Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

Пренатальная диагностика является важным клиническим инструментом для оценки генетических заболеваний (т.е. хромосомных аберраций, моногенные или полигенных / многофакторный заболевания) и врожденные пороки развития (то есть врожденная диафрагмальная грыжа, кистозные поражения легких, пупочная грыжа, Гастрошизис). Амниотической жидкости (AF) клетки легко получить из регулярно запланированных процедур во втором триместре беременности (т.е. амниоцентеза и амниоредукцией) или кесарева сечения 1, 2. Наличие клеток AF от пренатальной или неонатальных пациентов дает возможность использовать этот источник для регенеративной медицины, и некоторые исследователи исследовали возможность лечения различных повреждений тканей или болезни , используя популяцию стволовых клеток , выделенной из AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Возможность легко получать клетки AF от больных пациентов, в окне времени, в котором заболевание часто неподвижен, открывает путь к идее использования этого источника клеток для целей перепрограммирования. Действительно, индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки , полученные из клеток AF может быть дифференцирован в клетках , представляющих интерес для экстракорпорального тестирования на наркотики или для тканевой инженерии подходов, с тем чтобы подготовить адекватный пациент-специфической терапии до родов. Многие исследования уже продемонстрировали способность клеток AF перепрограммировать и дифференцировались в широком диапазоне типов клеток 13, 14, 15, 16, 17 </ SUP>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

С момента открытия Такахаши и Яманака 28 перепрограммирован соматических клеток через форсированной экспрессии четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, CMYC и Klf4), прогресс был достигнут в области перепрограммирования. Рассматривая различные методы, мы можем различать вирусные и невирусных подходы. Первый предполагает использование вирусных векторов (ретровирусы и лентивирусов), которые имеют высокую эффективность, но, как правило, неполное глушение ретровирусного трансгена, причем как следствие частично перепрограммирован клеточной линии и рискинсерционного мутагенеза 29, 30, 31. Невирусная метод использует различные стратегии: т.е. плазмиды, векторы, мРНК, белки, транспозонов. Вывод плюрипотентных клеток свободных трансгенных последовательностей стремится обойти потенциально вредные последствия вытекающей трансгенной экспрессии и инсерционного мутагенеза. Среди всех вышеперечисленных невирусных стратегий, то PiggyBac (PB) система транспозонов / транспозаза требует только перевернутые концевые повторы фланговые трансген и переходную экспрессию транспозазы фермента катализировать вставки или иссечения события 32. Преимущество в использовании транспозонов по сравнению с другими методами для генерации иПК клеток является возможность получения вектора свободных плюрипотентных клеток с не вирусным вектором подход, который показывает ту же самую эффективность ретровирусных векторов. Это возможно с помощью трассировки менее иссечения интегрированной кодировки транспозонов для reprogramming факторы после новой временной экспрессии транспозаза в клетках плюрипотентных 33. Учитывая , что ПБ является эффективным в различных типах клеток , 34, 35, 36, 37, больше подходит для клинического подхода в отношении вирусных векторов, а также позволяет для производства Xeno свободных плюрипотентных клеток в отличие от текущих вирусных производства протоколы , которые используют ксенобиотика условия, эта система используется для получения плюрипотентных клеток из мышиного AF.

Здесь мы предлагаем подробный протокол следующую уже опубликованную работу , чтобы показать производство плюрипотентных плюрипотентных клонов из клеток AF мыши (плюрипотентных клеток-AF) 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры проводились в соответствии с итальянским законодательством. Образцы Мышиные AF собирали из беременных мышей на 13,5 дней после коитуса (DPC) из C57BL / 6-Tg мышей (UBC-GFP) 30Scha / J называется GFP.

1. Производство транспозонов

Примечание: векторы экспрессии транспозону были получены с использованием стандартных методик. Плазмидную ДНК для мыши AF клеток трансфекции получали с использованием коммерческих наборов.

  1. Смешайте 10 нг плазмидной ДНК с 50 DH5 & alpha мкл бактерий в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Выдержите в микроцентрифужных пробирку на льду в течение 20 мин.
  2. Тепловой удар при 42 ° С в течение 40 сек.
  3. Поместите микроцентрифужную пробирку на льду в течение 2 мин.
  4. Добавьте 250 мкл подогретого (37 ° C) лизогении бульона (LB) бульона. Взболтать (300 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 30 мин.
  5. Спред 30 мкл каждой трансформации на LB пластинах с помощью 0,1 мг / мл ампициллина. Разрешить пластин сушить и инкубировать в перевернутом при 37 ° C OVernight.
  6. На следующий день, во второй половине дня, забрать 3 колонии, с использованием стерильных 200 мкл советов, от каждого преобразования и передачи на 0,1 мг / мл LB усилителя.
  7. Взболтать (300 оборотов в минуту) бактерии в течение ночи при температуре 37 ° С.
  8. Для очистки плазмиды используют коммерческие наборы. Сток плазмид при -20 ° C.

2. мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) Культура

  1. Окраска 6-луночные планшеты с 0,1% желатином
    1. Coat пластины под капотом добавлением 1 мл стерильного 0,1% желатина в каждой из шести лунок. Пусть желатин полимеризуется на инкубаторе (37 ° С) в течение 1 часа.
    2. Откажитесь от избытка, и высушить пластин в течение 1 часа.
    3. Используйте парафильмом, чтобы запечатать и хранить пластины при комнатной температуре.
  2. Инактивация MEF с Митомицин C
    1. Оттепель флакон 4 × 10 6 MEF клеток с использованием 37 ° C ванну.
    2. Семенной MEF в капюшоне на чашке Петри (+150 мм) с MEF среды.
    3. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
    4. (ОСТОРОЖНО!) Добавить митомицин С (5 мг / мл), когда клетки вырожденная.
    5. Место клетки в инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) в течение 3 часов.
    6. Удалить среду с клетками митомицином С. Wash три раза 1x фосфатного солевого буфера (PBS).
    7. Добавляют 2 мл коммерческих трипсина и поместить клетки в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин. После того, добавляют 18 мл блокирующего среды, чтобы остановить реакцию трипсина.
    8. Граф клеток с использованием Бюркера камеры в соответствии с протоколом производителя.
    9. Центрифуга клетки при 145 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
    10. Семенной 60000 клеток / см 2 инактивированной MEF на 0,1% желатина покрытием пластин.
    11. Выращивают клетки в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% СО 2, перед посевом AF и / или плюрипотентных клеток-AF.

3. Мышь AF Выделение клеток

  1. Настройка таймерных вязки и проверить вагинальное PLUГ.С. через 24 ч совместного жилья.
  2. Наблюдайте до 13,5 DPC и принести в жертву беременной дамбу через цервикальной дислокации.
  3. Очистите брюшной стенки животного с использованием 70% этанола.
  4. С помощью ножниц, выполнить срединной лапаротомии надрезывать длину брюшной стенки, чтобы получить доступ в брюшную полость.
  5. Выставляют матку с помощью щипцов. Удалите матку с помощью ножниц и передачи в 100 мм чашке Петри заполнены стерильной 1x PBS помещают на лед.
  6. Используйте стереомикроскопа для сбора автофокусировки при 10-кратным увеличением.
  7. Держите матку с пинцетом и удалить маточную стенку с ножницами. Будьте осторожны, чтобы избежать каких-либо повреждений плода мембран и, как следствие утечки околоплодных жидкостей.
  8. Сбор плодов в 100 мм Петри, наполненную стерильным 1x PBS и место на льду.
  9. Захватите плаценту одного плода с тонкость щипцами и место в чистом 100 мм чашку Петри.
  10. Удалите желтка с использованием тонких щипцов точек.
  11. После сбора AF, моют каждый зародыш стерильными 1x PBS с добавлением 1% бычьего эмбриональной сыворотки (FBS) и собирают в 15 мл коническую пробирку, содержащую AF.
  12. Центрифуга AF при 145 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант под капотом и семян осажденные клетки AF.

