Summary
该原稿描述的表型，并通过流式细胞从大鼠肾脏定居巨噬细胞的定量分析的详细协议。所得染色的细胞也可以用于其它应用，包括细胞分选，基因表达分析或功能性研究，从而增加在实验模型中获得的信息。
Protocol
该指令欧洲议会2010/63 / EU和国家指南二千零十三分之五十三下面这个协议被批准由当地机构动物护理和使用委员会。
1.试剂和溶液的制备
- 制备所有的试剂和溶液在无菌条件下并在层流罩下使用。保持在4℃下的解决方案。
- 制备染色缓冲液（2％胎牛血清（FBS）的在1×Dulbecco氏PBS）中。
- 加入0.5毫克胶原酶每个毫升盐水的制备胶原酶溶液。
- 制备氯胺酮/赛拉嗪的麻醉溶液（2:1体积/体积）。
2.肾脏灌注和提取
- 氯胺酮/甲苯噻嗪腹腔注射（75毫克/ 12毫克/千克体重）麻醉大鼠。仔细捏皮肤的小折，以检查该动物被充分麻醉。然后，盖上眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。注：4-纹个大的Wistar大鼠在此测定法中使用。
- 一旦大鼠被完全麻醉，将其放置在手术台上以仰卧姿势。
- 应用70％的乙醇于腹部。
- 做一个切口，中央通过腹部皮肤和腹膜，从耻骨到胸腔，暴露胸腔和腹腔。
- 注入盐溶液（0.9％）为腹主动脉灌注直到所有血液从肾脏除去使用灌注系统肾脏。切开主动脉在腹部的水平，以帮助释放血液。
- 从肾门（肾静脉，动脉和输尿管）切割取下大鼠双侧肾脏。为了解封肾脏，用手指，小心地分离胶囊11按下肾脏的边缘。
- 放置肾成Hanks'平衡盐溶液中。
3.肾消化细胞悬液
- 切半肾用剪刀切成小块，并把片放入1.5 ml管。
注：以下所有浓度为1个样品（1/2大鼠的肾脏）计算。 - 加入1 ml的胶原酶溶液中，并在37℃孵育30分钟。通过颠倒混合，每5分钟，以确保该胶原酶溶液可将整个组织。
- 收集溶液，并使之通过一个过滤器（40微米）配有一个柱塞的帮助，并且在10毫升染色缓冲液重悬它。
- 离心在400×g离心15分钟。
- 重悬在1ml的ACK（氯化铵 - 钾）溶解缓冲液沉淀。 1分钟在室温下30秒后，加入10 mL染色缓冲液以停止反应。
- 离心在400×g离心10分钟。
- 重悬在染色缓冲液（1ml）中的适当体积的沉淀并用过滤器（30微米）过滤细胞悬浮液。
- 计数上使用血球台盼蓝排除细胞的数目和2百万个细胞添加到1.5ml管站都进不去。
4.细胞染色和流式细胞仪分析
- 离心细胞，在100×g离心5分钟。
- 重悬在100μl大鼠血清的粒料（稀释1：100），10分钟，在4℃下阻断Fc受体。
- 通过加入1ml染色缓冲液和离心机100 xg的5分钟洗涤。
- 混合为细胞表面染色的抗体在100μl染色缓冲液为每个条件：CD45 APC-Cy7的（1：100），CD163 A647（4：100）和溶液来检测活细胞（3：1000）。
- 在黑暗中再悬浮在抗体混合物20分钟将细胞沉淀，在4℃。
- 通过加入1ml染色缓冲液和离心机在100×g离心5分钟洗涤。重复此步骤。
- 在4°C黑暗环境中添加600微升固定/通透的解决方案20分钟。
- 在170 xg离心用1ml透/洗涤缓冲液，离心洗涤2次，每次5分钟。
- 添加CD68 FITC抗体（35：1000）为intracel细胞性染色至100μl透/洗涤缓冲液对各条件。
- 重悬在CD68抗体溶液中的沉淀，并在黑暗中在4℃孵育50分钟。
- 用1ml透/洗涤缓冲液，离心洗涤，在170×g离心5分钟。
- 重悬在100μl透/洗涤缓冲液的沉淀，添加CD86PE抗体（35：1000），并在黑暗中在4℃孵育20分钟。
- 通过加入1ml透/洗涤的，在100×g离心5分钟，缓冲液和离心清洗。
- 重悬在100μl透/洗涤缓冲液的颗粒和把它传递给流式细胞管的流动。
- 通过流式细胞仪分析样品。决定在侧向散射光/前向散射光（SSC / FSC）窗门控活细胞CD45染色。在第二步骤中，分析在CD68 +细胞的CD86和CD163表达。
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Representative Results
我们分析了巨噬细胞的异质性与肾脏巨噬细胞浸润的存在增加相关肾损伤的炎症实验模型。在此模型中，肾损伤在饮水中Wistar大鼠3周诱导醛固酮（1毫克-1千克-1天）加的盐（NaCl 1％）的施用，如先前报道12。
我们的实验中的时间表中示出在图1中，首先，肾细胞中分离，采用机械方法和用胶原酶（ 图1A）进一步酶消化。此后，红细胞裂解并通过使用流式细胞仪检测肾巨噬细胞。细胞用抗CD45，CD86和CD163为膜检测和CD68细胞内染色（ 图1B）一起温育。最后，巨噬细胞p的表型根据方案opulations分析显示出图1C。
肾细胞巨噬细胞含量通过与CD45和CD68（ 图2A）双阳性选择细胞进行分析。使用上述协议，增加在醛固酮处理的大鼠中观察到的 CD45 + / CD68 +巨噬细胞相比，对照组（0.57±0.16对0.25±0.02，％CD45 + / CD68每总肾细胞+巨噬细胞）（ 图2，表见插图 ）。 的 CD45 + / CD68 +巨噬细胞的细胞活力，如通过流式细胞术用紫染料染色测定，是常规大于95％。此后，CD86（M1标记物）和CD163（M2标记物）的表达中所评估的（数据未示出） CD45 + / CD68 +细胞。醛固酮增多行政CD45 + / CD68 + / CD86 + M1的含量巨噬细胞（2.87±2.3对1.36±0.68;％ 的 CD45 + / CD68 + / CD86 +每总CD45 + / CD68 +细胞的巨噬细胞）（ 图2）。然而，在这两个醛固酮治疗组和对照组中观察到的 CD45 + / CD68的低编号+ / CD163 + M2巨噬细胞。来分析低CD163表达是否被实验方案中涉及到的蛋白水解脱落，我们重复此过程，包括胶原酶消化，在来自大鼠腹膜分离的巨噬细胞，如前所述13。 如图2B报道，CD45 + / CD68 +巨噬细胞为阳性既CD86和CD163，验证所选择的抗体的效用，并确认我们的协议为M1 / M2巨噬细胞的大鼠肾脏表征的有效性。
为了验证这些结果，与上述实验模型的肾损伤相关的炎症反应通过免疫组织化学和实时PCR分析。如在图3报道，增加在醛固酮+盐处理的大鼠中观察到CD68 +巨噬细胞，与对照组相比。然后，进行了测定巨噬细胞的表型标记物来表征肾M1 / M2巨噬细胞分布。醛固酮+盐处理后观察到的iNOS增加mRNA的表达和IFN-γ（M1标记），而的Arg1或IL-10的mRNA表达量（M2巨噬细胞标记）醛固酮给药后没有改变。总之，这些结果证实，醛固酮+盐给药介导的体内的炎性M1巨噬细胞的表型。
图1：协议肾细胞的分离和巨噬细胞流式细胞术检测。 （A）和巨噬细胞的检测用流式细胞仪（B）的g>的示意图。根据不同的分布CD45，CD68，CD86和CD163标志（C）不同的巨噬细胞表型的代表方案。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：M1和M2巨噬细胞标志物在肾脏从醛固酮通过流式细胞仪时大鼠 CD45染色的代表点图在侧向散射光/前向散射光（SSC / FSC）窗口（ 门控活细胞， 离开了 。 ）从在控制和醛固酮+盐处理的动物的肾脏悬浮液。在散点图内的框标识活细胞表达CD45。包括在这个盒子细胞进行分析以确定CD68 +细胞CD86和CD163表达（A，右 ）。散点图腹膜的巨噬细胞作为用于检测CD45，CD68，CD86和CD163的阳性对照，采用先前所用的相同的策略。该数据以平均值±SEM（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：醛固酮+盐务管理局后炎症反应。 （A）CD68染色和的代表性图像（B）中通过RT-PCR对M1标记（iNOS和INFγ）和M2标记（的Arg1和IL-10）的控制和醛固酮+盐处理的大鼠测量mRNA水平的定量分析。数据速递ED平均±SEM。 * P <0.05与对照。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
巨噬细胞是发挥不同炎性疾病，包括肾疾病中起重要作用的异构细胞。有在肾脏疾病中的巨噬细胞子集的表征越来越大的兴趣，因为每个细胞巨噬细胞亚群以不同的方式对肾损伤的发展有助于，据报道在肾小球肾炎，糖尿病性肾病和肾癌14-16。在急性肾损伤的早期阶段中，M1巨噬细胞的一个优势是观察，促进肾小管坏死和炎症。然而，在稍后阶段的M2巨噬细胞有较高含量被观察到的解决炎症并参与组织重塑。在慢性肾病，M1和M2的巨噬细胞同时共存在，尽管M1可以是主要的，从而增加了与永久炎性肾损害。因此，重要的是要提高我们的巨噬细胞亚型在肾脏病的病理生理作用的知识。免疫组化研究不能确定在一个可靠的方法17的巨噬细胞亚群的百分比。因此，有必要开发新的技术，以定量地确定不同的巨噬细胞的表型，并了解这些细胞对肾的炎症反应的作用。
该原稿描述的协议通过流式细胞术来确定在大鼠肾脏的巨噬细胞子集的数量和表型。在我们的研究中，大鼠进行醛固酮施用肾损害的炎性模型。在此模型中，我们观察到增加的 CD45 +和C68 +巨噬细胞浸润如通过流式细胞术确定，并通过免疫组织化学证实。此外，M1巨噬细胞（CD68 + / CD86 +），但不M2巨噬细胞的富集，分别在醛固酮处理的小鼠中观察到。这些结果由确定M 1（iNOS和IFN-γ）的mRNA表达和M2巨噬进一步证实年龄标记（的Arg1或IL-10）。隔离协议期间流式细胞仪分析报低细胞死亡率。有几个因素会影响细胞生存力和表面标记检测，例如组织离解的程度以及持续时间和组织消化（酶促，机械等 ）的类型。过度消化增加细胞死亡和巨噬细胞活化，并降低表面标记的表达，而相反的效果可能会从低肾脏离解的结果。然而，当我们的协议在从大鼠腹膜分离巨噬细胞进行的，在这些细胞中观察到CD86和CD163的增强的存在。
我们的协议已被优化，以确定从大鼠醛固酮介导的高血压在肾脏细胞巨噬细胞的异质性，并且因此，可以被外推到其它炎性肾疾病模型。但是，此过程可适于每种实验条件，因为炎症修改组织的完整性，从而影响组织的消化胶原酶率。
要注意的是用于测定总的巨噬细胞含量是很重要的，将细胞固定和透化以允许与CD68抗体18内标记。对于固定的协议包括使用甲醛的可能影响荧光染料缀合的初级抗体，尤其是藻红蛋白。要解决这个问题，除了固定/通透的解决方案，并进一步CD68染色后进行孵育CD86-PE抗体。另一方面，需要注意的是甲醛也可以与可能后的巨噬细胞分离执行的其他测定法，如mRNA表达测定干扰是很重要的。不过，也有可从甲醛固定细胞分离的mRNA商业试剂盒。
总之，该协议描述了肾的巨噬细胞的表型特征的方法在一个quantitati已经使用流式细胞仪的方式。总体而言，这里描述的方案是易于使用，可重复的，和有用的从大鼠肾脏区分不同巨噬细胞群体。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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