Summary
この原稿は、表現型とフローサイトメトリーによるラット腎臓からの常駐マクロファージの定量分析のための詳細なプロトコルを記述しています。得られた染色された細胞はまた、このように実験モデルで得られた情報を増加させる、細胞選別、遺伝子発現分析または機能的研究を含む他の用途に使用することができます。
Protocol
このプロトコルは、指令欧州議会の63分の2010 / EUと国家ガイドライン2013分の53以下のローカル施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
試薬およびソリューションの作製
- 無菌条件下で全ての試薬と解決策を準備し、層流フードの下で使用しています。 4℃でのソリューションをしてください。
- 染色バッファー（1×ダルベッコPBS中の2％ウシ胎児血清（FBS））を準備します。
- 生理食塩水の各mlにコラゲナーゼ0.5mgのを追加することで、コラゲナーゼ溶液を準備します。
- （2：1 v / v）をケタミン/キシラジン麻酔の溶液を調製します。
2.腎臓灌流および抽出
- ケタミン/キシラジン（75mgの/ 12ミリグラム/キログラム体重）の腹腔内注射により、ラットを麻酔。慎重に動物が十分に麻酔されていることを確認するために、皮膚の小さな倍をつまみます。その後、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、獣医軟膏で目をカバーしています。注：4月第齢のWistarラットを、このアッセイで使用されています。
- ラットが完全に麻酔された後、仰臥位で手術台の上に置きます。
- 腹部に70％エタノールを適用します。
- 胸膜および腹腔を露出させるために、恥骨から胸郭に、腹部皮膚及び腹膜を介して中央切開を行います。
- 全ての血液は腎臓から除去されるまで灌流システムを使用して腎臓を灌流するために腹部大動脈に生理食塩水（0.9％）を注入します。血液を解放するために役立つ腹部レベルで大動脈をカットします。
- 腎門部（腎静脈、動脈および尿管）から切断することにより、ラットから両方の腎臓を削除してください。腎臓をデカプセル化するには、慎重にカプセル11を分離し 、指を使って腎臓の端を押してください。
- ハンクス平衡塩溶液中に腎臓を置きます。
3.腎消化し、細胞懸濁液
- 小片にハサミで腎臓の半分をカットして入れて1.5mlチューブに個。
注：すべての次の濃度は、1サンプル（1/2ラットの腎臓）のために計算されています。 - コラゲナーゼ溶液1mlを加え、37℃で30分間インキュベートします。コラゲナーゼ溶液は、組織全体にアクセスすることを確認するために、5分毎に転倒混和します。
- ソリューションを収集し、プランジャーの助けを借りて、ストレーナ（40ミクロン）に通し、そして染色緩衝液10mlでそれを再懸濁します。
- 15分間400×gで遠心分離します。
- 1ミリリットルACK（塩化アンモニウムカリウム）ライジングバッファーでペレットを再懸濁します。室温で1分30秒後に、反応を停止する染色緩衝液10mlを加えます。
- 10分間400×gで遠心分離します。
- 再懸濁染色緩衝液（1ミリリットル）の十分なボリュームでペレットをストレーナ（30μm）を用いて、細胞懸濁液をフィルタリングします。
- 血球計数器で、トリパンブルー排除を用いて細胞の数をカウントし、STA用1.5mlチューブに200万セルを追加ining。
4.細胞染色およびフローサイトメトリー分析
- 5分間100×gで遠心分離した細胞。
- Fc受容体をブロックするために4℃で10分間：ラット血清を100μlでペレットを再懸濁（100 1希釈）。
- 5分間染色緩衝液および遠心分離100×gでの1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
- 生細胞（：千3）を検出すると、ソリューションCD45 APC-Cy7の（1：：：100）、CD163 A647（100 4）各条件のための染色緩衝液100μlの細胞表面染色のための抗体を混ぜます。
- 暗所で4℃で20分間、抗体混合物で細胞ペレットを再懸濁します。
- 5分間100×gで染色緩衝液遠心分離機を1ml添加することにより洗浄します。この手順を繰り返します。
- 暗所で4℃で20分間固定/透過処理溶液を600μlのを追加します。
- 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で2回洗浄します。
- intracelのために：CD68 FITC抗体（千35）を追加各条件のための透過化/洗浄バッファー100μlにlular染色。
- CD68抗体溶液中でペレットを再懸濁し、暗所で4℃で50分間インキュベートします。
- 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で洗浄します。
- 再懸濁、透過化/洗浄バッファー100μlでペレットをCD86PE抗体（35：1,000）を追加し、暗所で4℃で20分間インキュベートします。
- 5分間、100×gで透過化/洗浄緩衝液および遠心機の1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
- 透過化/洗浄バッファー100μlでペレットを再懸濁し、チューブ、フローサイトメトリーに渡します。
- フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。側方散乱光/前方散乱光（SSC / FSC）ウィンドウにゲーテッド生細胞におけるCD45染色を決定します。第2段階では、CD68 +細胞におけるCD86およびCD163発現を分析。
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Representative Results
私たちは、腎臓に浸潤マクロファージの存在の増加に関連した腎障害の炎症実験モデルにおけるマクロファージの不均一性を分析しました。以前に12報告されているように、このモデルでは、腎臓の損傷は、Wistarラットでの3週間の飲料水中アルドステロン（1ミリグラム-1キロ-1日）に加えて、塩（塩化ナトリウム1％）の投与によって誘発しました。
実験のスケジュールは、図1に示されている。まず、腎臓細胞をコラゲナーゼ（ 図1A）との機械的方法、さらに酵素消化を用いて単離しました。その後、赤血球を溶解し、腎臓マクロファージは、フローサイトメトリーを用いて検出しました。細胞は膜の検出および細胞内染色のためのCD68（ 図1B）のためのCD45、CD86及びCD163のための抗体と共にインキュベートしました。マクロファージpの最後に、表現型opulationsは、 図1Cに示したスキームに従って分析しました。
腎臓マクロファージコンテンツはCD45およびCD68（ 図2A）のための二重陽性で細胞を選択することによって分析しました。 （上記のプロトコル、対照群（総腎細胞当たり+マクロファージ0.57±0.16対0.25±0.02、％のCD45 + / CD68）と比較して、アルドステロン処置ラットで観察されたCD45 + / CD68 +マクロファージの増加を使用して、 図2、表の挿入を参照してください ）。 CD45 + / CD68 +マクロファージの細胞生存率は、紫色の色素でフローサイトメトリー染色によって決定されるように、95％よりも日常的に大きかった（データは示していない）.Thereafter、CD86（M1マーカー）及びCD163（M2マーカー）の発現は、間に評価しましたCD45 + / CD68 +細胞。アルドステロン投与は、CD45 + / CD68 + / CD86 + M1の含有量を増加させましたマクロファージ（2.87±2.3対1.36±0.68、総CD45 + / CD68 +細胞あたりの％のCD45 + / CD68 + / CD86 +マクロファージ）（ 図2）。しかし、CD45 + / CD68 + / CD163 + M2マクロファージの数が少ないが、アルドステロン処置群と対照群の両方で観察されました。以前に13を説明したように、低CD163の発現は、実験プロトコルの間のタンパク質分解脱落に関連していたか否かを分析するために、我々は、ラットの腹膜から単離されたマクロファージでは、コラゲナーゼ消化を含め、この手順を繰り返します。 図2Bに報告されたように、CD45 + / CD68 +腹膜マクロファージは、選択された抗体の有用性を検証し、ラットの腎臓におけるM1 / M2マクロファージの特徴付けのために私たちのプロトコルの有効性を確認し、CD86とCD163の両方に陽性でした。
これらの結果を検証するために、上記の実験モデルにおいて腎障害に関連する炎症応答は、免疫組織化学およびリアルタイムPCRにより調べました。 図3に報告したように、CD68 +マクロファージは、コントロールと比較して、アルドステロン+塩処理したラットにおいて観察された増加しました。その後、マクロファージの表現型マーカーは、腎臓のM1 / M2マクロファージの分布を特徴付けるために測定しました。 ARG1またはIL-10のmRNA発現（M2マクロファージマーカー）は、アルドステロン投与後に変化しなかった増加iNOSのmRNA発現およびIFN-γ（M1マーカー）は、アルドステロン+塩処理後に観察されました。一緒に、これらの結果は、アルドステロン+塩の投与が、in vivoでの炎症性M1マクロファージの表現型を媒介することを確認します。
図1：フローサイトメトリーによる腎細胞の単離のためのプロトコルおよびマクロファージの検出。 （B）による腎細胞単離（A）及びマクロファージの検出のG>略図。 CD45、CD68、CD86およびCD163マーカー（C）ごとに異なる分布に応じて異なるマクロファージの表現型の代表的なスキーム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：アルドステロンから腎臓におけるM1とM2マクロファージマーカーはフローサイトメトリーによって、ラットを処理した側方散乱光/前方散乱光（SSC / FSC）ウィンドウ（A、 左にゲーティング生細胞におけるCD45染色の代表的なドットプロット。 ）制御およびアルドステロン+塩処理動物における腎臓懸濁液から。ドットプロット内部のボックスは、生細胞を識別するCD45を発現しています。このボックスに含まれる細胞は、CD68 +細胞（A、右 ）にCD86およびCD163発現を決定するために分析しました。以前に使用したのと同じ戦略を適用するCD45、CD68、CD86およびCD163の検出のための陽性対照として腹腔マクロファージ、ドットプロット。データはSEM（B）±平均値として提示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：アルドステロン+塩投与後の炎症反応。 （A）CD68染色との代表的な画像（B）の制御およびアルドステロン+塩処理したラットでは、M1マーカーについてのRT-PCR（のiNOSおよびINFγ）とM2マーカー（ARG1およびIL-10）によって測定されたmRNAレベルの定量分析。データは明示されています平均±SEMとして編。 * P <0.05対コントロール。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マクロファージは、腎疾患を含む種々の炎症性疾患において重要な役割を果たしている異種の細胞です。糸球体腎炎、糖尿病性腎症や腎がん14-16で報告されているように、各マクロファージ亜集団は、腎障害の開発に異なる方法で寄与するため、腎疾患におけるマクロファージのサブセットの特性評価への関心が高まっています。急性腎損傷の初期段階では、M1マクロファージの優位性は、尿細管壊死および炎症を促進し、観察されました。しかし、後の段階でM2マクロファージのより高い含有量は、炎症を解決し、組織リモデリングに関与することが観察されます。 M1は、支配的であること、したがって増加し、炎症性腎障害を永続かもしれないが慢性腎臓病では、M1とM2マクロファージの両方が、同時に共存します。したがって、腎疾患におけるマクロファージの亜型の病態生理学的役割についての知識を増加させることが重要です。免疫組織化学的研究は、堅牢な方法17におけるマクロファージのサブセットの割合を決定することはできません。したがって、定量的に異なったマクロファージの表現型を決定するために腎炎症反応のこれらの細胞の役割を理解するための新しい技術を開発する必要があります。
本稿では、ラットにおいて、フローサイトメトリーにより腎マクロファージのサブセットの数および表現型を決定するためのプロトコルについて説明します。我々の研究では、ラットはアルドステロンの投与により腎障害の炎症モデルに供しました。このモデルでは、我々は、フローサイトメトリーによって決定し、免疫組織化学によって確認されるようにCD45 +及びC68 +マクロファージ浸潤の増加が観察されました。また、M1マクロファージ（CD68 + / CD86 +）のではなく、M2マクロファージの濃縮は、アルドステロン処置マウスで観察されました。これらの結果はさらに、M1（iNOSのおよびIFN-γ）およびM2 macrophのmRNA発現を測定することにより確認しました年齢マーカー（ARG1またはIL-10）。フローサイトメトリー分析は、単離プロトコールの間に低い細胞死亡率を報告しました。いくつかのこのような組織解離のレベル、細胞生存率および表面マーカーの検出に影響を与え得る要因、ならびに期間および組織消化（酵素的、機械的、 等 ）の種類があります。過剰消化は細胞死およびマクロファージの活性化を増加させ、逆の効果が低く、腎臓解離から生じ得る一方、表面マーカーの発現を減少させます。我々のプロトコルは、ラットの腹腔から単離したマクロファージ中で行った場合しかし、CD86及びCD163の拡張プレゼンスは、これらの細胞において観察されました。
我々のプロトコルは、アルドステロン媒介性高血圧ラットの腎臓におけるマクロファージの不均一性を決定するために最適化されているので、他の炎症性腎疾患モデルに外挿することができます。しかしながら、この手順は、各実験条件に適合させることができる炎症変更するためこのようにコラゲナーゼによる組織消化の速度に影響を与える組織の完全性、。
全マクロファージ含量の決意するために、細胞を固定した抗体CD68 18と細胞内標識化を可能にするために透過処理されたことに留意することが重要です。固定用のプロトコルは、一次抗体、特にフィコエリトリンにコンジュゲート蛍光色素に影響を与える可能性があり、ホルムアルデヒドの使用を含んでいました。この問題を解決するには、CD86-PE抗体とのインキュベーションは、固定/透過処理溶液を、さらにCD68染色を添加した後に行きました。一方、ホルムアルデヒドはまた、mRNA発現アッセイとして、マクロファージの単離後に実行することができる他のアッセイに干渉する可能性があることに留意することが重要です。しかし、ホルムアルデヒド固定細胞からmRNAを単離するために利用可能な市販のキットがあります。
要するに、このプロトコルはquantitati腎マクロファージの表現型の特徴付けのための方法を記載しますVEの方法フローサイトメトリーを使用して。全体的に、ここで説明するプロトコルは、ラット腎臓から別のマクロファージ集団を区別するために、使いやすく、再現性、かつ有用です。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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