4. Мышь АФ Культура клеток

  1. Посев мышь AF Cells
    1. За один день до посева, подготовить 0,1% желатин покрытием 6-луночного планшета с митомицин С обработанной MEF.
    2. После сбора AF, семена клетки , полученные из амниоцентеза (около 1 × 10 7 клеток , полученных из 6 плодов) на митотически инактивированных МЭФ с использованием АФ культуральной среды.
    3. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2, заменяя среду через день.
    4. После 7 дней культивирования, трансКлетки фект AF следуя процедуре, описанной ниже.

5. Трансфекция, ИПС-AF Cell Генерация и культура

Примечание: мышиные клетки AF трансфицировали транспозонов плазмиды РВ-tetO2-IRES-OKMS, в сочетании с выражением транспозазу плазмиды (mPBase) и с обратной тетрациклинового трансактиватора транспозонов плазмиды (PB-CAG-rtTA). Все плазмиды были предоставлены профессором Андраш Надь 33.

  1. Смешайте 1 мкг PB-tetO2-IRES-OKMS с 0,5 мкг mPBase и 0,5 мкг PB-КАГ-rtTA (Общая ДНК: 2 мкг) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  2. Развести ДНК до 100 мкл бессывороточной среды (среда Игла, модифицированная Дульбекко - DMEM).
  3. Добавить 8 мкл реагента для трансфекции (напр, Fugene) (при соотношении плазмидной ДНК: трансфекция агент 2 мкг (ДНК) , до 8 мкл агентом трансфекции) в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку , содержащую ДНК.
  4. Выдержите трансфекции смесь реагентов / ДНК в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Добавьте по каплям добавляют 100 мкл смеси реагента для трансфекции / ДНК на лунку на 6-луночный планшет с клетками AF мыши и распространять нежным закрученного, с получением конечного объема 2 мл / лунку. Оставьте в течение 24 часов.
  6. На следующий день после, индуцируют экспрессию факторов в Яманаки (Oct4, Klf4, CMYC, Sox2) путем подачи клетки со средой свежей ИПС-AF, дополненной 1,5 мкг / мл (2 доксициклина мл среды для каждой лунки).
  7. Поток клеток каждый день, без прохода, со свежим DOX-среде, содержащей (поддержания клеток в средах не дополненной доксициклина до точки 5.13).
  8. Соблюдайте клетки в течение 24 часов для экспрессии mCherry и ежедневно для образования колоний (колонии обычно появляются от 20 до 30 дней после трансфекции).
  9. За один день до сбора колонии, подготовить 96-луночного планшета для культуры ткани с митомицин С обработанных MEF.
  10. Выберите единичных колоний в 50 мкл объема USINGA 200 мкл пипеткой, и передавать их последовательно в 96-луночный планшет в отдельных скважинах.
  11. На следующий день после того, как, диссоциируют каждую колонию на отдельные клетки путем добавления 50 мкл коммерческого трипсина и инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С.
  12. Пипетировать вверх и вниз, чтобы детализировать колонию.
  13. Передача 50 мкл трипсина, содержащего Диссоцииро- колонию в новую лунку с инактивированной MEF на 0,1% желатином покрытием 96 луночного планшета заполняли 100 мкл свежей среды ИПС-AF, дополненной доксициклина.
  14. Когда клетки достигают 60-70% сплошности, расщепляется на лунку 24-луночного планшета.
  15. Когда клетки достигают 60-70% слияния, разделения 1: 2 до двух скважин, одна с доксициклин, а другой без доксициклина, чтобы проверить, если колонии появляются также в состоянии без доксициклина.
  16. Продолжайте поддерживать плюрипотентных-AF клонов, доксициклин независимая, на инактивированной MEF в среде ИПС-AF.
  17. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2, CHanging среды ежедневно.

6. щелочной фосфатазы Окрашивание

  1. Выполните щелочной фосфатазы окрашивания в соответствии с протоколом производителя всякий раз, когда есть появление доксициклин независимых плюрипотентных клеток-AF.

7. иммунофлуоресценции

  1. Когда есть появление доксициклин клеток независимых ИПС-AF, семена 150000 клеток / см 2 на лунку 24-луночного планшета с инактивированной MEF и роста клеток в течение 48 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
  2. (ОСТОРОЖНО!) Зафиксировать клетки путем добавления 300 мкл на лунку в 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Добавить 300 мкл 0,1% NP-40 до проницаемыми клеток.
  4. Промыть клетки с 300 мкл 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Добавьте 300 мкл блокирующего буфера (10% лошадиной сыворотки в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Используйте следующие первичные антитела: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (в соотношении 1:100) и SSEA1 (1:80). Развести SSEA1 с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 10% нормальной козьей сыворотки, 0,3 М глицина в 0,1% PBS-Tween-20. Развести все другие антитела с добавлением 10% лошадиной сыворотки в 1X PBS.
  7. Инкубируйте антител в течение ночи при температуре 4 ° С.
  8. Промыть 300 мкл 0,1% PBS-Tween-20.
  9. С помощью вторичных антител, разведенного в 10% лошадиной сыворотки в 1X PBS: Alexa594-конъюгированный козий анти-мышиного IgG (1: 200), Alexa594-конъюгированные куриный анти-козел IgG (1: 200), Alexa594-конъюгированные курица против кроличьего IgG (1: 200), Alexa568-конъюгированный козий анти-мышиных IgM (1: 200). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  10. Полоскание с 1x PBS.
  11. Ядра окрашиваются раствором Hoechst (1: 10000) в 1x PBS.

8. In Vitro дифференцировка клеток

  1. Для формирования висячей капли эмбриональных телец (ЭТ), культивировать одиночные капли (2000 клеток / 20 мкл) на крышку чашки Петри, с помощью дифференциации среды.
  2. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° Си 5% СО 2 в течение 4 -х дней.
  3. Передача ЭТ в 100 мм чашках бактериальный класса в суспензионной культуре в течение 3-х дней в дифференцировке среде.
  4. Пластинчатые ЭТ в 24-луночных пластин, покрытых базальной мембраны матрицы (разбавленного в соотношении 1:10 в DMEM) в течение еще 14 дней.
  5. Для иммунофлюоресценции анализа, используют первичные антитела: T (1: 100), αfp (1: 200) и Tubb3 (1: 500) 37.

9. В Vivo тератомы Формирование

  1. Вводят 100 мкл 1x PBS , содержащий от 1 × 10 6 клеток ИПС-AF в мышцу задней конечности из RAG2 - / - Гс - / - мышей.
  2. Жертвоприношение мышей через цервикальной дислокации через 6 недель после инъекции клеток.
  3. Удалите массы опухоли, отличающиеся по размеру от задних конечностей мышей для следующих анализов.
  4. Вырезать 7-10 мкм поперечные срезы изопентана замораживают опухоли использованием криостата.
  5. Для гематоксилином А.Н.d эозином (HE) Пятно:
    1. Пятно с HE оценить состав опухолевой ткани, в соответствии с протоколом производителя.
  6. Для иммунопероксидазной Stain:
    1. Закрепить секции тератома с 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
    2. Проницаемыми с 0,1% тритона Х-100.
  7. Инкубируйте со следующими антителами: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) и αSMA (1: 100), разведенного в 1% BSA в PBS 1x. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С (для Tubb3) или в течение ночи при 4 ° С (для других антител).
  8. Блок-пероксидаза с использованием 100% метанола в течение 20 мин.
  9. Инкубировать в течение 45 мин при температуре 37 ° С с вторичным антителом против мышиного конъюгированным с пероксидазой хрена (1: 150).
  10. Полоскание с 1x PBS.
  11. Инкубируйте с пероксидазой (HRP) субстрата (См Материалы таблицу) в течение 5 мин.
  12. Промыть проточной водой в течение 5 мин.
  13. Пятно гематоксилином QS в течение 9 сек.
  14. Полоскание с водопроводной водой.
    15. 10. Экстракция РНК из клеток

    1. Использование комплекта для коммерческой добычи РНК в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

    11. Экстракция РНК из тератомы

    1. Гомогенизируйте тератомы с помощью ступки и пестика и жидкий азот, чтобы избежать оттаивание образца.
    2. Взвешивают 25 мг ткани.
    3. Добавить 1 мл коммерческого реагента для экстракции РНК и 200 мкл хлороформа.
    4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    5. Центрифуга при 13000 х г и 4 ° С в течение 15 мин.
    6. Передача очищенную супернатант в новую пробирку.
    7. Для очистки РНК используют набор коммерческого выделения РНК в соответствии с протоколом производителя.

    12. с обратной транскрипцией-полимеразной цепной реакции Анализ

    1. Обобщить первой нити кДНК с использованием обратной транскриптазы для обратной транскрипцией (RT) -полимеразы цепной реакции (ПЦР) и олиго (дТ) Accorдинь с протоколом производителя, чтобы получить 50 нг / мкл кДНК. Развести кДНК с РНКазы водой при концентрации 10 нг / мкл.
    2. Выполнить ОТ-ПЦР с использованием ДНК-полимеразы в соответствии с протоколом производителя, используя 1 нг / мкл кДНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы оценить способность перепрограммирования клетки мыши AF были собраны из плодов GFP мышей. Клетки трансфицировали с круговым транспозонов плазмиды PB-tetO2-IRES-OKMS, выражающей факторы Яманака (Oct4, Sox2, CMYC и Klf4), связанных с флуоресцентным белком mCherry в доксициклина-индуцируемый образом, и обратный тетрациклина трансактиватор (PB- CAG-rtTA) плазмид вместе с выражением транспозазу плазмиды (mPBase). Клетки мышиной AF трансфицировали Oct4, Klf4, CMYC и Sox2 после 1 недели расширения в пробирке над MEF фидерного слоя. Для экспрессии экзогенных факторов, доксициклин был добавлен на следующий день после трансфекции в концентрации 1,5 мкг / мл, как описано выше 39. Выражение mCherry была видна через 24 ч после доксициклина того, что указывает на трансфекцию. Первые колонии с ЭС-подобной морфологией появились через 20 дней после того, как DOXycycline индукции и были выбраны 30 дней после трансфекции. Эти колонии были высеяны на инактивированных фидерных слоев фибробластов. После того, как собирание, выжившие клоны поддерживали в среде , дополненной доксициклина для некоторых пассажей , пока не установлено, что доксициклин независимыми в реплицируемых скважинах 33.

клоны мышей ИПС-AF были оценены по различным параметрам: выражение mCherry, щелочной фосфатазы окрашивания, экспрессию белка плюрипотентности маркеров Oct4, Sox2, Klf4, Nanog и SSEA1, экспрессия экзогенных и эндогенных генов плюрипотентности (Oct4, Klf4, CMYC и Sox2) , в пробирке (ЭТ) и естественных условиях (тератома анализа) дифференцировки. Они выполнили все критерии оценены , чтобы проверить их плюрипотентности, как представлено на рисунке 1.

Рисунок 1
Рисунок 1: Перепрограммирование мыши AF GFP + клеток. (А) Доксициклин независимые колонии плюрипотентных-AF GFP + клетки были отрицательными для экспрессии mCherry и положительным для окрашивания щелочной фосфатазы (ALP). Масштабные полоски = 250 мкм и 100 мкм. (B) Типичные изображения стабильных доксициклин-независимых ИПС-AF + GFP клетки , экспрессирующие Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и SSEA1. Шкала бар = 100 мкм. (C) анализ RT-PCR для экспрессии экзогенных (вектор на основе праймеров, Tg) и эндогенные (Oct4, Klf4, CMYC и Sox2) генов. Бета-2-микроглобулина (b2m) рассматривалась в качестве гена домашнего хозяйства. Перепрограммирован клеточные линии выращивали в присутствии (+) или отсутствие (-) (96 ч) доксициклина. R1 ES клетки использовали в качестве контроля. (ПЦР панель была изменена из Бертин и др. 38 (Д) Брутто вид тератомы , полученный через 6 недель после инъекции ИПР-AF GFP + клеток в подушечки задних конечностей RAG2 - / - Гс - / - мышей. (Е) тератомы гистологическое и иммуногистохимическое подтвердили дифференцировки клеток во все три зародышевых листка (эктодермы, мезодермы и энтодермы). αfetoprotein (АФП, эндодермы), αsmooth актин (αSMA, мезодерма), и В3 тубулина (Tubb3, эктодерма) были обнаружены в опухолевых масс. Шкала бар = 100 мкм. (F) RT-PCR анализ ЭТ и тератомы (Te). C +, положительный контроль; NTC, управление нешаблонном. Виментин (Вим, мезодерма), αfetoprotein (АФП, эндодермы) и β3 тубулина (Tubb3, эктодерма). (ПЦР панель была изменена из ссылки 38). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию гоэто цифра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, выбранный для получения индукции плюрипотентности имеет важное значение для клеток клинической безопасности в отношении долгосрочной трансплантации. В настоящее время существует несколько методов, подходящих для перепрограммирования. Среди не-интегративных методов, вирусный (SeV) вектор Сендай является РНК - вирусом , который может производить большое количество белка без интеграции в ядро инфицированных клеток 40 и может быть стратегия для получения плюрипотентных клеток. SEV векторов может быть привлекательным кандидатом для генерации трансляционной класса плюрипотентных клеток, но это представляет некоторые недостатки. Вирусный репликазы чувствителен к природе трансгенных последовательностей. Так как векторы SEV конститутивно репликации, они могут быть трудно устранить из клеток - хозяев, даже если различные стратегии используются , чтобы улучшить этот аспект 41, 42. Это требует специальной обработки, например, биологической безопасности кабинета 2-го уровня. Там яS только один коммерческий поставщик доступны. Существует ток отсутствие клинико-класса SeV для перепрограммирования и есть высокие издержки производства иПК клеток.

В связи с этим аспектам, система транспозонов можно считать лучшим подходом в отношении векторов SEV, и здесь мы устанавливаем, что эта система является подходящим методом для перепрограммирования клеток AF мыши с различными преимуществами. Это позволяет производить xenofree плюрипотентных клеток вопреки текущим вирусными производственных протоколов, которые используют ксенобиотиков условия. Это не имеет видимых видовой барьер и имеет емкость трансген грузов больше, чем вирусы. Это обеспечивает простую и надежную доставку плазмиды транспозонов посредством использования стандартного метода трансфекции клеток, который может быть легко выполнена в любой лаборатории, оборудованной биологической безопасности кабинета 1-го уровня. Транспозаза повторное выражение позволяет удалять PB элементов с последующим поколением след свободных от мышиных и человеческих плюрипотентных клеток, как было показано в различных сеLL линии 32, 34, 35. Различные исследования показали , что системы транспозонов отображать более низкую частоту в нацеливание рядом связанных с раком генов и меньшим смещением в ориентации активных генов по сравнению с вирусными векторами на основе 43, 44, 45, 46, 47. Перепрограммирование основанный на транспозонов зависит от выбранного способа доставки, и это ограничение из-за сопротивления или токсичности, связанной с методами трансфекции ДНК (липофекцию, электропорации или nucleofection). Здесь мы использовали не-липосомальной композиции, предназначенный для трансфекции ДНК, которая хорошо работала с мышью AF клеток. Если другие клетки используются, тесты будет необходимо использовать лучший способ доставки с точки зрения высокой эффективности и низкой токсичности. Суммарно, метод транспозонов PB считается безопаснымd низкая стоимость, но с более низкой эффективностью по сравнению с векторами SEV.

Что касается процедуры, чтобы получить мышь AF клетки, очень важно иметь беременной самки мыши доступны. Таким образом, необходимо создать достаточное количество спариваний (по крайней мере, шесть самок с двумя самками на самца).

Другие эксперименты могут быть выполнены конкретно на клетках человека AF для получения плюрипотентных клеток от здоровых и больных плодов. Учитывая широкий спектр врожденных заболеваний , которые могут быть обнаружены с помощью пренатальной диагностики, клетки , полученные из AF во время беременности являются лучшим источником для получения клеток плюрипотентных как для изучения болезни 48 , а также для планирования регенеративной подход медицины при дефектах тканей такие как сердечная или скелетной мышцы 49, 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Tags

Биология развития выпуск 120 амниотической жидкости клетки индуцированные плюрипотентные стволовые клетки PiggyBac транспозонов регенеративная медицина перепрограммирование мышь.
Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter