Summary
Diese Handschrift beschreibt ein detailliertes Protokoll für phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren durch Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können auch für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellsortierung, Genexpressionsanalyse oder funktionelle Untersuchungen, wodurch die in dem experimentellen Modell erhaltenen Informationen zu erhöhen.
Protocol
Dieses Protokoll wurde von den lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse nach der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments und der nationalen Richtlinie 53/2013 genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen unter sterilen Bedingungen und Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Halten Lösungen bei 4 ° C.
- Bereiten Färbepuffer (2% fötalem Rinderserum (FBS) in 1x Dulbecco-PBS).
- Bereiten Kollagenase-Lösung durch Zugabe von 0,5 mg Kollagenase zu jedem ml Kochsalzlösung.
- Bereiten Anästhesie Lösung von Ketamin / Xylazin (2: 1 v / v).
2. Nierenperfusion und Extraktion
- Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (75 mg / 12 mg / kg Gewicht). kneifen Sie vorsichtig eine kleine Hautfalte, um zu überprüfen, dass das Tier ausreichend betäubt. Dann decken die Augen mit vet Salbe Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Hinweis: 4-month-alten Wistar-Ratten werden in diesem Test verwendet.
- Sobald die Ratte völlig betäubt ist, legen Sie es auf einem OP-Tisch in Rückenlage.
- Bewerben 70% Ethanol auf den Bauch.
- Machen Sie einen zentralen Schnitt durch die Bauchhaut und Bauchfell, vom Schambein bis zum Brustkorb, die Pleura und Bauchhöhle zu belichten.
- Injizieren Kochsalzlösung (0,9%) in die Bauchaorta zu perfundieren Nieren ein Perfusionssystem verwendet, bis das gesamte Blut aus Nieren entfernt wird. Schneiden Sie die Aorta auf der Bauchebene zu helfen, das Blut freigeben.
- Entfernen Sie beide Nieren von Ratten durch vom Nierenhilus Schneiden (renale Vene, Arterie und Harnleiter). Um die Niere decapsulate, drücken Sie die Kante der Niere Fingern vorsichtig die Kapsel zu trennen 11.
- Legen Sie die Niere in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung.
3. Nieren Verdauung und Zellsuspension
- Schneiden Sie die Hälfte einer Niere mit einer Schere in kleine Stücke schneiden und dieStücke in ein 1,5 ml Röhrchen.
Hinweis: Alle folgenden Konzentrationen für 1 Probe berechnet (1/2 Rattenniere). - 1 ml der Kollagenase-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Mischen durch Umdrehen alle 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Kollagenase-Lösung das gesamte Gewebe zugreift.
- Sammeln Sie die Lösung und gibt sie durch ein Sieb (40 um) mit Hilfe eines Kolbens und Resuspension in 10 ml Färbepuffer.
- Zentrifuge bei 400 × g für 15 min.
- Re-suspend das Pellet in 1 ml ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysepuffer. Nach 1 min 30 sec bei Raumtemperatur, gibt 10 ml Färbepuffer die Reaktion zu stoppen.
- Zentrifuge bei 400 × g für 10 min.
- Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Färbepuffer (1 ml) und Filtern der Zellsuspension mit einem Sieb (30 um).
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer und mit 2 Millionen Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen für staining.
4. Zellfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse
- Zentrifugen Zellen bei 100 xg für 5 min.
- Resuspendieren des Pellets in 100 & mgr; l Rattenserum (verdünnt 1: 100) für 10 min bei 4 ° C Fc-Rezeptoren zu blockieren.
- Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge 100 xg für 5 min.
- Mischen Sie die Antikörper für Zelloberflächenfärbung in 100 ul Färbepuffers für jede Bedingung: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) und die Lösung zu lebenden Zellen erkennen (3: 1000).
- Resuspendieren des Zellpellets in der Antikörpermischung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Hinzufügen 600 ul Fixation / Permeabilisierung Lösung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Waschen 2-mal mit 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 170 xg für 5 min.
- Fügen Sie den CD68 FITC-Antikörper (35: 1000) für die intracelzelluläre Färbung zu 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer für jede Bedingung.
- Resuspendieren des Pellets in der CD68-Antikörperlösung und inkubiere 50 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Waschen mit 1 ml Permeabilisierungs / Waschpuffer und Zentrifuge bei 170 xg für 5 min.
- Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer, fügen CD86PE Antikörper (35: 1000) und für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert.
- Waschen durch Zugabe von 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 100 xg für 5 min.
- Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer und übergeben es an einer Durchflusszytometrie Röhre.
- Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie CD45-Färbung in Live-gated-Zellen in der Seitenstreulicht / Vorwärtsstreulicht (SSC / FSC) Fenster. In einem zweiten Schritt analysieren CD86 und CD163 Expression in CD68 + Zellen.
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Representative Results
Wir analysierten Makrophagen Heterogenität in einer entzündlichen experimentellen Modell der Nierenschädigung mit einer erhöhten Präsenz von Makrophagen in der Niere zu infiltrieren. In diesem Modell wurde Nierenschäden durch die Gabe von Aldosteron (1 mg -1 kg -1 Tag) und Salz (NaCl 1%) im Trinkwasser für 3 Wochen bei Wistar - Ratten induziert, wie zuvor 12 berichtet.
Der Zeitplan unserer Versuche ist in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wurden Nierenzellen isoliert unter Verwendung von mechanischen Verfahren und weiteren enzymatischen Verdau mit Kollagenase (1A). Danach wurden Erythrozyten lysiert und renal Makrophagen wurden mit Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die Zellen wurden mit Antikörper für CD45, CD86 und CD163 für Membran Nachweis und CD68 für die intrazelluläre Färbung (1B) inkubiert. Schließlich ist der Phänotyp der Makrophagen-populations wurde nach dem Schema analysiert in 1C gezeigt.
Renal wurde Makrophagengehalt analysiert durch Zellen mit Dual - Positivität für CD45 und CD68 (2A) ausgewählt wird . Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokoll, eine Erhöhung der CD45 + / CD68 + Makrophagen in Aldosteron behandelten Ratten beobachtet wurde , verglichen mit der Kontrollgruppe (0,57 ± 0,16 vs 0,25 ± 0,02% CD45 + / CD68 + Makrophagen pro Gesamtnierenzellen) ( Abbildung 2, siehe Tabelle einfügen). Die Lebensfähigkeit der Zellen von CD45 + / CD68 + Makrophagen, wie durch Durchflusszytometrie Färbung mit violetten Farbstoff bestimmt, wurde routinemäßig mehr als 95% (Daten nicht gezeigt) .Thereafter, CD86 (M1 - Marker) und CD163 (M2 Marker) Expression unter der beurteilt wurde CD45 + / CD68 + -Zellen. Aldosteron Verwaltung erhöht den Gehalt an CD45 + / CD68 + / CD86 + M1Makrophagen (2,87 ± 2,3 gegenüber 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + Makrophagen pro Gesamt CD45 + / CD68 + Zellen) (Abbildung 2). Jedoch ist eine geringe Zahl von CD45 + / CD68 + / CD163 + M2 Makrophagen wurden in beiden Aldosteron behandelten und Kontrollgruppen beobachtet. Um zu analysieren , ob die Expression niedrig CD163 wurde während des Versuchsprotokoll gegen proteolytischen Abwurf im Zusammenhang mit wiederholten wir dieses Verfahren, einschließlich Collagenaseverdau, in Makrophagen von Ratten Peritoneum isoliert, wie zuvor 13 beschrieben. Wie in 2B angegeben, CD45 + / CD68 + peritonealen Makrophagen wurden für positive sowohl CD86 und CD163, die Nützlichkeit der ausgewählten Antikörper zu validieren und die Wirksamkeit unserer Protokoll zur Charakterisierung von M1 / M2 Makrophagen in Rattenniere bestätigt.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen,die entzündliche Reaktion mit Nierenschädigung in den obigen experimentellen Modellen zugeordnet wurde durch Immunhistochemie und Echtzeit-PCR untersucht. Wie in Figur 3 angegeben, erhöhte CD68 + Makrophagen in Aldosteron + Salz behandelten Ratten beobachtet wurden, im Vergleich zur Kontrolle. Dann wurden Makrophagen-Phänotyp-Marker bestimmt Nieren-M1 / M2-Makrophagen-Verteilung zu charakterisieren. Erhöhte mRNA-Expression von iNOS und IFN-γ (M1 Marker) wurde nach Aldosteron + Salzbehandlung beobachtet, während Arg1 oder IL-10-mRNA-Expression (M2-Makrophagen-Marker) nicht nach Aldosteron-Verwaltung ändern. Zusammen bestätigen diese Ergebnisse , dass Aldosteron + Salz Verabreichung die Entzündungs M1 - Makrophagen - Phänotyp in vivo vermittelt.
Abbildung 1: Protokoll für die Nierenzellen Isolation und Makrophagen - Nachweis durch Durchflusszytometrie. (A) und Makrophagen - Detektion durch Durchflusszytometrie (B). Repräsentative Schema der verschiedenen Makrophagen - Phänotypen nach unterschiedlichen Verteilung für CD45, CD68, CD86 und CD163 Markierungen (C). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: M1 und M2 - Makrophagen - Marker in Kidneys von Aldosteron behandelten Ratten durch Durchflusszytometrie Repräsentative Dot-Plots von CD45 - Färbung in lebenden Zellen gated in der Seitenstreulicht / Vorwärtsstreulicht (SSC / FSC) Fenster (A, links. aus) Nieren Suspensionen in Kontrolle und Aldosteron + Salz behandelten Tieren. Die Box im Inneren der Dot-Plots identifiziert lebenden Zellenexprimieren CD45. Die Zellen in dieser Box enthalten waren CD86 und CD163 - Expression in CD68 + Zellen (A, rechts) zu bestimmen , analysiert. Dot-Plot für Peritonealmakrophagen als positive Kontrolle für den Nachweis von CD45, CD68, CD86 und CD163, die gleiche Strategie bisher verwendeten Anwendung. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM (B) dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Entzündliche Reaktion nach Aldosteron + Salz - Administration. (A) Repräsentative Bilder von CD68 - Färbung und (B) quantitative Analysen von Ebenen mRNA gemessen durch RT-PCR für M1 Marker (iNOS und INF & ggr;) und M2 Marker (Arg1 und IL-10) in der Steuerung und Aldosteron + Salz behandelten Ratten. Die Daten sind ausdrückliched als Mittelwert ± SEM. * P <0,05 vs. Kontrolle. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Makrophagen sind heterogene Zellen, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen spielen. Es ist bei der Charakterisierung von Makrophagen Subsets in renal disease zunehmendes Interesse , da jeder Subpopulation von Makrophagen zur Entwicklung von Nierenschädigung in einer anderen Weise trägt, wie 14-16 in Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie und Nierenkrebs berichtet. In den frühen Stadien der akuten Nierenschädigung, eine Dominanz von M1 Makrophagen beobachtet, tubuläre Nekrose und Entzündung fördern. Jedoch in späteren Stufen ein höherer Gehalt an M2 Makrophagen beobachtet Entzündungs zu lösen und in Geweberemodellierung teilzunehmen. Bei der chronischen Nierenerkrankungen, sowohl M1 und M2 Makrophagen koexistieren gleichzeitig, obwohl M1 vorherrschend sein können, wodurch sich und entzündliche Nierenschäden zu verewigen. Daher ist wichtig, unser Wissen über die pathophysiologische Rolle von Makrophagen-Subtypen bei Nierenerkrankungen zu erhöhen. Immunhistochemische Studien können nicht den Prozentsatz der Makrophagen - Subsets in einer robusten Weise 17 bestimmen. Daher ist es notwendig, neue Verfahren zu entwickeln, um quantitativ die verschiedenen Phänotypen Makrophagen bestimmen und die Rolle dieser Zellen auf Nierenentzündungsreaktion zu verstehen.
Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll der Anzahl und der Phänotyp der renalen Makrophagen Subsets mittels Durchflusszytometrie bei Ratten zu bestimmen. In unserer Studie wurden Ratten mit einem Entzündungsmodell der Nierenschädigung durch die Gabe von Aldosteron unterzogen. In diesem Modell beobachteten wir CD45 + erhöht und C68 + Makrophagen - Infiltration als mittels Durchflusszytometrie bestimmt und durch Immunhistochemie bestätigt. Weiterhin kann eine Anreicherung von M1 Makrophagen (CD68 + / CD86 +), nicht jedoch M2 Makrophagen wurden in Aldosteron behandelten Mäusen beobachtet. Diese Ergebnisse wurden bestätigt weiter durch die Bestimmung der mRNA-Expression von M1 (iNOS und IFN-γ) und M2 macrophAltersmarkierungen (Arg1 oder IL-10). Durchflusszytometrie Analyse berichtet niedrigen Zellmortalität während der Isolierung Protokoll. Es gibt mehrere Faktoren, sowie Dauer und Art der Gewebe Verdauung (enzymatisch, Mechaniker, etc.) die Lebensfähigkeit der Zellen und Oberflächenmarker - Erkennung, wie die Höhe der Gewebedissoziation beeinflussen können. Übermäßige Verdauung erhöht die Zellsterblichkeit und Makrophagenaktivierung und senkt die Oberflächenmarkerexpression, während die entgegengesetzte Wirkung von niedrigen Nieren Dissoziation führen kann. Wenn jedoch unser Protokoll in Makrophagen aus Ratten Peritoneum durchgeführt wurde, eine verstärkte Präsenz von CD86 und CD163 wurde in diesen Zellen beobachtet.
Unser Protokoll wurde optimiert mit Aldosteron vermittelter Hypertonie Makrophagen Heterogenität in Nieren von Ratten zu bestimmen, und daher kann auf andere entzündliche Nierenerkrankung Modellen extrapoliert werden. Jedoch kann dieses Verfahren auf jeden experimentellen Zustand angepasst werden, da die Entzündung ändertGewebeintegrität, wodurch die Rate der Gewebe Verdau durch Kollagenase zu beeinflussen.
Es ist wichtig , dass für die Bestimmung des Gesamtmakrophagengehalt zu beachten , wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert 18 mit CD68 - Antikörper intrazelluläre Markierung zu ermöglichen. Das Protokoll für die Fixierung umfaßten die Verwendung von Formaldehyd, die zu primären Antikörper konjugiert affect Fluorochrome können, insbesondere Phycoerythrin. Um dieses Problem zu beheben, Inkubation mit CD86-PE-Antikörper wurde nach Zugabe der Fixierung / Permeabilisierung Lösung und weiteren CD68-Färbung durchgeführt. Auf der anderen Seite ist es wichtig, dass Formaldehyd zu beachten, kann auch mit anderen Assays stören, die nach Makrophagen Isolierung durchgeführt werden kann, wie zum Beispiel mRNA-Expression-Assays. Allerdings gibt es kommerzielle Kits zur Verfügung zu mRNA aus Formaldehyd fixierten Zellen isolieren.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll ein Verfahren zur phänotypischen Charakterisierung von Nieren Makrophagen in einem quantitative Weise unter Verwendung von Durchflusszytometrie. Insgesamt beschriebene Protokoll ist hier einfach zu bedienen, reproduzierbar und nützlich zu verschiedenen Makrophagenpopulationen aus Rattennieren unterscheiden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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