Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601

Abstract

Dendrieten van dopaminerge neuronen te ontvangen en over te brengen synaptische input, ondersteuning actiepotentiaal back-vermeerdering en neurotransmitter release. Inzicht in deze fundamentele functies zal licht werpen op de uitwisseling van informatie in deze neuronen. Dendritische patch-clamp opnamen bieden de mogelijkheid om de elektrische eigenschappen van dendrieten en de onderliggende voltage-gated ionkanalen direct te onderzoeken. Echter, deze fijne structuren zijn moeilijk toegankelijk voor patch pipetten vanwege hun kleine diameter. Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap procedure voor stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopaminerge neuronen in acute plakjes verzamelen. Elektrofysiologische metingen worden gecombineerd met post hoc herstel van de morfologie van de cel. Succesvolle experimenten afhankelijk betere voorbereiding van segmenten, oplossingen en pipetten, adequate aanpassing van de optica en stabiliteit van de pipet in contact met de structuur opgenomen. Standard beginselen van de somatic patch-clamp-opname worden toegepast op dendrieten, maar met een zachtere aanpak van de pipet. Deze veelzijdige technieken kunnen worden toegepast op verschillende vragen over de prikkelbaar eigenschappen van dendrieten aan te pakken.

Introduction

Neuronen ontvangen synaptische informatie voornamelijk op hun dendrieten. Prikkelende en remmende synaptische signalen verspreiden van hun plaats van generatie op de integratie plaats waar actiepotentialen (AP) worden opgeroepen als het uitgangssignaal. Onderweg wordt synaptische potentialen zowel door de structuur van dendrieten en de interactie tussen passieve en actieve membraaneigenschappen. De combinatie van deze zeer variabele parameters verbreedt de rekenkracht van neuronen 1,2. De kleine diameter van dendrieten belemmert echter de studie van hun elektrische eigenschappen. De voortdurende ontwikkeling van de patch-clamp techniek 3, hebben de optiek 4 en verfijning van methoden voor slice voorbereiding 5 gedurende de laatste decennia opnames nodig van heel dun (0,7-3 um Ø) dendrieten 6,7. Deze methoden waren en zijn nog steeds voornamelijk gebruikt om de prikkelbaarheid van dendrieten onderzoeken verschillende of neuronen 8. Direct dendritische opnamen zijn essentieel voor de distributie 9-19 en verschillen in de functionele eigenschappen van 20-22 ionkanalen in neuronale afzonderlijke compartimenten bepalen. Deze gegevens zijn de noodzakelijke aanvulling van ionkanaal distributies gedetecteerd met immunohistochemie gecombineerd om licht en elektronenmicroscopie 23,24. Dual somatodendritisch opnamen zijn genomen om de verspreiding van actiepotentialen 9,13-15,21,22,25-27 en het verspreiden van synaptische potentials 13,16,18 langs de somatodendritische domein van neuronen te verkennen, het verkrijgen van gedetailleerde passieve kabel modellen 28- 30 en onderzoek naar de temporele resolutie van neuronale integratie 31.

De substantia nigra (SN) is een regio gelegen in het betrokken bij verschillende functies, zoals de controle van de beweging, de codering van beloning en gewone gedrag middenhersenen. De afname van dopamine als gevolg van de specifiekeverlies van dopaminerge (DA) neuronen in de SN is gekoppeld aan de motorische stoornissen waargenomen bij patiënten met de ziekte 32 van Parkinson. De nigrale circuit bestaat uit twee celtypes: dopaminerge en GABA-erge neuronen. Interessant is dat deze neuronen aantal specifieke kenmerken die hen onderscheiden van andere neuronen. Het axon van een groot deel van DA neuronen en sommige GABA neuronen afkomstig van een dendritische plaats aangeeft dat de dendritische as heterogeen (axon-dragende en axon ontbreekt dendrieten) 25,26,33. De morfologie van deze neuronen contrast dan de typische organisatie van neuronen waarbij de informatieoverdracht volgt de wet van dynamische polarisatie uitgezonden door Cajal: vanaf dendrieten, tot soma en uiteindelijk Axon 34. DA neuronen is ook bekend dat dopamine ontheffen van hun dendrieten 35, genereren barsten activiteit 36 en NMDA-receptor 37 plasticiteit. de dissectie van deze verschijnselen is ongrijpbaar zonder direct opnamen van de plaats waar ze worden geïnitieerd. Om inzicht te krijgen in de relatie tussen de precieze locatie en functionele eigenschappen van ionkanalen en hun rol in de dendritische prikkelbaarheid en informatie-overdracht in nigrale neuronen, directe dendritische opnames zijn de methode van keuze.

Dit rapport beschrijft een gedetailleerde procedure die kan worden gebruikt voor enkele en dubbele patch-clamp van dendrieten van nigrale neuronen en de overeenkomstige post hoc biocytine labeling verkrijgen. De uitgangspunten voor het patchen van de somatische en de dendritische membraan zijn zeer vergelijkbaar. Praktisch echter opnamen van dendritische plaatsen vereisen specifieke optimalisatie in relatie tot somatische opnamen. Succesvolle dendritische opnames afhankelijk van de kwaliteit van de plakjes, optimale instelling van de optica, zwakke benadering van de patch pipet en stabiliteit van de opnames.

Protocol

Alle hier beschreven experimentele procedures te volgen institutionele en nationale richtlijnen, EU-richtlijnen voor de Bescherming van Dieren en de richtsnoeren van de Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Bereiding van de oplossingen

  1. Standaard kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF; Tabel 1)
    1. Gebruik een hoge zuiverheidsgraad zouten 38 en schone glazen bekers eerder gespoeld met tweemaal gedestilleerd water om een verse oplossing te bereiden. Gebruik van hoge kwaliteit dubbel-gedestilleerd water voor de voorbereiding van alle extra- en intracellulaire oplossingen.
    2. Neem een 2 L beker te NaHCO3 lossen in 500 ml water en andere voor de andere zouten op te lossen teneinde precipitatie van tweewaardige ionen 39 volgens tabel 1 voorkomen. Reinig de spatel systematisch met tweemaal gedestilleerd water en drogen alvorens een zout . Gebruik een magnetische roerder homogeniseren dissolution. Voeg de oplossingen van beide bekers tot een geschikte volumetrische kolf en brengen het juiste volume.
    3. Zorg ervoor dat de uiteindelijke extracellulaire oplossing is volledig transparant en zonder enig spoor van neerslag.
    4. Breng een gasmengsel bestaande uit 95% O2 en 5% CO 2 (carbogen gas) met een glazen microfilter kaars (Ø 13 mm) 20 - 30 min vóór perfuseren de plakjes 38,40. controleren zorgvuldig de osmolariteit (2-3 opeenvolgende metingen) van de ACSF met een osmometer (optimaal bereik: 314-325 mOsmol / L). Bewaar de overblijvende oplossing na bereiding bij 4 ° C en gebruik het binnen 3 dagen.
  2. Snijoplossing (sucrose-ACSF; Tabel 2) 5,13
    1. Bereid 3 liter verse oplossing. Met 1 L tot hersenschijfjes bereiden uit één dier. Bewaar de resterende oplossing bij 4 ° C en gebruik het binnen 3 dagen.
      LET OP: Hoge Mg 2+ en lage Ca 2+ concentraties worden gebruikt om daling synaptische transmissie en de vervanging van sommige NaCl met sucrose het weefsel 5,40 bewaren.
  3. intracellulaire oplossingen
    1. Bereiden op voorhand 100 ml oplossing voor dual whole-cell opnames (tabel 3).
    2. Omvatten methylsulfaat 13,15,21 om een goede herstel van de morfologie van de cel te krijgen. biocytine zetten (0,1-0,4%) vervolgens onderzoeken van de morfologie van het neuron. Zoals een fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, Alexa 594 of 101 Sulforhodamine 41) om de uitbreiding van dendrieten tijdens de opname (optioneel) volgen.
    3. Bereid vooraf elektrode 100 ml oplossing voor cel verbonden opnamen (Tabel 4). In dit geval is de inwendige oplossing een hoge K + oplossing die de macroscopische Hyperpolarization kation (I h) isoleren en bevat blokkers voor andere spanningsafhankelijke ionkanalen.
    4. Store intracellulaire oplossingen in 2 ml porties bij -20 ° C. Gebruik een nieuwe portie voor elke nieuwe opname sessie. Controleer de osmolariteit van elke ontdooid monster zorgvuldig af met een osmometer. Neem een ​​nieuwe hoeveelheid als de osmolariteit niet overeenkomt met de beginwaarde.
    5. Breng de oplossing van het monster in een 3 ml spuit op de bovenzijde waarvan een 0,22 urn steriel filter injectiespuit is geplaatst. Houd de spuit op het ijs tijdens de opnamesessie om afbraak van de verbindingen (ATP, GTP of phosphocreatine) te beperken.

