Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

从黑质多巴胺神经元的Somatodendritic域亚细胞的膜片钳记录

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

多巴胺能神经元树突接收和传达突触输入，支持动作电位反向传播和神经递质的释放。了解这些基本的功能将在这些神经元的信息传递线索。树突状膜片钳记录提供了可能直接检查树突和底层电压门控离子通道的电性能。然而，这些精细结构由于其小直径的不容易接触到的补丁吸管。这份报告描述了一步一步的过程来收集急性片多巴胺能神经元的树突稳定可靠的录音。电生理测量结合的细胞形态的事后恢复。成功的实验依靠改进的切片，解决方案和移液管，在与记录的结构相接触的光学元件和吸液管的稳定性的充分调整准备。索姆标准原则ATIC膜片钳记录被施加到树突但用吸管的温和的方法。这些多功能的技术可以被实现为处理有关枝晶的可激发性的各种问题。

Introduction

神经元主要是收到他们的树突突触的信息。兴奋性和从它们产生的部位扩散到积分位点，其中动作电位（AP）的被诱发，作为输出信号抑制性突触信号。在他们的方式，突触电位通过树突的结构和被动和主动膜特性之间的相互作用的影响。这些高度可变参数的组合扩大的神经元1,2的计算能力。然而，树突的小直径却阻碍了其电性能的研究。 （ - 3微米直径0.7）树突6,7膜片钳技术3的不断发展，光学4对切片准备5种方法细化过去几十年中已经非常薄启用录音。这些方法，并且，仍然主要用于检查树突的兴奋性在各种Ø˚F元8。直接树突录音是必不可少确定的功能特性在不同的神经元隔间离子通道20-22的分布9-19和差异。这些数据与免疫相结合，光学和电子显微镜检测23,24离子通道分布的必要补充。双somatodendritic录音已实施探索动作电位9,13-15,21,22,25-27并沿神经元的somatodendritic域突触电位13,16,18蔓延的传播，获取详细的被动电缆型号28- 30，并调查神经集成31的时间分辨率。

黑质（SN），是位于参与多种功能，如运动的控制下，奖励和习惯行为的编码中脑区域。多巴胺由于具体的减少在SN多巴胺（DA）神经元的损失与在帕金森氏病32患者中观察到的运动障碍有关。黑质电路由两个主要的细胞类型：多巴胺能和GABA能神经元。有趣的是，这些神经元具有区别于其他神经元的一些特定功能。大比例的DA神经元和一些GABA神经元的轴突从树突站点指示树突是多相（轴突轴承和轴突缺失树突）25,26,33起源。从树突开始，到体细胞，最后到轴突34：这些神经元的形态与神经元的典型组织，其中信息传送遵循Cajal间发射的动态偏振法因此对比。还已知多巴胺神经元从其树突35释放多巴胺，产生爆裂活动36和NMDA受体可塑性37。该dissec这些现象是化不从他们的起始位点直接录音难以捉摸。到洞察的精确位置和离子通道的功能特性以及它们在黑质神经元的树突的兴奋性和信息传输的作用之间的关系，直接树突录音是选择的方法。

本报告描述了可用于从黑质神经元的树突和相应的事后生物胞素标记获得单和双膜片钳记录的详细过程。用于修补体细胞和树突状膜的基本原理非常相似。实际上然而，从树枝状站点录音要求相比于体录音特定优化。成功的树突录音靠片，光学器件的优化调​​整，在记录的膜片吸管和稳定性的温和方法的质量。

Protocol

这里描述的所有实验程序遵循的制度和国家指导方针，欧盟指令动物保护和欧洲实验动物科学协会联合会的指南。

1.溶液的制备

  1. 标准的人工脑脊液（ACSF;表1）
    1. 使用预先用双蒸水漂洗高纯度的盐38与干净的玻璃烧杯，以制备新鲜溶液。使用高品质的双蒸水对所有细胞内外溶液的配制。
    2. 取一个2L烧杯以溶解的NaHCO 3在500ml水中，另一个以溶解其它的盐，以按表1，以防止二价离子39的沉淀。用双蒸水系统清洁刮刀和服用盐之前烘干。使用磁力搅拌器匀化dissolutioñ。从两个烧杯溶液添加到适当的量瓶中，并带至适当的体积。
    3. 确保最终外溶液是完全透明的，无沉淀的任何痕迹。
    4. 申请用玻璃微滤器蜡烛（直径13mm）的20的95％O 2和5％的CO 2（卡波金气体）组成的混合气体-灌注切片38,40之前30分钟。仔细控制渗透压 - 学联（2 3个连续的测量结果）与渗透压力计（最佳范围：314 - 325 mOsmol / L）。存储制备后剩余的溶液在4℃下并在3天内使用。
  2. 切削液（蔗糖学联，表2）5,13
    1. 制备3升的新鲜溶液。使用1升，从一个动物准备的大脑切片。在4℃保存剩余的溶液并在3天内使用。
      注意：高镁离子和低的 Ca 2+浓度用于至decrease突触传递和一些氯化钠用蔗糖替代保存组织5,40。
  3. 细胞内的解决方案
    1. 预先准备用于双全细胞记录（ 表3）100毫升溶液中。
    2. 包括甲酯13,15,21获得细胞形态恢复良好。添加生物胞素（0.1 - 0.4％），以随后检查神经元的形态。包括荧光染料（ 如 Alexa的594或101酸性桃红41）跟随树突的记录（可选）在延长。
    3. 预先制备100细胞附着记录（ 表4）毫升电极溶液。在这种情况下，内部溶液是高K +溶液设计成宏观超极化激活阳离子电流（I H）隔离并包含用于其他电压-门控离子通道阻滞剂。
    4. 商店内在-20℃下2毫升等分试样的细胞溶液。使用新的等份每一个新的录音片段。检查每个等分解冻的渗透压仔细渗压计。取一个新的等分试样，如果渗透压不对应于该初始值。
    5. 从等分试样的溶液转移到其上的一个0.22微米的无菌针筒式过滤器被放置在顶部的3毫升注射器。保持记录会话期间冰上注射器限制其化合物（ATP，GTP或磷酸）的降解。

2.制作和补丁吸管的灌装

  1. 拉
    1. 使用水平电极拉马和厚壁硼硅玻璃管。对于全细胞和细胞附着录音，使用2毫米外径/ 1内径。确保玻璃管是绝对干净38。
    2. 如果不是这种情况下，浸泡玻璃毛细管在有机溶剂（ 例如，乙醇）第一，然后在双蒸水。简而言之热用本生灯毛细管的结局。另外，为了玻璃管洗净，直接从制造商加热（见材料清单）。
    3. 对于双somatodendritic录音，确保躯体吸液管电阻为6至10MΩ6,11和装满细胞内溶液（ 表3）树突状移液器8至19MΩ。对于标准化细胞贴附记录吸液管电阻为10MΩ的电阻来实现沿神经16,18,42,43的somatodendritic域比较的结果。
    4. 修补前准备每个记录会话之前（每天）新鲜移液器或立即使用他们5 -他们制造39后8小时。在一个有盖玻璃容器中存储的移液管以保护他们免受灰尘和尖端的阻碍。
  2. 抛光
    1. 检查并老天T-抛光用microforge每一个枪头获得与膜更好地锁住。使用microforge之前，融化铂加热丝一小块玻璃。每日恒常（彼得·乔纳斯，个人通信）更换的铂丝这种玻璃涂层。
      注意：用于细胞附着录音移液器可热抛光步骤之前被涂覆以减少背景噪音。涂层可以用绝缘剂来实现，如熔融的牙科用蜡22,44或硅氧烷弹性体39。

3.脑片的制备

  1. 使用16岁之间的健康Wistar大鼠 - 18日龄。不要使用不健康的动物或动物从低温或脱水的痛苦。开始片前的准备保持动物在一个安全和安静的地方。避免在房间内的任何其他动物，同时准备的动物。轻轻操纵动物。
  2. 倒入蔗糖学联为两个400毫升聚丙烯（PP）的烧杯，并将其放置在-80℃冷冻45分钟。混合解决方案来获得均匀冰冷的液体/冷冻溶液，然后将烧杯冰上。供应使用每个PP烧杯微型过滤蜡烛（孔径13毫米），卡波气蔗糖学联的解决方案。
  3. 准备切片机和储藏室
    1. 使用具有极低的垂直振动5,38一支高素质的组织切片机尽量减少切片尽可能的表层损坏。固定在切片机新鲜和整个刀片。
    2. 使用新的刀片的每个切削会话。避免刀片的弯曲。在刀片（约瑟夫Bischofberger，个人通信）的表面，请勿取出脂肪薄膜。
    3. 如果可以，检查垂直振动由制造商提供的vibroprobe。另外，使用一个特制的vibroprobe 5。降低叶片S的垂直振动O作为要尽可能接近0微米。
    4. 准备一个150毫升储备室45,46的片页上所描绘。 201参考39。倒入标准学联进入储藏室，并将其放置在水浴中。供应用微型过滤蜡烛（直径6毫米）卡波储备室解决方案。确保卡波气泡尽可能的小。
      注：建立一个新的储备室，每2 - 3个月保持切片质量不变。
  4. 切割片
    1. 在一个安静的房间中，实验者不被干扰或强调，在宫颈髓质水平斩首用手术剪刀（长150 MM）的动物。
    2. 切开皮肤在动物的头鼻到尾方向用手术刀在顶部和侧面将其删除。切从尾至头细剪的鼻部分头骨，然后取出头骨的两个部分横向。删除的B用薄刮刀雨水，并仔细拖放到含有冰冷一个聚丙烯烧杯（0 - 4℃）蔗糖ACSF平衡与卡波金38。
      注意：需要这一系列的步骤要尽可能快地进行，但也精心（<< 1分钟，约40秒）。
    3. 保持大脑在PP烧杯为〜2至5分钟，该溶液中。调整卡波金压力，以避免大脑运动。如果卡波金气泡用新的过大更换微过滤蜡烛。
    4. 放置脑上的9厘米培养皿，其中内底覆盖有约0.5厘米厚的Sylgard层38。提前准备这个培养皿。
    5. 包围用冰冷的蔗糖ACSF大脑。确保学联蔗糖解决方案的一些液相淹没大脑。为冠状切片，切断大脑前部在冠状面用手术刀或刀片。用冠状切口取出小脑。
    6. 应用氰基对试样托盘丙烯酸胶（面积约1cm 2）。粘贴脑块，使得正面部分面对切片阶段。小心滴上使用大开口的玻璃巴斯德移液管的粘贴脑的顶部蔗糖ACSF并随后慢慢淹没切片机的切割室。操纵样品托盘使切割面（ 即 ，第一组织击中叶片）是脑40的腹面。
    7. 用弯曲的玻璃微过滤蜡烛（直径6毫米）切割室（可选）应用卡波。
    8. 调节刀片15°的〜参照水平面5的角度。到达黑质削减之前在尾椎鼻方向〜500微米的冠状的大脑切片。减少切300的厚度 - 包含感兴趣的区域350微米厚的切片。
    9. 从组织块单独的片与连接到一个非常薄的灌注针平行于刀片边缘的注射器。弯曲的针，以便具有的针和注射器之间90°的角度。确保，同时除去从组织块的切片没有压力被施加到刀片。
  5. 商店片
    1. 传送用玻璃巴斯德移液管的最大开口（连接到一个灯泡）插入备用腔室中的条带。一旦所有的切片转移到备用室（克里斯托弗施密特Hieber，个人通讯）使水浴温度34℃进行0.5 - 1小时。
    2. 在此期间后关掉水浴，保持片在室温下。调整卡波金压力，以避免在保留腔室中的条带的运动。保持为10至20分钟的切片开始记录之前。
    3. 在SLI的一端与双蒸水还没有仔细彻底清洗设备和微滤器蜡烛庆安过程。

4.双体和Somatodendric录音在黑质细胞和用biocytin备案

  1. 按照描述的膜片钳设置的大会轴突指南和参考文献中给出切片。39,40,47。关于补丁的更基本方面的信息都在参考文献48。
  2. 准备录音室
    1. 放置1 - 2毫升双蒸水在记录室中。验证它是不是漏水。广场上的移动XY工作台录音室。
    2. 通过不透氧灌注管道系统（聚四氟乙烯）到录音室订阅标准ACSF。稳定在4的速率在室中的灌注流量- 5毫升分钟-1。保持管接合含有ACSF烧杯的长度和记录室尽可能短（1米）。
    3. 从储备室选择的脑切片，并将其转移到用玻璃巴斯德吸管的最大开口记录室中。覆盖用铂环的切片在记录室的底部在页码所描绘锚定它。 201参考39。使用一台铂金戒指（直径1.5厘米），并在其上粘上并行尼龙线（间距> 2mm）的。
  3. 调整和优化光学
    1. 可视化使用红外（IR）视频显微镜4,47,49,50的片。调整科勒照明51和优化微分干涉对比（DIC）51光学或倾斜照明（Dodt梯度对比- DGC）52,53。有关这一过程的更多细节在参考文献中给出。40,49。
    2. 检查切片的质量。只有保持与光滑，平坦的表面是不是太强烈对比的，具有唯一的小，散弹坑片。
    3. 填写与细胞内液2新鲜和未使用补丁移液器（
  4. 移液器定位片的表面上方
    1. 检查的银线氯化涂层的存在（浴参比电极和补丁电极;有关详细信息，请参阅轴突指南和参考文献39,54）。
    2. 插入移液器依次进入吸管持有者和使用连接吸管架，一个三通旋塞和一个压力计40油管电路施加正压（〜70毫巴）。降低吸移管到记录室的浴中。
    3. 检查对压力表的压力值是1〜恒 - 2分钟。如果压力下降，检查油管或吸管支架中的密封O形圈。
    4. 放置枪头在视频显示器的中间，并确保它不受阻碍。确保施加或释放压力，以移液管时枪头不移动。
    5. 正是在枪头的位置检查漂移和枪头振动通过绘制在显示屏的中央一个小十字并观察尖端的5分钟可能的运动。
    6. 施加电压的步骤（5毫伏）监测示波器上的吸移管的阻力。设置膜片钳放大器为0毫伏的保持电位。取消吸管补偿电压，使得直流电流吸管在放大器米39,51读数为零。
    7. 移动移液器下降到片和保持它们的表面上方。
  5. 选择和补丁长树突神经元
    1. 内的黑质中选择一个健康的神经元与可以在大约相同的复随后在长距离长枝晶烷（ 图1A和1B），使用的IR-Dodt梯度对比度（IR-DGC）。选择一个光滑和均匀的细胞体。避免两个强烈对比的细胞在切片（ 图1C和1D）的表面上，因为它是难以打破并保持一段时间稳定的记录条件（稳定串联电阻）。选择有其胞体神经元10 - 切片表面下30微米。
    2. 移动接近胞体的体电极（40 - 50微米的距离）和树突状电极接近的枝蔓在相同的距离。使用2倍的放大倍率（四倍换）选择和修补枝晶的一部分。获取监控2,100X的绝对放大率没有放大（1X）和5,500X的有2倍放大效果上。
    3. 由10毫巴略微松开体移液管的压力。如果有必要，调节树突和躯体吸管压力，以避免的C位移ELL结构（SOMA和树突）的片内。
    4. 接近膜才能看到一个小压痕树突状吸管的位置。松开枪头的压力和补丁的枝蔓，同时控制吸液管的阻力。在理想的条件下，只有很轻微的吸力足以获得良好的密封。
    5. 保持树枝状吸管在细胞贴附模式。移动体吸管接近体膜和补丁体膜。确保高密封阻力破裂细胞膜（> 1GΩ）39前获得。由几个微米轻微缩回既移液器从该膜，以避免胞体和树突的变形。
    6. 对于这两个移液管，降低尽可能移液器电容瞬变的幅度上使用具有高增益和小的过滤51和示波器的电压脉冲的当前步骤的顶部。进入全细胞模式无线个树枝状吸管，随后用体细胞移液管。
    7. 消除了全细胞电容瞬变和补偿串联电阻。监测并记录在开头的存取性，并定期期间，进行实验。如果串联电阻过高（> 50MΩ），重试与另一吸管。
    8. 收集红外DGC照片（ 图1A和1B）与视频图形打印机25，帧接收器或数码相机在高和低倍率。
      注意：在录制过程中神经元的肿胀（ 图1E和1F）被零星发现，但很少在解决方案的渗透压和pH值是正确调整39。
    9. 获得双体全细胞记录（体细胞-胞体）与相同的步骤（ 图2A）。
  6. 长期应用（几百毫秒）增加的去极化电流的步骤顺序与体细胞和树突状吸管唤起的AP（ 图2B，3C和3D）。记录在树突状，同时躯体吸管产生的潜力。
  7. 检查人工兴奋性突触后电位的多巴胺能神经元的传播（aEPSPs）
    1. 创建一个兴奋性突触后电流（EPSC）波形注入作为在双电流钳记录（ 图4A和4B）的电流指令。要做到这一点，建立与对应于感兴趣55神经元EPSCS测得的实际值幅度和时程值的双重指数。小心控制构造EPSC的和注入的EPSC波形的采样率保留原始时间过程。
      注：在真实的应用神经元波形之前，使用细胞模型进行测试。
    2. 依次通过树突注入波形和躯体吸管和记录造成了伴随躯体都和树突状吸管潜力。定期检查移液器的可能漂移。
  8. 从一个神经元的终止记录
    1. 取的IR-DGC图像在低倍率（目标：5X或10X）以记录片和电极内的神经元的位置。
    2. 慢慢地，轻轻地撤回树突和从神经元膜依次躯体移液器以形成具有两个移液器外面向外补丁。删除使用横向向上运动38的序列的吸移管。这些应该是短期的，然后再在长度逐渐增加。该记录结构有利于细胞膜的正确的关闭。
    3. 监控容性电流的响应电压钳的减少（增加接入电阻）5 mV的电压脉冲同时取出吸管。
    4. 一旦该膜是海带动了周边枪头，把它彻底走出录音室的。从浴中取出的目标。保持在记录室中的切片15 - 在标准ACSF 20分钟，以允许在所记录的神经元生物胞素的平衡（从细胞内溶液）。
    5. 轻轻用大开口巴斯德吸管进入包含标准学联25毫升广口琥珀色（棕色）玻璃瓶转移片。用盖关闭瓶。请参阅固定步骤第6段。

5.细胞贴附录音

  1. 选择具有超过一个树枝状延伸在同一平面上的长距离的神经元。确保感兴趣的枝晶可以遵循一个良好定义的索玛。
  2. 填充电极溶液（ 表4）的膜片吸管。设计解决方案通过包括特定的药理学试剂，记录在细胞连接配置感兴趣的电流以阻止其他离子茶nnels。
  3. 补丁在树突细胞贴附模式
    1. 可视化树枝状的一部分和使用操纵接近重新编码吸管。 （ - 80毫巴70），以避免枝晶的位移通过检查压力计适应在枪头的压力。在4.5.4补丁中描述的枝蔓。
    2. 记录一些IR-DGC照片（ 图5A）。尝试以获得密封阻力尽可能大（> 1GΩ39），充其量3之间- 10GΩ为细胞贴附记录18（ 图5B）。由几个微米缩回吸管从该膜，以避免枝晶的变形。
    3. 观察细胞贴附模式反映了黑质神经元的自发动作电位的动作电流。补充学联与钙离子和Na +通道阻滞剂（ 氯化镉和TTX，分别）来抑制动作电流。
    4. 应用2 SV从0毫伏到贴片唤起我 小时 （ 图5C）的保持电位-90毫伏电压的步骤。请记住，吸管电位和静息膜电位是在细胞连接配置56系列。有关详细信息，请参阅轴突指南和参考。39。
    5. 定期检查吸管可能漂移。
    6. 在记录结束时，破裂的补丁去在全细胞模式，并立即采取膜电位的读出。如第4.8.2和4.8.3，从而获得一个外面向外补丁退吸管。
  4. 从全细胞模式的相应躯体记录
    1. 沿枝晶看起来并找到相应的SOMA。使用的高电阻吸管-填充用K +的细胞内溶液（ 表3）（5 10MΩ）6,14,57。申请的简要吸力（负压力）向枪头，才能在全细胞模式进入破裂膜。
    2. 通过施加长甲亢和去极化电流阶跃（ 图5D）检查在电流钳的神经元的身份和允许生物胞素沿着树突扩散。应用短去极化电流的步骤以可视化的AP时程。
    3. ≤10分钟后，撤回吸管如第4.8.2，从而获得一个外面向外补丁 - 4.8.3。轻轻用大开口巴斯德吸管进入包含标准学联25毫升的琥珀色玻璃瓶转移片。用盖关闭瓶。
    4. 可替代地，首先获得含有另外一个荧光染料的吸移管溶液的体全细胞。允许染料的扩散和选择枝晶26的一部分。用的第二吸移管，修补在细胞贴附模式树枝状。使用共聚焦显微镜（如果可用）以提高荧光标记的可视化编辑枝晶14,22。
    5. 在外面向外配置中执行的树突录音，替代地或附加到细胞贴附记录10,22。看到从图5E和5F的外面向外补丁记录在电压-门控电流的一个例子。

6.黑质细胞的用biocytin标签

  1. 组织的固定
    1. 如果可能的话，使用单独的房间进行切片记录/组化处理38。
    2. 通过用4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH值= 7.4）用巴氏吸管取代ACSF固定切片。始终使用新鲜配制的固定液（<< 1周龄）。
      注意：使用合适的手的手套，并置于组织学实验室化学罩操纵，因为它的毒性的多聚甲醛。使用和C之前，请阅读此危险品的安全数据表赫克的有关规定化学品安全（危险物质指令（67/548 / EEC）欧盟委员会），因为这粉末被认为是诱发癌症。其他细节在参考文献58。
    3. 放置在4℃过夜的片。避免膜片钳设置或由低聚甲醛用于电任何设备的污染。
    4. 固定后，更换PBS固定液。使用不同的巴氏吸管用于除去固定液和应用PBS中。在PBS商店切片在4℃下进一步处理之前（1 - 2周）。在这种情况下，替换的PBS每周两次。始终使用新鲜配制的PBS（<< 1周龄）。
  2. 组织的染色
    1. 制备24孔细胞培养板的染色步骤。使用清洁设备转移片。用新鲜的PBS冲洗切片3×5分钟。
    2. 应用荧光素抗生物素蛋白DCS（抗生物素蛋白D，细胞分选级; 1μLfluoresCEIN /毫升的Triton X-100）和0.3％的Triton X-100的PBS在4℃下过夜。避光切片在整个染色。作为一种替代方法通过3,3'-二氨基到荧光标记的神经元光或电子显微镜分析21,58。
      注意：的Triton X-100是危险的。使用这种物质之前，请阅读安全数据表和欧盟委员会指令。
    3. 冲洗3×30分钟，用PBS，随后用PB（磷酸盐缓冲液，以避免在薄片的表面上形成结晶）。
  3. 安装在标准载玻片上的切片。与包埋剂小心地覆盖片。避免在包埋剂气泡。轻轻的把盖玻片，以完全覆盖切片。用显微镜可视化之前过夜风干的幻灯片。
  4. 在可视化后4℃保存标记切片。组织化学方法有用的技巧是在参考文献58,59。
  5. 清洁分别用于组织学和电设备。不要混在一起的组织学和电设备。

用biocytin填充神经元7. 邮政特设可视化

  1. 使用共聚焦显微镜可视化回收的神经元的形态。
    1. 大致定位在与萤光切片的荧光标记的神经元。检查神经元的树突并找到轴突和轴突气泡 - 用10倍或20倍的目标（2 4微米直径）。文档轴突的过程。
    2. 切换到共焦显微镜，并选择488纳米激光二极管激发包含在标记神经元的荧光。按照z轴的轴突和树突的延伸。
    3. 为了获得的Z-堆栈整个单元拍摄连续的图像。调整z轴（连续的图像之间的距离）的0.5的分辨率 - 1微米。收集细胞全光照的共聚焦图像G低（10X物镜）和高（60X目标，油浸）的放大倍率。
    4. 打开与成像软件（ImageJ的）60共聚焦显微镜获得的神经元的图像文件。由眼睛的z投影图像与红外DGC图像进行比较来定位电生理记录（ 图1，图2A，3A，4A，5A和5E）在补丁移液器的精确位置。
    5. 确定标记的神经元的morphometries：衡量轴突 - SOMA距离，沿somatodendritic域和树突状吸管和使用ImageJ的“测量”功能之间轴突记录移液器之间的距离。
    6. 重建一些神经元NeuronJ（ImageJ的），29了Imaris或Neuromantic 61。

8.电数据分析

  1. 使用与放大器有关的软件包严重分析数据（ 例如 ，Clampfit），或直接在其他软件进行数据分析，如Stimfit，一个开放源码软件62,63在我们最近出版13或者例如WinWCP。

Representative Results

上述协议打算促进使用树突膜片钳记录的数据的集合。这种技术与事后组织化学相结合，有助于深入了解许多电信号始发或蔓延到树突的机制。以树突直接访问补丁移液器是困难的，但特别注意的几个方法方面将提高录音的成功率。在稳定的体细胞记录足够的经验，实验者可以期望获得大多数尝试高电阻（GΩ）密封和完整的实验。一到两个高品质的树突状记录可以为每个夹层被收集。

含有健康的胞体和树突优质大脑切片的供应是访问这些精细结构（ 图1）的先决条件。的搜索标准一个用于选择这些神经元是平滑且均匀的表面遍布细胞，当与最佳调整光学观察到体细胞和树突低对比度（ 图1A和1B）。选择的神经元过强通常对比导致不稳定的记录（ 图1C和1C）。因此，例如神经元，应该避免。

相较于其他神经元，黑质多巴胺神经元显示特定的形态和电生理特性。这些通常与一个单个的体细胞移液管评估特征也可以在双体（ 图2）和somatodendritic记录（ 图3）观察到。龙超极化电流注入诱发称为“凹陷”（ 图2B和5D）膜电位整改。轴突起源，在大多数情况下，在一个树枝状站点识别使用互补标准13,25,26，这表明在这些神经元的树突隔室是多相（ 图3A - 3B）。其结果是，在AP首先观察到的隔室对应于其中轴突出现（ 图3C - 3D）的隔室13,25,26。轴突一般是由引起轴突的切割轴突疱切片64时终止，但没有系统检测到这种结构。

在黑质多巴胺神经元观察到连续的I H激活了明显下垂表明HCN亚基的高表达。为了确定I H突触信号的一体化的影响，产生并在somatodendritic双重录制55（<通过树突状记录电极注入突触状电流（EPSC）波形STRONG>图4）。这些模拟EPSCS的动力学进行了基于真实自然EPSCS的上升和下降时间常数。所得aEPSP记录与躯体电极。的I H阻滞剂ZD 7288的浴应用增加aEPSP的持续时间，指示我 h至突触信号（ 图4B）的时间过程的贡献。 ZD 7288还取消了膜电位整流确认从I H的激活（ 图4C）的凹陷的效果。用模拟EPSPS获得的结果可能是相关的使用电诱发EPSPS 65实验。映射的信道的在多巴胺神经元的somatodendritic域的精确分布，细胞贴附录音被执行（ 图5）。高电阻密封（>> 1GΩ）是绝对必要的细胞附着的录音（ 图5B ，I H与长极化电压步骤慢慢激活和当前稳态时达到数百毫秒（ 图5C）的后，如先前所示66。这一观察表明，在多巴胺神经元的树突表示HCN通道相比，那些在锥体神经元或其它类型的细胞10,16,66具有不同的亚单位。作为该信道的分配可能会在树突状隔室是不均匀的和作为树枝状隔室本身是异质的，枝晶（轴突载运或nonaxon轴承枝晶）的身份被IR-DGC图像与共焦图像进行比较发现后生物胞素染色（ 图3A和B）。细胞形态的恢复因此两个双重somatodendritic录音和用于经由后续体全细胞记录细胞贴附记录必要的。


图1. 可视化黑质多巴胺能神经元的胞体和树突近端用红外电视显微镜。 （A）IR-DGC一个黑质神经元DA显示索玛和近端树突和躯体都和树突状吸管的形象。双somatodendritic记录成功地在这个健康的神经元执行。观察低对比度和光滑表面遍布细胞的somatodendritic域。（B）一种健康的DA神经元的另一实例。（℃）DA神经元具有粗糙和不平坦的表面和更强的对比度。虽然已获得了双记录，稳定性是不理想的，并且记录时间为短（〜15分钟），由于在两个移液器接入电阻逐渐增加（D）示出的DA神经元的第二例的强烈对比的索玛和近端树突。在这种情况下，在全细胞模式突破后不久观察到的接入电阻的强劲增长。降低负压访问性的尝试不成功。在面板C和D的神经细胞可以在切片过程中已被破坏，并应避免用于实验。（E）在记录的开始的健康的DA神经元的同时双体记录。（F）的相同的神经元在图E与〜17分钟后，肿胀的细胞体。注意全没有相反，胞体的球一样的外观和大型核这不是健康的神经元明显的存在。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2。 同时双体录音从神经元DA从一个神经元的DA双体录制过程中（A）IR-DGC形象。（B）超极化和去极化1秒长的电流注入（-160至80Pa，增加80 PA）和与两个补丁移液器同时记录对应的电压变化。请注意，凹陷在电压跟踪存在下与去极化电流脉冲在漫长的超极化电流步骤和AP后大后超极化。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.双S IN DA的神经元omatodendritic记录。（A）一DA神经元的IR-DGC形象。树突和胞体之间的距离抽动吸在标有抗生物素蛋白偶联异硫氰酸荧光素（FITC）A组神经元的29微米。（B）共聚焦Z-投影图像。神经元在录制过程中充满了生物胞素。轴突源自接近由箭头指示的体细胞的近端枝晶。从记录在所述体躯（黑电压迹线）和树突面板A. AP中的神经元（C）的同时双somatodendritic全细胞电压记录（红色电压迹线）响应于经由所述体细胞（左一个1秒长的电流注入步骤;黑色电流曲线）和可替换的树突吸管（右;红色电流轨迹）（D）的体细胞和树突的AP在扩展时间标度所示。与任一体或树突电流注入，体细胞的AP（黑色）之前该树枝状的AP（红色）。在这个神经元的AP之间的延迟为120微秒和210微秒分别与体细胞和树突状电流注入。延误在AP的上升阶段于AP半数最大振幅进行测定。美联社在隔间接近其轴突出现，证实了以前的观察25,26首先观察。在这种情况下，树枝状记录从一个轴突缺乏树突制成。从轴突树突轴承是在文献记录的13（1在其图）的一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. 人工EPSPS传播沿DA能神经元的Somatodendritic轴。 （A）一DA神经元的IR-DGC形象。树枝状和体细胞移液管之间的距离为45微米。两个补丁移液器在全细胞电流钳记录模式。（B）的电流在电流钳记录有树枝状吸管和用于生成人工EPSP（顶部）。通过树突记录吸管55的电流由一个EPSC状波形的注入得到的（;τ 衰变 = 3毫秒振幅= 100 pA的τ 上升 = 0.6毫秒）。在底部，繁殖记录在控制条件下（黑色）苏摩aEPSPs和I H受体阻滞剂ZD7288的浴后应用（30微米，红色曲线）。每个电压跟踪是40个单次扫描的平均值。观察ZD7288指示我 小时，以EPSPS的时间过程的贡献存在的EPSP持续时间大幅增加。（C）电压的控制条件下（黑色）索玛记录轨迹和30μMZD 7288后应用（红色）响应于一个长（30 PA; 1秒）超极化电流阶跃。请注意没有膜电位整流（SAG）堵塞后的I <子>小时。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图 5. DA神经元树突 存在的 我 小时 。一个DA神经元和吸管近端枝晶（A）IR-DGC形象。（B）在细胞连接配置一个5 mV的电压指令期间电容和漏电流。密封电阻为5GΩ在本实施例（C）的超极化电压步骤;从一个膜电位的0毫伏诱导慢激活我 小时 （90毫伏顶部）。当前跟踪倒置，并配有一个单一的指数函数给出τ= 632毫秒的时间常数（D）电压以1秒hyper-全细胞记录，体细胞（图A）的反应和去极化电流脉冲（-160〜120 pA的，40 pA的增量）。体细胞全细胞记录在细胞附着在记录之后执行的。注意：如果没有接入点因TTX和Cd 2+的胞外应用细胞贴附记录期间抑制自发放电。这些电压门控钠离子和Ca添加2+电流阻滞剂来抑制动作电流。图A - D是来自同一神经元另一DA神经元和树突吸管（E）的IR-DIC图像由一个测试脉冲从一个50毫秒前脉冲在-120毫伏激活以0毫伏（F）的电压依赖性电流。在从面板大肠杆菌控股电位-80毫伏的神经元的近端树突切除一个外面向外补丁。请注意当前的时间依赖性失活。 请点击此处查看大图版本这个数字。

物质克/摩尔浓度对于1升
氯化钠 58.443 125毫米 7.305克
碳酸氢钠 84.007 25毫米 2.100克
氯化钾 74.551 2.5毫米 0.186克
加入NaH 2 PO 4 137.99 1.25毫米 0.172克
葡萄糖 198.17 25毫米 4.95克
氯化镁 1 M（溶液） 1毫米 1毫升
氯化钙 1 M（溶液） 2毫米 2毫升
摩尔渗透压浓度：〜310 mOsmol / L（最佳范围：314 - 325 mOsmol / L），pH值= 7.4

表1： 人工脑脊液（ACSF）。

物质克/摩尔浓度对于1升
氯化钠 58.443 87毫米 5.084克
碳酸氢钠 84.007 25毫米 2.1001克
氯化钾 7.551 2.5毫米 0.18637克
加入NaH 2 PO 4 137.99 1.25毫米 0.17248克
氯化镁 1 M（溶液） 7毫米 7毫升
葡萄糖 198.17 10毫 1.9817克</ TD>
蔗糖 342.29 75毫米 25.672克
氯化钙 1 M（溶液） 0.5毫米 0.5毫升
摩尔渗透压浓度：〜326 mOsmol / L，pH值= 7.4

表2： 蔗糖ACSF以制备切片。

物质克/摩尔浓度为100毫升
KMeSO 4 150.2 120毫米 1.8024克
氯化钾 74.56 20毫米 0.14912克
氯化镁 1 M（溶液） 2毫米 200微升
的 Na 2 ATP 五51.1 2毫米 0.1102克
的 Na 2 GTP 523.2 0.5毫米 0.02661克
的 Na 2 -Phosphocreatine 255.1 5毫米 0.1275克
EGTA 380.4 0.1毫米 3.803毫克
HEPES 238.31 10毫 0.23831克
生物胞素 1毫克/毫升 0.1克
摩尔渗透压浓度：〜302 mOsmol / L，pH值= 7.2用KOH调节

表 3： 双录音胞内溶液。

物质克/摩尔浓度 100毫升
氯化钾 74.56 120毫米 0.8947克
氯化钙 1 M（溶液） 2毫米 200微升
氯化镁 1 M（溶液） 1毫米 100微升
HEPES 238.31 10毫 0.23831
TEA-CL 165.7 20毫米 0.3314克
4-AP 94.11 5毫米 0.04705克
氯化钡2 244.26 1毫米 0.02443克
氯化镉 183.32 0.02毫米 0.3666毫克
TTX 1毫米 200纳米 20微升
摩尔渗透压浓度：〜290 mOsmol / L时，用D-葡萄糖（参考文献16）调节; pH值= 7.4

表 4： 细胞贴附录音电极溶液。

Discussion

这份报告描述了一个一步一步的协议实现双somatodendritic全细胞记录和当地树突录音。它是用于确定对突触后电位的时间过程离子通道（ 即，I H）的影响，并映射离子通道（Ⅰh）条沿黑质多巴胺神经元的somatodendritic域的分布，分别是有用的。导致电测量相结合， 事后组织化学恢复细胞形态。该程序是用来调查位于黑质多巴胺神经元，但可以概括为相邻黑质的GABA神经元，腹侧被盖区DA神经元或其它脑神经元。所有的步骤，也可以跟着审查黑质神经元的树突没有重要的修改表示其他离子通道。 事后可视化是用于与轴突轴承神经元特别相关树突，如黑质细胞25,26，海马东方明珠Oriens-alveus的interneurons 21或一些CA1神经元67。有趣的是，神经元共用这一功能似乎比一般认为67更常见。形态分析也揭示了电极和轴突的精确位置。后者的检测可以通过使用免疫组68,69轴突起始段（电压门控Na +通道或锚蛋白G）的表达的蛋白质的标记进行优化。

树突状记录和随后的神经元标记收集到的数据的可靠性不变地依赖于片质量。因此最大的努力需要施加到组织内保持细胞的活力。这是用柔和处理健康动物，高品质的工具和试剂，组织和冰冷的温度足够的氧合的整个切片的制备取得。稳定的拍摄条件依赖于健康的神经元的选择。在全细胞模式，串联电阻最初应尽可能低，并保持在整个实验常数。录音的稳定性还取决于高质量的机械手缺乏漂移和振动。检查以吸管持有人的连接和探头，控制了显微电缆松弛，避免温度或舞台动作的突然变化和检查机械手的机制：可以通过优化移液器稳定性可以减少这些干扰。对于双记录，甲基13,15,21已被包含在细胞内的解决方案，但葡糖9,14,25或者可使用。然而，主要的阴离子可以改变膜电位70,71和某些电压依赖性电流72。细胞内溶液可以补充与ATP，GTP和磷酸保存physiolo神经元的gical功能。另外，在移液管溶液中加入荧光染料（ 例如 ，Alexa的594或磺酰罗丹明101 41），以一个躯体记录期间形象化树突可以是有用的，例如以放置压力施加（在参考文献的图7。41）或电刺激吸管。对细胞附着的录音吸管解决方案包含一个高K +浓度，没有Na +的记录高我 小时 。值得注意的的 Na + / K +浓度比影响电流振幅10，电流11的反转电位和I H 73选通。可替代地，I H也可以用外奏10记录。然而，在该记录结构中，在通道的邻近的细胞内环境可以扰动。因此，在I的电压依赖性活化的差异<在使用细胞贴附补丁和外困10获得比较电流子> h的观察。神经元的肿胀膜片钳记录期间偶尔遇到，并且经常从不同的原因产生诸如水的溶液中的组合物中的低质量，强不平衡克分子渗透压浓度或pH的细胞内和细胞外溶液39或误差之间。电生理学记录的质量对回收的神经元的形态学的质量有直接的发病率。高电阻体移液器用于双重记录（6 - 10MΩ，如在6,11参考文献）和单体录音细胞附着的记录之后，以尽量减少细胞内环境14的稀释。因此，细胞贴附记录之后的全细胞体记录被保持短（<10分钟）。无论从体细胞和树突移液器外面向外补丁是针对C的正确的关闭至关重要ELL膜和细胞形态的随后回收。除了细胞的结构，神经化学含量可以为记录神经元59,74来确定。例如，细胞内蛋白质酪氨酸羟化酶可以免疫标记为多巴胺神经元13的明确鉴定。

DA神经元主要集中在SN致密部，与目前在SN相当低的密度网状部，在那里它们被混合使用一个较大的数字神经元GABA 75。而多巴胺神经元的细胞体是经常比GABA神经元大时，这些细胞的视觉识别与IR电视显微镜是不确定的，由致密部的不透明度部分阻碍。克服这些限制，多巴胺神经元的预选择可通过在神经元（TH 65或DAT为多巴胺神经元，GAD的特定人群表达荧光标记的使用转基因小鼠来促进为GABA神经元）和落射荧光照明。替代地，荧光染料可被包含在体电极的溶液，以促进枝晶的可视化。增加了荧光细胞的分辨率由尼普科夫旋转盘共聚焦14,22,30或组合以红外DGC 6双光子显微镜7带来的。几个优点相比，DIC有关DGC。首先，作为不需要DIC棱镜，对IR-DGC图像可以与荧光图像49,52,53,76重叠。第二，DGC可以与光刺激和光遗传学77相结合。

切片准备的一个缺点是神经元的完整性的保护。多巴胺神经元中的三个空间平面78,79延伸的树突和因此树枝状隔室的截断不能完全在片80避免。片的取向的选择（冠状，水平或对矢状）是一个权衡。神经支配和实验设计的原点，必须考虑选择片的正确方向。

直接树突修补是用于功能性离子通道的分布图中的细胞的不同区室的技术。此外，这种技术提供了确定在通道20的功能特性的可变性。作为一种补充的离子通道的位置和密度可通过免疫组织化学在光学及电子显微镜的水平17,23来确定。这种方法还提供了确定未至的补丁移液器小口径结构信道密度的可能性。然而，这些信道可能是在一个不同的功能状态24或甚至不活动相比，那些使用膜片钳技术记录。这两种技术，因此需要获取的位置和属性的完整图象在一个特定的蜂窝区17的离子通道。与电压敏感染料的发展，电压成像已经被用于检查AP和神经元EPSPS的在多个位置81的传播。作为替代双膜片钳记录，这种方法甚至可以为薄树突不在修补移液器访问，但必要的信号，并平均化的精确校准实现。

而在SN和腹侧被盖区的多巴胺神经元被广泛经由在生理和病理上下文躯体录音调查，其树突的功能特性保持在这两个条件是未知。从树突修补已实施黑质多巴胺神经元由几组成功13,25,26和仍然是首选的剖析这些细微的亚细胞结构8的兴奋性的方法。树突状录音提供进一步opportu无穷大审议的效率和突触传递的可塑性和树突兴奋82,83的可塑性。

Disclosures

作者宣称，他有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

我感谢文森特Seutin博士的一贯支持，克里斯泰勒Gillissen和Laurent Massotte优秀的技术援助，博士让Defourny和桑德拉Ormenese与共聚焦显微镜，雅克注定博士第二Axopatch 200B放大器的礼物，GIGA-成像建议共享平台的共聚焦显微镜和软件了Imaris和斯蒂芬·弗里曼博士批判地阅读手稿。 FNRS（U.N002.13和T.N0015.13）和与之相配套的比利时大学基金会（PubliéAVEC乐竞赛德拉基金会区大学比利时）公布的 - 这项工作是由来自比利时FRS资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

神经科学，第117，枝蔓，膜片钳，双录音，细胞附着，生物胞素标记，神经元形态，黑质，多巴胺能神经元，离子通道
从黑质多巴胺神经元的Somatodendritic域亚细胞的膜片钳记录
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter