिनों के, ट्रांसप्रक्रिया नीचे वर्णित निम्नलिखित fect वायुसेना कोशिकाओं।

5. अभिकर्मक, आईपीएस-वायुसेना सेल पीढ़ी और संस्कृति

नोट: माउस वायुसेना कोशिकाओं को एक Transposase प्लाज्मिड अभिव्यक्ति (mPBase) के साथ संयोजन के रूप में और (पीबी-कैग-rtTA) transposon प्लाज्मिड रिवर्स टेट्रासाइक्लिन transactivator साथ, पीबी tetO2-IRES-OKMS transposon प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। सभी plasmids प्रोफेसर एनड्रास नागी 33 द्वारा प्रदान किया गया।

  1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में: (2 माइक्रोग्राम कुल डीएनए) mPBase की 0.5 ग्राम और 0.5 PB-कैग-rtTA की माइक्रोग्राम के साथ मिक्स पीबी tetO2-IRES-OKMS के 1 माइक्रोग्राम।
  2. सीरम मुक्त मध्यम के साथ 100 μL (- DMEM Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) के लिए डीएनए पतला।
  3. 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब युक्त डीएनए में: (2 माइक्रोग्राम (8 μL अभिकर्मक एजेंट को डीएनए) के अभिकर्मक एजेंट प्लास्मिड डीएनए के अनुपात में) अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 μL (जैसे, FuGENE) जोड़ें।
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण सेते हैं।
  5. माउस वायुसेना कोशिकाओं के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण के 100 μL dropwise जोड़ें और कोमल घूमता द्वारा वितरित, 2 एमएल के अंतिम मात्रा / अच्छी तरह से। 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
  6. दिन के बाद, ताजा आईपीएस वायुसेना मध्यम डॉक्सीसाइक्लिन के 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मीडिया के 2 मिलीलीटर) के साथ पूरक के साथ कोशिकाओं को खिलाने से यामानाका के कारकों (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित।
  7. हर दिन कोशिकाओं फ़ीड, पारित होने के बिना, ताजा Dox युक्त मध्यम (बिन्दु 5.13 तक डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने) के साथ।
  8. mCherry अभिव्यक्ति के लिए 24 घंटे के भीतर और दैनिक कॉलोनी गठन (कालोनियों आम तौर पर अभिकर्मक के बाद 20 और 30 दिनों के बीच दिखाई देते हैं) के लिए कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  9. कॉलोनी उठा से पहले एक दिन, mitomycin सी का इलाज MEF के साथ एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट तैयार करते हैं।
  10. मात्रा usin के 50 μL में एकल कालोनियों उठाओजीए 200 μL पिपेट, और उन्हें क्रमिक रूप से अलग-अलग कुओं में एक 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित।
  11. दिन के बाद, वाणिज्यिक trypsin के 50 μl जोड़कर एकल कक्षों में हर कॉलोनी को अलग कर देना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. कॉलोनी disaggregate करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
  13. स्थानांतरण 50 एक 0.1% जिलेटिन लेपित 96 अच्छी तरह से थाली पर निष्क्रिय MEF के साथ एक नया अच्छी तरह से में अलग कॉलोनी युक्त trypsin के μL ताजा आईपीएस वायुसेना मध्यम डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक के 100 μL के साथ भर दिया।
  14. जब कोशिकाओं 60-70% संगम तक पहुँचने, 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में विभाजित है।
  15. दो कुओं, डॉक्सीसाइक्लिन के साथ एक और अन्य डॉक्सीसाइक्लिन के बिना, के लिए 2 यदि कालोनियों डॉक्सीसाइक्लिन बिना हालत में भी दिखाई सत्यापित करने के लिए: जब कोशिकाओं 60-70% संगम तक पहुँचते हैं, विभाजित 1।
  16. आईपीएस वायुसेना माध्यम में, आईपीएस-वायुसेना क्लोन, डॉक्सीसाइक्लिन स्वतंत्र बनाए रखने के लिए निष्क्रिय MEF पर जारी रखें।
  17. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2, पर कोशिकाओं खेती CHमध्यम दैनिक Anging।

6. alkaline फॉस्फेट धुंधला

  1. निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित alkaline फॉस्फेट धुंधला प्रदर्शन करना जब भी वहाँ डॉक्सीसाइक्लिन स्वतंत्र आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं की उपस्थिति है।

7. Immunofluorescence

  1. जब भी वहाँ डॉक्सीसाइक्लिन स्वतंत्र आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं की उपस्थिति है, निष्क्रिय MEF के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह पर 150,000 कोशिकाओं / 2 सेमी बीज, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
  2. (चेतावनी) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) की अच्छी तरह से प्रति 300 μl जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. 0.1% एनपी 40 कोशिकाओं permeabilize के 300 μl जोड़ें।
  4. 0.1% पीबीएस बीच 20 के 300 μl के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर (1x पीबीएस में 10% घोड़े सीरम) के 300 μl जोड़ें।
  6. निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) और SSEA1 (1:80)। 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 10% सामान्य बकरी सीरम, साथ SSEA1 पतला 0.3 एम 0.1% में ग्लाइसिन पीबीएस बीच -20। 1x पीबीएस में 10% घोड़े सीरम के साथ अन्य सभी एंटीबॉडी पतला।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी सेते हैं।
  8. के 0.1% पीबीएस बीच -20 300 μl से कुल्ला।
  9. 1x पीबीएस में 10% घोड़े सीरम में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: Alexa594 संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1: 200), Alexa594 संयुग्मित चिकन विरोधी बकरी आईजीजी (1: 200), Alexa594 संयुग्मित चिकन विरोधी खरगोश आईजीजी (1: 200), Alexa568 संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीएम (1: 200)। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  10. 1x पीबीएस के साथ कुल्ला।
  11. 1x पीबीएस में: Hoechst समाधान (10,000 1) के साथ दाग नाभिक।

8. विट्रो सेल भेदभाव में

  1. फांसी ड्रॉप embryoid निकायों (ईबीएस) के रूप में, भेदभाव माध्यम का उपयोग कर एकल बूंदों खेती (2,000 कोशिकाओं / 20 μl) पेट्री डिश के ढक्कन पर।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेतेऔर 5% 4 दिनों के लिए 2 सीओ।
  3. भेदभाव माध्यम में 3 दिनों के लिए निलंबन संस्कृति में 100 मिमी बैक्टीरियल ग्रेड बर्तन में ईबीएस स्थानांतरण।
  4. एक और 14 दिनों के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (DMEM में पतला 1:10) के साथ लेपित में प्लेट ईबीएस।
  5. टी (1: 100), αfp (1: 200) और Tubb3 (1: 500) 37 immunofluorescence विश्लेषण के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।

9. विवो टेराटोमा गठन

  1. / - - Γc - / - चूहों Rag2 की hindlimb की मांसपेशी में 1 एक्स 10 6 आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं से युक्त 1x पीबीएस के 100 μl इंजेक्षन।
  2. ग्रीवा अव्यवस्था 6 सप्ताह सेल इंजेक्शन के बाद के माध्यम से चूहों बलिदान।
  3. ट्यूमर जनता, उनके आकार द्वारा प्रतिष्ठित निकालें, निम्नलिखित विश्लेषण के लिए चूहों के hindlimb से।
  4. 7-10 माइक्रोन isopentane जमी ट्यूमर एक cryostat का उपयोग कर के मोटी अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती।
  5. Haematoxylin एक के लिएडी eosin (एचई) दाग:
    1. वह साथ दाग ट्यूमर के ऊतक रचना का मूल्यांकन करने, निर्माता प्रोटोकॉल का पालन।
  6. Immunoperoxidase दाग के लिए:
    1. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ टेराटोमा वर्गों को ठीक करें।
    2. 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ Permeabilize।
  7. निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ सेते हैं: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) और αSMA (1: 100) 1x पीबीएस में 1% BSA में पतला। 37 डिग्री सेल्सियस (Tubb3 के लिए) पर 1 घंटे या रात भर के 4 डिग्री सेल्सियस पर (अन्य एंटीबॉडी के लिए) के लिए सेते हैं।
  8. ब्लॉक peroxidase 20 मिनट के लिए 100% मेथनॉल का उपयोग कर।
  9. के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते माध्यमिक एंटीबॉडी विरोधी माउस एचआरपी संयुग्मित (1: 150)।
  10. 1x पीबीएस के साथ कुल्ला।
  11. साथ peroxidase (एचआरपी) सब्सट्रेट (देखें सामग्री तालिका) 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. 5 मिनट के लिए नल के पानी से कुल्ला।
  13. 9 सेकंड के लिए Haematoxylin क्यु साथ दाग।
  14. नल के पानी से कुल्ला।
    15. प्रकोष्ठों से 10 आरएनए निष्कर्षण

    1. निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक शाही सेना निकासी किट का प्रयोग करें।

    टेराटोमा से 11. शाही सेना निकालना

    1. टेराटोमा एक पैर और मोर्टार और तरल नाइट्रोजन का उपयोग नमूना विगलन से बचने के लिए homogenize।
    2. ऊतक के 25 मिलीग्राम वजन।
    3. आरएनए निकासी के लिए वाणिज्यिक अभिकर्मक के 1 एमएल और क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें।
    4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    6. एक नया ट्यूब को मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    7. शुद्ध करने के लिए आरएनए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक शाही सेना निकासी किट का उपयोग करें।

    12. रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण

    1. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) -polymerase चेन रिएक्शन (पीसीआर) और oligo (डीटी) एक्कोर के लिए एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर पहली कतरा सीडीएनए synthesizeडिंग निर्माता प्रोटोकॉल के, 50 एनजी / सीडीएनए के μL प्राप्त करने के लिए। 10 एनजी / μL की एकाग्रता में RNase मुक्त पानी के साथ सीडीएनए पतला।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग आरटी पीसीआर, 1 एनजी के उपयोग के प्रदर्शन करना / सीडीएनए के μL।

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Representative Results

reprogramming की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, माउस वायुसेना कोशिकाओं GFP चूहों के भ्रूण से एकत्र किए गए थे। प्रकोष्ठों पंजाब परिपत्र transposon प्लाज्मिड पीबी tetO2-IRES-OKMS, जो यामानाका कारकों (Oct4, Sox2, cMyc और Klf4) एक डॉक्सीसाइक्लिन-inducible ढंग से mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े व्यक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, और टेट्रासाइक्लिन transactivator रिवर्स थे ( कैग-rtTA) Transposase प्लाज्मिड अभिव्यक्ति (mPBase) के साथ मिलकर plasmids। माउस वायुसेना कोशिकाओं को एक MEF फीडर परत पर इन विट्रो विस्तार के 1 हफ्ते के बाद Oct4, Klf4, cMyc और Sox2 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। बहिर्जात कारकों की अभिव्यक्ति के लिए, डॉक्सीसाइक्लिन, 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में अभिकर्मक के बाद दिन के लिए जोड़ा गया है के रूप में पहले 39 में वर्णित है। mCherry की अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन अलावा से 24 घंटे, अभिकर्मक का संकेत के बाद दिखाई दे रहा था। एक ते तरह आकारिकी के साथ पहली कालोनियों 20 दिनों के बाद दिखाई दिया Doxycycline प्रेरण और 30 दिनों उठाया गया था बाद अभिकर्मक। इन कालोनियों निष्क्रिय fibroblast फीडर परतों पर वरीयता प्राप्त थे। चुनने के बाद, जीवित रहने का क्लोन तक डॉक्सीसाइक्लिन दोहराया कुओं 33 में स्वतंत्र हो पाया कुछ अंश के लिए डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक मध्यम में बनाए रखा गया।

माउस आईपीएस वायुसेना क्लोन विभिन्न मापदंडों के लिए मूल्यांकन किया गया: mCherry अभिव्यक्ति, alkaline फॉस्फेट धुंधला हो जाना, pluripotency मार्करों Oct4, Sox2, Klf4, Nanog और SSEA1, बहिर्जात और अंतर्जात pluripotency जीन (Oct4, Klf4, cMyc और Sox2) की अभिव्यक्ति के प्रोटीन अभिव्यक्ति इन विट्रो (ईबीएस) और इन विवो (टेराटोमा परख) भेदभाव। चित्रा 1 में संक्षेप के रूप में वे सभी मानदंडों को उनकी pluripotency को मान्य करने के लिए मूल्यांकन पूरा किया।

आकृति 1
चित्रा 1: माउस वायुसेना GFP + कोशिकाओं के reprogramming। आईपीएस वायुसेना GFP + कोशिकाओं (ए) डॉक्सीसाइक्लिन स्वतंत्र कालोनियों alkaline फॉस्फेट (एएलपी) धुंधला के लिए mCherry की अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक और सकारात्मक थे। स्केल सलाखों = 250 माइक्रोन और 100 माइक्रोन। (बी) Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 और SSEA1 व्यक्त स्थिर डॉक्सीसाइक्लिन स्वतंत्र आईपीएस वायुसेना + GFP सेल के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी) बहिर्जात (वेक्टर आधारित प्राइमरों, टीजी) और अंतर्जात (Oct4, Klf4, cMyc और Sox2) जीनों की अभिव्यक्ति के लिए आरटी पीसीआर विश्लेषण। बीटा-2-माइक्रोग्लोब्युलिन (b2m) एक गृह व्यवस्था जीन के रूप में माना जाता था। डॉक्सीसाइक्लिन की (96 घंटा) - reprogrammed सेल लाइनों उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति में बड़े हो रहे थे ()। R1 ES कोशिकाओं एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। (पीसीआर पैनल Bertin एट अल से संशोधित किया गया है। 38 (डी) टेराटोमा का सकल रूप में 6 सप्ताह के Rag2 हिंद अंग में आईपीएस वायुसेना GFP + कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद प्राप्त - / - γc - / - माउस। (ई) टेराटोमा ऊतक विज्ञान और सभी तीन रोगाणु परतों (बाहरी झिल्ली, mesoderm और एण्डोडर्म) में immunostaining की पुष्टि की सेल भेदभाव। αfetoprotein (एएफपी, endoderm), αsmooth पेशी actin (αSMA, mesoderm), और β3 tubulin (Tubb3, बाह्य त्वक स्तर) ट्यूमर जनता में पाया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (एफ) ईबीएस और टेराटोमा (ते) के आरटी पीसीआर विश्लेषण। सी +, सकारात्मक नियंत्रण; एनटीसी, गैर टेम्पलेट नियंत्रण। Vimentin (विम, mesoderm), αfetoprotein (एएफपी, endoderm) और β3 tubulin (Tubb3, बाहरी झिल्ली)। (पीसीआर पैनल संदर्भ 38 से संशोधित किया गया है)। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

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Discussion

विधि pluripotency की प्रेरण प्राप्त करने के लिए चुना लंबी अवधि के प्रत्यारोपण के संबंध में सेल नैदानिक ​​सुरक्षा के लिए प्रासंगिक है। आजकल, वहाँ reprogramming के लिए उपयुक्त कई तरीके हैं। गैर-एकीकृत तरीकों के अलावा, सेंडाइ वायरल (सेव) वेक्टर एक आरएनए वायरस है कि संक्रमित कोशिकाओं के नाभिक 40 में एकीकृत करने के बिना प्रोटीन की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं और एक रणनीति आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए हो सकता है। सेव वैक्टर translational ग्रेड आईपीएस कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक आकर्षक उम्मीदवार हो सकता है, लेकिन यह कुछ कमियों को प्रस्तुत करता है। वायरल replicase ट्रांसजेनिक दृश्यों की प्रकृति के प्रति संवेदनशील है। चूंकि सेव वैक्टर अनिवार्यता से दोहराने, वे मेजबान कोशिकाओं से समाप्त करने के लिए, भले ही अलग अलग रणनीतियों इस पहलू 41, 42 में सुधार करने के लिए उपयोग किया जाता है मुश्किल हो सकता है। यह एक ऐसी स्तर 2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट के रूप में विशेष हैंडलिंग, की आवश्यकता है। वहां मैंकेवल एक वाणिज्यिक विक्रेता उपलब्ध है। वहाँ reprogramming के लिए नैदानिक ​​ग्रेड सेव की मौजूदा कमी है और वहाँ आईपीएस कोशिकाओं के उत्पादन की उच्च लागत रहे हैं।

इन पहलुओं के कारण, transposon प्रणाली सेव वैक्टर के लिए सम्मान के साथ एक बेहतर तरीका माना जा सकता है, और यहाँ हम स्थापित इस प्रणाली के विभिन्न लाभ के साथ माउस वायुसेना कोशिकाओं reprogramming के लिए एक उपयुक्त तरीका है। यह xenofree आईपीएस कोशिकाओं वर्तमान वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल है कि जीनोबायोटिक शर्तों का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत के उत्पादन की अनुमति देता है। यह कोई स्पष्ट प्रजातियों बाधा है और एक transgene कार्गो क्षमता वायरस से भी बड़ा है। यह मानक सेल अभिकर्मक विधि का उपयोग करते हैं, जो आसानी से एक स्तर 1 जैविक सुरक्षा कैबिनेट के साथ सुसज्जित हर प्रयोगशाला में किया जा सकता है के माध्यम से प्लाज्मिड transposons की सरल और सुरक्षित प्रसव के लिए अनुमति देता है। के रूप में विभिन्न सीई में प्रदर्शन Transposase फिर से अभिव्यक्ति, पदचिह्न मुक्त माउस और मानव आईपीएस कोशिकाओं के फलस्वरूप पीढ़ी के साथ पंजाब तत्वों को हटाने के लिए परमिटडालूँगा लाइनों 32, 34, 35। विभिन्न अध्ययनों कि transposon सिस्टम कैंसर से संबंधित जीन और वायरल आधारित वैक्टर 43, 44, 45, 46, 47 की तुलना में सक्रिय जीन को निशाना बनाने में कम पूर्वाग्रह के पास लक्षित करने में एक कम आवृत्ति प्रदर्शन दिखाया। transposons के आधार पर चुना Reprogramming वितरण पद्धति पर निर्भर करता है, और इस प्रतिरोध या विषाक्तता डीएनए अभिकर्मक तरीकों (lipofection, electroporation या nucleofection) से संबंधित होने के कारण एक सीमा है। यहाँ हम एक गैर-लिपोसोमल डीएनए जो माउस वायुसेना कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए डिजाइन तैयार करने transfect इस्तेमाल किया। अन्य कोशिकाओं कार्यरत रहे हैं, तो परीक्षण उच्च दक्षता और कम विषाक्तता के मामले में सबसे अच्छा वितरण विधि का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। सरसरी तौर पर, पंजाब transposon विधि सुरक्षित एक माना जाता हैघ कम लागत पर एक कम क्षमता सेव वैक्टर के साथ तुलना के साथ।

प्रक्रिया माउस वायुसेना कोशिकाओं को प्राप्त करने के बारे में, यह गर्भवती मादा चूहों उपलब्ध है के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, यह matings की एक पर्याप्त संख्या (पुरुष के प्रति दो महिलाओं के साथ कम से कम छह महिलाओं) स्थापित करने के लिए आवश्यक है।

अधिक प्रयोगों मानव वायुसेना कोशिकाओं पर विशेष रूप से किया जा सकता है, स्वस्थ और रोगग्रस्त भ्रूण से आईपीएस कोशिकाओं का उत्पादन। गर्भ के दौरान वायुसेना से प्राप्त जन्मजात रोगों कि प्रसव पूर्व निदान के माध्यम से पता लगाया जा सकता है, कोशिकाओं की विस्तृत श्रृंखला को ध्यान में रखते हैं और यह भी ऊतक दोषों के मामले में एक पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण योजना बनाने के लिए दोनों के लिए आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा स्रोत रोग 48 का अध्ययन प्रतिनिधित्व इस तरह के हृदय या कंकाल की मांसपेशी 49, 50 के रूप में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 120 एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं प्रेरित pluripotent स्टेम सेल PiggyBac transposon पुनर्योजी चिकित्सा reprogramming माउस।
माउस एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन के एक transposon प्रणाली का प्रयोग
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Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

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