Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for fenotypisk og kvantitativ analyse av fastboende makrofager fra rotte-nyrer ved strømningscytometri. De resulterende fargede celler kan også brukes til andre formål, inkludert celle sortering, genekspresjonsanalyser eller funksjonelle studier, og dermed øke den informasjon som er innhentet i den eksperimentelle modellen.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av lokale Institutional Animal Care og Bruk komiteer etter direktiv 2010/63 / EU fra Europaparlamentet og nasjonale retningslinjer 53/2013.
1. Utarbeidelse av reagenser og løsninger
- Forbered alle reagenser og løsninger under sterile forhold og bruke under en laminær hette. Hold løsninger ved 4 ° C.
- Forbered farging buffer (2% føtalt bovint serum (FBS) i 1x Dulbeccos PBS).
- Fremstille kollagenase oppløsning ved tilsetning av 0,5 mg av kollagenase til hver ml saltvann.
- Forbered anestesi oppløsning av ketamin / xylazin (2: 1 v / v).
2. Nyre Perfusjons og Utvinning
- Bedøve rotter ved intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin (75 mg / 12 mg / kg vekt). klemme forsiktig en liten hudfold, for å sjekke at dyret er tilstrekkelig bedøvet. Deretter dekker øynene med veterinær salve for å hindre tørrhet mens under anestesi. Merk: 4-Manth gamle Wistar-rotter blir anvendt i denne analysen.
- Når rotta er helt bedøvet, legg det på et kirurgisk bord i liggende stilling.
- Påfør 70% etanol til magen.
- Gjør et sentralt snitt gjennom abdominal hud og bukhinne, fra pubis til brystkassen, for å avsløre pleural og bukhulen.
- Injisere saltoppløsning (0,9%) i den abdominale aorta for å perfuse nyrer ved hjelp av en perfusjon systemet inntil alt blod er fjernet fra nyrene. Kutt aorta på mage nivå for å frigjøre blodet.
- Fjern begge nyrer fra rotte ved å kutte fra nedsatt hilum (nedsatt vene, arterie og ureter). For å decapsulate nyrene, trykk på kanten av nyrene ved hjelp av fingrene, nøye skille kapselen 11.
- Plasser nyrene inn i Hanks 'balanserte saltløsning.
3. Nyre Fordøyelse og Cell Suspension
- Skjær halvparten av en nyre med saks i små biter og legg denbrikker i et 1,5 ml tube.
Merk: Alle følgende konsentrasjoner er beregnet for en prøve (1/2 rotte nyre). - Tilsett 1 ml av kollagenase løsning og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Bland ved hvert 5 min for å være sikker på at collagenase løsningen tilgang til hele vev.
- Samle løsningen og før den gjennom en sil (40 um) ved hjelp av et stempel, og resuspender den i 10 ml flekker buffer.
- Sentrifuger ved 400 xg i 15 min.
- Re-suspendere pellet i 1 ml ACK (Ammonium-klorid-Kalium) Lysing buffer. Etter 1 min 30 sek ved romtemperatur, tilsett 10 ml flekker buffer for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuger ved 400 xg i 10 min.
- Re-suspendere pelleten i et tilstrekkelig volum for flekker buffer (1 ml) og filtrer cellesuspensjonen ved hjelp av en sil (30 um).
- Tell antall celler ved hjelp av trypanblått-utelukkelse på et hemocytometer og legge til 2 millioner celler til et 1,5 ml rør for staining.
4. Cell Farging og flowcytometri analyse
- Sentrifuger cellene ved 100 xg i 5 min.
- Re-suspendere pelleten i 100 pl rotteserum (fortynnet 1: 100) i 10 minutter ved 4 ° C for å blokkere Fc-reseptorer.
- Vask ved å tilsette 1 ml av flekker buffer og sentrifuger 100 xg i 5 minutter.
- Bland antistoffer til celleoverflatefarging i 100 pl flekker buffer for hver betingelse: CD45 APC-CY7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) og løsning for å påvise levende celler (3: 1000).
- Re-suspen cellepelleten i antistoffblandingen i 20 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask ved å tilsette 1 ml av flekker buffer og sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter. Gjenta dette trinnet.
- Legg 600 mL av Fiksering / Permeabilization løsning i 20 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask 2 ganger med 1 ml Permeabilization / vaskebuffer og sentrifuger ved 170 xg i 5 minutter.
- Tilsett CD68 FITC antistoff (35: 1000) for Intracellular farging til 100 mL av Permeabilization / vaskebuffer for hver tilstand.
- Re-suspendere pelleten i den CD68-antistoff-løsning og inkuberes 50 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask med 1 ml Permeabilization / vaskebuffer og sentrifuger ved 170 xg i 5 minutter.
- Re-suspendere pellet i 100 ul Permeabilization / vaskebuffer, legge CD86PE antistoff (35: 1000) og inkuberes i 20 min ved 4 ° C i mørket.
- Vask ved å tilsette 1 ml av Permeabilization / vaskebuffer og sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter.
- Re-suspendere pellet i 100 ul Permeabilization / vaskebuffer og gi det til en flowcytometri tube.
- Analysere prøver av flowcytometri. Bestem CD45 flekker i levende celler gated i Side-spredt lys / foroverkastede lys (SSC / FSC) vindu. I et andre trinn, analysere CD86 og CD163 ekspresjon i CD68 + celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyserte makrofag heterogenitet i en inflammatorisk eksperimentell modell av nyreskade assosiert med øket forekomst av infiltrerende makrofager i nyrene. I denne modellen, ble nyreskade indusert ved administrering av aldosteron (1 mg -1 kg -1 dag) pluss salt (NaCl 1%) i drikkevannet i 3 uker i Wistar-rotter, som tidligere rapportert 12.
Tidsplanen for våre eksperimenter er vist i figur 1. For det første ble nyreceller isolert ved hjelp av mekaniske metoder og ytterligere enzymatisk nedbrytning med kollagenase (figur 1A). Deretter erytrocytter ble lysert og nyremakrofager ble påvist ved hjelp av strømningscytometri. Cellene ble inkubert med antistoffer for CD45, CD86 og CD163 for membran deteksjon og CD68 for intracellulær farging (figur 1B). Til slutt, fenotypen av makrofagen populations ble analysert i henhold til ordningen viste i figur 1C.
Nedsatt makrofag innholdet ble analysert ved å velge celler med dual positivitet for CD45 og CD68 (figur 2A). Ved anvendelse av protokollen som er beskrevet ovenfor, en økning i CD45 + / CD68 + makrofager ble observert på aldosteron-behandlede rotter sammenlignet med kontrollgruppen (0,57 ± 0,16 vs 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + makrofager pr totale nyreceller) ( Figur 2, se tabell innsats). Celleviabilitet av CD45 + / CD68 + makrofager, som bestemt ved strømningscytometri farging med fiolett fargestoff, var rutinemessig (data ikke vist) .Thereafter, CD86 (M1 markør) og CD163 (M2 markør) ekspresjon ble undersøkt blant de mer enn 95% CD45 + / CD68 + celler. Aldosteron administrering øket innholdet av CD45 + / CD68 + / CD86 + M1makrofager (2,87 ± 2,3 vs. 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + makrofager per totalt CD45 + / CD68 + celler) (figur 2). Men + / CD163 + M2-makrofager ble observert et lavt antall CD45 + / CD68 i både aldosteron-behandlede og kontrollgrupper. For å analysere hvorvidt den lave CD163 ekspresjon ble relatert til proteolytisk avgivelse i løpet av den eksperimentelle protokollen, vi gjentok denne fremgangsmåten, inkludert kollagenase fordøyelse, i makrofager isolert fra rotte peritoneum, som tidligere beskrevet 13. Som rapportert i figur 2B, var CD45 + / CD68 + peritonealmakrofager positivt både CD86 og CD163, validere nytten av de markerte antistoffer og bekrefter effektiviteten av vår protokoll for karakterisering av M1 / M2 makrofager i rottenyre.
For å validere disse resultatene,den inflammatoriske respons forbundet med nyreskade i ovennevnte eksperimentelle modeller ble studert ved immunhistokjemi og real-time PCR. Som rapportert i figur 3, økt CD68 + makrofager ble observert på aldosteron + saltbehandlede rotter, sammenlignet med kontroll. Deretter ble makro fenotype markører fast bestemt på å karakterisere nedsatt M1 / M2 makrofag distribusjon. Økt mRNA uttrykk av iNOS og IFN-γ (M1 markører) ble observert etter aldosteron + salt behandling, mens Arg1 eller IL-10 mRNA uttrykk (M2 makro markører) ikke endret etter aldosteron administrasjon. Sammen bekrefte disse resultatene at aldosteron + salt administrasjon formidler inflammatoriske M1 makrofag fenotype in vivo.
Figur 1: Protokoll for nyre celler Isolering og macrophage Detection ved flowcytometri. (A) og makrofag detektering ved strømningscytometri (B). Representant ordning av de ulike makro fenotyper i henhold til annen fordeling for CD45, CD68, CD86 og CD163 markører (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: M1 og M2 Makrofage Markører i nyrer fra aldosteron behandlede rotter ved flowcytometri Representative dot-plott av CD45 flekker i levende celler gated i Side-spredt lys / foroverkastede lys (SSC / FSC) vindu (A, venstre. ) nyresuspensjoner i kontroll og aldosteron + salt-behandlede dyr. Boksen inne dot tomter identifiserer levende celleruttrykker CD45. Celler som er inkludert i denne boksen ble analysert for å fastslå CD86 og CD163 uttrykk i CD68 + celler (A, høyre). Dot tomt for bukhinnemakrofager som positiv kontroll for påvisning av CD45, CD68, CD86 og CD163, bruk samme strategi brukt tidligere. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: inflammatorisk respons etter aldosteron + Salt Administration. (A) Representative bilder av CD68-farging og (B) kvantitative analyser av mRNA-nivåer målt ved hjelp av RT-PCR for M1 markører (iNOS og INFγ) og M2 markører (Arg1 og IL-10) i kontroll- og aldosteron + salt-behandlede rotter. Dataene er uttrykkeliged som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05 vs. kontroll. Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager er heterogene celler som spiller en viktig rolle i forskjellige betennelsessykdommer, inkludert nyrelidelser. Det er økende interesse for karakterisering av makrofager undergrupper i nyresykdom, fordi hver makrofag subpopulasjon bidrar på en annen måte til utvikling av nyreskade, som rapportert i glomerulonefritt, diabetisk nefropati og nyrekreft 14-16. I de tidlige stadiene av akutt nyreskade, er en overvekt av M1 makrofager observert, fremme tubulær nekrose og betennelse. Men i senere stadier et høyere innhold av M2-makrofager observeres for å løse betennelse og delta i vev-omforming. Ved kronisk nyresykdom, både M1 og M2 makrofager co-eksisterer samtidig, selv om M1 kan være dominerende, og dermed øke og vedlikeholdende inflammatorisk nyreskade. Derfor er det viktig å øke vår kunnskap om patofysiologiske rolle makro undergrupper i nyresykdom. Immunhistokjemiske studier kan ikke fastslå hvor stor prosentandel av makro undergrupper i en robust måte 17. Derfor er det nødvendig å utvikle nye teknikker for å kvantitativt bestemme de forskjellige macrophage fenotyper og for å forstå rollen til disse cellene på nyrebetennelsesreaksjon.
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å bestemme antall og fenotypen av nyremakrofager undergrupper ved strømningscytometri hos rotter. I vår studie ble rotter utsatt for en inflammatorisk modell av nyreskade ved administrasjon av aldosteron. I denne modellen, observerte vi økt CD45 + og C68 + makrofag infiltrasjon som bestemmes av flowcytometri og bekreftet av immunhistokjemi. Videre en berikelse av M1 makrofager (CD68 + / CD86 +), men ikke M2 makrofag, ble observert i aldosteron-behandlede mus. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved bestemmelse av mRNA-ekspresjon av M1 (iNOS og IFN-γ) og M2 macrophalder markører (arg1 eller IL-10). Strømningscytometri-analyse rapportert lav celle dødelighet i løpet av isolasjonsprotokoll. Det er flere faktorer som kan påvirke cellenes levedyktighet og overflatemarkører registrering, for eksempel graden av dissosiasjon vev, så vel som varighet og typen av vev fordøyelse (enzymatisk, mekanisk, etc.). Overdreven nedbrytning øker celledødelighet og makrofagaktivering og minsker overflatemarkør uttrykk, mens den motsatte effekt kan resultere fra lav nyre dissosiasjon. Men da vår protokoll ble gjennomført i makrofager isolert fra rotte peritoneum, ble en forbedret tilstedeværelse av CD86 og CD163 observert i disse cellene.
Vår protokollen er optimalisert for å bestemme makrofag heterogenitet i nyrer fra rotter med aldosteron-mediert hypertensjon, og derfor kan ekstrapoleres til andre provoserende nyresykdom modeller. Imidlertid kan denne prosedyren tilpasses hver eksperimentell betingelse fordi betennelse modifiserervev integritet, og dermed påvirke frekvensen av vev fordøyelsen av collagenase.
Det er viktig å merke seg at for bestemmelse av total makrofag innhold, ble cellene fiksert og permeabilisert for å tillate intracellulær merking med CD68-antistoff 18. Protokollen for fiksering omfattet bruk av formaldehyd som kan påvirke fluorokromer konjugert til primære antistoffer, spesielt phycoerythrin. For å løse dette problemet, inkubasjon med CD86-PE antistoff ble utført etter tilsetting av Fixation / Permeabilization løsning og videre CD68-farging. På den annen side er det viktig å merke seg at formaldehyd kan også interferere med andre analyser som kan utføres etter at makrofager isolert, for eksempel mRNA ekspresjon analyser. Men det er kommersielle kits tilgjengelig for å isolere mRNA fra formaldehyd fikserte celler.
Oppsummert beskriver denne protokollen en metode for fenotypisk karakterisering av nyremakrofager i et kvantitativtve måte ved hjelp av flow cytometri. Totalt sett er protokollen beskrevet her enkel å bruke, reproduserbar, og nyttig å diskriminere ulike makro populasjoner fra rotte nyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
