Summary
Dette håndskrift beskriver en detaljeret protokol for fænotypisk og kvantitativ analyse af hjemmehørende makrofager fra rotte nyrer ved flowcytometri. De resulterende farvede celler kan også bruges til andre formål, herunder celle sortering, genekspression analyse eller funktionelle studier, hvilket øger oplysninger indhentet i den eksperimentelle model.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af den lokale Institutional Animal Care og Brug udvalg efter direktiv 2010/63 / EU af Europa-Parlamentets og National Guideline 53/2013.
1. Forberedelse af reagenser og løsninger
- Forbered alle de reagenser og opløsninger under sterile forhold og bruge under en laminar flow hætte. Hold opløsningerne ved 4 ° C.
- Forbered farvning buffer (2% kalvefosterserum (FBS) i 1x Dulbeccos PBS).
- Forbered collagenaseopløsning ved tilsætning af 0,5 mg collagenase til hver ml saltvand.
- Forbered anæstesi opløsning af ketamin / xylazin (2: 1 v / v).
2. Nyre Perfusion og Extraction
- Bedøver rotter ved intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin (75 mg / 12 mg / kg vægt). knibe forsigtigt en lille hudfold, for at kontrollere, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet. Derefter dække øjnene med dyrlægen salve for at forhindre tørhed mens under anæstesi. Bemærk: 4-month-gamle Wistar-rotter anvendes i dette assay.
- Når rotten er totalt bedøvet, placere den på en kirurgisk bord i rygleje.
- Påfør 70% ethanol til maven.
- Foretag en central snit gennem den abdominale hud og bughinden, fra pubis til brystkassen, for at blotlægge de pleurale og bughule.
- Injicer saltvandsopløsning (0,9%) i den abdominale aorta til perfundere nyrer bruger perfusionssystem indtil alt blod fjernes fra nyrerne. Skær aorta i den abdominale plan for at hjælpe med at frigive blodet.
- Fjern begge nyrer fra rotten ved skæring fra den renale hilum (renal vene, arterie og ureter). At decapsulate nyrerne, tryk på kanten af nyren ved hjælp fingre, omhyggeligt adskille kapslen 11.
- Placer nyren i Hanks balancerede saltopløsning.
3. Nyre Fordøjelse og Cell Suspension
- Skær halvdelen af en nyre med en saks i små stykker og sættestykker i et 1,5 ml rør.
Bemærk: Alle følgende koncentrationer beregnes for en prøve (1/2 rottens nyre). - Der tilsættes 1 ml collagenaseopløsningen og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Bland ved inversion hver 5 min for at sikre, at collagenaseopløsningen adgang hele væv.
- Opsaml opløsningen og ledes gennem en si (40 um) ved hjælp af et stempel, og resuspender det i 10 ml farvning puffer.
- Centrifuger ved 400 xg i 15 min.
- Re-suspendere pellet i 1 ml ACK (Ammonium-Klorid-Kalium) lyse Buffer. Efter 1 min 30 sek ved stuetemperatur, tilsættes 10 ml farvning puffer for at standse reaktionen.
- Centrifuger ved 400 xg i 10 min.
- Resuspender pellet i en passende volumen af farvning puffer (1 ml) og filtreres cellesuspensionen ved anvendelse af en si (30 um).
- Tæl antallet af celler under anvendelse af trypanblåt-eksklusion på et hæmocytometer og tilsæt 2 millioner celler til et 1,5 ml rør til stalingen.
4. Cell Farvning og flowcytometrianalyse
- Centrifuger cellerne ved 100 x g i 5 min.
- Resuspender pellet i 100 pi rotteserum (fortyndet 1: 100) i 10 minutter ved 4 ° C for at blokere Fc-receptorer.
- Vask ved tilsætning af 1 ml farvning puffer og centrifugeres 100 xg i 5 min.
- Bland antistoffer til celleoverfladen farvning i 100 pi farvning buffer for hver betingelse: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) og opløsning til at detektere levende celler (3: 1,000).
- Resuspender cellepelleten i antistoffet mix i 20 min ved 4 ° C i mørke.
- Vask ved tilsætning af 1 ml farvning puffer og centrifugeres ved 100 xg i 5 min. Gentag dette trin.
- Tilsættes 600 pi Fiksering / Permeabilisering opløsning i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask 2 gange med 1 ml Permeabilisering / Wash buffer og centrifugeres ved 170 xg i 5 min.
- Tilsæt CD68 FITC-antistof (35: 1000) for Intracellastet, farvning til 100 pi Permeabilisering / Wash buffer for hver betingelse.
- Resuspender pellet i CD68-antistofopløsning og inkuberes 50 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask med 1 ml Permeabilisering / Wash buffer og centrifugeres ved 170 xg i 5 min.
- Resuspender pellet i 100 pi Permeabilisering / Wash buffer, tilsæt CD86PE antistof (35: 1,000) og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask ved tilsætning af 1 ml Permeabilisering / Wash buffer og centrifugeres ved 100 xg i 5 min.
- Re-suspendere pellet i 100 ul Permeabilisering / Wash buffer og videregive det til en flowcytometri rør.
- Analysere prøver ved flowcytometri. Bestem CD45 farvning i levende celler gated i Side-spredte lys / fremadrettede spredte lys (SSC / FSC) vinduet. I et andet trin, analysere CD86 og CD163 ekspressionen i CD68 + celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyserede makrofag heterogenitet i en inflammatorisk eksperimentel model for nyreskade forbundet med øget tilstedeværelse af infiltrerende makrofager i nyren. I denne model blev nyreskade induceret ved administration af aldosteron (1 mg 1 kg-1 dag) plus salt (NaCl 1%) i drikkevand i 3 uger i Wistar-rotter, som tidligere rapporteret 12.
Tidsplanen for vores eksperimenter er vist i figur 1. Først blev nyreceller isoleret ved anvendelse af mekaniske metoder og yderligere enzymatisk fordøjelse med collagenase (figur 1A). Derefter blev erythrocytter lyseret og renale makrofager blev detekteret ved hjælp af flowcytometri. Celler blev inkuberet med antistoffer for CD45, CD86 og CD163 for membran påvisning og CD68 til intracellulær farvning (figur 1B). Endelig fænotypen af makrofagen populations blev analyseret i henhold til ordningen viste i figur 1C.
Renal makrofag-indholdet blev analyseret ved selektion af celler med dobbelt positivitet for CD45 og CD68 (figur 2A). Under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, en stigning i CD45 + / CD68 + makrofager blev observeret i aldosteron-behandlede rotter i sammenligning med kontrolgruppen (0,57 ± 0,16 vs. 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + makrofager pr totale renale celler) ( Figur 2, se tabel indsats). Cellelevedygtighed af CD45 + / CD68 + makrofager, som bestemt ved flowcytometri farvning med violet farvestof, var rutinemæssigt større end 95% (data ikke vist) .Thereafter, CD86 (M1 markering) og CD163 (M2 markør) ekspression blev vurderet blandt de CD45 + / CD68 + celler. Aldosteron administration steg indholdet af CD45 + / CD68 + / CD86 + M1makrofager (2,87 ± 2,3 vs. 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + makrofager pr totale CD45 + / CD68 + celler) (figur 2). Men et lavt antal CD45 + / CD68 + / CD163 + M2 makrofager blev observeret i både aldosteron-behandlede og kontrolgrupper. At analysere, om den lave CD163 ekspressionen blev relateret til proteolytisk afgivelse under forsøgsprotokollen, vi gentog denne fremgangsmåde, herunder collagenase fordøjelse, i makrofager isoleret fra rotte peritoneum, som tidligere beskrevet 13. Som rapporteret i figur 2B, CD45 + / CD68 + peritoneale makrofager var positive for både CD86 og CD163, validering nytten af de udvalgte antistoffer og bekræfter effektiviteten af vores protokol til karakterisering af M1 / M2 makrofager i rotte nyre.
For at validere disse resultater,den inflammatoriske reaktion forbundet med nyreskade i de ovennævnte eksperimentelle modeller blev undersøgt ved immunohistokemi og real-time PCR. Som rapporteret i figur 3, øget CD68 + makrofager blev observeret i aldosteron + salt behandlede rotter, sammenlignet med kontrol. Derefter blev makrofag fænotype markører bestemmes at karakterisere renal M1 / M2 makrofag distribution. Forøget mRNA ekspression af iNOS og IFN-γ (M1 markører) blev observeret efter aldosteron + salt behandling, hvorimod ARG1 eller IL-10-mRNA-ekspression (M2 makrofagmarkører) ikke ændrede efter aldosteron administration. Samlet set viser disse resultater bekræfter, at aldosteron + salt administration medierer den inflammatoriske M1 makrofag fænotype in vivo.
Figur 1: Protokol for Renal Cells Isolering og makrofag Detection ved flowcytometri. (A) og makrofag detektering ved flowcytometri (B). Repræsentant ordning af de forskellige makrofag fænotyper efter anden fordeling for CD45, CD68, CD86 og CD163 markører (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: M1 og M2 makrofagmarkører i nyrer fra aldosteron behandlede rotter ved flowcytometri Repræsentative dot-plots af CD45 farvning i levende celler gated i Side-spredte lys / fremadrettede spredte lys (SSC / FSC) vindue (A, venstre. ) fra nyre suspensioner i kontrol og aldosteron + salt-behandlede dyr. Boksen inde dot plots identificerer levende cellerudtrykker CD45. Celler indeholdt i denne boks blev analyseret for at bestemme CD86 og CD163 ekspressionen i CD68 + celler (A, højre). Dot plot for peritoneale makrofager som positiv kontrol til påvisning af CD45, CD68, CD86 og CD163, der anvender den samme strategi tidligere anvendte. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Inflammatorisk respons efter aldosteron + Salt Administration. (A) Repræsentative billeder af CD68-farvning og (B) kvantitative analyser af mRNA-niveauer målt ved RT-PCR for M1 markører (iNOS og INFy) og M2 markører (ARG1 og IL-10) i kontrol og aldosteron + salt-behandlede rotter. Data expressed som middelværdi ± SEM. * P <0,05 over for kontrol. Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager er heterogene celler, der spiller en vigtig rolle i forskellige inflammatoriske sygdomme, herunder nyrelidelser. Der er stigende interesse for karakterisering af makrofager delmængder i nyresygdom, fordi hver makrofag subpopulation bidrager på en anden måde til udviklingen af nyreskade, som rapporteret i glomerulonefritis, diabetisk nefropati og nyrekræft 14-16. I de tidlige stadier af akut nyreskade, er en overvægt af M1 makrofager observeret, fremme tubulær nekrose og inflammation. Men i senere faser observeres et højere indhold af M2 makrofager til at løse inflammation og deltage i vævsomdannelse. Ved kronisk nyresygdom, både M1 og M2 makrofager sameksistere samtidig, selv om M1 kan være fremherskende, hvilket øger og fastholde inflammatorisk nyreskade. Derfor er det vigtigt at øge vores viden om patofysiologiske rolle makrofag undertyper i nyresygdom. Immunohistokemiske undersøgelser kan ikke bestemme den procentdel af makrofag delmængder på en robust måde 17. Derfor er det nødvendigt at udvikle nye teknikker til kvantitativt at bestemme de forskellige makrofag fænotyper og forstå den rolle, disse celler på renal inflammatorisk respons.
Dette håndskrift beskriver en protokol til at bestemme antallet og fænotypen af renale makrofager delmængder ved flowcytometri i rotter. I vores undersøgelse blev rotter underkastet en inflammatorisk model af nyreskade ved indgivelse af aldosteron. I denne model, observerede vi øget CD45 + og C68 + makrofaginfiltration som bestemt ved flowcytometri og bekræftet ved immunohistokemi. Endvidere en berigelse af M1 makrofager (CD68 + / CD86 +), men ikke M2 makrofag, blev observeret i aldosteron-behandlede mus. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved at bestemme mRNA-ekspression af M1 (iNOS og IFN-γ) og M2 macrophalder markører (ARG1 eller IL-10). Flowcytometri analyse rapporteret dødelighed lav celle under isolation protokollen. Der er flere faktorer, der kan påvirke cellernes levedygtighed og overflademarkører påvisning, såsom niveauet af væv dissociation samt varighed og type vævsfordøjelse (enzymatisk, mekaniker, etc.). Overdreven fordøjelse øger celle dødelighed og makrofag aktivering og formindsker overflade markør udtryk, mens den modsatte effekt kan skyldes lav nyre dissociation. Men da vores protokol blev gennemført i makrofager isoleret fra rotte peritoneum blev øget tilstedeværelse af CD86 og CD163 observeret i disse celler.
Vores protokol er blevet optimeret til at bestemme makrofag heterogenitet i nyrer fra rotter med aldosteron-medieret hypertension, og derfor kan ekstrapoleres til andre inflammatoriske renale sygdomsmodeller. Dog kan denne procedure tilpasses hver eksperimentel tilstand, fordi betændelse ændrervæv integritet, hvilket påvirker hastigheden af væv fordøjelse ved collagenase.
Det er vigtigt at bemærke, at til bestemmelse af total makrofag indhold blev celler fikseret og permeabiliseret til at tillade intracellulær mærkning med CD68-antistof 18. Protokollen for fiksering omfattede brugen af formaldehyd, der kan påvirke fluorokromer konjugeret til primære antistoffer, især phycoerythrin. Du kan løse problemet, blev inkubation med CD86-PE-antistof udføres efter tilsætning af Fiksering / Permeabilisering løsning og yderligere CD68-farvning. På den anden side er det vigtigt at bemærke, at formaldehyd kan også forstyrre andre assays, der kan udføres efter makrofager isolation, såsom mRNA-ekspression assays. Men der er kommercielle kits til rådighed til isolering af mRNA fra formaldehyd fikserede celler.
Sammenfattende denne protokol beskriver en metode til fænotypisk karakterisering af renale makrofager i en quantitative måde under anvendelse af flowcytometri. Samlet set den her beskrevne protokol er nem at bruge, reproducerbar og nyttigt at skelne forskellige makrofag populationer fra rotte nyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