2. Fabricage en vullen van Patch Pipette

  1. trekken
    1. Gebruik een horizontale elektrode trekker en dikwandige borosilicaatglas buizen. Voor whole-cel en cel bevestigd opnamen, gebruik dan een 2 mm buitendiameter / 1 mm binnendiameter. Zorg ervoor dat de glazen buizen is absoluut schoon 38.
    2. Indien dit niet het geval is, dompel glazen capillairen in een organisch oplosmiddel (bijvoorbeeld ethanol) En daarna in dubbel gedestilleerd water. In het kort verwarmen capillair eindes met een bunsenbrander. Als alternatief, orde glazen buizen gewassen en rechtstreeks van de fabrikant verwarmd (zie Materials lijst).
    3. Voor dubbele somatodendritische opnames voor dat de somatische pipet weerstand tussen 6 en 10 MQ 6,11 en tussen 8 en 19 MQ voor dendritische pipetten gevuld met intracellulaire oplossing (Tabel 3). Standaardiseren pipet weerstand voor-cel bevestigd opnamen naar een weerstand van 10 MQ tot vergelijkbare resultaten langs de somatodendritische domein van het neuron 16,18,42,43 bereiken.
    4. Bereid verse pipetten voor elke opnamesessie (elke dag) of onmiddellijk voor het patchen en gebruik ze 5-8 uur na hun fabricage 39. Store pipetten in een overdekte glazen container om ze te beschermen tegen stof en obstructie van de tip.
  2. polijsten
    1. Inspecteren en heat-polish elke pipetpunt met een microforge beter zeehonden met het membraan te verkrijgen. Voordat u de microforge Smelt een klein stukje glas op de platina verwarming gloeidraad. Vervang dit glas coating op de platina filament dagelijks standvastigheid (Peter Jonas, persoonlijke communicatie).
      LET OP: wordt gebruikt voor cel bevestigd opnames pipetten kunnen worden bekleed voor de warmte-polijsten stap om achtergrondgeluid te verminderen. Coating kan worden bereikt met een isolerende stof zoals gesmolten dentale was 22,44 of een silicone elastomeer 39.

3. Voorbereiding van Brain Slices

  1. Gebruik gezonde Wistar ratten tussen de leeftijd van 16 - 19 dagen oud. Gebruik geen ongezonde dieren of dieren die lijden aan onderkoeling of uitdroging. Alvorens de bereiding van segmenten blijven de dieren op een veilige en stille plaats. Vermijd elk ander dier in de kamer, terwijl de voorbereiding van een dier. Manipuleren dieren voorzichtig.
  2. Pour sucrose-ACSF in twee 400mL polypropyleen (PP) bekers en plaats deze in de -80 ° C vriezer gedurende 45 minuten. Meng de oplossing om een ​​homogene ijskoud vloeistof / bevroren oplossing te krijgen en zet de maatcilinders op ijs. Leveren de sucrose-ACSF oplossing carbogen gas met behulp van een microfilter kaars (Ø 13 mm) in elk PP beker.
  3. Bereid de snijmachine en de reserve kamer
    1. Gebruik een hoogwaardig tissue slicer met extreem lage verticale trillingen 5,38 tot beschadiging van de oppervlakkige lagen van segmenten zoveel mogelijk te beperken. Bevestig een frisse en hele scheermesje op de snijmachine.
    2. Gebruik een nieuw scheermesje voor elke maaibeurt. Vermijd het buigen van het scheermesje. Verwijder niet de vette film aan het oppervlak van het scheermesje (Josef Bischofberger, persoonlijke communicatie).
    3. Indien beschikbaar, controleer dan de verticale trillingen met een vibroprobe die door de fabrikant. U kunt ook gebruik maken van een op maat gemaakte vibroprobe 5. Verminder de verticale trillingen van het blad so, zo dicht mogelijk bij 0 urn.
    4. Bereid een 150 ml reserve kamer 45,46 voor plakjes zoals afgebeeld op p. 201 in Ref. 39. Giet standaard ACSF in de reserve kamer en plaats deze in een waterbad. Leveren de reserve kamer oplossing carbogen gebruik van een microfilter kaars (Ø 6 mm). Zorg ervoor dat de carbogen belletjes zijn zo klein mogelijk te maken.
      LET OP: Bouw een nieuwe reserve kamer elke 2 - 3 maanden om de slice kwaliteit constant te houden.
  4. Cut plakken
    1. In een stille ruimte waarin de onderzoeker niet wordt verstoord of gespannen, onthoofden het dier met chirurgische schaar (lengte 150 mm) ter hoogte van de cervicale medulla.
    2. Snijd de huid op de bovenkant van het hoofd van het dier in de neus naar caudaal met een scalpel en verwijder lateraal. Snijd de bovenkant van de schedel van de caudaal van de nasale deel van de kop met fijne schaar en verwijder beide delen van de schedel lateraal. Verwijder de bregen met een dunne spatel en zet het voorzichtig in een PP beker die ijskoude (0-4 ° C) sucrose-ACSF in evenwicht gebracht met carbogen 38.
      Opmerking: Deze serie stappen moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, maar ook zorgvuldig (<< 1 min, ongeveer 40 s).
    3. Houd de hersenen in de oplossing van de PP beker voor ~ 2-5 min. Stel de carbogen druk om bewegingen van de hersenen voorkomen. Vervang het microfilter kaars als de carbogen belletjes te groot door een nieuwe.
    4. Plaats de hersenen op een 9 cm Petrischaal waarbij de binnenzijde van de bodem is bedekt met een 0,5 cm dikke ~ Sylgard laag 38. Bereid deze petrischaal op voorhand.
    5. Omringen de hersenen met ijskoude sucrose-ACSF. Zorg ervoor dat sommige vloeibare fase van ACSF-sucrose-oplossing dompelt de hersenen. Voor coronale plakjes afgesneden het voorste gedeelte van de hersenen in het coronale vlak met een scalpel of een scheermesje. Verwijder de kleine hersenen met een coronale snede.
    6. Solliciteer cyaanacrylaat lijm op de specimen tray (stippellijn ~ 1 cm 2). Plak de hersenen blok zodanig dat het voorste gedeelte wordt geconfronteerd met het snijden podium. Zorgvuldig druppelen sucrose-ACSF bovenop de geplakte hersenen via de grote opening van een glazen Pasteur pipet en vervolgens langzaam onderdompelen snijkamer van de snijmachine. Manoeuvre de specimen tray, zodat het snijvlak (dat wil zeggen, de eerste weefsel om het blad te raken) is het ventrale oppervlak van de hersenen 40.
    7. Solliciteer carbogen met een gebogen glazen microfilter kaars (Ø 6 mm) naar de snij-kamer (optioneel).
    8. Stel het scheermesblad een hoek van ~ 15 ° met betrekking tot het horizontale vlak 5. Snijd coronale hersenen plakjes van ~ 500 urn in de caudaal van nasale richting vóór het bereiken van de substantia nigra. Verlaag de dikte 300 snijden - 350 urn dikke plakken die het gebied van belang.
    9. Afzonderlijke segmenten van het weefsel blok met een zeer dunne perfusie naald bevestigd aaneen spuit evenwijdig aan de rand van het scheermesblad. Buig de naald teneinde een hoek van 90 ° tussen de naald en de injectiespuit hebben. Zorgen dat geen druk wordt uitgeoefend op het scheermesblad tijdens het verwijderen van het deel van het weefsel blok.
  5. Store plakjes
    1. Breng de plakjes met behulp van de grootste opening van een glas Pasteur pipet (gekoppeld aan een gloeilamp) in de reserve kamer. Zodra alle segmenten zijn overgebracht naar de reserve kamer (Christoph Schmidt-Hieber, persoonlijke communicatie) breng de temperatuur van het waterbad van 34 ° C gedurende 0,5-1 uur.
    2. Na deze periode uit te schakelen het waterbad en houd de plakjes op kamertemperatuur. Stel de carbogen druk om bewegingen van de segmenten in de reserve kamer te vermijden. Houd de plakjes nog 10 tot 20 minuten voordat opnames.
    3. Maak de apparatuur en de microfilter kaarsen nog zorgvuldig grondig met tweemaal gedestilleerd water aan het einde van de slicing procedure.

4. Dual Somatische en Somatodendric Recordings in nigral Neuronen en biocytine Filing

  1. Volg de beschrijvingen voor de montage van een patch-clamp setup voor plakjes gegeven in The Axon Guide en in Refs. 39,40,47. Informatie met betrekking tot meer fundamentele aspecten van patching in Ref. 48.
  2. Bereid opname kamer
    1. Plaats 1-2 mL dubbel gedestilleerd water in de opname kamer. Controleer dat het niet lek. Plaats de opname kamer op de verschuivende xy tafel.
    2. Feed standaard ACSF door middel van een zuurstof-ondoordringbare perfusieslang systeem (polytetrafluorethyleen) naar de opname kamer. Stabiliseren van de perfusie stroming in de kamer met een snelheid van 4-5 ml min -1. Houd de lengte van de buis verbinden van de beker met ACSF en de opname kamer zo kort mogelijk (1 m).
    3. Selecteer een brein slice uit de reserve kamer en breng het inde opname kamer met de grootste opening van een glazen Pasteur pipet. Bedek het segment met een platina ring te verankeren aan de bodem van de opname geplaatst zoals afgebeeld op p. 201 in Ref. 39. Gebruik een platte platina ring (Ø 1,5 cm) en lijm parallelle nylon draden (afstand> 2 mm) op.
  3. Aanpassen en optimaliseren van de optica
    1. Visualiseer de plakjes met behulp van infrarood (IR) video microscopie 4,47,49,50. Pas de Köhlerverlichting 51 en optimaliseren van differentieel interferentie contrast (DIC) 51 optiek of de schuine verlichting (Dodt Gradient contrast - DGC) 52,53. Meer details over deze procedure worden gegeven in Refs. 40,49.
    2. Controleer de kwaliteit van de snee. Alleen houden plakjes met gladde en zelfs oppervlakken die niet al te sterk contrast en hebben slechts kleine, verspreide kraters.
    3. Vul 2 verse en ongebruikte patch pipetten met intracellulaire oplossing (
  4. Plaats de pipetten boven het oppervlak van het deel
    1. Controleer de aanwezigheid van chloride coating op de zilveren draden (bad referentie-elektrode en patch elektrode, voor meer informatie, zie De Axon Guide en Refs 39,54.).
    2. Plaats de pipetten achtereenvolgens in de pipet houder en breng overdruk (~ 70 mbar) via een leidingsysteem verbindt de pipet houder, een driewegkraan en een manometer 40. Laat de pipet in het bad van de opname kamer.
    3. Controleer of de drukwaarde op de manometer constant voor ~ 1-2 min. Als de druk afneemt, controleer dan de slang of de afdichtende O-ringen in de pipet houder.
    4. Plaats de pipetpunt in het midden van het beeldscherm en zodat deze niet wordt belemmerd. Zorg ervoor dat de pipetpunt niet beweegt wanneer het aanbrengen of druk vrijgeven van de pipet.
    5. Controleer op drift en trillingen van pipetpunt door het tekenen van een kruisje in het midden van het scherm precies ter plaatse van de pipetpunt en observeren 5 min mogelijke bewegingen van de tip.
    6. Toepassen van een spanning stap (5 mV) aan de pipet weerstand op een oscilloscoop controleren. Stel de holding potentieel van de patch-clamp versterker op 0 mV. Annuleren pipet offset potentieel, zodanig dat de DC pipet huidige leest nul op de versterker meter 39,51.
    7. Verplaats de pipetten tot aan de slice en onderhouden van hen boven het oppervlak.
  5. Selecteer en patch een neuron met lange dendrieten
    1. In de substantia nigra selecteer een gezonde neuron met lange dendrieten die over een grote afstand kan worden gevolgd ongeveer dezelfde plane (Figuur 1A en 1B) met behulp van IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Kies een gladde en homogene cel lichaam. Vermijd de twee sterk contrast cellen op het oppervlak van het deel (figuur 1C en 1D), omdat het moeilijk te breken en stabiele opnameomstandigheden tijd (stable serieweerstand) behouden. Selecteer neuronen die hun soma 10 hebben - 30 urn onder het stukje oppervlak.
    2. Verplaats de somatische elektrode nabij de soma (40 - 50 urn afstand) en de dendritische elektrode nabij de dendriet op dezelfde afstand. Gebruik een 2X vergroting (viervoudig wisselaar) te selecteren en te patchen een gedeelte van een dendriet. Verkrijgen op de monitor een absolute vergroting van 2,100X zonder vergroting (1X) en 5,500X met een 2x vergroting.
    3. Iets de druk van de somatische pipet vrijgeven 10 mbar. Eventueel reguleren dendritische en somatische pipet druk om verplaatsing van de c voorkomenell structuur (soma en dendrieten) binnen het segment.
    4. Plaats de dendritische pipet nabij het membraan om een ​​kleine kuiltjes zien. Laat de druk op de pipetpunt en de patch dendriet tijdens het regelen van de pipet weerstand. Onder ideale omstandigheden, slechts een zeer geringe onderdruk voldoende om een ​​goede afdichting te verkrijgen.
    5. Houd de dendritische pipet in de cel verbonden modus. Verplaats de somatische pipet dicht bij de somatische membraan en patchen van de somatische membraan. Zorg ervoor dat een hoge afdichting weerstand wordt verkregen voordat scheuren de celmembraan (> 1 GQ) 39. Enigszins trekken beide pipetten van het membraan door een paar urn tot vervorming van het cellichaam en dendrieten voorkomen.
    6. Voor beide pipetten verminderen zoveel mogelijk de amplitude van de pipet capaciteit transiënten bovenop de huidige stap met een spanningspuls met hoge versterking en filtering weinig 51 en de oscilloscoop. Treed binnen in de whole-cell-modus wiTh de dendritische pipet en vervolgens met de somatische pipet.
    7. Elimineer de whole-cell capaciteit transiënten en compenseren serie weerstand. Op en documenteert de toegang weerstand aan het begin van en regelmatig tijdens het experiment. Als serieweerstand te hoog (> 50 MQ), proberen een andere pipet.
    8. Verzamel IR-DGC foto's (figuur 1A en 1B) met een video grafische printer 25, een framegrabber of een digitale camera met een hoge en lage vergrotingen.
      LET OP: zwelling van neuronen tijdens de opname (figuur 1E en 1F) wordt sporadisch waargenomen, maar zelden wanneer de osmolariteit en de pH van de oplossingen is correct afgesteld 39.
    9. Het verkrijgen van dubbele somatische whole-cell opnames (soma - soma) met dezelfde procedure (Figuur 2A).
  6. Solliciteer lang (enkele honderden ms) het verhogen depolariserende huidige stappen sequentieelde somatische en dendritische pipet AP (Figuren 2B, 3C en 3D) oproepen. Het hieruit resulterende potentiaal op de dendritische en somatische pipet tegelijkertijd.
  7. Onderzoek de voortplanting van kunstmatige prikkelende postsynaptische potentials (aEPSPs) in dopaminerge neuronen
    1. Een prikkelende postsynaptische stroom (EPSC) golfvorm te injecteren als een actuele opdracht tijdens dual huidige-clamp opnamen (Figuren 4A en 4B). Om dit te doen, het bouwen van een dubbele exponentiële functie met een amplitude en tijdsduur die overeenkomen met echte waarden gemeten EPSCs in het neuron van belang 55. de controle van de sampling rates van de geconstrueerde EPSC en van de geïnjecteerde EPSC golfvorm aandachtig naar de originele tijdsverloop te behouden.
      Opmerking: Voor het aanbrengen van de golfvorm in een echte neuron, te testen met behulp van een model cel.
    2. Sequentieel injecteren de golfvorm via de dendritische ensomatische pipet en opnemen resulterende mogelijkheden voor zowel somatische en dendritische pipetten gelijktijdig. Controleer regelmatig op mogelijke drift van pipetten.
  8. Het beëindigen van de opname van een neuron
    1. Neem een ​​IR-DGC beeld bij een lage vergroting (doelstelling: 5X of 10X) om de positie van de neuron in het segment en de elektroden documenteren.
    2. Langzaam en voorzichtig terug te trekken van de dendritische en somatische pipetten van de neuronale membraan achtereenvolgens om outside-out plekken met beide pipetten vormen. Verwijder de pipet met een reeks zijdelingse opwaartse bewegingen 38. Deze moet kort op het eerste en dan geleidelijk te verhogen in lengte. Deze configuratie bevordert de opname sluiten van het celmembraan.
    3. Bewaken van de afname van capacitieve stromen (verhoging van de toegang resistentie) in reactie op een 5 mV spanningspuls in voltage-clamp onder intrekking pipet.
    4. Zodra het membraan zeeleidde rond de pipet tip, neem het volledig uit de opname kamer. Verwijder de doelstelling uit het bad. Houd het segment in de opname kamer voor 15 - 20 min in standaard ACSF equilibratie van biocytine (van de intracellulaire oplossing) in de opgenomen neuron mogelijk.
    5. Voorzichtig de slice te dragen met behulp van de grote opening van een Pasteur pipet in een 25 ml brede mond amber (bruin) glazen fles met standaard ACSF. Sluit de fles met een dop. Zie paragraaf 6 voor de fixatie stap.

5.-Cell bevestigd Recordings

  1. Selecteer een neuron dendriet met een zich over een grote afstand in hetzelfde vlak. Zorg ervoor dat de dendriet van belang kan worden gevolgd om een ​​goed gedefinieerde soma.
  2. Vul het patch pipet met elektrode oplossing (Tabel 4). Het ontwerp van de oplossing voor de huidige interesse in de cel bevestigd configuratie op te nemen door het opnemen van specifieke farmacologische middelen aan andere ion cha blokkerennnels.
  3. Patch de dendrite in de cel bevestigd mode
    1. Visualiseer een deel van de dendriet en de aanpak van de hercoderen pipet met behulp van de manipulator. Pas de druk bij de pipetpunt door eerst de manometer (70 - 80 mbar) om verplaatsing van de dendriet voorkomen. Patch de dendrite zoals beschreven in 4.5.4.
    2. Neem sommige IR-DGC foto's (figuur 5A). Probeer een afdichting weerstand zo groot mogelijk (> 1 GQ 39) te verkrijgen, op zijn best tussen 3-10 GQ voor cel verbonden opnamen 18 (figuur 5B). Trek de pipet van het membraan door een paar urn tot vervorming van de dendriet voorkomen.
    3. Observeer actie stromen in de cel bevestigd mode weerspiegelt spontane actiepotentialen van nigrale neuronen. Vul het ACSF met Ca 2+ en Na + kanaal blokkers (CdCl2 en TTX, respectievelijk) om actie te stromen onderdrukken.
    4. Breng een 2 svoltage stap van -90 mV van een bedrijf potentieel van 0 mV om de patch op te roepen I h (figuur 5C). Houd in gedachten dat de pipet potentieel en de rust membraanpotentiaal zijn in serie in de cel bevestigd configuratie 56. Voor meer informatie, zie De Axon gids en Ref. 39.
    5. Controleer regelmatig op mogelijke drift van de pipet.
    6. Aan het einde van de opname, scheuren de patch te gaan in de hele-cel modus en onmiddellijk een uitlezing van de membraanpotentiaal. Trek de pipet, zoals beschreven in de paragrafen 4.8.2 en 4.8.3 een outside-out patch te verkrijgen.
  4. Opnemen van de overeenkomstige soma in whole-cell modus
    1. Kijk langs de dendrieten en zoek de bijbehorende soma. Gebruik een hoge weerstand pipet (5-10 MQ) 6,14,57 gevuld met een K + -gebaseerde intracellulaire oplossing (Tabel 3). Breng een korte zuigkracht (onderdruk) aan depipet tip aan het membraan scheuren indienen om in de whole-cell-modus te gaan.
    2. Controleert de identiteit van de neuron in de huidige-clamp door toepassing van lange hyper- en depolariserende huidige stappen (figuur 5D) en laat biocytine diffunderen langs dendrieten. Solliciteer korte depolariserende huidige stappen om de AP tijdsverloop te visualiseren.
    3. Na ≤10 min, trekken de pipet om een ​​outside-out patch te verkrijgen zoals beschreven in de paragrafen 4.8.2 - 4.8.3. Voorzichtig de slice te dragen met behulp van de grote opening van een Pasteur pipet in een 25 ml amberkleurige glazen fles met standaard ACSF. Sluit de fles met een dop.
    4. Alternatief eerst een somatische hele cellen met een pipet oplossing die verder een fluorescerende kleurstof te verkrijgen. Kan de diffusie van de kleurstof en selecteer een gedeelte van een dendriet 26. Met een tweede pipet, patch de dendrite in de cel verbonden modus. Gebruik een confocale microscoop voorradig als de visualisatie van de fluorescent label verbeterened dendrite 14,22.
    5. Voer dendritische opnames in de outside-out configuratie, als alternatief of aanvulling op de cel bevestigd opnames 10,22. Zie een voorbeeld van een voltage-gated stromingen opgenomen vanaf een outside-out patch in figuur 5E en 5F.

6. biocytine Labeling van nigrale Neuronen

  1. Fixatie van het weefsel
    1. Gebruik indien mogelijk aparte kamers voor slice opname / histochemische verwerking 38.
    2. Bevestig de segmenten van de ACSF vervangen door 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH = 7,4) met een Pasteur pipet. Gebruik altijd vers bereide fixatief (<< 1 week oud).
      LET OP: Gebruik de juiste handschoenen en een chemische kap geplaatst in een histologie laboratorium paraformaldehyde manipuleren vanwege de toxiciteit. Lees het veiligheidsinformatieblad van deze gevaarlijke product voor gebruik en check de regelgeving inzake chemische veiligheid (Richtlijn voor gevaarlijke stoffen (67/548 / EEG) van de Europese Commissie), zoals dit poeder wordt verondersteld om kanker te veroorzaken. Andere details zijn in Ref. 58.
    3. Leg ze bij 4 ° C overnacht. Voorkom vervuiling van de patch-clamp setup of apparatuur die wordt gebruikt voor elektrofysiologie door paraformaldehyd.
    4. Na fixatie vervangen fixeeroplossing met PBS. Gebruik een andere Pasteur pipetten voor het verwijderen van fixatief en toepassing van PBS. WINKEL segmenten in PBS bij 4 ° C voor verdere verwerking (1-2 weken). In dit geval vervangt PBS twee keer per week. Gebruik altijd vers bereide PBS (<< 1 week oud).
  2. Kleuring van het weefsel
    1. Bereid een 24 goed celkweek plaat voor de kleuring stappen. Gebruik schone apparatuur om schijfjes te dragen. Spoel de schijfjes 3 x 5 min met verse PBS.
    2. Solliciteer Fluoresceïne avidine DCS (avidine D, cell sorter rang; 1 pl FLUOREScein / ml Triton X-100) en 0,3% Triton X-100 in PBS bij 4 ° C overnacht. Bescherm de schijfjes van licht gedurende de kleuring. Als alternatief voor fluorescentie, label neuronen via 3,3'-diaminobenzidine voor lichte of elektronenmicroscopische analyse 21,58.
      LET OP: Triton X-100 is gevaarlijk. Lees veiligheidsinformatieblad en de richtlijnen van de EU van de Commissie voor het gebruik van deze stof.
    3. Spoel 3 x 30 min met PBS en vervolgens met PB (fosfaatbuffer, om de vorming van kristallen aan het oppervlak van de plak te voorkomen).
  3. Monteer de plakjes op standaard glas dia's. Bestrijk de sneetjes zorgvuldig met een inbedding medium. Vermijd luchtbellen in de inbedding medium. Zet het dekglaasje voorzichtig om volledig te bedekken de slice. Air-Droog de glaasjes 's nachts voordat ze visualiseren met een microscoop.
  4. Bewaar de gemerkte plakjes bij 4 ° C na zichtbaar. Nuttig tricks op histochemische procedures zijn in Refs. 58,59.
  5. Reinig de gebruikte voor histologie en elektrofysiologie afzonderlijk apparatuur. Heeft histologie en elektrofysiologie apparatuur die niet door elkaar.

7. post hoc Visualisatie van biocytine gevulde Neuronen

  1. Gebruik een confocale microscoop om de morfologie van teruggewonnen neuronen te visualiseren.
    1. Ruwweg zoek de fluorescent gelabelde neuron in de slice met epifluorescentie. Onderzoek de dendritische prieel van neuronen en zoek de axon en axonale bleb (2-4 um Ø) met behulp van een 10x of 20x objectief. Noteer de loop van de axon.
    2. Overschakelen naar de confocale microscoop en selecteer de 488 nm laser diode aan de fluoresceïne in de gelabelde neuron prikkelen. Volg de verlenging van het axon en dendrieten in de z-as.
    3. Neem opeenvolgende afbeeldingen om een ​​z-stack voor de gehele cel te verkrijgen. Pas de resolutie van de z-as (afstand tussen opeenvolgende afbeeldingen) tot 0,5-1 urn. Verzamel confocale beelden van een cel using laag (10X objectief) en hoge (60X objectief, olie-immersie) vergroting.
    4. Open het beeldbestand van het neuron verkregen met de confocale microscoop met een imaging software (ImageJ) 60. Vergelijk imago van de z-projectie met afbeelding van een IR-DGC op het oog om de precieze positie van de patch pipetten lokaliseren tijdens de elektrofysiologische opname (figuren 1, 2A, 3A, 4A, 5A en 5E).
    5. Bepaal morphometries van gelabelde neuronen: het meten van de axon - soma afstand, afstanden tussen opname pipetten langs de somatodendritische domein en tussen de dendritische pipet en axon met behulp van de "Measure" -functie in ImageJ.
    6. Reconstrueren sommige neuronen met NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 of Neuromantic 61.

8. Analyse van de elektrofysiologische gegevens

  1. Met het softwarepakket gekoppeld aan de versterker om de gegevens (bijv Clampfit) of rechtstreeks een grove analyseandere software voor data-analyse, zoals Stimfit, een open source software 62,63 als in onze recente publicatie 13 of bijvoorbeeld WinWCP.

Representative Results

De hierboven beschreven protocol is van plan om het verzamelen van gegevens met behulp van dendritische patch-clamp opnames te vergemakkelijken. Deze techniek, gecombineerd met een post hoc histochemie, helpt om inzicht te krijgen in de mechanismen van de vele elektrische signalen uit of zich naar dendrieten. Directe toegang tot dendrieten met patch pipetten is moeilijk, maar speciale aandacht voor een aantal methodologische aspecten zal het slagingspercentage van de opnames te verbeteren. Een onderzoeker voldoende ervaring in stabiele somatische opname kunnen verwachten dat een hoge weerstand (GQ) zegels en complete experimenten te verkrijgen over de meeste pogingen. Een tot twee hoogwaardige dendritische opnames kunnen worden verzameld per dissectie.

De beschikbaarheid van hoogwaardige hersencoupes met gezond somata en dendrieten is vereist bij onderstaande structuren (Figuur 1). de -criteriaeen voor het selecteren van deze neuronen zijn een glad en homogeen oppervlak over de hele cel en een soma en dendrieten met weinig contrast wanneer waargenomen met optimale aangepast optiek (Figuur 1A en 1B). Het selecteren van neuronen te sterk algemeen contrast leidt tot onstabiele opnames (figuur 1C en 1C). Dus deze neuronen worden vermeden.

In vergelijking met andere neuronen, nigrale DA neuronen Specifieke morfologische en elektrofysiologische kenmerken. Deze functies meestal gemeten met een somatische pipet kan ook worden waargenomen in dubbele somatische (figuur 2) en somatodendritische opnamen (figuur 3). Lange hyperpolarizing huidige injecties leiden tot een membraanpotentiaal rectificatie genaamd 'sag' (Figuren 2B en 5D). Het axon oorsprong, in de meeste gevallen op een dendritische site geïdentificeerddie complementaire criteria 13,25,26, wat aangeeft dat de dendritische compartiment deze neuronen heterogeen (Figuur 3A - 3B). Bijgevolg, de ruimte waarin de eerste AP wordt waargenomen correspondeert met het compartiment waar de axon komt (Figuur 3C - 3D) 13,25,26. Het axon wordt doorgaans beëindigd door een axonaal bleb door een stek van de axon tijdens het snijden 64, maar deze structuur is niet systematisch gedetecteerd.

De uitgesproken sag waargenomen in nigrale DA neuronen volgend op de activering van I h suggereert een hoge expressie van HCN subeenheden. Om de invloed van I h over de integratie van synaptische signalen te bepalen, werden synaptische-achtige stroom (EPSC) golfvormen gegenereerd en via de dendritische registratie-elektrode geïnjecteerd tijdens somatodendritisch dual-opnamen 55 (<strong> Figuur 4). De kinetiek van deze gesimuleerde EPSCs waren gebaseerd op de opkomst en verval tijd constanten van echte spontane EPSCs. Het verkregen aEPSP werd opgenomen met de somatische elektrode. Bath toepassing van de Ih blocker ZD 7288 vergroot de duur van de aEPSP, waarin de bijdrage van Ih het tijdsverloop van synaptische signalen (Figuur 4B). ZD 7288 afgeschaft eveneens de membraanpotentiaal rectificatie bevestigt dat de sag resultaten van de activering van I h (Figuur 4C). De met gesimuleerde EPSPS resultaten kunnen worden gecorreleerd met experimenten met elektrisch opgewekte EPSPS 65. De precieze verdeling van het kanaal in de somatodendritisch domein van DA neuronen in kaart werden cellen gevoegd opnamen uitgevoerd (figuur 5). Een hoge weerstand afdichting (>> 1 GQ) is een absolute noodzaak voor de cel bevestigd opnamen (Figuur 5B ik h activeert langzaam met lange hyperpolarizing spanning stappen en de huidige steady-state wordt bereikt na honderden ms (figuur 5C), zoals eerder aangegeven 66. Deze waarneming geeft aan dat HCN kanalen uitgedrukt in dendrieten DA neuronen verschillende subeenheden in vergelijking met die in piramidale neuronen of andere celtypen 10,16,66. Aangezien de verdeling van het kanaal niet-homogene zou kunnen worden in de dendritische compartiment en zoals de dendritische compartiment is zelf heterogene, de identiteit van de dendriet (axon-dragende of nonaxon dragende dendrite) wordt onthuld door het IR-beeld-DGC te vergelijken met de confocale afbeelding na biocytine kleuring (Figuur 3A en B). Herstel van celmorfologie is daarom noodzakelijk voor zowel dual somatodendritisch opnames en voor cel bevestigd opnamen via latere somatische whole-cell opnames.


Figuur 1. Het visualiseren van het Soma en proximale dendrieten van nigrale dopaminerge neuronen Met behulp van infrarood videomicroscopie. (A) IR-DGC beeld van een nigrale DA neuron die de soma en proximale dendrieten en zowel somatische en dendritische pipetten. Een dubbele somatodendritische opname werd succesvol uitgevoerd op deze gezonde neuron. Observeer de lage contrast en het gladde oppervlak hele somatodendritische domein van de cel. (B) Een ander voorbeeld van een gezonde DA neuron. (C) DA neuron met een ruwere en oneffen oppervlak en een groter contrast. Terwijl een dubbele opname is verkregen, de stabiliteit niet optimaal en de opnameduur was kort (~ 15 minuten) door een geleidelijke verhoging van de toegankelijkheid weerstand op beide pipetten. (D) Tweede voorbeeld van een DA neuron met een sterk contrast soma en proximale dendrite. In dit geval werd een sterke toename van de weerstand kort toegang waargenomen na de breuk in het whole-cell modus. Een poging om de toegang tot weerstand door negatieve druk te verlagen is mislukt. Neuronen in paneel C en D kunnen zijn beschadigd tijdens het snijden procedure en moet worden vermeden experimenten. (E) gelijktijdig dubbele somatische opname in een gezonde DA neuron aan het begin van de opname. (F) Hetzelfde neuron zoals in paneel E met een gezwollen cel lichaam na ~ 17 min. Let op de volledige afwezigheid van contrast, de bal-achtige uiterlijk van de soma en de aanwezigheid van de grote kern niet waarneembaar is bij gezonde neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Gelijktijdige Double Somatische Opnemen van een DA Neuron. (A) IR-DGC afbeelding tijdens dubbele somatische opname van een DA neuron. (B) hyperpolarizing en depolariserende 1 s lang lopende injecties (-160 tot 80 pA, verhogen 80 PA) en overeenkomstige spanning veranderingen gelijktijdig opgenomen met zowel een patch pipetten. Let op de aanwezigheid van de sag in de spanning spoor met de lange hyperpolarizing huidige stap en de grote na-hyperpolarisatie na de AP tijdens de depolariserende stroomstoot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Dual S omatodendritic Opname in een DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatic pipet is 29 micrometer. (B) Confocale z-projectie beeld van het neuron in paneel A label met avidine geconjugeerd aan fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). De neuron was gevuld met biocytine tijdens het opnemen. Het axon afkomstig van een proximaal dendriet dichtbij de soma zoals aangegeven door de pijl. (C) Gelijktijdige dual somatodendritische whole-cell voltage opname van de neuron in panel A. AP opgenomen in de soma (zwarte spanning sporen) en dendriet (rood spanning sporen) in reactie op een 1 s lang stroominjectie stap via de somatische (linker, zwarte bes sporen) en als alternatief dendritische pipet (rechts, rood huidige trace) (D) somatische en dendritische AP getoond uitgebreid tijdschaal.. Bij beide somatische of dendritische huidige injectie, de somatische AP (zwart) vooraf aan de dendritische AP (rood). De vertraging tussen AP's in deze neuron bedroeg 120 microseconden en 210 microseconden met somatische en dendritische huidige injectie, respectievelijk. vertragingenwerden gemeten bij AP halfmaximale amplitude tijdens de stijgende fase van het AP. De AP wordt eerst waargenomen in het compartiment in de buurt van waar de axon naar voren komt, wordt bevestigd eerdere opmerkingen 25,26. In dit geval wordt de dendritische opname gemaakt van een axon-dendriet ontbreekt. Een voorbeeld van een opname van een axon-dragende dendriet is in Ref. 13 (in de fig. 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Voortplanting van Kunstmatige EPSPS Langs de somatodendritische As van DA neuronen. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatische pipet 45 urn. Beide patch pipetten zijn in de hele cel current-clamp opnamemodus. (B) Currentopgenomen met dendritische pipet huidige-clamp en gebruikt om de kunstmatige EPSP (boven) genereren. De stroom wordt verkregen door de injectie van een EPSC-achtige golfvorm (τ stijging = 0,6 ms verval τ = 3 ms; amplitude = 100 pA) via de dendritische opname pipet 55. Aan de onderkant, gepropageerd aEPSPs opgenomen in de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het bad toepassing van het I h blocker ZD7288 (30 micrometer; red trace). Elke spanning spoor is het gemiddelde van 40 enkele sweeps. Let op de grote toename van EPSP duur in aanwezigheid van ZD7288 met vermelding van de bijdrage van I h naar het tijdsverloop van EPSPS. (C) Spanning sporen opgenomen van de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het aanbrengen van 30 uM ZD 7288 ( rood) in antwoord op een lange (30 pA, 1 s) hyperpolarizing huidige stap. Let op de afwezigheid van de membraanpotentiaal rectificatie (sag) na de blokkering van I <sub> h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Aanwezigheid van I h in Dendrieten van DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron en pipet op proximale dendriet. (B) en capacitieve lekstromen tijdens een 5 mV spanning commando in-cell bijgevoegde configuratie. De afdichting verzet 5 GQ in dit voorbeeld (C) hyperpolarisatie spanningsstap. (90 mV; top) van een membraan potentiaal van 0 mV induceerde een langzaam activerende I h. De huidige trace werd omgekeerd en uitgerust met een enkele exponentiële functie die een tijd constante van τ = 632 ms. (D) Spanningreacties van de hele-cel opgenomen soma (panel A) tot 1 s hyper- en depolariserende stroompulsen (-160 tot 120 pA, 40 pA increment). De somatische whole-cell opname werd uitgevoerd nadat de cellen gehecht opname. Let op de afwezigheid van AP door het extracellulaire toepassing van TTX en Cd2 + spontane vuren onderdrukken in cellen gevoegd opname. Deze spanningsafhankelijke Na + en Ca 2+ stroom blokkers werden toegevoegd aan actie stromen onderdrukken. Panelen A - D van dezelfde neuron (E) IR-DIC beeld van een DA neuron en een dendritische pipet (F) Spanningsafhankelijke stromen door een testpuls geactiveerd om 0 mV van een 50 ms prepulse bij -120 mV.. in een outside-out patch uitgesneden uit de proximale dendrieten van het neuron in paneel E. Holding potentieel -80 mV. Let op de tijdsafhankelijke inactivatie van de huidige. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Stof g / mol Concentratie voor 1 L
NaCl 58,443 125 mM 7,305 g
NaHCO3 84,007 25 mM 2.100 g
KCl 74,551 2,5 mM 0,186 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,172 g
glucose 198,17 25 mM 4,95 g
MgCl2 1 M (oplossing) 1 mM 1 mL
CaCl2 1 M (oplossing) 2 mM 2 mL
Osmolariteit: ~ 310 mOsmol / L (optimaal bereik: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4

Tabel 1: kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF).

Stof g / mol Concentratie voor 1 L
NaCl 58,443 87 mM 5,084 g
NaHCO3 84,007 25 mM 2,1001 g
KCl 7,551 2,5 mM 0,18637 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,17248 g
MgCl2 1 M (oplossing) 7 mM 7 mL
glucose 198,17 10 mM 1,9817 g </ Td>
sucrose 342,29 75 mM 25,672 g
CaCl2 1 M (oplossing) 0,5 mM 0,5 mL
Osmolariteit: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tabel 2: Sucrose-ACSF plakjes bereiden.

Stof g / mol Concentratie voor 100 ml
KMeSO 4 150,2 120 mm 1,8024 g
KCl 74,56 20 mM 0,14912 g
MgCl2 1 M (oplossing) 2 mM 200 gl
Na 2 ATP 551.1 2 mM 0,1102 g
Na 2 GTP 523,2 0,5 mM 0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine 255.1 5 mM 0,1275 g
EGTA 380,4 0,1 mM 3,803 mg
Hepes 238,31 10 mM 0,23831 g
biocytine 1 mg / mL 0,1 g
Osmolariteit: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ingesteld met KOH

Tabel 3: Intracellulaire oplossing voor dubbele opnamen.

Stof g / mol Concentratie voor 100mL
KCl 74,56 120 mm 0,8947 g
CaCl2 1 M (oplossing) 2 mM 200 gl
MgCl2 1 M (oplossing) 1 mM 100 gl
Hepes 238,31 10 mM 0,23831
TEA-Cl 165,7 20 mM 0,3314 g
4-AP 94,11 5 mM 0,04705 g
BaCl2 244,26 1 mM 0,02443 g
CdCl2 183,32 0,02 mM 0,3666 mg
TTX 1 mM 200 nM 20 gl
Osmolariteit: ~ 290 mOsmol / L aanpast met D-glucose (Ref. 16); pH = 7,4

Tabel 4: Elektrode oplossing voor cel verbonden opnamen.

Discussion

Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap protocol dual somatodendritische whole-cell opnames en lokale dendritische opnamen voeren. Het is nuttig voor het bepalen van de invloed van ionkanalen (dwz I h) op het tijdsverloop van postsynaptische potentialen en in kaart brengen van de verdeling van het ionkanaal (Ih) langs de somatodendritische domein van nigrale DA neuronen, respectievelijk. Resulterende elektrofysiologische metingen worden gecombineerd om hoc histochemie plaatsen op celmorfologie herstellen. De procedure werd gebruikt om DA neuronen in de substantia nigra onderzoeken, maar kan worden gegeneraliseerd naburige nigrale GABA neuronen, ventrale tegmentale gebied DA neuronen en andere neuronen van de middenhersenen. Alle stappen kunnen ook worden gevolgd om andere ionkanalen, uitgedrukt in dendrieten van nigrale neuronen zonder belangrijke wijzigingen te onderzoeken. Bericht hoc visualisatie is met name relevant voor de neuronen met axon-dragendedendrieten, zoals nigrale neuronen 25,26, hippocampus Oriens-Alveus interneuronen 21 of een CA1 piramidale neuronen 67. Interessant, neuronen het delen van deze functie lijkt vaker voor dan algemeen wordt gedacht 67 te zijn. Morfologische analyse toont ook de precieze positie van de elektroden en axon. De detectie van de laatste kan worden geoptimaliseerd door de etikettering van eiwitten tot expressie gebracht in de axon eerste segment (spanningsafhankelijke Na + kanalen of Ankyrin G) met behulp van immunohistochemie 68,69.

De betrouwbaarheid van de gegevens verzameld met dendritische opnames en daaropvolgende neuronale labeling steeds afhankelijk van de kwaliteit segment. Maximale inspanningen moeten derhalve worden toegepast om de levensvatbaarheid van cellen in het weefsel te behouden. Dit wordt bereikt met zachte behandeling van gezonde dieren, kwalitatief hoogwaardige gereedschappen en reagentia, voldoende zuurstofvoorziening van het weefsel en ijskoude temperaturen gedurende de voorbereiding van de schijfjes. Stabiele opname-omstandigheden een beroep doen op de selectie van gezonde neuronen. In de hele-cel functie zou serieweerstand aanvankelijk zo laag mogelijk en constant gehouden gedurende het experiment. De stabiliteit van de opnames is verder afhankelijk van hoogwaardige manipulatoren verstoken van drift en trillingen. Deze verstoringen kunnen worden gereduceerd door het optimaliseren van de pipet stabiliteit: het controleren van de verbinding met pipet houder en headstage, beheersen die micromanipulator kabels slap vermijden plotselinge temperatuurschommelingen of podium beweging en controleren van het mechanisme van de manipulator. Voor dubbele opnamen is methylsulfaat 13,15,21 opgenomen in de intracellulaire oplossing, maar gluconaat 9,14,25 alternatief kan worden toegepast. Echter, de belangrijkste anion de membraanpotentiaal 70,71 en sommige spanningsafhankelijke stroom 72 te wijzigen. Intracellulaire oplossing kan worden aangevuld met ATP, GTP en fosfocreatine de physiolo behoudengische functies van neuronen. Bovendien, het toevoegen van een fluorescerende kleurstof in de pipetoplossing (bijvoorbeeld Alexa 594 of Sulforhodamine 101 41) aan de dendrieten visualiseren tijdens een somatische opname kan nuttig zijn om bijvoorbeeld een drukuitoefening plaatsen (figuur 7 in Ref. 41) of een elektrische stimulerende pipet. De pipet oplossing-cel aangesloten opnamen bevat een hoge concentratie K + en Na + geen grote Ih opnemen. Opmerkelijk de concentratieverhouding Na + / K + beïnvloedt de amplitude 10, de omkeringspotentiaal van de huidige 11 en de gating van I h 73. Als alternatief kan ik u ook worden opgenomen met behulp van buiten-outs 10. In deze opname configuratie zonder dat door de intracellulaire milieu in de nabijheid van de kanalen worden verstoord. Bijgevolg verschillen in voltage-afhankelijke activering van I <sub> h werden vergelijkbare stromen verkregen met cellen verbonden patches en buiten-outs 10. Zwelling van neuronen wordt soms aangetroffen in patch-clamp en ontstaat vaak door verschillende oorzaken, zoals de lage kwaliteit van het water, sterke onbalans in osmolariteit en pH tussen de intra- en extracellulaire oplossingen 39 of fouten in de samenstelling van oplossingen. De kwaliteit van elektrofysiologische opnames heeft een directe invloed op de kwaliteit van de morfologie van teruggewonnen neuronen. Hoge weerstand somatische pipetten worden gebruikt voor dubbele opnamen (6-10 MQ, zoals in referentie 6,11.) En één somatische opnamen na-cel verbonden opnamen op de verdunning van het intracellulaire milieu 14 minimaliseren. De hele cellen somatische opname na-cel aangesloten opname dus kort gehouden (<10 min). Outside-out patches van zowel de somatische en dendritische pipetten zijn essentieel voor een goede afsluiting van het cell membraan en de daaropvolgende herstel van de cel morfologie. Naast de structuur van de cel, kan de neurochemische inhoud worden bepaald voor de opgenomen neuronen 59,74. Zo kan het intracellulaire tyrosine hydroxylase worden immunolabeled voor eenduidige identificatie van DA neuronen 13.

DA neuronen worden voornamelijk in de SN pars compacta, met een veel lagere dichtheid in de SN pars reticulata, waar ze worden vermengd met een groter aantal GABA neuronen 75. Terwijl het cellichaam van DA neuronen vaak groter dan die van GABA neuronen, de visuele identificatie van deze cellen met IR-videomicroscopie onzeker en gedeeltelijk belemmerd door de dekking van de pars compacta. Om deze beperkingen te omzeilen, kan de voorselectie van DA neuronen worden vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die een fluorescente merker in een specifieke populatie van neuronen (TH 65 of DAT voor DA neuronen, GADvoor GABA neuronen) en epifluorescentie verlichting. Alternatief kan een fluorescerende kleurstof in de oplossing van de somatische elektrode worden opgenomen om de visualisatie van dendrieten vergemakkelijken. Hogere resolutie van de fluorescerende cel wordt aangeboden door Nipkow draaiende schijf confocale 14,22,30 of twee-foton microscopie 7 gecombineerd om IR-DGC 6. Verscheidene voordelen gerelateerd aan DGC vergeleken met DIC. Ten eerste, zoals DIC prisma's niet nodig zijn, imago van de IR-DGC kan worden bedekt met een afbeelding fluorescentie 49,52,53,76. Ten tweede kan DGC worden gecombineerd met fotostimulering en optogenetics 77.

Een nadeel van slice voorbereiding is het behoud van de integriteit van neuronen. DA neuronen breiden hun dendrieten in de drie ruimtelijke vlakken 78,79 en derhalve afknotting van de dendritische compartiment kan niet volledig worden vermeden in plakken 80. De keuze van de oriëntatie van plakjes (coronale, horizontaal of parasagittale) is een trade-off. De oorsprong van de innervatie en de proefopzet moet worden geacht om de juiste oriëntatie van de plakken te selecteren.

Direct dendritische patches is de techniek om de verdeling van functionele ionkanalen kaart in de verschillende compartimenten van cellen. Daarnaast biedt deze techniek de variabiliteit in functionele eigenschappen kanalen 20 bepalen. Als aanvulling van de locatie en de dichtheid van ionkanalen kan worden vastgesteld met behulp van immunohistochemie op het Licht en elektronen microscopie niveaus 17,23. Deze benadering biedt de mogelijkheid om het kanaal dichtheid in klein kaliber structuren die niet toegankelijk zijn patch pipetten bepalen. Maar deze kanalen kan in een afzonderlijke functionele toestand 24 of zelfs inactief ten opzichte van die zijn opgenomen met patch-clamp technieken. Beide technieken zijn daarom nodig om een ​​compleet beeld van de locatie en de eigenschappen van het verkrijgen vanionenkanalen in een specifieke cellulaire gebied 17. Met de ontwikkeling van spanningsgevoelige kleurstoffen, is spanning beeldvorming gebruikt om de verspreiding van AP's en EPSPS in neuronen op meerdere locaties 81 onderzocht. Als alternatief voor dubbele patch-clamp Deze benadering kan ook worden toegepast voor dunne dendrieten die niet toegankelijk patch pipetten maar vereisen nauwkeurige kalibratie van de signaal en middeling.

Terwijl DA neuronen in de SN en ventrale tegmentale gebied op grote schaal onderzocht middels somatische opnamen in de fysiologische en pathofysiologische context, de functionele eigenschappen van de dendrieten nog zwaar in beide gevallen. Patchen van dendrieten is geïmplementeerd voor nigrale dopamine neuronen door verschillende groepen met succes 13,25,26 en blijft de methode bij uitstek om prikkelbaar eigenschappen van deze fijne subcellulaire structuren 8 ontleden. Dendritische opnames zorgen voor een verdere MOGELIJKHEDEschap om de efficiëntie en de plasticiteit van synaptische transmissie en de plasticiteit van dendritische prikkelbaarheid 82,83 onderzoeken.

Disclosures

De auteur verklaart dat hij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Ik dank Dr Vincent Seutin voor zijn voortdurende steun, Christelle Gillissen en Laurent Massotte voor een uitstekende technische bijstand, Drs Jean Defourny en Sandra Ormenese voor adviezen met de confocale microscoop, Dr Jacques Destiné voor de gave van de tweede Axopatch 200B versterker, de GIGA-Imaging platform voor het delen van de confocale microscoop en Imaris software en Dr Stephen Freeman voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Belgische FRS - FNRS (U.N002.13 en T.N0015.13) en gepubliceerd met de steun van de Belgische Universitaire Stichting (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

Neuroscience dendriet patch-clamp dual-opnames cel bevestigd biocytine etikettering neuronale morfologie substantia nigra dopaminerge neuronen ionkanaal
Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clampMore

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter