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Developmental Biology

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

산전 진단은 유전 질환 (즉, 염색체 이상, monogenetic 또는 인성 / polygenetic 질환)과 선천성 기형 (즉, 선천성 횡격막 탈장, 낭포 성 폐 병변, exomphalos, 배벽 갈림 증)을 평가하는 중요한 임상 도구입니다. 양수 (AF) 세포는 임신의 두 번째 임신 중 정기적으로 예약 절차에서 획득하는 간단한 (즉, 양수 천자 및 amnioreduction) 또는 제왕 절개 섹션 1, 2입니다. 태아 또는 신생아 환자 AF 세포의 이용은 재생 의학이 소스를 사용할 수있는 가능성을 제공하고, 여러 연구자들은 AF 3, 4, 5, 6에서 분리 된 줄기 세포 집단을 사용하여 서로 다른 조직 손상 또는 질환을 치료하는 가능성을 조사7, 8, 9, 10, 11, 12. 쉽게 질병들은 종종 고정 된 시간 윈도우에서 질병 환자 AF 셀을 획득 할 가능성은 프로그래밍 목적이 셀 소스를 사용하는 아이디어에 방법을 연다. 실제로, AF 세포로부터 유래 된 유도 다 능성 줄기 (IPS) 세포는 출산 전에 적절한 환자 별 치료를 준비하기 위해, 시험관 내 약물 검사 또는 조직 공학 방법에 대한 관심의 세포 분화 될 수있다. 많은 연구가 이미 AF 세포의 능력은 세포 형태 13, 14, 15, 16, 17 <넓은 범위로 재 프로그램과 차별화 될 입증/ SUP> 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

네 개의 전사 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)의 강제 표현을 통해 다카하시 및 재 프로그램 체세포의 야마나카 (28)에 의해 발견 이후, 진행 프로그래밍의 분야에서했다. 다른 방법을 고려하여, 우리는 바이러스 및 비 - 바이러스 성 방법을 구별 할 수있다. 첫번째 부분 재 프로그램 세포주의 결과와의 위험 모두 고효율이지만 레트로 바이러스 유전자 보통 불완전 침묵을 가질 바이러스 벡터 (레트로 바이러스 및 렌티 바이러스)의 사용을 예상삽입 성 돌연변이 29, 30, 31. 즉, 플라스미드 벡터, mRNA의 단백질, 트랜스포존 : 비 - 바이러스 성 방법은 다른 전략을 사용한다. 유전자 서열의 무료 만능 줄기 세포의 유도는 새는 유전자 발현 및 삽입 성 돌연변이 유발의 잠재적으로 해로운 영향을 회피하는 것을 목표로하고있다. 위에서 언급 한 모든 비 바이러스 전략 중, 피기 백 (PB) 트랜스포존 / 트랜스 시스템은 삽입 또는 절제 이벤트 (32)을 촉매하는 유전자와 트랜스 효소의 일시적인 발현을 측면에만 역전 된 말단 반복을 필요로한다. 만능 줄기 세포의 생성을위한 다른 방법을 통해 트랜스포존을 사용의 장점은 레트로 바이러스 벡터의 동일 효율을 나타내는 비 - 바이러스 벡터 방식 벡터 프리 만능 줄기 세포를 얻을 수 있다는 것이다. 이것은 reprogr위한 통합 트랜스포존 인코딩 트레이스 이하로 절단 할 수있다만능 줄기 세포 (33)의 트랜스의 새로운 일시적 발현 다음과 같은 요소를 amming. PB가 다른 세포 유형 34, 35, 36, 37 효율적임을 감안할 때, 바이러스 벡터에 대한 임상 적 접근 방식에 더 적합하며, 생체이 물을 사용하여 현재의 바이러스 생산 프로토콜 달리 이종없는 만능 줄기 세포의 생산을 허용 조건은,이 시스템은 뮤린 AF에서 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 사용된다.

여기에서 우리는 마우스 AF 세포 (IPS-AF 세포) (38)로부터 만능 만능 줄기 클론의 생산을 보여주기 위해 이미 게시 작업을 다음과 같은 세부적인 프로토콜을 제안한다.

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Protocol

모든 절차 이탈리아 법에 따라했다. 쥐의 AF 샘플은 GFP라는 C57BL / 6-Tg는 (UBC-GFP) 30Scha / J 마우스에서 13.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 한 쥐에서 수확했다.

1. 트랜스포존 생산

주 : 트랜스포존 발현 벡터는 표준 클로닝 방법을 사용하여 생성 하였다. 마우스 AF 세포 형질 전환 용 플라스미드 DNA 상업용 키트를 사용하여 제조 하였다.

  1. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 DH5α 박테리아의 50 μL와 플라스미드 DNA 10ng의 섞는다. 20 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 품어.
  2. 40 초 동안 42 ° C에서 열 충격.
  3. 2 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 놓습니다.
  4. 미리 예열 (37 ° C) 원성 국물 (LB) 배지 250 μl를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃ (300 RPM)를 흔든다.
  5. 0.1 ㎎ / ㎖ 앰피 실린와 LB 플레이트에 각 변형의 30 μl를 확산. 판 건조, 37 ° C 오븐에서 반전 품어 허용ernight.
  6. 다음날, 오후에, 각각의 변환에서, 멸균 200 μl의 팁을 사용하여, 3 식민지를 선택하고 0.1 ㎎ / ㎖ LB 앰프에 전송합니다.
  7. 하룻밤 37 ° C에서 (300 RPM) 박테리아를 흔들어.
  8. 플라스미드 정제 용 상용 장비를 사용합니다. -20 ° C에서 스톡 플라스미드.

2. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 문화

  1. 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트의 코팅
    1. 여섯 개의 우물 각 멸균 0.1 % 젤라틴 1 ㎖를 추가 후드 코트 판. 젤라틴 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C)를 중합 할 수 있습니다.
    2. 초과 폐기하고, 1 시간 동안 접시를 건조.
    3. 실온에서 저장 판을 밀봉하고 파라 필름을 사용합니다.
  2. 미토 마이신 C와 MEF의 불 활성화
    1. 37 ° C 조를 이용하여 4 × 10 6 MEF 세포의 병을 해동.
    2. MEF 매체와 페트리 접시 (150mm)의 후드에서 MEF을 시드.
    3. 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포 배양.
    4. (주) 세포가 합류 있습니다 마이 토마 이신 C (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
    5. 인큐베이터에 장소 세포 (37 ° C와 5 % CO 2) 3 시간 동안.
    6. 마이 토마 이신 C를 세척 세포와 1 배의 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 매체를 제거합니다.
    7. 5 분 동안 37 ° C 배양기에 상업 트립신과 장소 세포 2 ㎖를 추가합니다. 후, 트립신 반응을 정지 매체를 차단 18 ml에 추가 할 수 있습니다.
    8. 제조사의 프로토콜에 따라 BURKER 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
    9. 5 분 145 XG에 원심 분리기 세포. 상층 액을 버린다.
    10. 씨앗 60,000 세포 / 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에 불 활성화 MEF의 cm 2.
    11. AF 및 / 또는 AF-만능 줄기 세포를 파종 전에, 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 세포를 배양.

3. 마우스 AF 세포 분리

  1. 시간 제한 교배를 설정하고 질 PLU를 확인공동 주택의 24 시간 후 GS.
  2. 13.5 DPC 때까지 관찰하고 자궁 경부 전위를 통해 임신 댐을 희생.
  3. 70 % 에탄올을 사용하여 동물의 복부 벽을 청소한다.
  4. 가위를 사용하여 복강에 접근하기 위해 복부 벽의 길이를 절개 정중선 개복을 수행한다.
  5. 집게를 사용하여 자궁을 노출. 1X PBS 얼음에 배치 멸균 가득 100mm 배양 접시에 가위 및 전송을 사용하여 자궁을 제거합니다.
  6. 10 배 배율에서 AF를 수집하는 실체 현미경을 사용합니다.
  7. 집게와 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거합니다. 태아 막과 그에 따른 양수 누수에 손상을 피하기 위해주의해야합니다.
  8. 멸균 1X PBS로 가득 100mm 배양 접시에 태아를 수집하고 얼음에 배치합니다.
  9. 깨끗한 100mm 페트리 접시에 좋은 점 집게와 장소 하나 태아의 태반을 잡고.
  10. 좋은 점 집게를 사용 골목 노른자를 제거합니다.
  11. AF 컬렉션 후, 1 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 멸균 1X PBS로 각 태아 세척하고, 15 mL의에 AF를 함유하는 원뿔형 튜브를 수집한다.
  12. 5 분 145 XG에 원심 분리기 AF. 후드 뜨는을 제거하고 펠렛 AF 세포를 시드.

4. 마우스 AF의 세포 배양

  1. 마우스 AF 세포의 파종
    1. 어느 날 전에 시드로, 마이 토마 이신 C 처리 MEF와 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
    2. AF 컬렉션 후, AF 배지를 사용하여 (약 1 × 10 7 세포는 태아에서 얻은 6)를 비활성화 mitotically MEF 상으로 양수로부터 얻은 세포를 시드.
    3. 매일 매체를 변경, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 배양.
    4. 문화 7 일, 트랜스 후아래에 설명 된 절차에 따라 AF에는 영향 셀.

5. 형질, 만능 줄기-AF 세포 생성 및 문화

주 : 마우스 AF 세포 (PB-CAG-rtTA) 트랜스포존 플라스미드 트랜스 발현 플라스미드 (mPBase)과 관련하여 역방향의 테트라 사이클린 transactivator 더불어 PB-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포존 플라스미드로 형질 감염시켰다. 모든 플라스미드는 교수 안드라스 나기 (33)에 의해 제공되었다.

  1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 (2 μg의 전체 DNA) 0.5 mPBase의 μg의 0.5 PB-CAG-rtTA의 μg의와 PB-tetO2-IRES-OKMS 1 μg의 혼합.
  2. 무 혈청 배지 100 μL (- DMEM 둘 베코 변형 이글 배지)로 DNA를 희석.
  3. (플라스미드 DNA의 비율로 8 μL 형질 제 2 μg의 (DNA)의 형질 전환 제) (예를 들면, 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene) 형질 감염 시약 8 μL를 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 관 함유하는 DNA로.
  4. 실온에서 15 분 동안 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 인큐베이션.
  5. / 웰이 용액의 최종 부피 마우스 AF 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 100 μL를 적하 첨가하고 완만 한 소용돌이로 배포한다. 24 시간 동안 둡니다.
  6. 하루 후, 독시사이클린 1.5 μg의 / ㎖ (각 웰에 대한 미디어 2 mL)으로 보충 된 신선한 만능-AF 배지로 세포를 공급하여 야마나카의 인자 (인 Oct4, Klf4, cMyc, Sox2이)의 발현을 유도한다.
  7. 신선한 DOX 함유 배지 (포인트 5.13까지 독시 싸이클린 보충 미디어에서 세포를 유지)를, 통과하지 않고, 매일 세포를 공급.
  8. mCherry 발현 24 시간 이내에 매일 콜로니 형성 (식민지는 일반적으로 형질 전환 후 20 30 일 사이에 표시)에 대한 세포를 관찰한다.
  9. 하루 콜로니 피킹 전에, 마이 토마 이신 C 처리 된 MEF가있는 96- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다.
  10. 볼륨 날기의 50 μL에 하나의 식민지를 선택GA 200 μL 피펫, 개별 웰에서 96 웰 플레이트로 순차적으로 전달.
  11. 하루 후, 상용 트립신의 50 μL를 추가하여 하나의 셀에 각 콜로니를 해리하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다.
  12. 식민지를 해리하는 아래로 피펫합니다.
  13. 독시 싸이클린 보충 신선한 만능 줄기-AF 매체의 100 μL 가득 96 웰 플레이트 코팅 된 0.1 % 젤라틴에 불 활성화 MEF와 새로운 잘으로 해리 식민지를 포함하는 트립신의 양도 50 μL.
  14. 세포를 60-70 %의 컨 플루 언스에 도달하면, 24 웰 플레이트의 웰에 나누어.
  15. 식민지 독시 싸이클린없는 상태로 나타날 경우 확인이 우물, 독시사이클린없이 독시사이클린 한 다른, 2 : 세포가 60-70%의 합류에 도달하면 1 분할.
  16. IP에-AF 매체에 불 활성화 MEF에, 독시사이클린 독립적 인 만능 줄기-AF 클론을 유지하기 위해 계속합니다.
  17. 채널 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양매일 매체를 anging.

6. 알칼리성 포스파타제 염색

  1. 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이있을 때마다 제조사의 프로토콜은 다음 알칼리성 포스파타제 염색을 수행한다.

7. 면역 형광

  1. 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이 될 때마다, 비활성 MEF있는 24 웰 플레이트의 웰에 150,000 세포 / cm 2 시드, 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 세포를 성장한다.
  2. (주의)을 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 웰 당 300 μl를 첨가하여 세포를 고정.
  3. 0.1 % NP-40 Permeabilize 하시려면하는 세포 300 μl를 추가합니다.
  4. 0.1 % PBS-트윈 20의 300 μL로 세포를 씻어.
  5. 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (PBS 1X 10 % 말 혈청) 300 μL를 추가한다.
  6. (1:10 인 Oct4 (1:80), Sox2이 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog를 다음 일차 항체를 사용하여0)과 SSEA1 (1:80). 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청으로 희석 SSEA1 0.3 M 글리신, 0.1 %의 PBS-트윈 -20. 1X PBS 10 % 말 혈청과 다른 모든 항체 희석.
  7. 4 ℃에서 밤새 항체를 품어.
  8. 0.1 % PBS-트윈-20의 300 μl를 씻어.
  9. 1X PBS에서 10 % 말 혈청 희석 보조 항체를 사용 Alexa594 결합 염소 항 - 마우스 IgG (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭고기 방지 염소 IgG를 (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭 항 - 토끼 IgG의를 (1 : 200) Alexa568 결합 염소 항 - 마우스 IgM의 (1 : 200). 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션.
  10. 1X PBS로 씻어.
  11. 1X PBS에서 : 훽스트 용액 (10,000 1)와 얼룩 핵.

체외 세포 분화 8.

  1. 매달려 드롭 배아 체 (사채)을 형성, 분화 배지를 사용하여 배양 접시의 뚜껑에 (2,000 세포 / 20 μL) 한 방울을 육성.
  2. 37 ° C에서 요리를 품다4 일 동안 5 % CO 2.
  3. 분화 배지에서 3 일간 현탁 배양에 100mm 박테리아 수준의 요리로 사채를 전송합니다.
  4. 또 다른 14 일간 (DMEM에서 1:10 희석) 기저막 행렬로 코팅 된 24 잘 번호판 플레이트 사채.
  5. T (1 : 100), αfp (1 : 200) 및 Tubb3 (1 : 500) 37 면역 형광 분석의 경우, 일차 항체를 사용합니다.

9. 생체 기형 종 형성

  1. - / - γC - / - 생쥐 Rag2의 사지의 근육에 1 × 10 6-AF 만능 줄기 세포를 포함하는 1X PBS 100 ㎕를 주입한다.
  2. 육주 세포 주입 후 자궁 전위를 통해 쥐를 희생.
  3. 다음과 같은 분석을위한 쥐의 뒷다리에서, 크기에 의해 구별 종양 덩어리를 제거합니다.
  4. 그라 이오 스탯을 사용하여 이소 펜탄 냉동 종양의 7 ~ 10 μm의 두께 횡단면을 잘라.
  5. 헤 마톡의에 대한D의 에오신 (HE) 얼룩 :
    1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 종양 조직 구성을 평가하는 HE와 얼룩.
  6. immunoperoxidase 얼룩의 경우 :
    1. 실온에서 15 분 동안 4 % PFA로 기형 섹션을 고정한다.
    2. 0.1 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면.
  7. 다음 항체와 인큐베이션 : Tubb3 (1 : 100) αfp (1시 50분) 및 αSMA (1 : 100) 1X PBS에 1 % BSA에서 희석한다. 1 (Tubb3 용) 37 ° C에서 시간 또는 밤새 4 ° C에서 (다른 항체)에 대한 품어.
  8. 20 분 동안 100 % 메탄올을 사용하여 블록 옥시다아제.
  9. 37 ° C에서 45 분 동안 품어 HRP - 복합 (1 : 150) 이차 항체 항 - 마우스는.
  10. 1X PBS로 씻어.
  11. 5 분 동안 퍼 옥시 다제 (HRP) 기판 (재료 표 참조)에 품어.
  12. 5 분 동안 수돗물로 씻어.
  13. 9 초 동안 헤 마톡 QS로 얼룩.
  14. 수돗물로 씻어.
    15. 세포에서 10 RNA 추출

    1. 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용합니다.

    기형 종에서 11 RNA 추출

    1. 샘플을 해동 피하기 위해 봉과 박격포와 액체 질소를 사용하여 기형 종을 균질화.
    2. 조직의 25 mg의 무게.
    3. RNA 추출을위한 상용 시약 1 mL의 클로로포름 200 μL를 추가합니다.
    4. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
    5. 13,000 XG에 원심 분리기 15 분 동안 4 ° C.
    6. 새로운 튜브에 클리어 뜨는을 전송합니다.
    7. RNA의 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용 정화합니다.

    (12) 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 분석

    1. 역전사 (RT) -polymerase 연쇄 반응 (PCR)과 올리고 (DT) 코르위한 역전사 효소를 이용하여 제 1 가닥 cDNA의 합성제조 업체의 프로토콜 땡은 50 NG / cDNA를 μL을 얻었다. 10 NG / μL의 농도의 RNase없는 물과 cDNA를 희석.
    2. RT-PCR은 1 NG를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 폴리머 라 아제를 사용하여 수행 / μL의 cDNA.

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Representative Results

프로그래밍의 능력을 평가하기 위해 마우스 AF 세포를 GFP 마우스의 태아로부터 수집 하였다. 세포는 솔더 (Soler) (a 독시사이클린 - 유도 방식으로 mCherry 형광 단백질에 연결된 야마나카 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)를 나타내고, 원형 트랜스포존 플라스미드 PB-tetO2-IRES-OKMS, 형질 및 테트라 사이클린 transactivator 역방향했다 CAG-rtTA)은 트랜스의 발현 플라스미드 (mPBase)와 함께 플라스미드. 마우스 AF 세포는 MEF 피더 레이어를 통해 체외 확장 1 주 이후 인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이 형질했다. 앞서 설명한대로 39 외인성 인자의 발현을 위해, 독시사이클린은 1.5 μg / ml의 농도 형질 다음날 하였다. mCherry의 발현 형질을 나타내는 독시사이클린 추가에서 24 시간 후에 볼 수 있었다. ES-같은 형태를 가진 최초의 식민지 이십일 DOX 후 등장ycycline 유도 및 30 일을 후 형질을 포착했다. 이 식민지는 불 활성화 된 섬유 아세포의 피더 레이어에 접종 하였다. 수확 후 복제 된 웰 (33)에 독립적 인 독시사이클린 것으로 발견 될 때까지 생존 한 클론 일부 계대 독시사이클린이 보충 된 배지에서 유지 하였다.

마우스 만능 줄기-AF 클론은 다른 매개 변수에 대한 평가 : mCherry 식, 알칼리 포스 파타 아제 염색의 다 능성 마커 인 Oct4, Sox2이, Klf4, Nanog를하고 SSEA1, 외인성 및 내인성 능성 유전자 (인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이)의 발현 단백질 발현을 , 시험 관내 (사채) 및 생체 내 (기형 종 분석) 분화한다. 도 1에 요약 된 바와 같이 그들은 그들의 능성을 검증하기 위해 평가 된 모든 기준을 충족.

그림 1
그림 1 : 마우스 AF의 GFP + 세포의 재 프로그래밍. 만능 줄기-AF GFP + 세포의 (A) 독시 싸이클린 독립 식민지는 알칼리성 포스파타제 (ALP) 염색에 대한 mCherry의 표현에 대한 부정과 긍정적이었다. 스케일 바 = 250 μm의 100 μm의. (B) 인 Oct4, Sox2이, Nanog를, Klf4와 SSEA1을 표현 안정적인 독시 싸이클린 독립적 인 만능 줄기-AF GFP + 세포의 대표 이미지를. 스케일 바 = 100 μm의. (C) 외인성 (벡터 기반 프라이머, Tg)가 내생 (인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이) 유전자의 발현에 대한 RT-PCR 분석. 베타 2- 마이크로 글로불린 (B2M)는 하우스 키핑 유전자로 간주 하였다. 리 프로그래밍 된 세포주가 존재 (+) 또는 부재하에 배양 하였다 (-) (96 시간)의 독시사이클린. R1 ES 세포를 대조군으로 사용 하였다. (PCR 패널 Bertin이 등의 알에서 수정되었습니다. (38) (D) 육주 Rag2의 뒷다리에 만능 줄기-AF GFP가 + 세포의 주입 후의 기형 종의 총 외관 - / - γC - / - 마우스입니다. 세 가지 배엽 (외배엽, 중배엽과 내배엽)에 (E) 기형 종의 조직 학적 및 면역 확인 세포 분화. αfetoprotein (AFP, 내배엽은), αsmooth 근육 액틴 (αSMA, 중배엽), 및 β3 튜 불린 (Tubb3, 외배엽)는 종양 덩어리에서 검출되었다. 스케일 바 = 100 μm의. (F) 사채 및 기형 종 (테)의 RT-PCR 분석. C +, 양성 대조군; NTC, 비 템플릿 제어 할 수 있습니다. 멘틴 (빔, 중배엽), αfetoprotein (AFP, 내배엽)와 β3의 튜 불린 (Tubb3, 외배엽). (PCR 패널 참조 (38)에서 수정되었습니다). 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

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Discussion

능성의 유도를 얻기 위해 선택된 방법은 장기 이식에 대한 임상 세포의 안전을 위해 적합하다. 요즘 프로그래밍에 적합한 여러 가지 방법이 있습니다. 비 통합 방법 중에서, 센다이 바이러스 (SEV) 벡터는 감염된 세포의 핵 (40)로 통합하지 않고 대량의 단백질을 생산할 수 및 만능 줄기 세포를 수득하기위한 전략 될 수있는 RNA 바이러스이다. SEV 벡터는 병진 급 IPS 세포의 생성을위한 매력적인 후보가 될 수 있지만, 몇 가지 단점을 나타낸다. 리플리 바이러스는 유전자 서열의 특성에 민감하다. SEV 벡터가 구조적으로 복제하기 때문에, 서로 다른 전략이 측면 (41), (42)을 개선하기 위해 사용되는 경우에도, 숙주 세포로부터 제거하기 어렵다. 이 같은 레벨 2 생물 안전 캐비닛 등의 특수 처리가 필요합니다. 이 전하나의 상용 공급 업체가 사용할 수에요. 프로그래밍에 대한 임상 수준의 SEV의 현재 부족하다 및 유도 만능 줄기 세포 생산의 높은 비용이 있습니다.

때문에 이러한 측면에, 트랜스포존 시스템은 SEV 벡터에 대한 더 나은 방법으로 간주하고, 여기에 우리가이 시스템은 다양한 장점과 마우스 AF 세포를 재 프로그래밍에 적합한 방법이다 것을 입증 할 수있다. 그것은 생체 이물 조건을 사용하여 현재 바이러스 생산 프로토콜에 반대 xenofree 만능 줄기 세포의 생산을 할 수 있습니다. 그것은 명백한 종의 장벽이없는 바이러스보다 큰 유전자화물 용량을 가지고있다. 그것은 쉽게 레벨 1 생물학적 안전 캐비넷 구비 각 실험실에서 수행 될 수있는 표준 세포 형질 전환 방법의 사용을 통해 플라스미드 트랜스포존의 간단하고 안전한 전달을 허용한다. 다양한 CE에서 입증 된 바와 같이 트랜스 재 발현, 발자국없는 마우스와 인간 만능 줄기 세포의 생성과 그에 PB 요소의 제거를 허용LL 라인 32, 34, 35. 다른 연구는 트랜스포존 시스템은 암과 관련된 유전자의 바이러스 벡터 계 43, 44, 45, 46, 47에 비해 활성 유전자를 표적으로 덜 바이어스 근처 타겟팅 낮은 주파수를 표시 할 것으로 나타났다. 트랜스포존에 기초하여 재 프로그래밍은 선택된 전달 방법에 의존하며, 이는 DNA 형질 감염 법 (리포 펙션, 일렉트로 포 레이션 또는 nucleofection)에 관련된 저항이나 독성을 제한한다. 여기에서 우리는 마우스 AF 세포와 잘 작동 DNA를 형질하도록 설계된 비 리포좀 제제를 사용했다. 다른 셀이 이용되는 경우, 테스트는 높은 효율과 낮은 독성의 관점에서 최적의 전송 방법을 사용하는 것이 필요하다. 약식의 PB 트랜스포존 방법 안전한 것으로 간주D 저렴한 비용으로하지만, SEV 벡터에 비해 낮은 효율.

마우스 AF 세포를 얻기위한 방법에 대해서, 임신 한 암컷 마우스를 사용할 수있는 것이 중요하다. 이와 같이, 이는 교배 적절한 수 (수컷 암컷 당 두 적어도 6 암컷)를 설정하는 것이 필요하다.

더 많은 실험이 건강하고 병에 걸린 태아에서 IPS 세포를 생산하는 인간의 AF 세포에 구체적으로 수행 될 수있다. 임신 동안 AF 얻은 선천성 산전 진단을 통해 검출 될 수있는 질환 세포의 광범위한 범위를 고려하면, 또한 조직 결함의 경우에, 재생 의료 방법을 계획 질병 48 공부 모두 만능 줄기 세포를 유도하는 최적의 소스를 나타낸다 같은 심장이나 골격근 49, 50.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

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트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조
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Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

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