Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulære Patch-klemme Opptak fra Somatodendritic Domain of Nigral dopaminneuroner

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

Dendritter av dopaminerge nevroner motta og formidle synaptic innspill, støtte aksjonspotensial back-forplantning og frigjøring av nevrotransmittere. Forstå disse grunnleggende funksjonene vil belyse informasjonsoverføring i disse nevronene. Dendrittiske patch-clamp opptak gi mulighet til direkte å undersøke de elektriske egenskapene til dendritter og underliggende spenningsstyrte ionekanaler. Men disse fine strukturer er ikke lett tilgjengelig for patch pipetter grunn av sin lille diameter. Denne rapporten beskriver en trinn-for-trinn prosedyre for å samle stabil og pålitelig opptak fra dendritter av dopaminerge nevroner i akutte skiver. Elektrofysiologiske målinger kombineres med post hoc utvinning av cellemorfologi. Vellykkede forsøk er avhengige av forbedret fremstilling av skiver, løsninger og pipetter, tilstrekkelig justering av optikk og stabiliteten av pipetten i kontakt med den registrerte strukturen. Standard prinsipper Somatic patch-clamp opptak brukes til dendritter, men med en mildere tilnærming av pipetten. Disse allsidige teknikker kan implementeres for å håndtere ulike spørsmål som gjelder de hissige egenskapene dendritter.

Introduction

Nerveceller motta synaptiske informasjon hovedsakelig på sine dendritter. Eksitatoriske og hemmende synaptiske signaler spres fra deres side av generasjon til integrering nettsted hvor aksjonspotensialer (APS) er fremkalt som utgangssignalet. På sin vei, er synaptiske potensialer påvirket av både strukturen i dendritter og samspillet mellom passive og aktive membranegenskaper. Kombinasjonen av disse svært variable parametre utvider regnekraft av nerveceller 1,2. Imidlertid liten diameter av dendritter hindrer imidlertid studier av deres elektriske egenskaper. Den kontinuerlige utviklingen av patch-clamp teknikken 3, har optikk 4 og foredling av metoder for skive forberedelse 5 i løpet av de siste tiårene aktivert opptak fra svært tynn (0,7 til 3 mikrometer Ø) dendritter 6,7. Disse metodene var, og er, fortsatt i stor grad brukes til å undersøke excitability av dendritter i en rekke of nevroner 8. Direkte dendrittiske opptak er avgjørende for å bestemme fordelingen 9-19 og forskjeller i de funksjonelle egenskaper 20-22 av ionekanaler i forskjellige nevronale avdelinger. Disse dataene er nødvendig supplement av ionekanal distribusjoner oppdages med immunhistokjemi sammen til lys- og elektronmikroskopi 23,24. Dual somatodendritic innspillinger er iverksatt for å utforske utbredelsen av aksjonspotensialer 9,13-15,21,22,25-27 og spredning av synaptiske potensialer 13,16,18 langs somatodendritic domenet av nerveceller, få detaljerte passive kabel modeller 28- 30 og undersøke tidsoppløsningen av nevronale integrering 31.

Substantia nigra (SN) er en region som ligger i midthjernen er involvert i flere funksjoner, som for eksempel kontroll av bevegelse, koding av belønning og fast atferd. Reduksjonen av dopamin på grunn av den spesifikketap av dopaminergiske (DA) neuroner i SN er forbundet med de motoriske forstyrrelser som observeres hos pasienter som lider av Parkinsons sykdom 32. Den nigral krets er sammensatt av to hovedcelletyper: dopaminerge og GABAergiske nevroner. Interessant, disse nevronene har flere spesifikke funksjoner som skiller dem fra andre nerveceller. Axon av en stor andel av DA nevroner og noen GABA nevroner stammer fra en dendrittiske nettstedet indikerer at dendrittiske arbor er heterogen (axon bærende og axon-mangler dendritter) 25,26,33. Morfologien av disse nevronene i kontrast derfor med den typisk organisering av neuroner i hvilken informasjonsoverføring følger loven om dynamisk polarisasjon som utsendes av Cajal: fra dendritter, til soma og til slutt til axon 34. DA-nevroner er også kjent for å frigjøre dopamin fra sine dendritter 35, generere sprengning aktivitet 36 og NMDA-reseptor-plastisitet 37. den dissecsjon av disse fenomenene er unnvikende uten direkte opptak fra stedet der de er igangsatt. For å få innsikt i forholdet mellom den nøyaktige beliggenheten og funksjonelle egenskaper av ionekanaler og deres rolle i dendrittiske oppstemthet og informasjonsoverføring i nigral nevroner, direkte dendrittiske innspillinger er metoden for valg.

Denne rapporten beskriver en detaljert fremgangsmåte som kan anvendes for å oppnå enkle og doble patch-clamp opptak av dendritter av nigral nevroner og den tilsvarende post hoc biocytin merking. De grunnleggende prinsipper for patching den somatiske og dendrittiske membranen er svært like. Praktisk talt imidlertid opptak fra dendrittiske områder krever spesifikke optimalisering i forhold til somatiske opptak. Vellykket dendrittiske opptak stole på kvaliteten på skivene, optimal justering av optikken, skånsom tilnærming av oppdateringen pipette og stabilitet av opptakene.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her følger institusjonelle og nasjonale retningslinjer, EU-direktiv for beskyttelse av dyr og Retningslinjene av Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Utarbeidelse av Solutions

  1. Standard kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF, tabell 1)
    1. Bruk høy renhet salter 38 og rent begerglass tidligere skylles med dobbeltdestillert vann for å fremstille en frisk oppløsning. Bruk av høy kvalitet dobbeltdestillert vann for fremstilling av alle ekstra- og intracellulære løsninger.
    2. Ta en 2 liters begerglass for å oppløse NaHCO3 i 500 ml vann og en annen for å oppløse de andre salter for å hindre utfelling av toverdige ioner 39 i henhold til tabell 1. Rens spatelen systematisk med dobbeltdestillert vann og tørk det lot en salt . Bruke en magnetisk rører for å homogen OPPLØSNINGn. Tilsett løsninger fra begge begre til en hensiktsmessig målekolbe og bringe til riktig volum.
    3. Pass på at den endelige ekstracellulære løsningen er helt gjennomsiktig og uten spor av nedbør.
    4. Anvende en gassblanding bestående av 95% O 2 og 5% CO2 (karbogen gass) med et glassmikrofilter lys (Ø 13 mm) 20 - 30 For min før perfusert skivene 38,40. nøye kontrollere osmolaritet (2 - tre på hverandre følgende målinger) av ACSF med et osmometer (optimalt område: 314-325 mOsmol / L). Den gjenværende oppløsning etter fremstilling ved 4 ° C, og bruke det i løpet av 3 dager.
  2. Cutting løsning (sukrose-ACSF, tabell 2) 5,13
    1. Forbered 3 liter frisk oppløsning. Bruk en L for å forberede hjernen skiver fra ett dyr. Den gjenværende oppløsning ved 4 ° C, og bruke det i løpet av 3 dager.
      MERK: Høy Mg 2+ og lave Ca 2+ konsentrasjoner er vant til å decrease synaptisk transmisjon og substitusjon av noen NaCl med sukrose for å bevare vevet 5,40.
  3. intracellulære løsninger
    1. Forberede seg på forhånd 100 ml løsning for to hel-celle opptak (Tabell 3).
    2. Inkluder methylsulfate 13,15,21 å oppnå god utvinning av celle morfologi. Legg biocytin (0,1 til 0,4%) for å undersøke senere morfologi av nervecellen. Ta med et fluorescerende fargestoff (f.eks Alexa 594 eller Sulforhodamine 101 41) for å følge forlengelse av dendritter under innspillingen (valgfritt).
    3. Forberede seg på forhånd 100 ml elektrode løsning for celle-festet opptak (Tabell 4). I dette tilfelle den indre løsningen er en høy-K + løsning utviklet for å isolere den makroskopiske hyperpolarisering-aktivert kation strøm (I h) og inneholder blokkere for de øvrige spenningsstyrte ionekanaler.
    4. butikk intracellulære oppløsninger i 2 ml porsjoner ved -20 ° C. Bruk en ny delmengde for hver nye opptak. Sjekk osmolariteten av hver tint delmengde nøye med osmometer. Ta en ny delmengde hvis osmolariteten ikke svarer til den opprinnelige verdien.
    5. Overfør løsningen fra alikvoten inn i en 3 ml sprøyte på toppen av hvilken en 0,22 pm sterilt sprøytefilter er plassert. Oppbevar sprøyten på isen under innspillingen for å begrense nedbrytning av sine forbindelser (ATP, GTP eller phosphocreatine).

2. Fabrikasjon og Fylling av Patch Pipette

  1. trekke
    1. Bruk en horisontal elektrode avtrekker og tykkveggede borsilikatglass rør. For hel-celle og celle-festet opptak, bruk en 2 mm ytre diameter / 1 mm indre diameter. Påse at glasset slangen er helt ren 38.
    2. Hvis dette ikke er tilfelle, dyppe glasskapillærer i et organisk løsningsmiddel (for eksempel etanol) Først og deretter i dobbeltdestillert vann. Kort fortalt varme kapillær avslutninger med en Bunsen-brenner. Alternativt, for glass tubing vasket og varmet opp direkte fra produsenten (se Materialer liste).
    3. For to somatodendritic innspillinger, sørge for at det somatiske pipette motstanden er mellom 6 og 10 Megohm 6,11 og mellom 8 og 19 Megohm for dendrittiske pipetter når fylt med intracellulære løsning (tabell 3). Standard pipette motstand for celle-festet opptak til en motstand på 10 Megohm å oppnå sammenlignbare resultater langs somatodendritic domenet av nervecellen 16,18,42,43.
    4. Klargjør ferske pipetter før hvert opptak (hver dag) eller umiddelbart før patching og bruke dem 5-8 timer etter sin fabrikasjon 39. Oppbevar pipetter i en overbygd glassbeholder for å beskytte dem mot støv og obstruksjon av spissen.
  2. polering
    1. Inspiser og heat-polsk hver pipette med en microforge å oppnå bedre tetninger med membranen. Før du bruker microforge, smelte en liten del av glass på platina oppvarming filament. Erstatt dette glasset belegg på platina filament daglig for utholdenhet (Peter Jonas, personlig meddelelse).
      MERK: Pipetter brukes til celle festet opptak kan belegges før varme polering skritt for å redusere bakgrunnsstøy. Belegget kan oppnås med et isolerende middel slik som smeltet dental voks 22,44 eller en silikon-elastomer 39.

3. Utarbeidelse av hjernen skiver

  1. Bruk sunn Wistar rotter i alderen 16 - 19 dager gamle. Ikke bruk usunn dyr eller dyr som lider av hypotermi eller dehydrering. Før fremstillingen av skiver holde dyret på en trygg og stille sted. Unngå å ha andre dyr i rommet mens han forberedte et dyr. Manipulere dyr forsiktig.
  2. Hell sukrose-ACSF i to 400ml polypropylen (PP) begre og plassere dem i -80 ° C fryser i 45 min. Bland løsningen for å få en homogen iskald væske / frossen løsning og plassere begrene på is. Forsyne sukrose-ACSF løsning med carbogen gass ved hjelp av en mikrofilter stearinlys (Ø 13 mm) i hver PP beger.
  3. Klargjør slicer og reserve kammer
    1. Bruk en høy kvalitet vev høvelen med ekstremt lave vertikale vibrasjoner 5,38 for å minimere skader på de overfladiske lag av skiver så mye som mulig. Fiks en frisk og hel barberblad på høvelen.
    2. Bruk en ny barberblad for hver skjæring sesjon. Unngå å bøye av barberblad. Ikke fjern fettfilm på overflaten av barberblad (Josef Bischofberger, personlig meddelelse).
    3. Hvis tilgjengelig, sjekk den vertikale vibrasjoner med en vibroprobe levert av produsenten. Alternativt kan du bruke en skreddersydd vibroprobe 5. Redusere de vertikale vibrasjoner av bladet so at de er så nær som mulig til 0 um.
    4. Forbered en 150 ml reserve kammer 45,46 for skiver som vist på s. 201 i Ref. 39. Hell standard ACSF inn i reservatet kammeret og legg den i et vannbad. Forsyne reserve kammer løsning med carbogen ved hjelp av en mikrofilter stearinlys (Ø 6 mm). Pass på at CARBOGEN boblene er så liten som mulig.
      MERK: Bygg en ny reserve kammer hver 2 - 3 måneder for å holde stykket kvalitet konstant.
  4. skjære skiver
    1. I et stille rom der eksperimentator ikke blir forstyrret eller stresset, halshogge dyret med kirurgi saks (lengde 150 mm) på nivå med cervical medulla.
    2. Kutt i huden på toppen av dyrets hode i den nasale til caudal retning med en skalpell og fjerne den sideveis. Skjær toppen av skallen fra hale til nese del av hodet med fine sakser og fjerne begge deler av skallen sideveis. Ta av bregn med en tynn stekespade og slippe den forsiktig inn i en PP beger inneholder iskald (0-4 ° C) sukrose-ACSF likevekt med carbogen 38.
      MERK: Denne sekvensen av trinn må gjøres så raskt som mulig, men også omhyggelig (<< 1 min, omtrent 40 s).
    3. Hold hjernen i løsningen av PP begeret for ~ 2 til 5 min. Juster karbogen trykk for å unngå bevegelser i hjernen. Bytt mikro stearinlys hvis CARBOGEN boblene er for stor med en ny en.
    4. Plasser hjernen på en 9 cm Petri-skål der inne bunnen er dekket med en ~ 0,5 cm tykt lag 38 Sylgard. Forberede denne petriskål på forhånd.
    5. Omgir hjernen med iskald sukrose-ACSF. Sikrer at noen flytende fase av ACSF-sukroseløsning dukker ned i hjernen. For koronale skiver, avskåret fremre delen av hjernen i den koronale flyet med en skalpell eller et barberblad. Fjern lillehjernen med en koronal kutt.
    6. Påfør cyanoakrylat lim på prøvebrettet (område ~ 1 cm 2). Lim hjernen blokken slik at den fremre delen vender mot kuttetrinnet. Nøye dryppe sukrose-ACSF på toppen av den innlimte hjernen ved hjelp av den store åpningen av et glass Pasteur pipette og deretter langsomt senke skjærekammeret til deleren. Manøvrere prøven skuffen slik at snittflaten (dvs. til den første vev treffer bladet) er ventral overflaten av hjernen 40.
    7. Påfør carbogen med en bøyd glass mikrofilter stearinlys (Ø 6 mm) til kuttekammeret (valgfritt).
    8. Juster barberblad med en vinkel på ~ 15 ° med henvisning til horisontalplanet 5. Skjær koronale hjernen skiver av ~ 500 mikrometer i hale til nasal retning før den når substantia nigra. Reduser tykkelsen å kutte 300 - 350 mikrometer tykke skiver som inneholder regionen av interesse.
    9. Separate skiver fra vevsblokk med en svært tynn perfusjon nål festet tilen sprøyte parallelt med kanten av barberblad. Bøye nålen slik at den har en vinkel på 90 ° mellom nålen og sprøyten. Pass på at ikke noe press påføres barberblad mens du fjerner skive fra vevet blokken.
  5. Lagre skiver
    1. Overfør skivene ved hjelp av den største åpning av et glass Pasteur pipette (festet til en pære) inn i reservekammeret. Når alle skiver er overført til reservekammeret (Christoph Schmidt-Hieber, personlig kommunikasjon) bringe temperaturen i vannbad til 34 ° C i 0,5 til 1 time.
    2. Etter denne perioden slå av vannbadet og holde skivene ved romtemperatur. Juster karbogen trykk for å unngå bevegelser av skivene i reserve kammeret. Hold skiver for ytterligere 10 til 20 minutter før du starter opptak.
    3. Rengjøre utstyret og mikro lys forsiktig ennå grundig med dobbeltdestillert vann ved slutten av slicing prosedyre.

4. Dual Somatiske og Somatodendric Recordings i Nigral Nerveceller og Biocytin Filing

  1. Følg beskrivelser for montering av en patch-clamp oppsett for skiver gitt i Axon Guide og i Refs. 39,40,47. Opplysninger om mer grunnleggende sider ved patching er i Ref. 48.
  2. Forbered opptaket kammer
    1. Plasser 1 - 2 ml dobbeltdestillert vann i opptakskammeret. Kontroller at det ikke er lekk. Plasser opptaket kammer på skiftende xy bordet.
    2. Strøm standard ACSF gjennom et oksygen-ugjennomtrengelig perfusjon rørsystem (polytetrafluoretylen) til opptakskammeret. Stabil perfusjon strømning i kammeret med en hastighet av 4 - 5 ml min -1. Holde lengden av røret å bli med i begerglass innehold ACSF og opptakskammeret så kort som mulig (1 m).
    3. Velg en hjerne skive fra reserve kammeret og overføre den tilopptaket kammeret ved hjelp av den største åpningen av et glass Pasteur pipette. Dekk skive med en platina ring for å feste den på bunnen av opptakskammeret som vist på s. 201 i Ref. 39. Bruk en flat platina ring (Ø 1,5 cm) og lim parallelle nylontråd (mellomrom> 2 mm) på den.
  3. Justere og optimalisere optikk
    1. Visual skivene via infrarød (IR) videomikroskopi 4,47,49,50. Juster Köhler belysning 51 og optimalisere differensial interferens kontrast (DIC) 51 optikk eller skrå belysning (Dodt Gradient kontrast - DGC) 52,53. Flere detaljer om denne fremgangsmåten er gitt i Refs. 40,49.
    2. Sjekk kvaliteten på skive. Bare holde skiver med glatte og jevne flater som ikke er altfor sterkt kontrast og har bare små, spredte kratere.
    3. Fyll 2 ferske og ubrukte patch pipetter med intracellulære løsning (
  4. Plasser pipettene over overflaten av den skive
    1. Sjekk at det finnes klorid belegg på sølvtråder (badekar referanseelektrode og patch elektrode, for detaljer, se The Axon Guide og Refs 39,54.).
    2. Sett pipetter sekvensielt inn i pipetten holdere og anvende positivt trykk (~ 70 mbar) ved hjelp av en slange krets forbinder pipette holder, en tre-veis kran og et manometer 40. Senk pipette inn på badet av opptakskammeret.
    3. Kontroller at trykkverdien på manometeret er konstant for ~ 1 - 2 min. Hvis trykket går ned, sjekk slangen eller de tettende O-ringer inne i pipetten holderen.
    4. Sett pipettespissen i midten av video monitor og sikre at det ikke blir hindret. Sørg for at pipettespissen ikke beveger seg når du søker eller slippe press på pipetten.
    5. Sjekk for drift og vibrasjonene i pipettespissen ved å tegne et lite kors på midten av skjermen nøyaktig ved plasseringen av pipettespissen og observere i 5 min mulige bevegelser av spissen.
    6. Anvende en spenningstrinn (5 mV) for å overvåke pipetten motstand på et oscilloskop. Sett holder potensialet i patch-clamp forsterker til 0 mV. Avbryt pipette offset potensial slik at DC pipette dagens leser null ved forsterkeren meter 39,51.
    7. Flytt pipetter ned til stykket og vedlikeholde dem over overflaten.
  5. Velg og lappe et nevron med lange dendritter
    1. Innenfor substantia nigra velge en sunn neuron med lange dendritter som kan følges over en lang avstand på omtrent samme plane (figur 1A og 1B) ved hjelp av IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Velge en jevn og homogen cellelegemet. Unngå de to sterkeste kontrast celler på overflaten av skive (figur 1C og 1D), fordi det er vanskelig å bryte inn og bevare stabile opptaksforhold over tid (stabil serie motstand). Velg nevroner som har sitt soma 10-30 mikrometer under skive overflaten.
    2. Beveg somatiske elektrode nær den soma (40 - 50 um bort), og den dendrittiske elektrode i nærheten av dendritt på samme avstand. Bruk en 2X forstørrelse (firedobbelt veksler) for å velge og lappe en del av en dendrite. Få på skjermen en absolutt forstørrelse på 2,100X uten forstørrelse (1X) og 5,500X med en 2X forstørrelse.
    3. Litt avlaster trykket av den somatiske pipetten ved 10 mbar. Hvis det er nødvendig, regulere dendritisk og somatisk pipette trykk for å unngå forskyvning av cell struktur (soma og dendritt) i stykket.
    4. Plasser dendrittiske pipetten i nærheten av membranen for å kunne se en liten smilehullet. Slipp trykket på pipettespissen og lappe dendrite mens kontrollere pipetten motstand. Under ideelle betingelser, er tilstrekkelig til å oppnå en god tetning bare et meget svakt sug.
    5. Hold dendrittiske pipette i cellen festet modus. Flytt somatisk pipette nær somatisk membran og lappe den somatisk membran. Sørg for at en høy forsegling motstand oppnås før sprekker cellemembranen (> 1 GΩ) 39. Litt trekke tilbake begge pipetter bort fra membranen ved et par um for å unngå deformasjon av cellekroppen og dendritt.
    6. For begge pipetter, redusere så mye som mulig amplituden av pipette kapasitans transienter på toppen av den aktuelle trinn ved hjelp av en spenningspuls med høy forsterkning og lite filtrering 51 og oscilloskopet. Skriv inn i hel-celle-modus with dendrittiske pipette og deretter med den somatiske pipette.
    7. Eliminere hel-celle kapasitans transienter og kompensere for seriemotstand. Overvåke og dokumentere tilgang motstand i begynnelsen av, og regelmessig under, forsøket. Hvis seriemotstand er for høy (> 50 Megohm), prøv med en annen pipette.
    8. Samle IR-DGC bilder (figur 1A og 1B) med en video grafiker 25, en ramme grabben eller et digitalt kamera ved høye og lave forstørrelser.
      MERK: Hevelse av nevroner under opptak (figur 1E og 1F) er sporadisk observert, men sjelden når osmolariteten og pH av løsninger er riktig justert 39.
    9. Skaff doble somatiske hel-celle opptak (soma - soma) med samme prosedyre (figur 2A).
  6. Påfør lange (flere hundre ms) økende depolariserende gjeldende trinnene i rekkefølgemed somatiske og dendrittiske pipette til å fremkalle APS (figur 2B, 3C og 3D). Spill den resulterende potensialet på dendrittiske og somatisk pipette samtidig.
  7. Undersøke spredning av kunstig eksitatoriske postsynaptiske potensial (aEPSPs) i dopaminerge neuroner
    1. Lag en eksitatoriske postsynaptiske strøm (EPSC) bølgeform å injisere som en aktuell kommando under to current-clamp opptak (figur 4a og 4b). For å gjøre dette, bygge en dobbel eksponentiell funksjon med amplitude og tid kursverdier som tilsvarer reelle verdier målt for EPSCs i nervecellen av interesse 55. kontrollere nøye samplingsfrekvenser på den konstruerte EPSC og av den injiserte EPSC bølgeform for å bevare den opprinnelige tids kurset.
      Merk: Før du påfører bølgeform i en ekte nevron, teste den ved hjelp av en modell celle.
    2. Sekvensielt injisere bølgeformen via dendrittiske ogsomatisk pipette og posten resulterer potensialer for både somatiske og dendrittiske pipetter samtidig. Sjekk regelmessig for mulig drift av pipetter.
  8. Avslutte opptak fra et nevron
    1. Ta en IR-DGC bilde ved en lav forstørrelse (objektiv: 5X eller 10X) for å dokumentere posisjonen til neuron innenfor skive og elektrodene.
    2. Sakte og forsiktig trekke dendrittiske og de somatiske pipettene fra den neuronale membran sekvensielt for å danne utvendige ut flekker med begge pipetter. Fjern pipetten ved hjelp av en sekvens av lateral-bevegelser oppover 38. Disse bør være kort i begynnelsen, og deretter gradvis øke i lengde. Dette opptaket konfigurasjon begunstiger korrekt lukking av cellemembranen.
    3. Overvåk reduksjon av kapasitive strømmer (økning i tilgangs motstand) som respons på en 5 mV spenningspuls i spenningsklemmen mens uttak av pipetten.
    4. Når membranen er sjøledet rundt pipettespissen, ta den helt ut av opptaket kammeret. Fjern målet fra badekaret. Hold skive i innspillingen kammeret i 15 - 20 min i standard ACSF å tillate likevekt av biocytin (fra den intracellulære løsning) i innspilte nervecellen.
    5. overføre skive forsiktig ved hjelp av den store åpningen av en Pasteur-pipette inn i en 25 ml stor åpning rav (brun) glassflaske inneholdende standard ACSF. Lukk flasken med et lokk. Se punkt 6 for fiksering trinn.

5. Cell-festet Recordings

  1. Velge et neuron med en dendritt som strekker seg over en lang avstand i samme plan. Kontroller at Dendritt av interesse kan følges til en veldefinert soma.
  2. Fyll lappen pipette med elektroden løsning (tabell 4). Utforme løsningen for å spille inn den nåværende interesse i cellen-festet konfigurasjon ved å inkludere spesifikke farmakologiske midler til å blokkere andre ion channels.
  3. Patch dendrite i cellen-festet modus
    1. Visualisere et parti av dendritt og nærmer omkoding pipetten ved hjelp av manipulatoren. Tilpasse trykket i pipettespissen ved å kontrollere manometeret (70-80 mbar) for å unngå forskyvning av dendritt. Patch dendritt som beskrevet i 4.5.4.
    2. Spill noen IR-DGC bilder (figur 5A). Forsøker å oppnå en tetning motstand så stor som mulig (> 1 GΩ 39), i beste fall mellom 3 - 10 GΩ for celle-bundet opptak 18 (figur 5B). Trekke tilbake pipetten bort fra membranen ved et par um for å unngå deformasjon av dendritt.
    3. Observer handling strøm i cellen-festet modus reflektere spontane aksjonspotensialer av nigral nerveceller. Supplere ACSF med Ca 2+ og Na + kanal stopper (CdCl 2 og TTX, henholdsvis) å undertrykke handling strømninger.
    4. Påfør en to svoltage steg på -90 mV fra et holdingselskap potensial fra 0 mV til lappen for å fremkalle jeg h (figur 5C). Husk at pipetten potensial og hvilemembranpotensialet er i serie i cellen festet konfigurasjon 56. For mer informasjon, se The Axon guide og Ref. 39.
    5. Sjekk regelmessig for mulig drift av pipetten.
    6. Ved slutten av opptaket, revne lappen for å gå i hel-celle-modus og umiddelbart ta en avlesning av membranpotensialet. Trekk pipetten som beskrevet i avsnitt 4.8.2 og 4.8.3 for å få en-out patch.
  4. Ta opp fra tilsvarende soma i hel-celle-modus
    1. Se langs dendrite og finn den tilsvarende soma. Bruk en høy motstand pipette (5 - 10 Megohm) 6,14,57 fylt med en K + -basert intracellulær løsning (tabell 3). Påfør en kort suge (undertrykk) tilpipettespissen til å briste membranen for å gå inn i det hel-celle-modus.
    2. Sjekk for identiteten til nervecellen i dagens-klemme ved å bruke lang hyper- og depolariserende aktuelle trinn (figur 5D) og la biocytin til diffuse langs dendritter. Påfør korte depolariserende aktuelle tiltak for å visualisere AP tid kurset.
    3. Etter ≤10 min, trekke pipetten for å få en-out patch som beskrevet i avsnitt 4.8.2 - 4.8.3. overføre skive forsiktig ved hjelp av den store åpningen av en Pasteur-pipette inn i en 25 ml ravfarget glassflaske inneholdende standard ACSF. Lukk flasken med et lokk.
    4. Alternativt kan først få en somatisk hel-celle med en pipette oppløsning som i tillegg inneholder et fluorescerende fargestoff. Tillate diffusjonen av fargestoffet og velge et parti av en dendritt-26. Med andre pipette, lappe dendrite i cellen festet modus. Bruke et konfokalt mikroskop hvis det er tilgjengelig for å bedre visualiseringen av det fluorescens merketed dendritt 14,22.
    5. Utfør dendrittiske opptak i utenfor-out konfigurasjon, alternativt eller i tillegg til celletilkoblede opptak 10,22. Se et eksempel på en spenningsstyrte strømmer spilt inn fra en ekstern-out patch i figur 5E og 5F.

6. Biocytin Merking av Nigral Nerveceller

  1. Fiksering av vevet
    1. Hvis mulig, bruk separate rom for bit opptak / histokjemisk behandling 38.
    2. Feste skivene ved å erstatte ACSF med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer saltvann (PBS, pH = 7,4) med en Pasteur pipette. Bruk alltid nylaget fiksativ løsning (<< 1 uke gammel).
      FORSIKTIG: Bruk passende hånd hansker og en kjemisk hette plassert i en histologi laboratorium for å manipulere paraformaldehyde grunn av sin giftighet. Les sikkerhetsdatabladet av denne farlige produktet før bruk og cpokker forskrift om kjemikaliesikkerhet (farlige stoffer (67/548 / EEC) fra EU-kommisjonen) som dette pulveret er tenkt å fremkalle kreft. Andre detaljer er i Ref. 58.
    3. Plasser skivene ved 4 ° C over natten. Unngå kontaminering av patch-clamp oppsett eller noe utstyr som brukes for elektrofysiologi ved Paraformaldehyde.
    4. Etter fiksering erstatte fiksativ løsning med PBS. Bruk en annen Pasteur pipetter for å fjerne fiksativ løsning og bruke PBS. Oppbevar skiver i PBS ved 4 ° C før videre behandling (1 - 2 uker). I så fall erstatte PBS to ganger i uken. Bruk alltid nylaget PBS (<< 1 uke gammel).
  2. Farging av vev
    1. Forbered en 24 godt cellekultur plate for farging trinn. Bruk rent utstyr for å overføre skiver. Skyll skivene 3 x 5 min med ferske PBS.
    2. Påfør Fluorescein Avidin DCS (Avidin D, cellesorterer klasse, 1 mL Fluorescerendecein / ml Triton X-100) og 0,3% Triton X-100 i PBS ved 4 ° C over natten. Beskytt skivene fra lys hele farging. Som et alternativ til fluorescens, etikett neuroner via 3,3'-diaminobenzidin for lys eller elektronmikroskopanalyse 21,58.
      FORSIKTIG: Triton X-100 er farlig. Les produktdatablad og EU-kommisjonsdirektiv før du bruker dette stoffet.
    3. Skyll 3 x 30 minutter med PBS og deretter med PB (fosfatpuffer, for å unngå dannelse av krystaller på overflaten av den skive).
  3. Monter skivene på standardglass. Dekk skivene forsiktig med en innstøpningsmediet. Unngå luftbobler i innstøpningsmediet. Sett dekkglass forsiktig for å dekke helt stykket. Lufttørk lysbildene natten før visualisere dem med et mikroskop.
  4. Lagre de merkede skiver ved 4 ° C etter visualisering. Nyttige triks på histochemical prosedyrer er i Refs. 58,59.
  5. Rengjør utstyret som brukes for histologi og elektro separat. Ikke bland histologi og elektroutstyr sammen.

7. Post Hoc Visualisering av Biocytin fylte Nerveceller

  1. Bruk en konfokal mikroskop for å visualisere morfologi av gjenvunne nevroner.
    1. Grovt finne fluorescensmerkede nervecellen i stykket med epifluorescence. Undersøk dendrittiske arbor av nevroner og finn axon og aksonal bleb (2-4 mikrometer Ø) med en 10x eller 20x objektiv. Dokumentere løpet av aksonet.
    2. Bytt til konfokal mikroskop og velger laser diode 488 nm å opphisse fluorescein som finnes i den merkede nervecellen. Flg forlengelse av axon og dendritter i z-aksen.
    3. Ta suksessive bilder for å oppnå en z-stabel for hele cellen. Justere oppløsningen av z-aksen (avstand mellom på hverandre følgende bilder) til 0,5 til 1 pm. Samle confocal bilder av en celle using lav (10X objektiv) og høy (60X objektiv, olje-neddykking) forstørrelse.
    4. Åpne bildefilen av nervecellen oppnådd med konfokal mikroskop med et bildebehandlingsprogrammer (ImageJ) 60. Sammenlign z-projeksjon bilde med en IR-DGC bilde av øyet for å finne den nøyaktige plasseringen av patch pipettene i løpet av de elektrofysiologiske opptak (figur 1, 2A, 3A, 4A, 5A og 5E).
    5. Bestem morphometries av merket nevroner: måle axon - soma avstand, avstander mellom opptaks- pipetter langs somatodendritic domene og mellom dendrittiske pipette og axon bruke "Mål" -funksjonen i ImageJ.
    6. Rekonstruere noen nevroner med NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 eller Neuromantic 61.

8. Analyse av Elektro data

  1. Bruk programvarepakke i forbindelse med forsterkeren til grovt analysere dataene (f.eks Clampfit) eller direkte etannen programvare for dataanalyse som Stimfit, en åpen kildekode programvare 62,63 som i vår siste utgivelse 13 eller for eksempel WinWCP.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne protokollen har til hensikt å legge til rette for innsamling av data ved hjelp av dendrittiske patch-clamp opptak. Denne teknikken, kombinert med post hoc histokjemi, bidrar til å få innsikt i mekanismene for mange elektriske signaler som stammer eller sprer seg i dendritter. Direkte tilgang til dendritter med patch pipetter er vanskelig, men spesiell oppmerksomhet til flere metodiske aspektene vil øke suksessraten av opptakene. En eksperimentator tilstrekkelig erfaring i stabil somatiske opptak kan forvente å oppnå høy motstand (GΩ) pakningene og komplette eksperimenter på de fleste forsøk. En til to dendrittiske opptak av høy kvalitet kan samles per disseksjon.

Tilgjengeligheten av høy kvalitet hjerneskiver som inneholder sunt somata og dendritter er en forutsetning for å få tilgang til disse fine strukturer (figur 1). den criterien for valg av disse nevronene er en glatt og homogen overflate over hele cellen og en soma og dendritter med lav kontrast når observert med optimale justert optikk (figur 1A og 1B). Valg av nevroner for sterkt kontrast generelt fører til ustabile opptak (figur 1C og 1C). Derfor er slike neuroner bør unngås.

I forhold til andre nerveceller, nigral DA nevroner vise spesifikke morfologiske og elektrofysiologiske egenskaper. Disse funksjonene vanligvis vurderes med én somatisk pipette kan også observeres i dual somatisk (figur 2) og somatodendritic opptak (figur 3). Lange hyperpolariserer nåværende injeksjoner indusere en membranpotensialet utbedring kalt synke (Tall 2B og 5D). Axon stammer, i de fleste tilfeller på en dendritisk område som er identifisertved hjelp av komplementære kriterier 13,25,26, noe som indikerer at det dendritiske rommet i disse nevronene er heterogent (figur 3A - 3B). Som en konsekvens av kammeret hvor AP er observert første svarer til kammeret i hvilket aksonene fremkommer (figur 3C - 3D) 13,25,26. Axon er vanligvis avsluttet ved en aksonal bleb forårsaket av en skjæring av axon under kutting 64, men denne strukturen er ikke systematisk detektert.

Den uttalt sag observert i nigral DA-nevroner påfølgende aktivering av Ih antyder en høy ekspresjon av HCN subenheter. For å bestemme påvirkning av jeg h på integrering av synaptiske signaler, ble synaptiske lignende strøm (EPSC) bølgeformer generert og injisert via dendrittiske innspillingen elektroden under somatodendritic dual opptak 55 (<strong> Figur 4). Kinetikken for disse simulerte EPSCs var basert på vekst og forfall tidskonstanter av ekte spontane EPSCs. Den resulterende aEPSP ble spilt inn med somatisk elektroden. Bath anvendelse av I-h blokker ZD 7288 økte varigheten av aEPSP, noe som indikerer at bidraget fra Ih til tidsforløpet av synaptiske signaler (figur 4B). ZD 7288 avskaffet også membranpotensialet utbedring som bekrefter at sag resultatene fra aktiveringen av I h (figur 4C). Resultatene oppnådd med simulerte EPSP resultatene kan være korrelert til eksperimenter som bruker elektrisk utløste EPSP 65. For å kartlegge nøyaktig fordeling av kanalen i somatodendritic domenet av DA nevroner, ble celle festet opptak implementert (figur 5). En høy motstand forsegling (>> 1 GΩ) er en absolutt nødvendighet for celle-festet opptak (figur 5B jeg h sakte med lange hyperpolariserer spenningstrinn og den nåværende steady-state oppnås etter hundrevis av ms (figur 5C), som tidligere vist 66. Denne observasjonen indikerer at HCN kanaler uttrykt i dendritter av DA-neuroner har forskjellige underenheter i forhold til de i pyramidale neuroner eller andre celletyper 10,16,66. Som fordelingen av kanalen kan være homogen i det dendritiske kammeret og som dendrittiske kammeret er i seg selv heterogen, blir identiteten av dendritt (axon-bærende eller nonaxon bærende dendritt) viste ved sammenligning av IR-DGC bilde med konfokalt bilde etter biocytin farging (figur 3A og B). Gjenoppretting av celle morfologi er derfor nødvendig for begge to somatodendritic innspillinger og for celle-festet opptak via påfølgende somatiske hel-celle opptak.


Figur 1. Visualisere Soma og Proximal dendritter av Nigral dopaminerge nevroner bruker infrarød Videomicroscopy. (A) IR-DGC bilde av en nigral DA nevron viser soma og proksimale dendrite og både somatiske og dendrittiske pipetter. En dobbel somatodendritic opptaket ble vellykket utført på denne sunne neuron. Observer lav kontrast og den glatte overflate over hele somatodendritic domenet av cellen. (B) Et annet eksempel på en sunn DA neuron. (C) DA neuron med en grovere og ujevn overflate og en sterkere kontrast. Mens en dual opptak er oppnådd, stabiliteten var suboptimal, og varigheten på opptaket var kort (~ 15 min) på grunn av en gradvis økning av tilgangen motstand på begge pipetter. (D) Andre eksempel på en DA nevron som viser et sterkt kontrast soma og proksimale dendrite. I dette tilfelle ble en sterk økning av motstanden tilgangs observert kort tid etter bruddet i hel-celle-modus. Et forsøk på å minske tilgangen motstand ved undertrykk var mislykket. Nevroner i panel C og D kan ha blitt skadet under skjæreprosedyren, og bør unngås for eksperimenter. (E) samtidig dobbel somatisk opptak i en sunn DA neuron ved begynnelsen av opptaket. (F) Samme nevron som i panel E med en hoven celle kroppen etter ~ 17 min. Merk hele fravær av kontrast, ball-lignende utseende av soma og tilstedeværelsen av den store kjernen som ikke er synlig i friske nerveceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Samtidig Double Somatic Opptak fra et DA Neuron. (A) IR-DGC bilde under dobbel somatisk opptak fra et DA nevron. (B) Hyperpolarizing og depolariserende 1 s lange nåværende injeksjoner (-160 80 pA, øke 80 Pa) og tilsvarende spenningsendringer registreres samtidig med begge patch pipetter. Legg merke til tilstedeværelsen av sag i spennings spor med den lange Hyperpolarizing aktuelle trinnet og den store etter hyperpolarization etter AP under depolariserende strømpulsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Dual S omatodendritic opptak i en DA Neuron. (A) IR-DGC bilde av en DA nevron. Avstanden mellom dendrittiske og somatic pipette er 29 mikrometer. (B) Confocal z-projeksjon bilde av nervecellen i panel A merket med avidin konjugert til fluorescein (FITC). Nervecellen ble fylt med biocytin under opptak. Axon stammer fra en proksimal dendritt nær soma som indikert ved pilen. (C) samtidig dual somatodendritic hel-cellespenning opptak fra neuron i panel A. AP registreres i soma (sort spenning spor) og dendritt (rød spenning spor) som reaksjon på en en s lang strøminjeksjon trinn via somatisk (venstre; solbær spor) og alternativt dendrittiske pipette (høyre; rød strøm trace) (D) Somatic og dendrittiske AP vist ved utvidet tidsskala.. Med enten somatisk eller dendrittiske nåværende injeksjon, den somatiske AP (svart) innledet dendrittiske AP (rød). Forsinkelsen mellom aksesspunkter i denne nervecellen var 120 ms og 210 ms med somatiske og dendrittiske nåværende injeksjon, henholdsvis. forsinkelserble målt til AP halvmaksimalt amplitude under den stigende fasen av AP. AP er observert først i kammeret i nærheten av hvilken det framgår axon, noe som bekrefter tidligere observasjoner 25,26. I dette tilfellet er det dendritiske opptak laget av et axon-mangler dendritt. Et eksempel på et opptak fra et akson bærende Dendritt er i Ref. 13 (i deres Fig. 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Utbredelse av Kunstige EPSP Langs Somatodendritic Axis of DA nerveceller. (A) IR-DGC bilde av en DA-neuron. Avstanden mellom dendrittiske og somatisk pipette er 45 mikrometer. Begge patch pipetter er i hel-celle strøm klemme opptaksmodus. (B) Currentregistrert med dendrittiske pipette i strøm-klemme og som brukes til å generere den kunstige EPSP (øverst). Strømmen blir oppnådd ved injeksjon av en EPSC-lignende bølgeform (ź stige = 0,6 ms; ź råte = 3 ms; amplitude = 100 pA) via den dendrittiske opptak pipetten 55. Nederst, spredte aEPSPs registrert på soma kontroll forhold (svart) og etter badet anvendelse av jeg h blocker ZD7288 (30 mikrometer; rød kurve). Hver spenning spor er gjennomsnittet av 40 enkeltrom sweeps. Legg merke til stor økning i EPSP varighet i nærvær av ZD7288 indikerer bidraget fra Ih til tidsforløpet av EPSP. (C) Spenning traser registrert fra soma i kontrollforhold (sort), og etter påføringen av 30 uM ZD 7288 ( rød) som reaksjon på en lang (30 pA; 1 s) Hyperpolarizing strømsprang. Legg merke til fraværet av membranpotensialet retting (SAG) etter blokkering av I <sub> h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Tilstedeværelse av jeg h i dendritter av DA Neuron. (A) IR-DGC bilde av en DA nevron og pipette på proksimale dendritt. (B) Kapasitive og lekkasjestrømmer i løpet av en fem spenning kommando mV i celle-festet konfigurasjon. Tetningen motstand var 5 GΩ i dette eksempel (C) Hyperpolarizing spenningstrinn. (90 mV; topp) fra en membranpotensialet fra 0 mV induserte en langsomt aktive I h. Den nåværende trase ble invertert og utstyrt med en enkelt eksponentiell funksjon som gir en tidskonstant av ź = 632 ms. (D) Spenningreaksjoner fra hele celle registrert soma (panel A) til en s hyper- og depolariserende strømpulser (-160 til 120 pA, 40 pA tilvekst). Somatiske hel-celle-opptak ble utført etter celle-tilknyttet opptaket. Legg merke til fraværet av aksesspunkter på grunn av den ekstracellulære anvendelse av TTX og Cd2 + for å undertrykke spontan avfyring i løpet av celle-tilknyttet opptaket. Disse spenningsstyrte Na + og Ca 2+ aktuelle blokkere ble lagt til undertrykke handling strømninger. Paneler A - D er fra samme nervecelle (E) IR-DIC bilde av en annen DA neuron og en dendrittisk pipette (F) Spenning-avhengige strømmer aktiveres av en testpuls til 0 mV fra en 50 ms prepulse ved -120 mV.. i en utenfor-out patch fjernet fra den proksimale dendrite av nervecellen i panelet E. Holding potensial -80 mV. Legg merke til tidsavhengige inaktivering av strømmen. Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.

Stoff g / mol Konsentrasjon i 1 L
NaCl 58,443 125 mm 7,305 g
NaHCO3 84,007 25 mm 2,100 g
KCl 74,551 2,5 mm 0,186 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,172 g
glukose 198,17 25 mm 4,95 g
MgCl2 1 M (oppløsning) 1 mm 1 ml
CaCl2 1 M (oppløsning) 2 mm 2 mL
Osmolaritet: ~ 310 mOsmol / L (optimal rekkevidde: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4

Tabell 1: Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF).

Stoff g / mol Konsentrasjon i 1 L
NaCl 58,443 87 mM 5,084 g
NaHCO3 84,007 25 mm 2,1001 g
KCl 7,551 2,5 mm 0,18637 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,17248 g
MgCl2 1 M (oppløsning) 7 mm 7 mL
glukose 198,17 10 mm 1,9817 g </ Td>
sukrose 342,29 75 mm 25,672 g
CaCl2 1 M (oppløsning) 0,5 mm 0,5 mL
Osmolaritet: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4

Tabell 2: Sukrose-ACSF for å fremstille skiver.

Stoff g / mol Konsentrasjon til 100 mL
KMeSO 4 150.2 120 mm 1,8024 g
KCl 74,56 20 mm 0,14912 g
MgCl2 1 M (oppløsning) 2 mm 200 ul
Na 2 ATP 551.1 2 mm 0,1102 g
Na 2 GTP 523,2 0,5 mm 0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine 255,1 5 mm 0,1275 g
EGTA 380,4 0,1 mm 3.803 mg
Hepes 238,31 10 mm 0,23831 g
Biocytin 1 mg / mL 0,1 g
Osmolaritet: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 innstilt med KOH

Tabell 3: Intracellulær løsning for to opptak.

Stoff g / mol Konsentrasjon 100ml
KCl 74,56 120 mm 0,8947 g
CaCl2 1 M (oppløsning) 2 mm 200 ul
MgCl2 1 M (oppløsning) 1 mm 100 pl
Hepes 238,31 10 mm 0,23831
TEA-Cl 165,7 20 mm 0,3314 g
4-AP 94,11 5 mm 0,04705 g
bacl 2 244,26 1 mm 0,02443 g
CdCl 2 183,32 0,02 mM 0.3666 mg
TTX 1 mm 200 nM 20 mL
Osmolaritet: ~ 290 mOsmol / L, justert med D-glukose (Ref. 16); pH = 7,4

Tabell 4: Elektrode løsning for celle-festet opptak.

Discussion

Denne rapporten beskriver en steg-for-steg-protokollen for å gjennomføre to somatodendritic hel-celle opptak og lokale dendrittiske opptak. Det er nyttig for å bestemme innvirkningen av ionekanaler (dvs. I h) på tidsforløpet av postsynaptiske potensialer og kartlegge fordelingen av ionekanalen (I h) langs somatodendritic domenet av nigral DA-neuroner, respektivt. Dannede elektrofysiologiske målinger kombineres for å legge hoc histokjemi å gjenopprette celle morfologi. Fremgangsmåten ble anvendt for å undersøke DA-nevroner lokalisert i substantia nigra, men kan generaliseres for nabo nigral GABA neuroner, ventrale tegmentale område DA-nevroner eller andre midthjernen nerveceller. Alle trinnene kan også følges for å undersøke andre ionekanaler uttrykt i dendritter av nigral nevroner uten viktige modifikasjoner. Post hoc visualisering er spesielt relevant for nevroner med axon bærendedendritter, for eksempel nigral nevroner 25,26, hippocampus Oriens-alveus interneurons 21 eller noen CA1 pyramidale nevroner 67. Interessant, nevroner som deler denne funksjonen ser ut til å være mer vanlig enn generelt antatt 67. Morfologisk analyse avslører også den nøyaktige plasseringen av elektrodene og axon. Påvisningen av den sistnevnte kan optimaliseres ved merking av proteiner uttrykt i axon innledende segment (spenningsstyrte Na + kanaler eller Ankyrin G) ved hjelp av immunhistokjemi 68,69.

Påliteligheten av data innsamlet med dendrittiske opptak og påfølgende neuronal merking alltid avhenger av skive kvalitet. Maksimal innsats må derfor anvendes for å opprettholde levedyktigheten av celler i vevet. Dette oppnås med skånsom håndtering av friske dyr, høykvalitets verktøy og reagenser, tilstrekkelig oksygenering av vev og iskalde temperaturer gjennom utarbeidelse av skiver. Stabile opptaksforhold stole på valg av sunne nevroner. I det hel-celle-modus, bør seriemotstand i utgangspunktet være så lav som mulig og holdt konstant gjennom hele forsøket. Stabiliteten av opptakene er videre avhengig av høy kvalitet manipulatorer blottet for drift og vibrasjoner. Disse forstyrrelsene kan reduseres ved å optimalisere pipette stabilitet: kontrollerer forbindelsen til pipetten holderen og til heads, kontroll av at mikromanipulator kabler er slakk, unngå plutselige endringer i temperatur eller stadium bevegelse og kontroll av mekanismen av manipulatoren. For to innspillinger har methylsulfate 13,15,21 blitt inkludert i den intracellulære løsning, men gluconate 9,14,25 kan alternativt benyttes. Imidlertid kan hoved anion endre membranpotensialet 70,71 og noen spenningsavhengige strøm 72. Intracellulær løsning kan suppleres med ATP, GTP og fosfokreatin å bevare physiolobiologiske funksjoner av nerveceller. I tillegg, å tilsette et fluorescerende fargestoff i pipetten oppløsning (f.eks Alexa 594 eller sulforodamin 101 41) for å visualisere de dendritter i løpet av en somatisk opptak kan være nyttig for eksempel for å plassere en trykkpåvirkning (fig 7 i Ref. 41) eller en elektrisk stimulerende pipette. Pipetten løsningen for celle-festet opptakene inneholder en høy K + konsentrasjon og ingen Na + til å spille inn store jeg h. Verdt å merke seg den Na + / K + konsentrasjonsforholdet påvirker strømamplitude 10, reversering potensial på dagens 11 og portstyrings av I h 73. Alternativt kan jeg h også bli tatt opp med utenfor-outs 10. I dette opptaket konfigurasjon kan imidlertid den intracellulære miljøet i nærhet av kanalene bli forstyrret. Følgelig forskjeller i spenningsavhengige aktivering av I <sub> h observeres når en sammenligner strømninger innhentet ved hjelp av celle festet lapper og utenfor-outs 10. Hevelse av nerveceller er av og til oppstått i løpet av patch-clamp-opptak, og ofte oppstår fra forskjellige årsaker, for eksempel den lave kvalitet på vannet, sterk ubalanse i osmolaritet eller pH mellom intra- og ekstracellulære løsninger 39 eller feil i sammensetningen av løsninger. Kvaliteten på elektrofysiologiske opptak har en direkte virkning på kvaliteten av morfologien av gjenopprettede neuroner. Høy motstand somatiske pipetter brukes for dual opptak (6 - 10 Megohm, som i Refs 6,11.) Og for enkeltsomatiske opptak etter celle-festet opptak for å minimere utvanning av den intracellulære miljø 14. Hel-celle somatisk opptak følgende celle-tilknyttet opptaket er derfor holdes kort (<10 minutter). Utenfor-out patcher fra både somatiske og dendrittiske pipetter er avgjørende for riktig lukking av cell membran og etterfølgende utvinning av cellemorfologi. I tillegg til cellens struktur, kan nevrokjemiske innhold bestemmes for de registrerte nevroner 59,74. For eksempel kan den intracellulære protein tyrosin hydroksylase bli immunolabeled for entydig identifikasjon av DA nevroner 13.

DA-nevroner er hovedsakelig konsentrert i SN pars compacta, med en mye lavere tetthet som er tilstede i SN pars reticulata, hvor de blir blandet med et høyere antall GABA neuroner 75. Mens cellen kroppen av DA nevroner er ofte større enn for GABA nerveceller, er usikkert og delvis hindret av tettheten av Pars comp visuell identifisering av disse cellene med IR-videomicroscopy. For å omgå disse begrensningene, kan den forhåndsvalg av DA nevroner forenkles ved bruk av transgene mus som uttrykker en fluoriserende fargestoff i en bestemt populasjon av nerveceller (TH 65 eller DAT for DA nevroner, GADfor GABA nevroner) og epifluorescence belysning. Alternativt kan et fluoriserende fargestoff inngå i løsningen av somatiske elektroden for å lette visualiseringen av dendritter. Økt oppløsning av fluorescerende celle er brakt av Nipkow spinnende disk confocal 14,22,30 eller to-foton mikroskopi 7 kombineres til IR-DGC 6. Flere fordeler knytter seg til DGC i forhold til DIC. Først, som DIC prismer ikke er nødvendig, IR-DGC bilde kan overlappes med en fluorescens bilde 49,52,53,76. For det andre kan DGC kombineres med photostimulation og optogenetics 77.

En ulempe ved fremstillingen skive er bevaring av integriteten av nerveceller. DA nevroner utvide sine dendritter i de tre romlige plan 78,79 og derfor avkutting av dendrittiske rommet ikke kan unngås helt i skiver 80. Valget av orienteringen av skiver (koronale, horisontal eller parasagittal) er en avveining. Opprinnelsen til innervasjon og eksperimentell design må anses å velge riktig orientering av skiver.

Direkte dendrittiske patching er teknikken som brukes til å kartlegge fordelingen av funksjonelle ionekanaler i de forskjellige avdelinger av celler. I tillegg har denne teknikken gir for å bestemme variasjonen i funksjonelle egenskaper til kanalene 20. Som et supplement plassering og tetthet av ionekanaler kan fastslås ved hjelp av immunhistokjemi på lys og elektronisk mikros nivåer 17,23. Denne fremgangsmåten gir også mulighet for å bestemme den kanal tettheten i småkalibrede strukturer som er utilgjengelige for patch-pipetter. Men disse kanalene kan være i en tydelig funksjonell tilstand 24 eller inaktiv i forhold til de som er registrert med patch-clamp teknikker. Begge teknikkene er derfor nødvendig for å få et fullstendig bilde av plasseringen og egenskapene tilionekanaler i en bestemt cellulær region 17. Med utviklingen av spenningsfølsomme fargestoffer, har spenningen avbildning blitt brukt til å undersøke forplantning av APS og EPSP i nerveceller på flere steder 81. Som et alternativ til to patch-clamp-opptak, kan denne fremgangsmåten også bli implementert for tynne dendritter som ikke er tilgjengelige for patch-pipetter, men nødvendiggjør nøyaktig kalibrering av signalet og i snitt.

Mens DA nevroner i SN og ventral tegmentale området er mye undersøkt via somatiske opptak i den fysiologiske og patofysiologiske sammenheng, funksjonelle egenskaper sine dendritter fortsatt i stor grad ukjent i begge forhold. Patching fra dendritter har blitt implementert for nigral dopamin nevroner av flere grupper med suksess 13,25,26 og er fortsatt den metoden for valg for å dissekere hissige egenskapene til disse fine subcellulære strukturer 8. Dendrittiske innspillinger gi en ytterligere opportuning til å granske effektivitet og plastisitet av synaptisk transmisjon og plastisitet av dendrittiske oppstemthet 82,83.

Disclosures

Forfatteren erklærer at han ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Jeg takker Dr Vincent Seutin for hans konstant støtte, Chrisgillissen og Laurent Massotte for utmerket teknisk assistanse, Drs Jean Defourny og Sandra Ormenese for råd med konfokal mikroskop, Dr Jacques DESTINE for gaven av andre Axopatch 200B forsterker, GIGA-Imaging plattform for deling av konfokal mikroskop og Imaris programvare og Dr Stephen Freeman for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra de belgiske FRS - FNRS (U.N002.13 og T.N0015.13) og publisert med støtte fra den belgiske Universitetet Foundation (publie avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

Neuroscience Dendritt patch-clamp dual opptak celle-festet biocytin merking neuronal morfologi substantia nigra dopaminerge nevroner ion-kanal
Subcellulære Patch-klemme Opptak fra Somatodendritic Domain of Nigral dopaminneuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter