Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

Dendriter av dopaminerga neuroner emot och förmedla synaptiska ingång, support aktionspotentialens back-spridning och frisättning av signalsubstans. Att förstå dessa grundläggande funktioner kommer att kasta ljus på informationsöverföringen i dessa nervceller. Dendritiska patch-clamp inspelningar ger möjlighet att direkt undersöka de elektriska egenskaperna hos dendriter och underliggande spänningsstyrda jonkanaler. Emellertid är dessa fina strukturer inte är lättillgängliga för patch pipetter på grund av deras lilla diameter. Denna rapport beskriver en steg-för-steg för att samla stabila och tillförlitliga inspelningar från dendriterna av dopaminerga nervceller i akuta skivor. Elektrofysiologiska mätningar kombineras med post hoc återvinning av cellmorfologi. Lyckade experiment beroende av förbättrad framställning av skivor, lösningar och pipetter, adekvat justering av optik och stabilitet av pipetten är i kontakt med den inspelade strukturen. Standardprinciper SOMmatiska patch-clamp inspelning tillämpas på dendriter men med en mjukare inställning av pipetten. Dessa mångsidiga tekniker kan genomföras för att ta itu med olika frågor som rör de exciterbara egenskaper dendriter.

Introduction

Nervceller får synaptiska uppgifter främst på deras dendriter. Retande och hämmande synaptiska signaler sprids från deras webbplats genereringsintegrationsstället där aktionspotentialer (APS) är framkallade som utsignalen. På vägen är synaptiska potentialer påverkas av både struktur dendriter och samspelet mellan de passiva och aktiva membranegenskaper. Kombinationen av dessa mycket variabla parametrar vidgar beräkningskraft av neuroner 1,2. Emellertid hindrar emellertid studier av deras elektriska egenskaper den lilla diametern hos dendriter. Den kontinuerliga utvecklingen av patch-clamp-tekniken 3 har optiken 4 och förfining av metoder för skiva beredning 5 under de senaste decennierna aktiverade inspelningar från mycket tunn (0,7-3 um Ø) dendriterna 6,7. Dessa metoder var, och är fortfarande till stor del används för att undersöka retbarhet av dendriter i en mängd of neuroner 8. Direkt dendritiska inspelningar är avgörande för att bestämma fördelningen 9-19 och skillnader i de funktionella egenskaperna 20-22 av jonkanaler i distinkta neuronala fack. Dessa uppgifter är ett nödvändigt komplement till jon kanalfördel detekteras med immunohistokemi kombineras för att ljus och elektronmikroskopi 23,24. Dubbla somatodendritiska inspelningar har genomförts för att undersöka utbredningen av aktionspotentialer 9,13-15,21,22,25-27 och spridning av synaptiska potentialer 13,16,18 längs somatodendritiska domänen av nervceller, få detaljerade passiva kabel modeller 28- 30 och undersöka den temporala upplösningen av neuronal integration 31.

Substantia nigra (SN) är en region som ligger i mellanhjärnan involverad i flera funktioner såsom kontroll av förflyttningar, kodningen av belöning och invanda beteenden. Minskningen av dopamin på grund av den specifikaförlust av dopaminerga (DA) neuron i SN är associerad med de motoriska störningar som observeras i patienter som lider av Parkinsons sjukdom 32. Den nigral Kretsen består av två huvudcelltyper: dopaminerga och GABAergic neuroner. Intressant, dessa neuroner har flera särdrag som skiljer dem från andra nervceller. Axonet av en stor del av DA-neuroner och vissa GABA nervceller härrör från en dendritisk webbplats indikerar att dendritiska berså är heterogen (axon bärande och axon-saknar dendriter) 25,26,33. Morfologin av dessa nervceller kontrasterar därför med den typiska organisation av neuroner där informationsöverföringen följer lagen om dynamiska polarisering som avges av Cajal: från dendriter, till soma och slutligen till Axon 34. DA nervceller är också kända för att frigöra dopamin från deras dendriter 35, generera spricker aktivitet 36 och NMDA-receptorn plasticitet 37. den dissecning av dessa fenomen är svårfångade utan direkta inspelningar från den plats där de initieras. För att få insikt i förhållandet mellan det exakta läget och funktionella egenskaper hos jonkanaler och deras roll i den dendritiska retbarhet och informationsöverföring i nigrala neuroner, direkta dendritiska inspelningar är den metod som.

Denna rapport beskriver ett detaljerat förfarande som kan användas för att erhålla enkel och dubbel patch-clamp inspelningar från dendriter av nigrala neuroner och motsvarande post hoc biocytin märkning. De grundläggande principerna för lapp den somatiska och dendritiska membranet är mycket lika. Praktiskt dock inspelningar från dendritiska webbplatser kräver specifik optimering jämfört med somatiska inspelningar. Framgångsrika dendritiska inspelningar är beroende av kvaliteten på de skivor, optimal anpassning av optiken, mild metoden av plåstret pipetten och stabilitet av inspelningarna.

Protocol

Alla experimentella procedurer som beskrivs här följer institutionella och nationella riktlinjer, EU-direktiv om skydd av djur och riktlinjerna för Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Framställning av lösningar

  1. Standard artificiell cerebrospinalvätska (ACSF, Tabell 1)
    1. Använd hög renhet alter 38 och ren glasbägare som dessförinnan sköljts med dubbeldestillerat vatten för att framställa en ny lösning. Använd hög kvalitet dubbeldestillerat vatten för framställning av alla extra- och intracellulära lösningar.
    2. Ta en 2 liter bägare att upplösa NaHCO 3 i 500 ml vatten och en annan för att lösa andra salter för att förhindra utfällning av divalenta joner 39 enligt tabell 1. Rengör spateln systematiskt med dubbeldestillerat vatten och torka den innan du tar ett salt . Använd en magnetisk omrörare för att homogenisera dissolution. Tillsätt lösningarna från båda bägare till en lämplig mätkolv och tillföra lämplig volym.
    3. Se till att den slutliga extracellulära lösning är helt transparent och utan spår av nederbörd.
    4. Tillämpa en gasblandning bestående av 95% O2 och 5% CO2 (carbogen gas) med en glasmikrofilter ljus (Ø 13 mm) 20 - 30 min innan perfusion skivorna 38,40. kontrollerar noga osmolaritet (2 - 3 mätningar i följd) i ACSF med en osmometer (optimalt område: 314-325 mOsmol / L). Lagra den återstående lösningen efter beredning vid 4 ° C och använda den inom 3 dagar.
  2. Skär lösning (sackaros-ACSF, tabell 2) 5,13
    1. Förbereda 3 L av färsk lösning. Använd ett L för att förbereda hjärnan skivor från ett djur. Lagra den återstående lösningen vid 4 ° C och använda den inom 3 dagar.
      OBS: Hög Mg 2+ och låga Ca 2 + koncentrationer används för att decrease synaptisk transmission och ersättandet av vissa NaCl med sackaros för att bevara vävnaden 5,40.
  3. intracellulära lösningar
    1. Förbereda i förväg 100 ml lösning för dubbla helcells-inspelningar (tabell 3).
    2. Inkludera metylsulfat 13,15,21 för att få god återhämtning av cellmorfologi. Lägg biocytin (0,1-0,4%) för att undersöka senare morfologin av neuron. Inkludera ett fluorescerande färgämne (t.ex. Alexa 594 eller Sulforhodamine 101 41) för att följa en förlängning av dendriter under inspelningen (tillval).
    3. Förbereda i förväg 100 ml elektrod lösning för cell bifogade inspelningar (tabell 4). I detta fall är intern lösning är en hög K + lösning för att isolera den makroskopiska hyperpolarisation aktiverade katjon ström (I h) och innehåller blockerare för de andra spänningsstyrda jonkanaler.
    4. store intracellulära lösningar i 2 ml alikvoter vid -20 ° C. Använd en ny portion för varje ny inspelning. Kontrollera osmolaritet varje tinade alikvot försiktigt med en osmometer. Ta en ny portion om osmolariteten inte motsvarar det ursprungliga värdet.
    5. Överför lösningen från alikvoten in i en 3 ml spruta på toppen av vilket ett 0,22 | im sterilt sprutfilter är placerat. Håll sprutan på is under inspelningen för att begränsa nedbrytning av dess föreningar (ATP, GTP eller fosfokreatin).

2. Tillverkning och fyllning av Patch pipett

  1. Dragande
    1. Använd en horisontell elektrod avdragare och tjocka väggar borosilikat glasrör. För hela celler och cell bifogade inspelningar, använd en 2 mm ytterdiameter / 1 mm innerdiameter. Se till att glasröret är helt ren 38.
    2. Om detta inte är fallet, sänk glaskapillärer i ett organiskt lösningsmedel (t.ex. etanol) Först och sedan i dubbeldestillerat vatten. värme kort kapillär ändelser med en bunsenbrännare. Alternativt ordning glasrör tvättas och värms upp direkt från tillverkaren (se Material lista).
    3. För dubbla somatodendritiska inspelningar, se till att den somatiska pipetten motståndet är mellan 6 och 10 MQ 6,11 och mellan 8 och 19 MQ för dendritiska pipetter när fylld med intracellulär lösning (tabell 3). Standardisera pipett motstånd för cell bifogade inspelningar till ett motstånd på 10 MQ att uppnå jämförbara resultat längs somatodendritiska domänen av neuron 16,18,42,43.
    4. Förbered färska pipetter före varje inspelningssession (varje dag) eller omedelbart före lappning och använda dem 5-8 timmar efter deras tillverkning 39. Förvara pipetter i en täckt glasbehållare för att skydda dem från damm och obstruktion av spetsen.
  2. Putsning
    1. Inspektera och heat-polska varje pipettspets med en microforge att få bättre tätningar med membranet. Innan du använder microforge, smälta en liten bit av glas på platinaglödtråd. Ersätt denna glasbeläggning på platinaglöd dagligen för beständighet (Peter Jonas, personlig kommunikation).
      OBS: Pipetter som används för cell bifogade inspelningar kan beläggas innan värme polering steg för att minska bakgrundsljud. Beläggning kan åstadkommas med ett isolerande medel såsom smält dental vax 22,44 eller en silikonelastomer 39.

3. Beredning av hjärnan skivor

  1. Använd friska Wistar-råttor i åldrarna mellan 16 - 19 dagar gammal. Använd inte ohälsosamma djur eller djur som lider av hypotermi eller uttorkning. Innan du börjar framställningen av skivor hålla djuret i en säker och tyst plats. Undvik att ha något annat djur i rummet medan du förbereder ett djur. Manipulera djur försiktigt.
  2. Häll sackaros-ACSF i två 400ml polypropen (PP) bägare och placera dem i -80 ° C frys under 45 min. Blanda lösning för att få en homogen is kall vätska / frysta lösningen och placera bägarna på is. Förse sackaros-ACSF lösning med karbogen gas med hjälp av en mikro ljus (Ø 13 mm) i varje PP bägare.
  3. Förbered skivare och reservkammaren
    1. Använd en högkvalitativ tissue skivare med extremt låga vertikala vibrationer 5,38 för att minimera skador på ytliga skikten av skivor så mycket som möjligt. Fastställa en ny och hela rakblad på skärmaskinen.
    2. Använd en ny rakblad för varje skär session. Undvika böjning av rakblad. Ta inte bort fettfilmen på ytan av rakbladet (Josef Bischofberger, personlig kommunikation).
    3. Om tillgängligt, kontrollera vertikala vibrationer med en vibroprobe tillhandahålls av tillverkaren. Alternativt kan du använda en skräddarsydd vibroprobe 5. Minska de vertikala vibrationerna av bladet so för att vara så nära som möjligt till 0 pm.
    4. Förbered en 150 ml reservkammaren 45,46 för skivor som visas på sid. 201 i Ref. 39. Häll standard ACSF i reserven kammaren och placera den i ett vattenbad. Förse reservkammarlösningen med karbogen med hjälp av en mikro ljus (Ø 6 mm). Se till att CARBOGEN bubblorna är så liten som möjligt.
      OBS: Bygg en ny reservkammare var 2 - 3 månader för att hålla segmentet kvalitet konstant.
  4. skurna skivorna
    1. I en tyst rum där försöksledaren inte störs eller stressad, halshugga djuret med kirurgi sax (längd 150 mm) i höjd med hals märgen.
    2. Skära in i huden vid toppen av djurets huvud i den nasala till kaudal riktning med en skalpell och ta bort den i sidled. Skär av toppen av skallen från kaudalt den nasala delen av huvudet med fina sax och ta bort båda delarna av skallen sidled. Ta bregn med en tunn spatel och släpp den försiktigt i en PP bägare innehållande iskall (0-4 ° C) sackaros-ACSF jämviktad med karbogen 38.
      OBS: Denna sekvens av steg som behöver göras så fort som möjligt, men också minutiöst (<< 1 min, ungefär 40 s).
    3. Hålla hjärnan i lösningen för PP bägare under ~ 2-5 min. Justera karbogen tryck för att undvika rörelser hos hjärnan. Byt ut mikro ljus om CARBOGEN bubblorna är för stora med en ny.
    4. Placera hjärnan på en 9 cm petriskål, i vilken insidan botten är täckt med en ~ 0,5 cm tjockt Sylgard skiktet 38. Förbered denna petriskål i förväg.
    5. Omger hjärnan med iskall sackaros-ACSF. Se till att någon flytande fas av ACSF-sackaroslösning submerges hjärnan. För koronalt skivor, avbröt främre delen av hjärnan i frontalplanet med en skalpell eller ett rakblad. Ta bort lillhjärnan med en coronal snitt.
    6. tillämpa cyanoakrylatlim på preparatfacket (område ~ 1 cm 2). Klistra in hjärnan blocket så att den främre delen är vänd mot skiv scenen. Noggrant droppa sackaros-ACSF ovanpå det inklistrade hjärnan med den stora öppningen av ett glas pasteurpipett och därefter långsamt dränka skärkammaren i skivaren. Manövrera provfacket så att skärytan (dvs den första vävnads att träffa blad) är den ventrala ytan av hjärnan 40.
    7. Applicera carbogen med en böjd glasmikro ljus (Ø 6 mm) till skärkammaren (tillval).
    8. Justera rakbladet i en vinkel på ~ 15 ° med hänvisning till horisontalplanet 5. Skär koronalt hjärnan skivor av ~ 500 nm i den kaudala till nasal riktning innan den når substantia nigra. Minska tjockleken för att skära 300 - 350 | im tjocka skivor innehållande regionen av intresse.
    9. Separata skivor från vävnadsblock med en mycket tunn perfusion nål fäst viden spruta är parallell med kanten av rakblad. Böja nålen så att den har en vinkel på 90 ° mellan nålen och sprutan. Se till att inget tryck anbringas på rakbladet medan man avlägsnar skivan från vävnadsblocket.
  5. lagra skivor
    1. Överför skivor med hjälp av största öppningen av en glas pasteurpipett (fäst vid en glödlampa) i reserven kammaren. När alla skivorna överförs till reserven kammaren (Christoph Schmidt-Hieber, personlig kommunikation) bringa temperaturen på vattenbadet till 34 ° C under 0,5-1 h.
    2. Efter denna period slå av vattenbadet och hålla skivorna vid rumstemperatur. Justera karbogen trycket för att undvika rörelser hos skivorna i reserven kammaren. Håll skivorna i ytterligare 10 till 20 minuter innan inspelningar.
    3. Rengör utrustningen och mikrofiltret ljus försiktigt men grundligt med dubbeldestillerat vatten i slutet av slicing procedur.

4. Dubbla Somatiska och Somatodendric Recordings i nigrala Neurons och biocytin Filing

  1. Följ beskrivningarna för montering av en patch-clamp konfiguration för skivor som anges i Axon Guide och i ref. 39,40,47. Information om mer grundläggande aspekter av patch är i ref. 48.
  2. Förbereda inspelning kammaren
    1. Placera 1 - 2 ml dubbeldestillerat vatten i inspelningen kammaren. Kontrollera att det inte är läckande. Placera inspelningen kammaren på skiftande xy tabellen.
    2. Mata standard ACSF genom en syretäta perfusion slangsystem (polytetrafluoretylen) till inspelningen kammaren. Stabilisera perfusionen flödet i kammaren med en hastighet av 4-5 ml min -1. Hålla längden på slangen ansluta bägaren innehållande ACSF och inspelningen kammaren så kort som möjligt (1 m).
    3. Välj en hjärna skiva från reserven kammaren och överföra den tillinspelningen kammaren med den största öppningen av en glas pasteurpipett. Täck skiva med en platinaring för att förankra den vid botten av inspelningen kammaren såsom visas på sid. 201 i Ref. 39. Använd en platt platina ring (Ø 1,5 cm) och limma parallella nylontrådar (avstånd> 2 mm) på den.
  3. Justera och optimera optik
    1. Visualisera skivorna med hjälp av infraröd (IR) video mikroskopi 4,47,49,50. Justera Köhler belysning 51 och optimera differential interferens kontrast (DIC) 51 optik eller sned belysning (Dodt Gradient kontrast - DGC) 52,53. Mer detaljer om detta förfarande ges i ref. 40,49.
    2. Kontrollera kvaliteten på segmentet. Bara hålla skivor med jämna och jämna ytor som inte är alltför starkt kontrast och har endast små, spridda kratrar.
    3. Fyll 2 färska och oanvända plåster pipetter med intracellulär lösning (
  4. Placera pipetterna ovanför ytan av den del
    1. Kontrollera förekomsten av klorid beläggning på silvertrådar (bad referenselektrod och patch elektrod, för mer information, se The Axon Guide och ref 39,54.).
    2. Sätt in pipetter sekventiellt in i pipetten tagarna och tillämpa positivt tryck (~ 70 mbar) med hjälp av en slang förbindelse som förbinder pipetten hållaren, en trevägskran och en manometer 40. Sänk pipetten i badet av inspelningen kammaren.
    3. Kontrollera att tryckvärdet på manometern är konstant för ~ 1 - 2 min. Om trycket minskar, ta slangen eller tätnings O-ringarna inuti pipetten hållaren.
    4. Placera pipettspetsen i mitten på bildskärmen och se till att den inte hindras. Säkerställa att pipettspetsen inte rör sig när applicering eller avge tryck till pipetten.
    5. Kontrollera för avdrift och vibrationer av pipettspetsen genom att rita ett litet kors i mitten av bildskärmen exakt vid positionen för pipettspetsen och observera under 5 min möjliga rörelser av spetsen.
    6. Applicera ett spänningssteg (5 mV) för att övervaka pipetten motståndet på ett oscilloskop. Ställa in hållpotential av patch-clamp-förstärkare till 0 mV. Avbryt pipetten offset potential så att DC-pipetten strömmen läser noll vid förstärkarens mätare 39,51.
    7. Flytta pipetterna ner till skiva och underhålla dem ovanför ytan.
  5. Välj och korrigera en neuron med långa dendriter
    1. Inom substantia nigra välja en hälsosam neuron med långa dendriter som kan följas över långa avstånd på ungefär samma plane (Figur 1A och 1B) med användning av IR-Dodt Gradient Kontrast (IR-DGC). Välj en jämn och homogen cellkroppen. Undvika de två starkt kontrasterade celler på ytan av den del (Figur 1C och 1D), eftersom det är svårt att bryta sig in och bevara stabila inspelningsförhållanden över tid (stabil seriemotstånd). Välj nervceller som har sitt soma 10-30 um under segmentet ytan.
    2. Flytta den somatiska elektroden nära soma (40-50 | j, m bort) och den dendritiska elektroden nära dendrit på samma avstånd. Använd en 2X förstoring (fyrfaldig växlare) för att välja och lappa en del av en dendrit. Skaffa på monitorn en absolut förstoring av 2,100X utan förstoring (1X) och 5,500X med en 2X förstoring.
    3. Något släppa trycket av den somatiska pipett med 10 mbar. Om det är nödvändigt, reglera dendritiska och somatiska pipett tryck för att undvika förskjutning av cell struktur (soma och dendrit) inom segmentet.
    4. Placera den dendritiska pipetten nära membranet för att se en liten dimpling. Släpp trycket på pipettspetsen och patch Dendrite samtidigt styra pipetten motståndet. Under idealiska förhållanden, är endast en mycket liten sug tillräcklig för att erhålla en god tätning.
    5. Håll dendritiska pipetten i cellen-anslutna läge. Flytta den somatiska pipetten nära den somatiska membranet och patcha somatiska membranet. Se till att en hög tätning motstånd uppnås innan spricker cellmembranet (> 1 GΩ) 39. Något dra tillbaka båda pipetter bort från membranet genom ett par | im för att undvika deformation av cellkroppen och dendrit.
    6. För båda pipetter, minska så mycket som möjligt amplituden hos pipett kapacitans transienter ovanpå det aktuella steget med hjälp av en spänningspuls med hög förstärkning och liten filtrering 51 och oscilloskopet. Gå in i helcells-läge with dendritiska pipett och därefter med den somatiska pipett.
    7. Eliminera helcells-kapacitans transienter och kompensera för seriemotstånd. Övervaka och dokumentera motstånd tillgång i början av och regelbundet under experimentet. Om serieresistans är för hög (> 50 MQ), försöka igen med en annan pipett.
    8. Samla IR-DGC bilder (figur 1A och 1B) med en video grafisk skrivare 25, en ram grabber eller en digitalkamera vid höga och låga förstoringar.
      OBS: Svullnad av nervceller under inspelning (Figur 1E och 1F) är sporadiskt observeras, men sällan när osmolariteten och pH av lösningar är rätt justerad 39.
    9. Erhålla dubbla somatiska helcells-inspelningar (soma - Soma) med samma förfarande (Figur 2A).
  6. Applicera lång (flera hundra ms) ökade depolariserande aktuella stegen i tur och ordningmed det somatiska och dendritiska pipett för att framkalla APs (Figurerna 2B, 3C och 3D). Spela den resulterande potentialen vid dendritiska och somatiska pipett samtidigt.
  7. Undersök spridning av artificiella excitatoriska postsynaptiska potentialer (aEPSPs) i dopaminerga neuroner
    1. Skapa en excitatoriska postsynaptiska ström (epsc) vågform att injicera ett strömkommando under dubbla strömkläm inspelningar (figurerna 4A och 4B). För att göra detta, bygga en dubbel exponentiell funktion med amplitud och tidsförloppsvärden motsvarande verkliga värden som uppmätts för EPSCs i neuron av intresse 55. kontrollerar noga samplingsfrekvenser på det konstruerade epsc och av den injicerade epsc vågformen att bevara den ursprungliga tidsförloppet.
      Obs: Innan du ansöker vågformen i en verklig neuron, testa det med en modell cell.
    2. Sekventiellt injicera vågformen via den dendritiska ochsomatisk pipett och spela följd potentialer för både somatiska och dendritiska pipetter samtidigt. Kontrollera regelbundet för eventuell drift av pipetter.
  8. Avslutande av inspelningen från en neuron
    1. Ta en IR-DGC bild på en låg förstoring (mål: 5X eller 10X) för att dokumentera positionen för neuron inom segmentet och elektroderna.
    2. Långsamt och försiktigt dra den dendritiska och somatiska pipetter från neuronala membranet sekventiellt för att bilda utanför ut lappar med både pipetter. Ta pipetten med hjälp av en sekvens av lateral-uppåtgående rörelser 38. Dessa bör vara kort först och sedan gradvis öka i längd. Denna inspelning konfiguration gynnar korrekt förslutning av cellmembranet.
    3. Övervaka minskningen av kapacitiva strömmar (ökning i åtkomstmotståndet) som svar på en 5 mV spänningspuls i spänning-clamp samtidigt dra tillbaka pipetten.
    4. När membranet är havetledas runt pipettspetsen, ta den helt ur inspelningen kammaren. Ta bort målet från badet. Håll skiva i inspelningen kammaren för 15 - 20 minuter i standard ACSF för att möjliggöra utjämning av biocytin (från intracellulära lösning) i den inspelade neuron.
    5. överföra försiktigt segment med hjälp av den stora öppningen av en pasteurpipett i 25 ml bred mun bärnsten (brun) glasflaska som innehåller standard ACSF. Förslut flaskan med ett lock. Se punkt 6 för fixeringssteget.

5. Cell-anslutna inspelningar

  1. Välj en neuron med en dendrit som sträcker sig över en lång sträcka i samma plan. Se till att dendrit av intresse kan följas för att en väldefinierad soma.
  2. Fyll fläckpipetten med elektrodlösning (Tabell 4). Utforma lösningen för att spela in ström av intresse i cellen-anslutna konfiguration genom att inkludera specifika farmakologiska medel för att blockera andra jon channels.
  3. Patch dendrit i cellen-anslutna läge
    1. Visualisera ett parti av dendrit och närma omkodningen pipetten med hjälp av manipulatorn. Anpassa trycket vid pipettspetsen genom att kontrollera manometer (70-80 mbar) för att undvika förskjutning av dendrit. Patch dendrit som beskrivs i 4.5.4.
    2. Spela några IR-DGC bilder (Figur 5A). Försök att erhålla en tätning motstånd så stort som möjligt (> 1 GΩ 39), i bästa fall mellan 3-10 GΩ för celllösa inspelningar 18 (figur 5B). Dra tillbaka pipetten bort från membranet genom ett par | im för att undvika deformation av dendrit.
    3. Beakta åtgärds strömmar i cellen-anslutna läge återspeglar spontana aktionspotentialer av nigrala neuroner. Komplettera ACSF med Ca2 + och Na + kanalblockerare (CdCl2 och TTX, respektive) för att undertrycka action strömmar.
    4. Applicera en 2 svoltage steg av -90 mV från en hållpotential av 0 mV till plåstret att framkalla I h (figur 5C). Tänk på att pipetten potential och vila membranpotential är i serie i cell fäst konfiguration 56. För mer information, se The Axon guide och Ref. 39.
    5. Kontrollera regelbundet för eventuell drift av pipetten.
    6. Vid slutet av inspelningen, bristning plåstret att gå i helcells-läget och sedan omedelbart ta en avläsning av membranpotentialen. Dra tillbaka pipetten som beskrivs i avsnitt 4.8.2 och 4.8.3 för att erhålla en utanför-out patch.
  4. Spela in från motsvarande soma i hela celler läge
    1. Titta längs dendrit och lokalisera motsvarande soma. Använda en hög-motstånd pipett (5-10 MQ) 6,14,57 fylld med en K + -baserad intracellulär lösning (tabell 3). Applicera en kort sugning (undertryck) tillpipettspetsen att brista membranet för att komma in i helcells-läge.
    2. Kontrollera om identiteten av neuron i strömklämma genom att tillämpa långa hyper- och depolariserande aktuella stegen (figur 5D) och låt biocytin att diffundera längs dendriter. Applicera korta depolariserande aktuella stegen att visualisera AP tidsförloppet.
    3. Efter ≤10 min återkalla pipetten för att få en utanför-out patch som beskrivs i avsnitt 4.8.2 - 4.8.3. överföra försiktigt segment med hjälp av den stora öppningen av en pasteurpipett till en 25 ml bärnstensfärgad glasflaska som innehåller standard ACSF. Förslut flaskan med ett lock.
    4. Alternativt först få en somatisk hel-cell med en pipett lösning innehållande ytterligare en fluorescerande färg. Tillåta diffusion av färgämnet och välj en del av en dendrit 26. Med en andra pipett patch Dendrite i cellen-anslutna läge. Använda ett konfokalmikroskop om tillgänglig för att förbättra visualiseringen av den fluorescensetiketted dendrit 14,22.
    5. Utför dendritiska inspelningar i utsidan ut konfiguration, alternativt eller dessutom till celllösa inspelningar 10,22. Se ett exempel på en spänningskänsliga strömmar som spelats in från en extern ut lappar i figur 5E och 5F.

6. biocytin Märkning av nigrala nervceller

  1. Fixering av vävnaden
    1. Om det är möjligt, använda separata rum för skiva inspelning / histokemisk bearbetning 38.
    2. Fixera skivorna genom att ersätta ACSF med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert-saltlösning (PBS, pH = 7,4) med en Pasteur-pipett. Använd alltid nygjord fixativlösning (<< 1 vecka gamla).
      VARNING: Använd hand handskar och en kemisk huva placeras i en histologi laboratorium för att manipulera paraformaldehyd på grund av dess toxicitet. Läs säkerhetsdatablad av denna farliga produkter före användning och check det föreskrifter om kemikaliesäkerhet (direktivet om farliga ämnen (67/548 / EEG) från EU-kommissionen), eftersom detta pulver tros ge upphov till cancer. Andra detaljer är i Ref. 58.
    3. Placera skivor vid 4 ° C över natten. Undvika förorening av patch-clamp installation eller utrustning som används för elektrofysiologi av paraformaldehyd.
    4. Efter fixering, byt ut fixeringslösning med PBS. Använd en annan Pasteur pipetter för att avlägsna fixeringslösning och tillämpning av PBS. Lagra skivor i PBS vid 4 ° C före ytterligare bearbetning (1 - 2 veckor). I det här fallet, byt PBS två gånger i veckan. Använd alltid nygjord PBS (<< 1 vecka gamla).
  2. Färgning av vävnaden
    1. Förbered en 24 brunn cellodlingsplatta för färgningssteg. Använd ren utrustning för att överföra skivor. Skölj skivorna 3 x 5 min med färska PBS.
    2. Applicera Fluorescein avidin DCS (Avidin D, cellsorterare klass, 1 pl fluorescein / ml Triton X-100) och 0,3% Triton X-100 i PBS vid 4 ° C över natten. Skydda skivorna från ljus i hela färgning. Som ett alternativ till fluorescens, etikett nervceller via 3,3-diaminobensidin för ljus eller elektronmikroskopanalys 21,58.
      VARNING: Triton X-100 är farlig. Läs säkerhetsdatablad och EU kommissionens direktiv innan du använder detta ämne.
    3. Skölj tre x 30 min med PBS och därefter med PB (fosfatbuffert, för att undvika bildandet av kristaller vid ytan av den del).
  3. Montera skivor på vanliga glasskivor. Täck skivorna försiktigt med en inbäddning medium. Undvika luftbubblor i inbäddning mediet. Sätt täck försiktigt för att täcka helt segmentet. Lufttorka glasen natten innan visualisera dem med mikroskop.
  4. Lagra de märkta skivor vid 4 ° C efter visualisering. Användbara tricks på histokemiska förfaranden i ref. 58,59.
  5. Rengör den utrustning som används för histologi och elektrofysiologi separat. Blanda inte histologi och elektroutrustning tillsammans.

7. Post Hoc Visualisering av biocytin fyllda neuroner

  1. Använda ett konfokalt mikroskop för att visualisera morfologin hos återvunna neuroner.
    1. Ungefär lokalisera fluorescerande neuron i segmentet med epifluorescence. Undersök dendritiska berså av nervceller och lokalisera axonet och axonal Bleb (2-4 um Ø) med en 10x eller 20x objektiv. Dokumentera loppet av axonet.
    2. Växla till konfokalmikroskop och välj 488 nm laserdiod för att excitera fluorescein som finns i den märkta neuron. Följa förlängningen av axon och dendriter i z-axeln.
    3. Lagra flera bilder i för att erhålla ett z-stack för hela cellen. Justera upplösningen av z-axeln (avståndet mellan på varandra följande bilder) till 0,5-1 pm. Samla konfokala bilder av en cell using låg (10X objektiv) och hög (60X objektiv, oljeimmersions) förstoring.
    4. Öppna bildfilen av neuron erhålls med konfokalmikroskop med en bildbehandlingsprogram (ImageJ) 60. Jämföra z-projektionsbilden med ett IR-DGC bild genom ögat för att lokalisera den exakta positionen för de patch pipetter under de elektrofysiologiska inspelning (figurerna 1, 2A, 3A, 4A, 5A och 5E).
    5. Bestäm morphometries av märkta nervceller: mäta axon - soma avstånd, avstånden mellan inspelning pipetter längs somatodendritiska domänen och mellan den dendritiska pipett och axon med "Measure" funktion i ImageJ.
    6. Återskapa vissa nervceller med NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 eller Neuromantic 61.

8. Analys av Elektro Data

  1. Använd programpaketet i samband med förstärkaren till grovt analysera data (t.ex. Clampfit) eller direkt enannan programvara för dataanalys såsom Stimfit, en öppen källkod 62,63 som i vår senaste publikation 13 eller till exempel WinWCP.

Representative Results

Den ovan beskrivna protokollet för avsikt att underlätta insamlingen av data med hjälp av dendritiska patch-clamp inspelningar. Denna teknik, i kombination med post hoc histokemi, hjälper till att få insikt i mekanismerna för många elektriska signaler har sitt ursprung eller sprids i dendriter. Direkt tillgång till dendriter med patch pipetter är svårt, men särskild uppmärksamhet åt flera metodologiska aspekter kommer att förbättra andelen framgångsrika inspelningar. En försöks tillräcklig erfarenhet i stabil somatiska inspelning kan förvänta sig att få hög resistans (GΩ) tätningar och kompletta experiment på de flesta av försöken. En till två dendritiska inspelningar av hög kvalitet kan tas ut per dissekering.

Tillgången på högkvalitativa hjärnan skivor som innehåller friska somata och dendriter är en förutsättning för att få tillgång till dessa fina strukturer (Figur 1). den criterien för val av dessa neuroner är en slät och homogen yta över hela cellen och en soma och dendriter med låg kontrast när observeras med optimala justeras optik (Figur 1A och 1B). Välja nervceller alltför starkt kontrasterade i allmänhet leder till instabila inspelningar (Figur 1C och 1C). Därför sådana nervceller bör undvikas.

I jämförelse med andra nervceller, nigrala DA nervceller visa specifika morfologiska och elektrofysiologiska egenskaper. Dessa funktioner vanligtvis bedömts med en enda somatisk pipett kan också iakttas i dubbel somatiska (Figur 2) och somatodendritiska inspelningar (Figur 3). Långa hyperpolarizing nuvarande injektioner framkalla en membranpotential rättelse kallas "sag" (figurerna 2B och 5D). Axonet sitt ursprung, i de flesta fall, på en dendritisk plats som identifierasmed användning av komplementära kriterier 13,25,26, vilket indikerar att den dendritiska fack i dessa neuroner är heterogen (Figur 3A - 3B). Som en följd av det utrymme där AP observeras först motsvarar facket där axonet framträder (Figur 3C - 3D) 13,25,26. Axonet i allmänhet avslutas med en axonal Bleb orsakas av en skärning av axonet under skärning 64, men denna struktur är inte systematiskt upptäcks.

Den utpräglade sag observerats i nigrala DA-neuroner som följer på aktivering av I h antyder en hög expression av HCN subenheter. För att bestämma påverkan av I h på integration av synaptiska signaler genererades och injicerades via dendritiska inspelningen elektroden under somatodendritiska dubbla inspelningar 55 (<synaptiska liknande ström (epsc) vågformerstrong> Figur 4). Kinetiken för dessa simulerade EPSCs var baserade på stig- och falltidskonstanter av verkliga spontana EPSCs. Den resulterande aEPSP spelades in med den somatiska elektroden. Bad tillämpning av I h blockerare ZD 7288 ökade varaktigheten av aEPSP, vilket indikerar bidraget av I h till tidsförloppet för synaptiska signaler (Figur 4B). ZD 7288 avskaffades också membranpotentialen rättelse bekräftar att sag resultaten från aktivering av I h (figur 4C). De resultat som erhölls med simulerade EPSPS kan korreleras till experiment med användning av elektriskt framkallade EPSPS 65. Att kartlägga exakt fördelning av kanalen i somatodendritiska domänen av DA-neuroner, var cell bifogade inspelningar genomförts (Figur 5). En hög resistans tätning (>> 1 GΩ) är en absolut nödvändighet för cell bifogade inspelningar (Figur 5B jag h långsamt med långa hyperpolariserande spänningssteg och den nuvarande steady-state uppnås efter hundratals ms (Figur 5C), som tidigare visats 66. Denna observation indikerar att HCN kanaler uttryckta i dendriter av DA nervceller har olika subenheter i jämförelse med dem i pyramidala nervceller eller andra celltyper 10,16,66. Eftersom fördelningen av kanalen kan vara icke-homogena i den dendritiska utrymmet och som den dendritiska utrymmet i sig själv är heterogen, är identiteten hos den dendritliknande (axon bärande eller nonaxon bärande dendrit) avslöjade genom att jämföra IR-DGC bild med konfokal bild efter biocytin färgning (Figur 3A och B). Återvinning av cellmorfologin är därför nödvändigt att både dubbla somatodendritiska inspelningar och för cell bifogade inspelningar via efterföljande somatiska helcells-inspelningar.


Figur 1. Visualisering Soma och proximala dendriter av nigrala dopaminerga neuroner Använda IR Videomicroscopy. (A) IR-DGC bild av en nigral DA neuron visar soma och proximala dendrit och båda somatiska och dendritiska pipetter. En dubbel somatodendritisk inspelning fördes framgångsrikt på denna friska neuron. Observera låg kontrast och slät yta över hela somatodendritiska domänen hos cellen. (B) Ett annat exempel på en hälsosam DA neuron. (C) DA neuron med en grövre och ojämn yta och en starkare kontrast. Medan en dubbel inspelning har erhållits, stabiliteten var suboptimal, och inspelningstiden var kort (~ 15 min) på grund av en gradvis ökning av motståndet tillgång på båda pipetter. (D) Andra exempel på en DA neuron visar en starkt kontraste soma och proximal dendrit. I detta fall var en kraftig ökning av åtkomstmotståndet observeras strax efter pausen i hela celler läge. Ett försök att minska motståndet åtkomst av negativt tryck misslyckades. Nervceller i panel C och D kan ha skadats under skärförfarandet och bör undvikas för experiment. (E) Samtidig dubbel somatiska inspelning i en sund DA neuron i början av inspelningen. (F) Samma neuron som i panel E med en svullen cellkropp efter ~ 17 minuter. Notera hela frånvaron av kontrast, bollen liknande utseende soma och närvaron av den stora kärnan som inte framgår i friska nervceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Samtidig Double Somatic inspelning från en DA Neuron. (A) IR-DGC bild under dubbel somatisk inspelning från en DA-neuron. (B) hyperpolarisering och depolariserande 1 s långa ström injektioner (-160 till 80 pA, öka 80 pA) och motsvarande spänningsändringar registreras samtidigt med båda patch pipetter. Notera förekomsten av sag i spännings spår med den långa hyperpolarizing aktuella steget och den stora efter hyperpolarisation efter AP under depolariserande strömpulsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Dual S omatodendritic inspelning i en DA Neuron. (A) IR-DGC bild av en DA neuron. Avståndet mellan den dendritiska och somatic pipett är 29 nm. (B) Confocal z-projektion bild av neuron i panel A märkt med avidin konjugerat till fluoresceinisotiocyanat (FITC). Neuronen fylldes med biocytin under inspelning. Axonet sitt ursprung från en proximal dendrit nära soma såsom indikeras med pilen. (C) Samtidig dubbla somatodendritisk hel-cellspänningen inspelning från neuron i panel A. AP registreras i soma (svart spännings spår) och dendrit (röd spänning spår) som svar på en en långa ströminducering steg via somatiska (vänster, svarta vinbär spår) och alternativt dendritiska pipett (höger, röd nuvarande spår) (D) somatiska och dendritiska AP visas i expanderad tidsskala.. Med antingen somatiska eller dendritiska ströminjektion, somatiska AP (svart) föregick dendritiska AP (röd). Fördröjningen mellan APs i denna neuron var 120 ps och 210 ps med somatisk och dendritiska ströminjektion, respektive. förseningaruppmättes vid AP halv-maximal amplitud under den stigande fasen av AP. AP observeras först i facket nära som Axon framträder, vilket bekräftar tidigare observationer 25,26. I detta fall är den dendritiska inspelningar från ett axon-saknar dendrit. Ett exempel på en inspelning från en axon bärande dendrit är i ref. 13 (i sin fig. 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Förökning av artificiella EPSP Längs somatodendritisk Axis of DA nervceller. (A) IR-DGC bild av en DA neuron. Avståndet mellan den dendritiska och somatiska pipett är 45 | im. Båda patch pipetter är i hela celler strömklämma inspelningsläge. (B) Ströminspelad med den dendritiska pipett i ström-klämma och används för att generera den artificiella EPSP (överst). Den ström erhålles genom injektion av en epsc liknande vågform (t rise = 0,6 ms; t sönderfalls = 3 ms; amplitud = 100 pA) via den dendritiska inspelnings pipetten 55. Längst ner, förökade aEPSPs inspelade på soma kontroll förhållanden (svart) och efter badet tillämpningen av I h blockerare ZD7288 (30 ^ M, rött spår). Varje spänning spår är genomsnittet av 40 enskilda svep. Observera den stora ökningen av EPSP varaktighet i närvaro av ZD7288 indikerar bidrag jag h till tidsförloppet för EPSPS. (C) Spännings spår som spelats in från soma i kontrollförhållanden (svart) och efter tillämpningen av 30 iM ZD 7288 ( röd) som svar på en lång (30 pA; 1 s) hyperpolarizing aktuella steget. Notera avsaknaden av membranpotentialen rättelse (sag) efter blockering av I <sub> h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Förekomst av I h i dendriter av DA Neuron. (A) IR-DGC bild av en DA neuron och pipett på proximala dendrit. (B) Kapacitiva och läckströmmar under en 5 mV spänningskommando i cell-anslutna konfiguration. Tätningen motståndet var 5 GΩ i detta exempel (C) hyperpolariserande spänningssteg. (90 mV, överst) från en membranpotentialen av 0 mV inducerade en långsamt aktiverar jag h. Den aktuella spår inverterades och utrustad med en enda exponentiell funktion som ger en tidskonstant på T = 632 ms. (D) Spänningsvaren från helcell-inspelad soma (panel A) till 1 s hyper- och depolariserande strömpulser (-160 till 120 pA, 40 pA öka). Den somatiska helcells-inspelning utfördes efter det cell bifogade inspelning. Notera avsaknaden av AP på grund av den extracellulära tillämpningen av TTX och Cd 2+ för att undertrycka spontan bränning under cell-anslutna inspelning. Dessa spänningskänsliga Na + och Ca2 + nuvarande blockerare sattes för att undertrycka action strömmar. Paneler A - D är från samma neuron (E) IR-DIC bild av en annan DA neuron och en dendritisk pipett (F) spänningsberoende strömmar aktiveras av en testpuls till 0 mV från en 50 ms prepulse vid -120 mV.. i en utanför-out patch ut från den proximala dendrit av neuron i panelen E. Holding potential -80 mV. Notera tidsberoende inaktivering av strömmen. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Ämne g / mol Koncentration för en L
NaCl 58,443 125 mM 7,305 g
NaHCOs 3 84,007 25 mM 2,100 g
KCl 74,551 2,5 mm 0,186 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,172 g
glukos 198,17 25 mM 4,95 g
MgCl2 1 M (lösning) 1 mM 1 ml
CaCl2 1 M (lösning) 2 mM 2 ml
Osmolaritet: ~ 310 mOsmol / L (optimal räckvidd: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4

Tabell 1: artificiell cerebrospinalvätska (ACSF).

Ämne g / mol Koncentration för en L
NaCl 58,443 87 mM 5,084 g
NaHCOs 3 84,007 25 mM 2,1001 g
KCl 7,551 2,5 mm 0,18637 g
NaH 2 PO 4 137,99 1,25 mM 0,17248 g
MgCl2 1 M (lösning) 7 mM 7 ml
glukos 198,17 10 mM 1,9817 g </ Td>
sackaros 342,29 75 mM 25,672 g
CaCl2 1 M (lösning) 0,5 mM 0,5 ml
Osmolaritet: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4

Tabell 2: Sackaros-ACSF att förbereda skivor.

Ämne g / mol Koncentration för 100 ml
KMeSO 4 150,2 120 mM 1,8024 g
KCl 74,56 20 mM 0,14912 g
MgCl2 1 M (lösning) 2 mM 200 ^
Na 2 ATP 551,1 2 mM 0,1102 g
Na 2 GTP 523,2 0,5 mM 0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine 255,1 5 mM 0,1275 g
EGTA 380,4 0,1 mM 3.803 mg
Hepes 238,31 10 mM 0,23831 g
biocytin 1 mg / ml 0,1 g
Osmolaritet: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 justerat med KOH

Tabell 3: Intracellulär lösning för dubbla inspelningar.

Ämne g / mol Koncentration för 100ml
KCl 74,56 120 mM 0,8947 g
CaCl2 1 M (lösning) 2 mM 200 ^
MgCl2 1 M (lösning) 1 mM 100 ^
Hepes 238,31 10 mM 0,23831
TEA-Cl 165,7 20 mM 0,3314 g
4-AP 94,11 5 mM 0,04705 g
BaCl2 244,26 1 mM 0,02443 g
CdCl2 183,32 0,02 mM 0.3666 mg
TTX 1 mM 200 nM 20 ^
Osmolaritet: ~ 290 mOsmol / L, justerat med D-glukos (Ref 16.); pH = 7,4

Tabell 4: Elektrod lösning för cell bifogade inspelningar.

Discussion

Denna rapport beskriver en steg-för-steg-protokollet för att genomföra dubbla somatodendritiska helcells-inspelningar och lokala dendritiska inspelningar. Den är användbar för bestämning av inverkan av jonkanaler (dvs., I h) på tidsförloppet för postsynaptiska potentialer och kartlägga fördelningen av jonkanalen (I h) längs den somatodendritiska domänen av nigrala DA-neuroner, respektive. Resulterande elektrofysiologiska mätningar kombineras för att i efterhand histokemi att återvinna cellmorfologin. Förfarandet användes för att undersöka DA neuron belägna i substantia nigra, men kan generaliseras till angränsande nigrala GABA nervceller, ventrala tegmentområdet DA nervceller eller andra mitthjärnan nervceller. Alla steg kan även följas för att undersöka andra jonkanaler som uttrycks i dendriter av nigrala neuroner utan viktiga förändringar. Post hoc visualisering är särskilt relevant för nervceller med axon bärandedendriter, såsom nigrala neuroner 25,26, hippocampus oriens-Alveus interneuronen 21 eller några CA1 pyramidala nervceller 67. Intressant, neuroner delar den här funktionen verkar vara vanligare än i allmänhet trott 67. Morfologisk analys avslöjar också den exakta positionen för elektroderna och axon. Detektering av den senare kan optimeras genom märkning av proteiner som uttrycks i axonet första segmentet (spänningskänsliga Na + -kanaler eller ankyrin G) med hjälp av immunhistokemi 68,69.

Tillförlitligheten av uppgifter som samlats in med dendritiska inspelningar och efterföljande neuronal märkning beror alltid på skiva kvalitet. behöver därför maximal ansträngning som skall tillämpas för att bevara livskraften hos cellerna i vävnaden. Detta uppnås med varsam hantering av friska djur, högkvalitativa verktyg och reagens, tillräcklig syresättning av vävnad och iskalla temperaturer under utarbetandet av skivor. Stabila inspelningsförhållanden är beroende av valet av friska nervceller. I helcells-läge, bör serieresistans initialt vara så låg som möjligt och hålls konstant genom hela experimentet. Stabiliteten av inspelningarna är vidare beroende av hög kvalitet manipulatorer saknar drift och vibrationer. Dessa störningar kan minskas genom att optimera pipetten stabilitet: kontrollera anslutningen till pipetten innehavaren och huvudsteg, styrning att mikromanipulator kablar är slack, undvika plötsliga förändringar i temperatur eller scenen rörelse och kontroll mekanismen av manipulatorn. För dubbla inspelningar har metylsulfat 13,15,21 inkluderats i den intracellulära lösningen, men glukonat 9,14,25 kan alternativt användas. Emellertid kan huvud anjonen förändra membranpotentialen 70,71 och vissa spänningsberoende strömmar 72. Intracellulär lösning kan kompletteras med ATP, GTP och fosfokreatin att bevara physiologiska funktionerna hos neuroner. Dessutom, tillsätta ett fluorescerande färgämne i pipetten lösning (t.ex. Alexa 594 eller Sulforhodamine 101 41) för att visualisera dendriter under en somatisk inspelning kan vara användbart till exempel att placera en tryckapplicerings (figur 7 i ref. 41) eller en elektrisk stimulerande pipett. Pipetten lösning för cell bifogade inspelningar innehåller en hög K + koncentration och ingen Na + att spela stor I h. Anmärkningsvärd koncentrationsförhållandet för Na + / K + påverkar strömamplituden 10, den jämviktspotential för den aktuella 11 och grindnings av I h 73. Alternativt kan jag h också registreras med hjälp av utanför-outs 10. I denna inspelning konfiguration kan emellertid den intracellulära miljön i närheten av kanalerna störas. Följaktligen skillnader i spänningsberoende aktivering av I <sub> h observeras när man jämför strömmar erhållits med användning av cell fäst patchar och utanför-outs 10. Svullnad av nervceller ibland påträffas under patch-clamp inspelning, och ofta uppstår från olika orsaker såsom den låga kvaliteten på vattnet, stark obalans i osmolaritet eller pH mellan intra- och extracellulära lösningar 39 eller fel i sammansättningen av lösningar. Kvaliteten på elektrofysiologiska inspelningar har en direkt inverkan på kvaliteten på morfologin av återvunna nervceller. Hög motstånds somatiska pipetter används för dubbla inspelningar (6 - 10 Mohm, såsom i ref 6,11.) Och för enkel somatiska inspelningar efter celllösa inspelningar för att minimera utspädningen av den intracellulära miljön 14. Helcell-somatisk inspelning efter den cell bifogade inspelning är därför hållas kort (<10 min). Utanför-out fläckar från både somatiska och dendritiska pipetter är avgörande för korrekt stängning av cell membran och efterföljande återvinning av cellmorfologin. Förutom cellens strukturen, kan neurokemiska innehållet bestämmas för de registrerade neuronerna 59,74. Till exempel kan det intracellulära proteinet tyrosinhydroxylas att immunolabeled för entydig identifiering av DA-neuroner 13.

DA nervceller är huvudsakligen koncentrerad till SN pars compacta, med en mycket lägre densitet närvarande i SN pars reticulata, där de blandas med ett större antal GABA neuroner 75. Medan cellkroppen av DA-neuroner är ofta större än den för GABA nervceller, är visuell identifiering av dessa celler med IR-videomicroscopy osäkra och delvis hindras av opaciteten hos pars compacta. För att kringgå dessa begränsningar, kan urvals av DA-neuroner underlättas genom användning av transgena möss som uttrycker en fluorescerande markör i en specifik population av neuroner (TH 65 eller DAT för DA-neuroner, GADför GABA-neuroner) och epifluorescence belysning. Alternativt kan ett fluorescerande färgämne inkluderas i lösningen av den somatiska elektroden för att underlätta visualisering av dendriter. Ökad upplösning av fluorescerande cell förs av Nipkow spinning disk konfokala 14,22,30 eller två foton mikroskopi 7 kombineras för att IR-DGC 6. Flera fördelar är relaterade till DGC i jämförelse med DIC. Först, eftersom DIC prismor inte behövs, IR-DGC bild kan överlagras med en fluorescens bild 49,52,53,76. För det andra, kan DGC kombineras med fotostimulering och optogenetik 77.

En nackdel med skiva beredning är bevarandet av integriteten för neuroner. DA nervceller förlänga sina dendriter i de tre rumsliga planen 78,79 och kan därför inte helt undvikas trunkering av den dendritiska utrymmet i skivor 80. Valet av orientering skivor (koronalt, horisontellt eller parasagittal) är en kompromiss. Ursprunget till innervation och experimentell design måste anses att välja rätt riktning skivor.

Direkt dendritisk lapp är den teknik som används för att kartlägga fördelningen av funktionella jonkanaler i de olika facken i celler. Dessutom erbjuder denna teknik för att bestämma variationen i funktionella egenskaper kanaler 20. Som ett komplement plats och tätheten av jonkanaler kan fastställas med hjälp av immunohistokemi på ljuset och elektronisk mikroskopi nivåer 17,23. Detta tillvägagångssätt erbjuder också möjligheten att bestämma kanaltätheten i finkalibriga strukturer som är otillgängliga för patch pipetter. Men dessa kanaler kan vara i en tydlig funktionstillstånd 24 eller till och med inaktiva i jämförelse med dem som registrerats med patch-clamp-tekniker. Båda teknikerna är därför nödvändigt att få en fullständig bild av läget och egenskaperna hosjonkanaler i en specifik cellulär region 17. Med utvecklingen av spänningskänsliga färgämnen, har spännings avbildning använts för att undersöka utbredningen av APs och EPSPs i neuroner på flera platser 81. Som ett alternativ till dubbla patch-clamp inspelningar kan även implementeras denna metod för tunna dendriter som inte är tillgängliga för patch pipetter, men nödvändiggör noggrann kalibrering av signalen och medelvärdes.

Medan DA-neuroner i SN och ventrala tegmentområdet allmänt undersöks via somatiska inspelningar i fysiologiska och patofysiologiska sammanhang de funktionella egenskaperna hos deras dendriter är i stort sett okänd i båda villkoren. Patchning från dendriter har implementerats för nigrala dopaminneuroner av flera grupper med framgång 13,25,26 och förblir den metod som före att dissekera exciterbara egenskaperna hos dessa fina subcellulära strukturer 8. Dendritiska inspelningar ge en ytterligare möjskapen att granska effektiviteten och plasticitet av synaptisk transmission och plasticitet av dendritiska retbarhet 82,83.

Disclosures

Författaren förklarar att han inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Jag tackar Dr Vincent Seutin för hans ständiga stöd, Christ Gillissen och Laurent Massotte för utmärkt tekniskt stöd, Dr. Jean Defourny och Sandra Ormenese för råd med konfokalmikroskop, Dr Jacques Destine för gåvan av den andra Axopatch 200B förstärkare, GIGA-Imaging plattform för att dela konfokalmikroskop och Imaris programvara och Dr Stephen Freeman för kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från de belgiska FRS - FNRS (U.N002.13 och T.N0015.13) och publiceras med stöd av den belgiska University Foundation (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

Neurovetenskap dendrit patch-clamp dubbla inspelningar cell-anslutna biocytin märkning neuronal morfologi substantia nigra dopaminerga neuron jonkanal
Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter