Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

Fosterdiagnostikk er et viktig klinisk verktøy for å evaluere genetiske sykdommer (dvs. kromosomavvik, monogenetic eller polygenetisk / multifaktoriell sykdommer) og medfødte misdannelser (dvs. medfødt diafragma brokk, cystisk lungelesjoner, exomphalos, gastroschise). Fostervann (AF) celler er enkle å få tak i fra rutinemessig fastsatte prosedyrer i andre trimester av svangerskapet (dvs. fostervannsprøve og amnioreduction) eller keisersnitt 1, 2. Tilgjengeligheten av AF-celler fra prenatal eller nyfødte gir mulighet for å bruke denne kilde for regenerativ medisin, og flere forskere undersøkt muligheten for å behandle forskjellige vev skader eller sykdommer ved hjelp av en stilk cellepopulasjon isolert fra AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Muligheten for lett å skaffe AF-celler fra syke pasienter, etter et tidsvindu der sykdommen er ofte stasjonær, åpner veien til ideen om å bruke denne celle kilde for omprogrammering formål. Faktisk kan induseres pluripotent stammen (IPS) celler avledet fra AF-celler differensieres i cellene av interesse for in vitro legemiddeltesting eller vev for tekniske fremgangsmåter, for å fremstille en tilfredsstillende pasientspesifikk behandling før fødsel. Mange studier har allerede demonstrert evne til AF-celler til å være nytt og differensiert i et bredt spekter av celletyper 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Siden oppdagelsen av Takahashi og Yamanaka 28 av omprogrammerte somatiske celler gjennom tvungen uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, cMyc og Klf4), er det gjort framgang innen omprogrammering. Tatt i betraktning de ulike metoder, kan vi skille mellom viral og ikke-virale tilnærminger. Den første forventer at bruken av virale vektorer (retrovirus og lentivirus), som har høy virkningsgrad, men vanligvis er ufullstendig stanse av den retrovirale transgenet, med både er konsekvensen av en delvis omprogrammeres cellelinje og risiko forinsertional mutagenese 29, 30, 31. Den ikke-viral metoden bruker ulike strategier: dvs. plasmider, vektorer, mRNA, protein, transposoner. Avledning av iPS celler uten transgene sekvenser tar sikte på å omgå de potensielt skadelige effektene av utett transgene uttrykk og insertional mutagenese. Blant alle de ovennevnte ikke-virale strategier, krever PiggyBac (PB) transposon / transposase-systemet bare de inverterte terminale gjentakelser flankerende et transgen og forbigående ekspresjon av transposase enzym for å katalysere innsetting eller eksisjons- hendelser 32. Fordelen ved bruk av transposoner i forhold til andre fremgangsmåter for IPS celle generasjon er muligheten for å oppnå vektorfrie iPS-celler med en ikke-viral vektor tilnærming som viser den samme effektivitet av retrovirale vektorer. Dette er mulig ved spor mindre fjerning av den integrerte transposon som koder for reprogramming faktorer etter en ny forbigående uttrykk for transposase i iPS celler 33. Gitt at PB er effektiv i forskjellige celletyper 34, 35, 36, 37, er mer egnet for en klinisk tilnærming med hensyn til virale vektorer, og gjør det mulig for produksjon av Xeno-fri iPS celler i motsetning til dagens viral produksjon protokoller som bruker xenobiotisk betingelser, blir dette systemet anvendt for å oppnå iPS celler fra murin AF.

Her foreslår vi en detaljert protokoll etter allerede publiserte arbeider for å vise produksjonen av pluripotente iPS kloner fra mus AF celler (iPS-AF celler) 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer var i samsvar med italiensk lov. Murine AF prøver ble høstet fra gravide mus på 13,5 dager etter samleie (DPC) fra C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-mus kalt GFP.

1. Transposon Produksjon

MERK: transposon ekspresjonsvektorer ble generert ved hjelp av standard kloningsprosedyrer. Plasmid DNA for mus AF celler transfeksjon ble fremstilt ved bruk kommersielle kits.

  1. Bland 10 ng av plasmid-DNA med 50 ul DH5a bakterier i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Inkuber mikrosentrifugerør på is i 20 min.
  2. Varmesjokk ved 42 ° C i 40 sek.
  3. Plasser mikrosentrifugerør på is i 2 min.
  4. Tilsett 250 ul av forvarmet (37 ° C) lysogeni buljong (LB) medium. Rist (300 rpm) ved 37 ° C i 30 minutter.
  5. Spre 30 ul av hver transformasjon på LB-plater med 0,1 mg / ml ampicillin. La platene til å tørke og inkuber invertert ved 37 ° C overnight.
  6. Neste dag, på ettermiddagen, plukke 3 kolonier, ved hjelp av sterile 200 mL tips, fra hver transformasjon og overføre til 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Rist (300 rpm) bakterier over natten ved 37 ° C.
  8. For plasmid rensing bruke kommersielle kits. Aksje plasmider ved -20 ° C.

2. Mouse Embryonic fibroblast (MEF) Kultur

  1. Belegging av de seks-brønns plater med 0,1% Gelatin
    1. Belegge platene under panseret tilsetning av 1 ml steril 0,1% gelatin til hver av de seks brønner. La gelatin polymerisere på den inkubator (37 ° C) i 1 time.
    2. Kast overskudd, og tørke platene i 1 time.
    3. Bruk parafilm for å forsegle og lagre platene ved romtemperatur.
  2. Inaktivering av MEF med mitomycin C
    1. Tine en ampulle med 4 x 10 6 MEF-celler ved bruk av et 37 ° C bad.
    2. Seed MEF i panseret på en petriskål (150 mm) med MEF medium.
    3. Dyrke cellene ved 37 ° C og 5% CO2.
    4. (FORSIKTIG) Tilsett mitomycin C (5 mg / ml) når cellene er sammenflytende.
    5. Plasser cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 3 timer.
    6. Fjern medium med mitomycin C. Vask cellene tre ganger med 1 x fosfatbuffer saltvann (PBS).
    7. Tilsett 2 ml av den kommersielle trypsinlignende og plassere cellene inn i 37 ° C inkubator i 5 min. Etter, tilsett 18 ml blokkere medium for å stoppe trypsin reaksjon.
    8. Telle celler ved hjelp av en Burker kammer i henhold til produsentens protokoll.
    9. Sentrifuger cellene ved 145 xg i 5 min. Kast supernatanten.
    10. Seed 60.000 celler / cm 2 av inaktivert MEF på 0,1% gelatin belagte plater.
    11. Dyrke cellene i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, før såing AF og / eller IPS-AF-celler.

3. Mouse AF Cell Isolation

  1. Sett opp tidsbestemt parringer og sjekk vaginal plugs etter 24 timer av co-bolig.
  2. Observer inntil 13,5 DPC og ofre gravid demningen ved halshugging.
  3. Rens bukveggen av dyret ved hjelp av 70% etanol.
  4. Ved hjelp av saks, utføre en midtlinjen laparotomi incising lengden av bukveggen for å få tilgang til bukhulen.
  5. Expose livmoren ved hjelp av pinsett. Fjern livmoren ved hjelp av saks og overføring til en 100 mm petriskål fylt med steril 1 x PBS lagt på is.
  6. Bruk en stereomikroskop for å samle AF på 10X forstørrelse.
  7. Hold i livmoren med pinsett og fjerne livmorveggen med en saks. Vær forsiktig for å unngå skader på fosterhinnene og påfølgende fostervann lekkasje.
  8. Samle fostre opp en 100 mm petriskål fylt med sterilt 1x PBS og legg på is.
  9. Ta tak i placenta av ett foster med en fin spiss pinsett og plasser i en ren 100 mm petriskål.
  10. Fjern plommesekken ved hjelp av fin spiss tang.
  11. Etter AF samling, vask hver foster med steril 1 x PBS supplementert med 1% føtalt bovint serum (FBS) og samles opp i 15 ml konisk rør inneholdende AF.
  12. Sentrifuger AF ved 145 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten under panseret og frø de pelle AF celler.

4. Mouse AF Cell Culture

  1. Seeding av Mouse AF Cells
    1. En dag før seeding, utarbeide en 0,1% gelatin-belagt seks-brønns plate med mitomycin C-behandlet MEF.
    2. Etter AF samling, frø cellene hentet fra en fostervannsprøve (rundt 1 x 10 7 celler hentet fra 6 fostre) på mitotisk inaktivert MEF bruker AF dyrkingsmedium.
    3. Dyrke cellene ved 37 ° C og 5% CO2, endring av mediet annenhver dag.
    4. Etter 7 dagers kultur, transfekt AF celler etter prosedyren beskrevet nedenfor.

5. Transfeksjon, iPS-AF Cell Generation og kultur

MERK: Mus AF-celler ble transfektert med PB-tetO2-IRES-OKMS transposonet plasmid, i forbindelse med en transposase ekspresjonsplasmid (mPBase) og med omvendt tetracyklin transaktivator (PB-CAG-rtTA) transposonet plasmid. Alle plasmider ble gitt av professor Andras Nagy 33.

  1. Bland 1 ug av PB-tetO2-IRES-OKMS med 0,5 ug av mPBase og 0,5 ug av PB-CAG-rtTA (Total DNA: 2 ug) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Fortynn DNA til 100 ul med serumfritt medium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium - DMEM).
  3. Tilsett 8 mL av transfeksjon reagens (f.eks Fugene) (i forholdet plasmid DNA: transfeksjon middel av 2 pg (DNA) i 8 mL transfeksjon middel) i 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende DNA.
  4. Inkuber transfeksjon reagens / DNA-blandingen i 15 minutter ved romtemperatur.
  5. Tilsett dråpevis 100 ul transfeksjon reagens / DNA-blandingen per brønn i en 6-brønns plate med mus AF-celler og fordele ved forsiktig virvel, med et sluttvolum på 2 ml / brønn. La i 24 timer.
  6. Dagen etter, indusere ekspresjon av Yamanaka er faktorer (OCT4, Klf4, cMyc, Sox2) ved å mate cellene med fersk iPS-AF medium supplert med 1,5 mikrogram / ml doksycyklin (2 ml media for hver brønn).
  7. Mate celler hver dag, uten passasje, med fersk DOX holdig medium (vedlikeholde celler i media supplert med doksycyklin til punkt 5.13).
  8. Observer celler i 24 timer for mCherry uttrykk og daglig for kolonidannelse (kolonier vanligvis være mellom 20 og 30 dager etter transfeksjon).
  9. En dag før kolonien plukking, utarbeide en 96-brønns vevskultur plate med mitomycin C-behandlet MEF.
  10. Plukk enkeltkolonier i 50 mL volum usinga 200 ul pipette, og overføre dem sekvensielt inn i en 96-brønns plate i individuelle brønner.
  11. Dagen etter, dissosiere hver koloni inn i enkeltceller ved å tilsette 50 ul av den kommersielle trypsin og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
  12. Pipetter opp og ned for å disaggregert kolonien.
  13. Overføring 50 mL av trypsin inneholdende dissosierte kolonien inn i en ny brønn med inaktivert MEF på en 0,1% gelatin-belagte 96-brønns-plate som er fylt med 100 ul av frisk IPS-AF-medium supplert med doksycyklin.
  14. Når cellene når 60-70% konfluens, delt inn i en brønn i en 24-brønns plate.
  15. Når cellene når 60-70% samløpet, delt 1: 2 til to brønner, en med doksycyklin og den andre uten doksycyklin, for å kontrollere om kolonier vises også i stand uten doksycyklin.
  16. Fortsett å opprettholde iPS-AF kloner, doxycycline uavhengig, på inaktivert MEF i iPS-AF medium.
  17. Dyrke cellene ved 37 ° C og 5% CO2, changing medium daglig.

6. alkalisk fosfatase Farging

  1. Utfør alkalisk fosfatase farging følge produsentens protokoll når det er utseendet doxycycline uavhengige iPS-AF celler.

7. immunfluorescens

  1. Når det er utseendet av doxycycline uavhengige IPS-AF-celler, frø 150.000 celler / cm2 på en brønn i en 24-brønns plate med inaktivert MEF, og dyrke cellene i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. (FORSIKTIG) fiksere cellene ved tilsetning av 300 ul per brønn av 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 min ved romtemperatur.
  3. Tilsett 300 ul 0,1% NP-40 for å permeabilisere cellene.
  4. Rens cellene med 300 ul 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Tilsett 300 ul blokkeringsbuffer (10% hesteserum i 1 x PBS) i 1 time ved romtemperatur.
  6. Bruk følgende primære antistoffer: OCT4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) og SSEA1 (1:80). Fortynn SSEA1 med 1% bovint serumalbumin (BSA), 10% normalt geiteserum, 0,3 M glycin i PBS 0,1% Tween-20. Fortynn alle andre antistoffer med 10% hesteserum i 1 x PBS.
  7. Inkuber antistoffer over natten ved 4 ° C.
  8. Skyll med 300 ul 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Bruk sekundære antistoffer fortynnet i 10% hesteserum i 1 x PBS: Alexa594-konjugert geit-anti-mus IgG (1: 200), Alexa594-konjugert kylling anti-geite-IgG (1: 200), Alexa594-konjugert kylling-anti-kanin-IgG (1: 200), Alexa568-konjugert geite-anti-muse-IgM (1: 200). Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
  10. Skyll med 1x PBS.
  11. Flekk-kjerner med Hoechst-løsning (1: 10000) i 1 x PBS.

8. In vitro-celledifferensiering

  1. For å danne hengende slipp embryoid organer (EBS), dyrke enkelt dråper (2000 celler / 20 mL) på lokket av petriskåler, ved hjelp av differensiering medium.
  2. Inkuber rettene ved 37 ° Cog 5% CO2 i 4 dager.
  3. Overfør EBS inn i 100 mm bakteriell grad retter i suspensjonskultur for 3 dager i differensiering medium.
  4. Plate EBS i 24 brønnplater belagt med basalmembran matrix (fortynnet 1:10 i DMEM) for ytterligere 14 dager.
  5. For immunfluorescens analyser, bruke primære antistoffer: T (1: 100), αfp (1: 200) og Tubb3 (1: 500) 37.

9. I Vivo Teratoma Formation

  1. Injisere 100 ul 1x PBS som inneholder 1 x 10 6 iPS-AF celler inn i muskelen av bakben av Rag2 - / - γc - / - mus.
  2. Sacrifice mus gjennom halshugging 6 uker etter celle injeksjon.
  3. Fjern tumormasser, preget av sin størrelse, fra bakben av musene for følgende analyser.
  4. Skjær 7-10 um tykke tverrgående seksjoner av isopentan-frosset tumor ved anvendelse av en kryostat.
  5. For haematoxylin end eosin (HE) Stain:
    1. Flekk med HE å evaluere svulstvev sammensetning, etter produsentens protokoll.
  6. For immunoperoxidase Stain:
    1. Fiks teratom seksjoner med 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur.
    2. Permeabilize med 0,1% Triton X-100.
  7. Inkuber med følgende antistoffer: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) og αSMA (1: 100) fortynnet i 1% BSA i 1 x PBS. Inkuber i 1 time ved 37 ° C (for Tubb3) eller over natten ved 4 ° C (for de andre antistoffer).
  8. Blokk-peroksidase ved hjelp av 100% metanol i 20 min.
  9. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C med sekundært antistoff anti-muse-HRP-konjugert (1: 150).
  10. Skyll med 1x PBS.
  11. Inkuber med peroksidase (HRP) substrat (se Materialer tabell) i 5 minutter.
  12. Skyll med vann fra springen i 5 min.
  13. Flekk med haematoxylin QS for 9 sek.
  14. Skyll med vann fra springen.
    15. 10. RNA Utvinning fra Cells

    1. Bruk et kommersielt RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens anbefalte protokoll.

    11. RNA Utvinning fra Teratoma

    1. Homogenisere teratom ved hjelp av en støter og morter og flytende nitrogen for å unngå tining prøven.
    2. Veie 25 mg vev.
    3. Tilsett 1 ml kommersielt reagens for RNA-ekstraksjon og 200 ul kloroform.
    4. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
    5. Sentrifuger ved 13000 xg og 4 ° C i 15 min.
    6. Overfør supernatanten fjernet til et nytt rør.
    7. For å rense RNA bruke et kommersielt RNA-ekstraksjon kit ifølge produsentens protokoll.

    12. Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon Analyse

    1. Syntetisere den første-tråd cDNA ved anvendelse av en revers transkriptase for revers transkripsjon (RT) -polymerase-kjedereaksjon (PCR) og oligo (dT) hending til produsentens protokoll, for å få 50 ng / mL av cDNA. Fortynn cDNA med RNase-fritt vann ved en konsentrasjon på 10 ng / ul.
    2. Utføre RT-PCR ved bruk av DNA-polymerase i henhold til produsentens protokoll, å benytte 1 ng / mL av cDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å evaluere evnen av omprogrammering, ble mus AF cellene oppsamlet fra fostre til GFP mus. Cellene ble transfektert med sirkulære transposon plasmid PB-tetO2-IRES-OKMS, som uttrykker Yamanaka faktorer (Oct4, Sox2, cMyc og Klf4) knyttet til mCherry fluorescerende protein i en doksycyklin-induserbar måte, og omvendt tetracyklin transaktivatorprotein (PB CAG-rtTA) plasmider sammen med den transposase ekspresjonsplasmid (mPBase). Mus AF celler ble transfektert med Oct4, Klf4, cMyc og Sox2 etter en uke med in vitro ekspansjon over en MEF mater lag. For ekspresjon av eksogene faktorer, ble det tilsatt doksycyklin dagen etter transfeksjon ved en konsentrasjon på 1,5 pg / ml, som tidligere beskrevet 39. Uttrykket av mCherry var synlig etter 24 timer fra doksycyklin tillegg indikerer transfeksjon. De første kolonier med en ES-lignende morfologi først 20 dager etter DOXycycline induksjon og ble plukket 30 dager etter transfeksjon. Disse koloniene ble sådd på inaktiv fibroblast mater lag. Etter å plukke, ble overlevende kloner opprettholdt i medium supplert med doksycyklin for noen avsnitt før funnet å være doksycyklin uavhengig i replikert brønner 33.

Mouse iPS-AF kloner ble evaluert for ulike parametere: mCherry uttrykk, alkalisk fosfatase farging, protein uttrykk av pluripotency markører Oct4, Sox2, Klf4, Nanog og SSEA1, uttrykk for eksogene og endogene pluripotency gener (Oct4, Klf4, cMyc og Sox2) , in vitro (EBS) og in vivo (teratom assay) differensiering. De oppfylte alle kriteriene evaluert for å validere sin pluripotency, som oppsummert i figur 1.

Figur 1
Figur 1: Omprogrammering av mus AF GFP + celler. (A) Doxycycline uavhengige kolonier av IPS-AF-GFP + celler var negative for ekspresjon av mCherry og positivt for den alkaliske fosfatase (ALP) farging. Skala barer = 250 og 100 um. (B) Representative bilder av stabile doxycycline uavhengig iPS-AF GFP + celle uttrykker Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 og SSEA1. Scale bar = 100 mikrometer. (C) RT-PCR-analyse for ekspresjon av eksogene (vektorbaserte primere, Tg) og endogene (Oct4, Klf4, cMyc og Sox2) gener. Beta-2-mikroglobulin (B2M) ble ansett som en husholdningsgenet. Omprogrammeres cellelinjer ble dyrket i nærvær (+) eller fravær (-) (96 timer) av doksycyklin. R1 ES-celler ble anvendt som en kontroll. (PCR panel har blitt forandret fra Bertin et al. 38 (D) Brutto utseende teratom fått 6 uker etter injeksjon av iPS-AF GFP + celler i baklemmene av Rag2 - / - γc - / - mus. (E) Teratoma histologi og farging bekreftet celledifferensiering i alle tre bakterie lag (ektoderm, mesoderm og endoderm). αfetoprotein (Afp, endoderm), ble αsmooth muskel aktin (αSMA, mesoderm), og β3 tubulin (Tubb3, ektoderm) oppdaget i tumormasser. Scale bar = 100 mikrometer. (F) RT-PCR-analyse av EBS og teratom (Te). C +, positiv kontroll; NTC, ikke-mal kontroll. Vimentin (Vim, mesoderm), αfetoprotein (Afp, endoderm) og β3 tubulin (Tubb3, ektoderm). (PCR panel har blitt modifisert fra referanse 38). Klikk her for å se en større versjon av ther figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den velges for å oppnå den induksjon av pluripotency metode er relevant for celle kliniske sikkerheten med hensyn til langtids transplantasjon. I dag finnes det flere metoder som er egnet for omprogrammering. Blant de ikke-integrerende metoder, er Sendai viral (SeV) vektor et RNA-virus som kan produsere store mengder protein uten å integrere inn i kjernen av de infiserte celler 40 og kan være en strategi for å få iPS-celler. Sev vektorer kan være en attraktiv kandidat for generering av translasjonelle grad iPS-celler, men det byr på visse mangler. Den virale replikase er følsom for arten av de transgene sekvenser. Siden sev vektorer konstitutivt replikere, kan de være vanskelige å fjerne fra vertscellene, selv om ulike strategier benyttes til å forbedre dette aspektet 41, 42. Det krever spesiell håndtering, slik som en nivå 2 biologisk trygghetskabinett. Der jeger bare en kommersiell leverandør tilgjengelig. Det er en dagens mangel på klinisk kvalitet SeV for omprogrammering og det er høye kostnader ved iPS celleproduksjon.

På grunn av disse forhold, kan transposonet system betraktes som en bedre måte med hensyn til SEV vektorer, og her etablerer vi at dette systemet er en egnet metode for å omprogrammere muse AF-celler med forskjellige fordeler. Det gjør at produksjonen av xenofree iPS-celler i strid med gjeldende viral produksjons protokoller som bruker xenobiotiske forhold. Den har ingen åpenbar art barrieren og har et transgen lastekapasitet større enn virus. Det tillater enkel og sikker levering av plasmid transposoner gjennom bruk av standard celle transfeksjon metode som lett kan utføres i alle laboratorier er utstyrt med et nivå en biologisk trygghetskabinett. Transposase re-ekspresjon tillater fjerning av PB elementene med derav følgende dannelse av fotavtrykket-frie mus og humane iPS celler, som vist i forskjellige cell linjene 32, 34, 35. Forskjellige studier viste at transposonet systemene viser en lavere frekvens i målretting nær kreftrelaterte gener og mindre skjevhet i målretting aktive gener i forhold til virusbaserte vektorer 43, 44, 45, 46, 47. Omprogrammering basert på transposoner avhenger av den valgte leveringsmetode, og dette er en begrensning på grunn av motstanden eller toksisiteten relatert til DNA-transfeksjonsmetoder (lipofeksjon, electroporation eller nucleofection). Her har vi brukt en ikke-liposomal formulering utviklet for å transfektere DNA som jobbet godt med musen AF celler. Hvis andre celler blir ansatt, vil testene være nødvendig å bruke den beste leveringsmåte i form av høy effektivitet og lav toksisitet. Summarisk er det PB transposonet metoden anses å være trygge end lav pris, men med en lavere effektivitet sammenlignet med Sev vektorer.

Når det gjelder fremgangsmåten for å oppnå mus AF-celler, er det avgjørende å ha gravid kvinnelig mus tilgjengelig. Som sådan, er det nødvendig å sette opp et tilstrekkelig antall parringer (minst seks hunner med to kvinner per mann).

Flere eksperimenter kan utføres spesifikt på menneske AF celler til å produsere iPS-celler fra friske og syke fostre. Tatt i betraktning det brede spekter av medfødte sykdommer som kan oppdages gjennom fosterdiagnostikk, celler hentet fra AF i løpet av svangerskapet representerer den beste kilden for å utlede iPS celler for både å studere sykdommen 48 og også for å planlegge en regenerativ medisin tilnærming i tilfelle av vev defekter slik som hjerte- eller skjelettmuskel 49, 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Tags

Developmental Biology fostervann celler indusert pluripotente stamceller PiggyBac transposon regenerativ medisin omprogrammering mus.
Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter