Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Metastaser til sekundære områder som lunger, lever og bein er en traumatisk hendelse med en dødelighet på ca 90% en. Av disse områdene, er det lunge den mest vanskelig å vurdere ved å bruke intra optisk avbildning på grunn av sin lukkede posisjon inne i legemet, skjøre natur og vital rolle i å opprettholde riktig fysiologi. Mens kliniske modaliteter (positronemisjonstomografi (PET), magnetisk resonans imaging (MRI) og computertomografi (CT)) er i stand til å tilby ikke-invasive bilder av dette vevet, de mangler den oppløsningen som er nødvendig for å visualisere de tidligste seeding arrangementer, med en enkelt piksel som består av nesten tusen celler. Aktuelle modeller av metastatisk lungesykdom seeding postulat at hendelser like etter en svulst celle ankomst er deterministisk for overlevelse og påfølgende vekst. Dette betyr at sanntidsintraavbildningsverktøy med enkelt celle oppløsning 2 er nødvendig for å definere de fenotyper av seeding cells og teste disse modellene. Mens høy oppløsning optisk avbildning av lungen har blitt utført ved anvendelse av forskjellige ex vivo preparater, disse eksperimentene er typisk enkelt tids-punktprøvene, og er utsatt for artefakter og eventuelle feilaktige konklusjoner etter den dramatisk endret omgivelsene (temperatur, overflod, cytokiner, etc. ) som følge av fjerning fra brysthulen og sirkulasjonssystemet 3. Nyere arbeider har vist at time-lapse intra optisk avbildning av det intakte lungen blir mulig ved hjelp av en vakuum stabilisert bildevinduet 2,4,5 har imidlertid typisk bilde ganger vært begrenset til omtrent 6 timer. Her beskriver vi en protokoll for å utføre langtidsintra time-lapse avbildning av lungene anvendelse av et slikt vindu i løpet av en periode på 12 timer. Time-lapse bildesekvenser som oppnås ved hjelp av denne metoden gi visualisering og kvantifisering av celle-celle interaksjoner, membran dynamikk og vaskulær perfusjon i lungene. Vi videre describe et bildebehandlingsteknikk som gir en uhørt klar utsikt til lunge microvasculature.

Introduction

Høy oppløsning intra optisk avbildning har vist seg å være avgjørende for å forstå mange biologiske prosesser, slik at enkelt-celle og sub-cellulære parametre som skal måles og kvantifiseres. I kreftforskning har intravital avbildning av tumor og stromale celler førte til oppdagelsen av mange microenvironmental interaksjoner 6-11 som bare er til stede i det intakte dyr.

Oppdagelser om microenvironments forbundet med intravasation og spredning av kreftceller i brystkreft ved hjelp av enkelt celle oppløsning optisk imaging in vivo har selv ført til nye markører for prognose og behandlingsrespons hos brystkreftpasienter 12-16. De beste bildeteknologi tilgjengelig for visning dypt inne intakte indre vitale organer er de kliniske modaliteter (MRI, PET, CT) som tilbyr utmerket utsikt over hele organet og kan avsløre sykdommer selv før de produserer kliniske symptomer. De er ikke i stand, hsom fører til, for å avsløre de tidligste stadier av metastasering og de cellulære mekanismer som driver tumorutvikling på grunn av deres mangel på enkeltcelle-oppløsning. Etter den tid lungemetastaser er synlige i disse modaliteter, de er godt etablert og voksende. Gitt den anslår at 90% av disseminerte tumorceller som kommer til lungen heller ikke overlever 17 eller innledningsvis forbli hvil 18, og den observasjon at de kommer langt tidligere enn tidligere antatt 19, å avbilde de tidligste trinnene for ankomst og overlevelse blir avgjørende for å å forstå prosessen med metastatisk såing og tilbakefall av tumorvekst ved fjerntliggende områder.

Utføre disse observasjonene i lungen har vist seg svært vanskelig imidlertid; de aller fleste imaging studier har benyttet ex vivo eller eksplantering preparater 20-23, som bare gir et blikk inn i lungene ved enkelt tidspunkter. Selv om disse preparatene kan gi oss nyttig infobekreftelse, de gir ikke en fullstendig forståelse av samspillet, årsak og virkning relasjoner, og dynamikken som oppstår mellom de ulike komponentene i mikromiljøet. Mangelen på en skikkelig sirkulasjonssystemet (og samtidig ubalanse av homeostase) og frakobling fra resten av kroppens immunsystem gjør det ønskelig å validere konklusjoner som disse preparatene genererer i intakt vev in vivo.

Mange grupper har utført intra avbildning av det intakte lunge 2,4,5,24-33 med Wearn og tysk å være den første til å kirurgisk eksponere pleural lag 24 og Terry den første til å utnytte en implanterbar bildevinduet 25.

Høy oppløsning i lungen er sterkt hindret av lunge konstant bevegelse og flere teknikker har blitt utviklet for å overvinne denne begrensningen. Wagner og Filley 27 studerte den naturlige bevegelse av canine lungeog utviklet sin kirurgiske protokollen til å finne sin implantert vindu over en relativt stasjonær region mens Wagner utnyttet vakuumet i vinduet hans kirurgisk forberedelse til å immobilisere vevet 28. Siden den gang har en rekke teknikker blitt benyttet til bilde lungene inkludert: bronkie klem, sekvensiell apnea og gated bildebehandling, oversamples oppkjøp, liming av lungen lapp og vakuum 34. Hver av disse har sine fordeler og ulemper, og ingen teknikk har dukket opp som bedre enn en annen 34. For eksempel, bronkie klem og sekvensiell apné endre den normale utveksling av gasser i lungen, og kan føre til atelektase. Lukket bildebehandling og oversamples oppkjøpet ikke lider av disse ulempene, men krever høy hastighet eller spesialisert tenkelig utstyr ikke allment tilgjengelig. Endelig er både liming av lungen og vakuumteknikken unngå begge de ovennevnte ulemper, men kan utvise skjærkraft indusert skade hvis behandling er ikke takno. I de senere år har vakuum vinduet blitt miniatyrisert og tilpasset for bruk i mus ved hjelp av konfokal mikroskopi og multiphoton 4,5,33 og utmerket høy-oppløsning avbildning er blitt oppnådd 2. Tabell 1 oppsummerer denne rike historie og fremhever de papirer som beskriver nye fremskritt i bruk av intra lunge bilde vinduer.

Denne protokollen beskriver bruk av utvidede time-lapse multiphoton intravital mikroskopi av bildet metastaser i lever, lunge intakt med den høyeste subcellulære mulig oppløsning. Bildene er kjøpt for opp til 12 timer ved hjelp av en multiphoton mikroskop utstyrt med en høy numerisk apertur objektiv og flere fotomultiplikatorrør (PMT) detektorer. Transgene musemodeller anvendes for å fluorescerende merke opprinnelige makrofager sammen med fluoriserende høy molekylvekt, dekstran og fluorescerende protein transfekterte tumorceller (for å merke vaskulaturen og tumorceller hhv støttevalseney). Selv om dette valget av fluorescerende merkede celler muliggjør visualisering av tumorcelle-endotelial celle-makrofag-interaksjoner og dynamikk, vil denne protokollen fungere for en hvilken som helst stamme av fluorescerende eller ikke-fluorescerende mus. Etter oppkjøpet blir rest drift bevegelse (hvis noen) elimineres ved hjelp av en Fiji plugin 35,36 og egendefinerte makroer tid gjennomsnittlig vaskulær kanal for å eliminere blinkende forårsaket av umerkede sirkulerende blodceller.

Selv om denne protokollen fokuserer på avbildningsmetastase, de teknikker som er anvendbare for mange andre biologiske prosesser observerbare med høy oppløsning encellet avbildning i lungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert godkjennelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Generering fluorescensmerkede musemodell og tumorceller

  1. Fremstille 100 ml 0,1% (w / v) bovint serumalbumin / fosfat-bufret saltvann (BSA / PBS) buffer ved å blande 0,1 g av BSA med 100 ml PBS.
  2. Forbered fluorescensmerkede tumorceller ved stabil transfeksjon.
    MERK: Her bruker vi E0771-LG-celler, en svært metastatisk derivat av E0771 muse brvstadenokarsinom celler 37 som ble isolert fra metastatiske svulster utviklet i lungene av C57BL / 6 mus injisert intravenøst med foreldre E0771 celler 38.
    1. 24 timer før transfeksjon, plate 1 x 10 5 EO771-LG-celler på en 60 mm vev kultur tallerken på 2 ml av antibiotic frie 10% FBS (føtalt bovint serum) DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium) og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. På tidspunktet for transfeksjon, inkuber 2 pg av det fluorescerende protein vektor med 10 ul av transfeksjon-reagens i 30 minutter før tilsetning av 190 ul av redusert serum media.
    3. Vask EO771-LG-celler med Dulbeccos fosfatbufret saltvann (D-PBS) én gang og legge transfeksjon mix forsiktig.
    4. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 6 timer.
    5. Vask de transfekterte cellene og kultur i 2 ml komplett DMEM (10% FBS, 1 mM pyruvat, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) i 2 dager.
    6. Vask cellene med 2 ml steril PBS, tilsett 500 ul av 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C.
    7. Samle cellesuspensjon og blandes med minst ett volum av komplett DMEM og spinne ned ved 280 x g.
    8. Resuspender cellene i 1 ml komplett DMEM og utvide cellekultur inn i10 cm vev kultur parabolen.
    9. Starte utvalget av transfekterte celler ved tilsetning av 700 ug / ml G418 selektive antibiotikum til 8 ml komplett DMEM og kulturen i en uke, endring av medium hver tredje dag.
  3. Berike fluorescerende populasjonen fra transfekterte celler som har vært under seleksjon i G418 ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) 39,40.
    1. Vask cellene med 5 ml PBS og tilsett 1,5 ml av 0,25% trypsin.
    2. Inkuber i 2 minutter ved 37 ° C og blandes med minst ett volum av komplett DMEM.
    3. Samle cellesuspensjon og spinne ned ved 280 xg og re-suspendere celler i 1 ml steril 0,1% (vekt / volum) BSA / PBS-buffer.
    4. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 pm sikt og juster volumet til 1 ml med 0,1% BSA / PBS-buffer for sortering.
    5. FACS-sortere 10% smarteste befolkningen basert på fluorescens spektrum bruker FACS sorter 41.
    6. Kultur de sorterte celler for en uke under utvalg (700 ug / ml G418 i fullstendig DMEM).
    7. Reselect fluorescerende merkede celler ved flowcytometri ved å gjenta trinn 1.3.1 til 1.3.6 igjen.
    8. Etter en andre runde med utvelgelse, trypsineres, filter og re-suspendere celler i 0,1% BSA / PBS som beskrevet (trinn 1.3.1-1.3.4). Juster konsentrasjon for å 2 x 10 6 celler / ml for enkeltcellesortering inn i 96-brønners plater ved bruk av FACS-sorter.
    9. Forbered 3-5 96 brønners plater med 100 ul komplett DMEM for samlingen. For å forbedre overlevelse etter sortering, tilsett 100 mL av filtrert dyrkningsmedium fra retter der EO771-LG-celler ble dyrket 42.
    10. Etter sortering av cellene i 96-brønners plater, returnerer celler til dyrking i 2 dager (37 ° C, 5% CO2).
    11. Identifisere brønner med levedyktige enkelt kloner ved undersøkelse under en invertert mikroskop med 5x forstørrelse.
    12. Trypsineres og utvide levedyktige kloner og fryse celler for backup.
      1. Vask brønner med grpå grunn av kloner med 100 ul steril PBS. Tilsett 50 ul av 0,25% w / v trypsin og inkuberes 2 minutter ved 37 ° C. Tilsett 50 ul komplett DMEM og overføres til sterile V-bunn eller rund bunn 96-brønners plate for å spinne ned ved 280 xg i 5 minutter.
      2. Resuspender celler i 100 ul av 700 ug / ml G418 komplett DMEM og plate hver klon i 12-brønners plater. Legg 400 mL av komplett DMEM med G418 og kultur til confluent.
      3. Vask brønnene med 500 ul PBS, tilsett 100 ul av 0,25% trypsin og inkuberes 2 minutter ved 37 ° C. Tilsett 100 komplett DMEM og spinne ned i 5 min ved 280 x g. Resuspender cellene i 100 pl av komplett DMEM med G418 og plateceller i 6 brønners plater inntil sammenflytende.
      4. Når konfluent, trypsineres celler, spinne ned og resuspender i 10% DMSO i FBS å fryse celle aksjer.
      5. Hold 1/10 av cellesuspensjoner i kultur ved plating dem i 100 mm vevskulturstudier retter for evaluering av sin metastatiske potensial.
  4. Test metastatisk potensial av utvalgte kloner.
    1. Trypsineres og re-suspendere celler i saltvann til en konsentrasjon på 2,5 x 10 6 celler / ml og injisere 200 ul inn i C57BL / 6 mus intravenøst gjennom halevenen.
    2. Etter 2 uker, samle lungevev som tidligere beskrevet 23 og kvantifisere tumorbelastning ved overflaten count eller stereological metode 43. Velg kloner med høy metastatisk potensial for intra bildebehandling.
  5. Hev MacBlue (en myeloid promoter kjører cyan fluorescerende protein (CFP) uttrykk (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) reporter mus 44.
    MERK: Vanligvis er mus mellom 8 og 12 uker som brukes, men mus så tidlig som 7 og så sent som 20 uker har blitt testet for å fungere også.

2. multiphoton mikroskop Set up and Imaging Forberedelse

MERK: Selv om denne protokollen kan utføres på en hvilken som helst multiphoton mikroskop, systemet som brukes for å skaffe data som er vist i denne protokollen er blitt beskrevet tidligere i detalj 45.

  1. Slå på alle mikroskop og laser komponenter, inkludert to-foton-lasere og detektorene i minst en time forut for den ønskede avbildnings tid.
  2. Like før operasjonen, måle kraften i lyset innspill til mikroskopet ved å plassere hodet av den optiske strømmåleren i strålebanen like før mikroskop og justere laser slutten hulrom speil knotter inntil maksimal lysintensitet på 880 nm leses på optisk strømmåleren.

3. Vakuumsystem Sett opp

  1. Lim dekkglass i bildevinduet (Supplemental Figur 1) med cyanoacrylate. La det være minst 4 timer for limet tørke helt.
    MERK: Dette trinnet kan også gjøres på forhånd.
  2. Skjær 100 ul pipettespissen ved den første linje fra den lille åpningen, og koble det uslipte enden til den tynne vacuum slange.
  3. Kople vakuumsystem i henhold til figur 1 og figur 2 et brev.
  4. Med vakuum på, og den åpne ende er blokkert, justere vakuumregulatoren for <3 hPa.
    MERK: Slutt justering av vakuumnivået vil bli utført ved observasjon av blodkar in vivo.
  5. Bruke en tynn film av petroleum fett til undersiden av avbildningsplaten for å hindre at objektivlinsen nedsenking medium fra å bli kjempe bort av avbildningsplaten.
  6. Plasser bildeplaten på mikroskopet scenen.
    MERK: tilpasset bildeplate (Supplemental Figur 3) er et ark med 1/8 "tykk aluminium maskinert både for å passe i den fasen innsats plass og med et gjennomgående hull i midten for å holde bildevinduet.
  7. Sett vakuum vinduet inn i avbildningsplate med dekkglass ned.
  8. Sterilisere alle overflater og instrumenter, inkludert bilde scenen plate, og bildebehandling seierdow med 70% etanol.
  9. Koble den avskårne enden av pipetten tips til vakuum vinduet og tape slangen ned til bildebehandling plate.
  10. Ta målet nær bilde vinduet og plassere en stor dråpe vann mellom objektiv og dekkglass.
  11. Pass på at det ikke er noen lekkasjer fra dekkglass ved å blokkere den sentrale åpningen av vakuum vinduet og verifisere at vanndråpen mellom objektiv og dekk ikke blir aspirert.
    MERK: En gammel stil mus ballen plasseres over vinduet er nyttig for å blokkere den sentrale åpningen.

4. Surgery

  1. Forbered sterile kirurgiske området.
    1. Plasser alle instrumenter innen rekkevidde. Sterilisere alle overflater og instrumenter, inkludert kirurgiske området, og kirurgiske verktøy med 70% etanol.
  2. Knyt en 3 tommers lengde på 2-0 sutur til kateteret, ¼ tomme over fôring med en dobbel knute.
  3. Forbered halen vene kateter folgende den publiserte protokollen ved Harney et al. 46.
  4. Ved hjelp av en infrarød (IR) varmelampe, varme dyr i buret for ~ 5 minutter for å øke blodstrømmen i halevenen, og for å hjelpe til kateterinnførings. Det anbefales å holde dyret varmet til fysiologiske temperaturer i hele den kirurgiske prosedyren ved hjelp av enten en varmelampe eller en oppvarming pad.
  5. Bedøve dyret med 5% isofluran og kontrollere at det ikke er noen respons på en tå klype.
  6. Påfør ophthalmic salve til øynene til dyret.
  7. Påfør hårfjerningskrem lotion for 10-30 sek å fjerne hår fra venstre side av dyret; fra midtlinjen av brystet til ¼ av ryggen og fra armhulen til like under brystkasse.
  8. Rengjør eventuelle overskytende lotion og sterilisere hud med 70% alkohol.
  9. Fest en steril sprøyte fylt med PBS til halevenekateter og sette inn og tape på plass etter den publiserte protokoll fra Harney et al. 46. Pass på at tapen er sikkert levd opp til nålen seg selv og er ikke gratis i gapet mellom halen og tape.
  10. Intubere mus etter enten den protokoll som er publisert av Das et al., 47 eller ved IL et al. 48
  11. Slå på ventilator og sett den til å levere 135 pust per minutt og 200 mL av isofluran oksygen blanding.
  12. Koble tracheal kateter til ventilator.
  13. Flytt musen til det kirurgiske området. Vær svært forsiktig ikke for å løsne kateteret.
  14. Bind 2-0 sutur rundt snuten av musen under fremre tennene.
  15. Tape kateteret til snuten.
  16. Tape venstre forbena til kateteret for å holde den ut av operasjonsområdet.
  17. Senk isoflurananestesi til et vedlikeholdsnivå på 2,5% og bekrefte det er ingen respons på en tå klype.
  18. Bruke skarp saks, fjerne en cm 2 av huden over venstre brystveggen.
  19. Lift tHan melkefettpute og cauterize utsatte blodkar med kirurgi penn.
  20. Resect fettpute ved å kutte med skarp saks.
  21. Fjern muskelen laget ned til brystkassen ved å kutte med skarp saks. Pass på å ikke kutte aksillær vene kjører på bunnen av forbena.
  22. Bruk pinsett til å ta tak og løfte den 6. ribben. Ved hjelp av de skarpe sakser som holdes ved en grunn vinkel (~ 5 °) skjæres ribben nær kanten av åpningen i huden. Vær svært forsiktig så du ikke berører den eksponerte lungevevet.
  23. Utvide åpningen i brystveggen for å avdekke hele lungen lapp ved å fjerne fire sammenhengende ribbeina.
    Merk: Hold åpningen minst 5 mm fra brystbenet for å unngå hjerte.
  24. Løft forsiktig musen ved å ta tak i halen og tracheal kateter og flytte musen til mikroskopet bildebehandling scenen.
  25. Med vakuum av, fylle kammeret i vakuum vindu med PBS.
  26. Snu musen og plassere den eksponertelunge over vakuumbildevinduet.
  27. Sakte skru på vakuum til ca 3-5 inches av kvikksølv ved hjelp av kuleventil.
  28. Plasser en begrensende sele laget av silkepapir brettes i to to ganger over brystet av musen og tape til scenen plate som vist i Supplemental Figur 2.
  29. Clip låret sensor av pulsoksymeter til dyrets øvre del av låret og starte programvaren.
  30. Plasser miljøkammeret på scenen og slå på varmen for å holde musen i en fysiologisk temperatur.
  31. Redusere nivået av isofluran til 1-1,5% for å opprettholde anestesi og opprettholde blodstrøm.

5. intra Imaging

  1. Ta med 25 x 0,95 numerisk apertur (NA) objektiv nær dekkglass og legge til en stor dråpe vann mellom dem.
  2. Bruke epifluorescence modus, se FITC kanal og bringe lungevevet i fokus.
  3. Hvis det ikke gjøres før operasjonen, jegnject tumorceller via halevenekateter.
    1. Frakoble PBS sprøyten fra halevenekateter.
    2. Laster en steril sprøyte med 100 mL av tumorcellesuspensjon (2 x 10 7 celler / ml i PBS maksimum).
      MERK: Dette trinnet kan gjøres på forhånd for å studere kreftcelle ankomst til lungen ved forskjellige tidspunkter.
    3. Koble sprøyten med tumorceller på halevenekateter.
    4. Sakte injisere tumorcellene i halevenen.
    5. Koble fra sprøyten med tumorceller fra halevenekateter.
    6. Koble PBS sprøyten i halevenekateter.
      MERK: identifisere plasseringen av alle tumorcellene før injisering av dekstranet som det blir vanskelig å skille tumorcellene fra dekstranet signal via okulær etter injeksjonen.
  4. Finn tumorceller til bilde
    1. For bildebehandling enkelte kreftceller, finne alle kreftceller og registrere sine steder med the multi panel av programvaren.
      1. Finn alle felt av utsikt til bilde ved å observere tumorceller i mikroskop okularet.
      2. I programvaren, bytte til multipanelet ved å klikke på Multi-Point-knappen, og lagre plasseringen av cellen ved å klikke på Legg til posisjon-knappen.
    2. For mosaikk bildebehandling, finne opprinnelsen til mosaikk og angi bilde koordinater
      1. Finn en stilling i øvre venstre hjørne av strukturen for å bli tatt.
      2. Zero x-, y- og z-koordinatene til scenen ved å trykke på "Zero" -knappen på scenen kontrolleren.
      3. Last opp den aktuelle listen over mosaikk koordinater ved å klikke på "Last ned" knappen og velge en liste.
        MERK: En liste eksempel for en 2 x 2 mosaikk med en 20% overlapping av en 500 um synsfelt ville være: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400 400).
  5. Fjern sprøyten wed PBS i halevenekateter og erstatte med den sprøyten som inneholder dekstran.
  6. Injiseres sakte opp til 100 ul av 20 mg / ml 155 kDa rhodamin-dekstran ble oppløst i PBS til mus via halevenekateter, etterfulgt av injisering av 50 ul steril PBS for å spyle ledningen. Ikke innføre noen bobler inn i linjen. Når det er nødvendig, injiserer dekstran i det minste en time etter at kreftcelleinjeksjon, slik at det totale volum som administreres til musen ikke overstiger 4 ml / kg / time.
  7. Sett opp bildeparametere.
    1. Slå mikroskop for å multiphoton modus.
    2. Still zoomen til en faktor på 2X ved å klikke på knappen tidssignaler og oppdatering av Zoomfaktor feltet.
    3. Juster lasereffekt til ~ 10% (~ 10-15 mW ved prøven) ved å klikke på knappen detektorer og laser og deretter justere Tsunami Strøm glidebryteren til 10.
  8. Bilde hvert sted for å bekrefte tilstedeværelse av tumorceller og visualisere strømningen og integriteten til vasculature.
    MERK: Fartøyer skal se helt dynket med rennende erytrocytter og fluorescerende dekstran bør ligge innenfor skipene uten lekkasje til ekstravaskulære mellomrom. Omtrent 10 - 20 tumorceller forventes å være innenfor den klare åpning av vakuum vinduet.
  9. Juster startdybde på hvert sted som skal avbildes.
    1. For hvert sted, juster z posisjonen ved å rotere fokus knotten på scenen kontrolleren til bilde toppen bit av svulsten cellen.
    2. Plasser cellen i midten av synsfeltet.
    3. Klikk på Multipoint-knappen, klikk på plasseringen av synsfeltet for å markere den, og klikk på Legg fulgt av Slett-knappen for å erstatte cellens lagret posisjon i flerpunkts liste.
    4. Visuelt observere den relative lysstyrke av tumorcellen i hver posisjon.
  10. Lagre de nye plasseringer av hver av cellene ved å klikke på Lagre-knappen i Multipoint panelet end angi filnavn.
  11. For avbildning av enkelte kreftceller, plukke tre celler på ca tilsvarende lysstyrke og slette alle andre steder fra multi listen ved å klikke på deres plassering i listen og deretter klikke på knappen Slett.
  12. Klikk på knappen detektorer og laser og juster glidebryterne for PMT gevinst på de grønne og røde kanaler 45 slik at signalene er under metning.
  13. Juster glidebryteren for den blå kanalen 45 slik at makrofager vises cyan.
    MERK: Eventuelle andre harmoniske signal vises bare i den blå kanalen og kan skilles fra cyan makrofager ved å følge kanalen subtraksjon prosedyren tidligere beskrevet 45.
  14. Sett z-stack start dybde til 0 mikrometer og enden dybde til 24 mikrometer ved å flytte z scenen til stedet og klikke på Start og Slutt knapper hhv.
    MERK: Celler innen denne dybden vil bli visualisert med de beste signal tilstøy og oppløsning.
  15. Sett størrelse z skrittet til 3 mikrometer.
  16. Still inn bildeparametere følgende parametere tidligere beskrevet 45,49.
    1. For avbildning av enkelte kreftceller, klikker du på knappen tidssignaler og deretter inn 4 V inn zoomfaktor feltet (tilsvarende en zoomfaktor på 1,5 X), skriv tre inn i ramme gjennomsnitt feltet og klikk på Time-Lapse-knappen og skrive 10 i Time-lapse-feltet.
      MERK: Disse innstillingene vil få en ramme hver 3 sek.
    2. For mosaikk bildebehandling, klikker du på knappen tidsstyringssignaler og angi en zoomfaktor på 1,5 V (tilsvarer en zoomfaktor på 4X), skriv tre i antall ramme gjennomsnitt og klikk på Time-Lapse-knappen og skriv 10 inn i tids bortfaller tidsforsinkelse feltet.
      MERK: Disse innstillingene vil få en ramme hver 3 sek.
  17. Aktiver multi, z-stack og t-lapse bildemoduser ved å klikke på tasten.
  18. Trykk på Record-knappen for å hente bilder.
    IKKEE: Lung vev er svært delikat og utsatt for foto-skade. Hvis du etter tid lapse bildebehandling blodstrømmen stopper fotografert feltet, er mest sannsynlig laser for høyt og påfølgende avbildning av andre felt må gjøres på lavere effekt.
  19. Hver 30-45 minutter, langsomt injisere 50 pl PBS eller saltvann for å opprettholde hydratiseringen av dyret.

6. Eutanasi

  1. Øk isofluran til 5%.
  2. Holde dyret under 5% isofluran til 30 sek etter at det slutter å puste og fjerne dyret fra scenen.
  3. Utfør halshugging for å sikre fullstendig aktiv dødshjelp.

7. Bildeanalyse

  1. For enkelt celle bildebehandling eksperimenter:
    1. Laste ned bilder til Fiji og formatere dem som et Hyperstack.
    2. For hver z-skive i Hyperstack, spille tid lapse film og søke etter rest xy bevegelse. Hvis rest xy bevegelse blir funnet, gjelder plugin kalt StackReg 36 til stakken tileliminere bevegelsen.
  2. For mosaikk bildebehandling eksperimenter:
  3. Laste ned bilder til Fiji og sy dem sammen ved å åpne Mosaic Stikkmakro (Supplemental kodefil Mosaic Stikk) og legge inn informasjon om bildene som katalogen, filen basisnavn, antall x og y felt i mosaikk og antall skiver og tidspunkter.
    MERK: På grunn av hvordan Java tolker kataloger, må mappenavnene ha to backslashes som undermapper separatorer. På grunn av begrensninger i den innebygde plugin Parvise Stikking, må basen filnavn inneholder ingen streker.
  4. For å få et klart syn på grensene av blodkar, gjennomsnittlig sammen alle de tidspunkter for blod kanal inn et enkelt bilde og deretter gjenskape dette bildet som bakgrunn for hver ramme av filmen av de andre kanalene.
    MERK: Dette gjøres ved å kjøre den Utfør Blood gjennomsnitt for makro (kode Supplemental fil Utfør Blood av gjennomsnitt).

    5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere hva slags resultater som kan oppnås med denne metoden, injisert vi E0771-LG tumorceller merket med fluorescerende protein Clover i halevenen av MacBlue mus 44 ved varierende tidspunkter før operasjonen. Etter operasjonen ble 155 kD rhodamine merket dekstran injisert IV for å markere blodkar og time-lapse bildebehandling ble utført.

Når bildebehandling mus 24 timer etter injeksjon, enkeltceller er synlige på innsiden av blodkar, i samspill med makrofager og monocytter. Et eksempel på dette er vist i figur 2A (Supplemental Film 1). Her et enkelt optisk del av en enslig tumorcelle (grønn) 12 mikrometer dypt fast i lungene blodkar avbildes i løpet av fem timer og 20 minutter som det forbigående samhandler med en person bosatt makrofag (cyan). Blodkar er merket ved høy molekylvekt dekstran. Stabiliteten avbildebehandling er slik at sekvensiell z-stack avbildning av feltet kan være kjøpt og en 3-dimensjonal rekonstruksjon kan gjøres (figur 2B, Supplemental Movie 2).

Bruk av objekt innstillingene som er beskrevet i protokollen for mosaikk avbildning tillater avbildning av strukturer som er større enn en enkelt synsfelt. For eksempel, Figur 3 viser anskaffelse av en enkelt metastatisk lesjon, 12 dager etter injeksjon. Dette 5 x 5 mosaikk viser en 890 um synsfelt i løpet av 205 min ved 15 (figur 3A, venstre panel; Opplysning Film 3) og 25 um (figur 3A, høyre panel) under overflaten av lungen. Til tross for stort synsfelt gjør den høye oppløsningen på de underliggende rammer som utgjør mosaikk fangst av subcellulære hendelser som mitose av en enkelt celle som gjenspeiles av kromosom separasjon (Figur 3B, SupplementalMovie 4).

Intravaskulær injeksjon av en høy molekylvekt fluorescensmerkede dekstran resulterer i merking av de vaskulære hulrommet, men umerkede sirkulerende erytrocytter og leukocytter tilstoppe dekstranet. I de små kapillærene i lungene, er den fullstendig okklusjon som resulterer i en blinkende av dekstran signal og et tap av definisjonen av vaskulaturen grensene (figur 4, venstre; Opplysning Film 5). Den høye romlige stabilitet som tilbys av denne protokollen gir tid gjennomsnittsberegning av blodet kanal, uten uskarpheter, og dermed gjenopprette de midlertidige okklusjoner. De andre signalkanalene kan deretter legges over blodkar for å gi et klart bilde av fartøyet grenser (figur 4, høyre, Supplemental Movie 6).

Figur 1
Fig. 1: Oppbygging av vakuumsystemet huset vakuum utnyttes og satt til å definert nivå med en vakuumregulatoren. En fange kolbe forhindrer kontaminering av regulatoren og vakuumsystemet ved kroppsvæsker. Et tynt fleksibelt rør formidler vakuum til en pipettespiss kuttet for å passe inn i vakuumporten på bildevinduet. Den bildevinduet er passe inn i en innfelt spor i bildeplaten opprettholde sin posisjonelle stabilitet med hensyn til mikroskopet objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Single Cell Imaging i Lung (A) Still fra en time lapse film av en enkelt svulst celle i kapillær seng av lungene 24 timer etter halevenen.injeksjon. (Rød = blodkar, Grønn = tumorceller, Cyan = Makrofager) (B) Stabil bilde tillater tre dimensjon rekonstruksjon av bildedata over tid. Blodårene har vært tid gjennomsnitt for klarhet. (Rød = blodkar, Grønn = tumorceller, Blue = makrofager). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Stabilitet av Lung gir høy oppløsning, Stor-synsfelt Imaging i Lung ved sekvensiell Oppkjøp og sammensying av multippel lav forstørrelse Felt (A) 5 x 5 mosaikk som viser en 890 mikrometer synsfelt. en metastatisk lesjon i lungen 12 dager etter haleveneinjeksjon av tumorceller tatt på 15 mikrometer under den tette overflaten(Venstre panel). Høyre panel viser den samme metastatisk lesjon 25 mikrometer under lungene overflaten. (B) De enkelte høyoppløselige felt avsløre subcellulære prosesser som kromosom innretting (gule piler) og separasjon (røde piler) under celledeling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: intravaskulær injeksjon av fluorescensmerket med høy molekylvekt Dextran Marks lumen av vaskulaturen Bortsett fra når Umerket Erytrocytter og andre sirkulerende blodceller tilstoppe fluorescens signalet (A) okklusjon resulterer i en ufullstendig merking som beveger seg i tid som resulterer i en blinkende effekt skygging. fartøyet grenser. (B) Den høyeromlig stabilitet av vakuum-vinduet gjør at blodet kanalen for å være tid i gjennomsnitt, fylle i de midlertidige okklusjoner og tydelig definere fartøyet grenser. De andre kanalene er så kledde uten gjennomsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

År Først Forfatter / Siste Forfatter Dyr Kirurgi Type Imaging Merknader
1926 Wearn og tysk katter Brystveggen kuttet ned til pleural lag. Second åpning laget gjennom membranen ned til pleura for belysning. Bright-felt mikroskopi. Først "vindu" gjennom pleural veggen.
1939 Terry katter Ribs er skilt, en i. Vinduet implantert, luft fjernes fra thorax med vakuum. Binocular og huden mikroskop med polarisert lys. Først implantert optiske vinduet. Brukte vakuum for å trekke vev til vinduet.
1963 de Alva & Rainer Kaniner og hunder En eller to ribbene resected og en i. Vindu innsatt og sutureres til brystveggen. Skin ble stengt over vinduet og dyr tillatt å helbrede. Før bildebehandling, ble huden dissekert å eksponere vinduet. Brukte høyhastighets stroboscopic cinematography gjennom en lav mag (11X) objektiv. Først overlevelse vinduet.
1965 Wagner & Filley hunder Høyre forbena fjernet, en rib klipp og vindu innsatt og sutureres. Refleksjon mikroskopi med 22X objektiv. Først relativt bevegelse fri vindu uten vakuum.
Wagner hunder En Rib er resected, tre i. Vinduet implantert. Gjengeflens skruene på vinduet for å danne tetning til brystveggen. Lysfelt mikroskopi med høy forstørrelse 100X oljeneddyppingsobjektivet. Først vinduet for å bruke vakuum for å stabilisere vev bevegelse.
1992 Groh & Goetz kaniner En rib resected, 1,2 i. Vinduet implantert. Gjengeflens skruene på vinduet for å danne tetning til brystveggen. Vacuum brukt. Epifluorescent mikroskopi med 25X objektiv. Første gangs bruk av et vakuum vindu med epifluorescens.
1994 Fingar & Wieman rotter 2 ribs er resected, en i. Vindu implantert og sutureres til brystveggen og hud. Epifluorescent mikroskopi med 40X objektiv. Først overlevelse vindu i rotter.
2000 Funakoshi & Mitsui mus Hele brystveggen fjernet. Vakuum suge ring festet til høyre lunge. Konfokalmikroskopi med en 20X objektiv. Første bruk av vakuum vindu i mus.
2005 Lamm & Glenny rotter Hele brystveggen fjernes, ett i. Vinduet knyttet til lunge. Refleksjon og epifluorescent mikroskopi med en 20X objektiv. Første bruk av vakuum vindu i rotter.
2008 Tabuchi & Keubler mus 3 ribs er resected, anvendt plastfilm for å åpne for å tette hull i brystveggen. Air fjernet via intrapleural kateter. Epifluorescent mikroskopi med 20X objektiv. Først å bruke plastfilm for å forsegle åpningen i brystveggen.

Tabell 1: historisk oversikt over Develling av intra Lung Imaging Windows. Mange nye intralungebilde vinduer har blitt utviklet gjennom årene med den nyeste blir miniatyrisert for bruk i mus, syssels vakuum for stabilisering vev og oppnå høy nok oppløsning til å være i stand til å avsløre subcellulære detalj.

Supplemental Figur 1: Design Tegning av vakuum Imaging Window Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplemental Figur 2: Fotografier av Vacuum Setup Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplemental Figur 3: Design Drawing av Stage Plate Insert Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplemental Figur 1
Supplemental Movie. 1: Film av stillbilder i figur 2A (Høyreklikk for å laste ned).

Supplemental Figur 2
Supplemental Move to. Movie 3D rekonstruksjon vist i figur 2B viser ulike visningsvinkler og progresjon over tid (Høyreklikk for å laste ned).


Supplemental Movie 3:. Movie av 5x5 mosaikk vist i figur 3A ved 15 mikrometer under lungeoverflaten (Høyreklikk for å laste ned).

Supplemental Figur 4
Supplemental Movie 4:. Movie av en enkelt celle avbildet i figur 3B under mitose i lungene (Høyreklikk for å laste ned).

Supplemental Figur 5
Supplemental Movie 5: Movie av figur 4, venstre panel viser okklusjon og fsurring. (Høyreklikk for å laste ned).

Supplemental Figur 6
Supplemental Movie 6. Movie i figur 4, høyre panel viser utvinning av vaskulær definisjon etter blod i snitt (Høyreklikk for å laste ned).

Kode supplerende fil. Mosaic Stikking Klikk her for å laste ned denne filen.

Kode supplerende fil. Utfør Blood gjennomsnitt for Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Høy oppløsning in vivo optisk avbildning kombinert med fluorescensmerkede funksjonelle koder som proteiner og antistoffer har dramatisk økt vår forståelse av metastatisk kaskade. Det har gjort det mulig direkte visualisering og kvantifisering av enkelt-celle og sub-cellulære parametre i tumorceller, vertsceller og deres mikromiljø. Denne avbildning innenfor den primære svulsten har ført, for eksempel, til oppdagelsen av diskrete mikromiljøer som er støttende for enten vekst eller spredning invasjon 6,7. I tilfelle av invasjon, har in vivo avbildning avslørte den preferensielle rollen som ko-migrational streaming av makrofager og tumorceller i intravasation 7,50.

I videregående steder som lunge, forstå dynamikken i tumorcelle atferd på de tidligste stadiene av metastaser, inkludert pre-micrometastasis seeding scenen når single og små grupper av kreftceller kommer ogkommuniserer med blodkaret endotelet, vil bare oppnås ved hjelp av høyoppløselig optisk avbildning. Standard kliniske bildediagnostikk har oppløsningen er nødvendig for å visualisere enten den fine struktur av kapillaren sengen eller morfologien og interaksjonen av celler ved enkelt celle oppløsning. Imaging teknikker som presenteres i denne protokollen utføre denne utfordrende oppgave.

Intrabilde vinduer som de som er oppført i tabell 1 tilbudet en betydelig fordel fremfor ex vivo lunge forberedelser ved å opprettholde riktig lungefysiologi inkludert perfusjon, tilkobling til immunsystemet og tilbyr mer enn bare en statisk visning av mobilnettet dynamikk. Vakuumet stabilisert vinduer spesielt tilbud et nivå av vev stabilitet som gjør at oppkjøpet av svært registrerte bilder, slik at tredimensjonale rekonstruksjoner (figur 2B) og mulighet for stort synsfelt mosaikk imaging (Figure 3A). Sammen disse gir en rekke visninger av lungene, fra en histologisk typen lav forstørrelse utsikt som gir vev morfologi, til en sub mobil utsikt som kan avsløre kromosom separasjon og diskriminere sovende og dele tumorceller (Figur 3B). Flere oppkjøp kanaler tillate flere celletyper og deres samspill for å bli visualisert samtidig (figur 2A).

Mens protokollen tar litt teknisk innsikt, praksis og oppmerksomhet til noen kritiske trinn og poeng vil forbedre suksessen rate av prosedyren og bilde tider på opptil 12 timer kan forventes. Det er viktig å sørge for at lungevevet er godt sentrert over vinduet (trinn 4.25). Dette sikrer at vakuum påføres jevnt og fullstendig over i lungevevet (trinn 4.27). Unnlatelse av å sentrere vev vil resultere i bevegelse av vevet. Den begrensende sele (Supplemental Figur 2) brukes to redusere bevegelse indusert av innsnevring av interkostalrom muskler under den naturlige åndedrag dyret tar. Det bør være tettsittende over mus, men ikke komprimere brystet. For mye kompresjon legger press på alle lobene i lungene så vel som hjerte og resulterer i en redusert levedyktighet av musen. Hvis dekstran ikke er observert flytende i lungen blodkar etter injeksjon (trinn 5.8), er lungevev enten skadet av feil håndtering under kirurgi eller vakuumnivået er for høyt. Senking vakuumet ved 0,5 til 1 tommer Hg kan være forsøkt å se om strømmen er gjenopprettet. Dersom strømmen ikke er gjenopprettet, eller hvis det er strømning, men dekstran er observert extravascularly, lungevevet har blitt skadet i denne regionen og det vil være nødvendig å avbilde et annet synsfelt. Opprettholdelsen av riktig blodstrømning i bilde område er viktig for å sikre at riktig fysiologi skal måles. Ettersom oksygen tilføres til vev fra innsiden av alveolene og ikke gjennom vasculature, er usannsynlig iskemisk hypoksi. Likevel kan unperfused blodkar potensielt føre til endret oksygen / CO 2 nivåer, og vil også hindre sirkulerende leukocytter fra å nå vevet av interesse. Visualisering av strømmer erytrocytter kan benyttes som en indikator for den riktige lungefunksjonen. Lungevev er svært delikat og også utsatt for foto-skade. Hvis du etter tid lapse bildebehandling blodstrømmen stopper fotografert feltet, er mest sannsynlig laser for høyt og påfølgende avbildning av andre felt må gjøres på lavere effekt. Vi har funnet ~ 10-15 mW på prøven for å produsere tilstrekkelig skarpe bilder uten photodamage når du bruker enten GFP eller Clover (som har fire ganger gjennomsnittlig lysstyrke) transfekterte celler. Minstelysstyrkenivåer for de fluorescerende proteiner er svært avhengig av objektparametre og uttrykket nivåer i cellene og må prøves empirisk.

I denne protokollen, tumorceller merket med en lys cytoplasmic fluorescerende protein som gir et klart syn på cellekroppen og intracellulære områder som utelukker protein (dvs. kjernen). Makrofager er merket ved å benytte en transgen musemodell syngenisk til tumorcellene. Merking begge celletyper muliggjør visualisering av deres direkte interaksjon i sanntid. Den utvidede varighet bildebehandling tillater kvantifisering av hyppighet, varighet og omfang som kreftceller kommuniserer med makrofager i en fysiologisk relevant sammenheng.

Når utført riktig, kan denne prosedyren bevegelse gratis, multiple-kanal, høy oppløsning, encellede bildebehandling i intakt lunge i perioder på inntil 12 timer. Bruken av en høy numerisk apertur objektivlinsen som 25X 0.95NA og multiphoton muligheter for elektronisk zoom gir den høyeste oppløsningen optisk avbildning i lungen sett til dags dato.

Intravaskulært injisert fluorescerende, høy molekylvekt dekstran performs den doble rollen merking av vaskulære rommet og verifisere sin integritet. 155 kDa dekstran benyttes for å forhindre diffusjon gjennom interendothelial mellomrom. Ethvert tegn på mangel på vaskulær flyt eller vaskulær lekkasje til ekstravaskulære rom indikerer skader på vev på grunn av feil håndtering eller overdreven vakuum.

Endelig kan unike bildebehandlingsteknikker benyttes som kan dra nytte av den høye romlige stabiliteten av denne protokollen. Siden de umerkede erytrocytter og andre leukocytter utelukke fluorescerende dekstran når de passerer gjennom kapillærene, kan dette signalet gjennomsnitt over tid for å fjerne blinkende at de skaper. Dette gir en veldefinert riss av blodkar ikke er mulig på annen måte.

Begrensninger av denne teknikken inkluderer både invasiv kirurgi, noe som potensielt kompliserer bruken for studiet av sykdommer som svekker dyret (f.eks sent stadium metastatisk kreft,akutt sigdcelleanemi), og det faktum at operasjonen er terminalen som begrenser den brukes til en enkelt, enskjønt lang (opp til 12 timer), avbildning sesjon. Videre, gitt den lange varigheten av bildebehandling økten og den lave leverglykogen reserve av mus 51, glukose tilskudd kan gis for å unngå potensielle kilder til skjevhet i eksperimenter.

Denne protokollen kan potensielt bli modifisert med injiserbare fluorescensmerkede antistoffer, enten i stedet for eller i tillegg til dekstranet for å merke andre strukturer eller celletyper i sanntid. Dette vil utvide mulighetene for å analysere og dissekere svulsten mikromiljøet ved direkte visualisere kreftcelle-vertscelleinteraksjoner og dynamikk i sanntid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Tags

Cancer Research intra bildebehandling vakuum vindu multiphoton mikroskopi lunge time-lapse kreft biologi
Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T.,… More

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter