Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا

doi: 10.3791/54604 Published: November 18, 2016

Abstract

توضح هذه المخطوطة إدخال ميزات التوجيه خلية تليها التسليم المباشر للخلايا إلى هذه الميزات في bioink هيدروجيل باستخدام نظام صرف الآلي الآلي. تم اختيار bioink خاص لأنها تتيح الخلايا الرواسب نحو والشعور الميزات. نظام صرف bioprints خلايا قابلة للحياة في bioinks هيدروجيل باستخدام احداهما بمساعدة رأس الطباعة. ومع ذلك، من خلال استبدال رأس الطباعة مع قلم شحذ أو مشرط، ونظام صرف يمكن أيضا أن تستخدم لخلق العظة الطبوغرافية من خلال النقش السطح. حركة القلم يمكن برمجتها في الخطوات من 10 ميكرون في X، Y والاتجاهات Z. كانت قادرة على توجيه الخلايا الجذعية الوسيطة، التأثير عليهم لاعتماد الصرف ممدود في محاذاة مع اتجاه أخاديد "أخاديد نمط. ويمكن تصميم الزخرفة باستخدام البرمجيات بالتآمر في خطوط مستقيمة، دوائر متحدة المركز، وموجات جيبية. في إجراء لاحق، الليفيتوقفت الانفجارات والخلايا الجذعية الوسيطة في 2٪ الجيلاتين bioink، لbioprinting في احداهما مدفوعة قذف رأس الطباعة. ثم طباعة bioink تحمل الخلية باستخدام نفس الإحداثيات المبرمجة المستخدمة في الحفر. كانت قادرة على الإحساس والتفاعل مع الميزات محفورا كما يتضح من التوجه ممدود على طول اتجاه الأخاديد محفورا الخلايا bioprinted.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الزخرفة متعمدة من وضع الخلية تتيح تشكيل الثقافات التي تحاكي في الجسم الحي منظمة الخلوية 1. في الواقع، والبحث في التفاعل بين أنواع الخلايا متعددة يمكن أن يحصل على مساعدة تنظيم 2،3 وضع المكاني. معظم أنظمة الزخرفة تعتمد على إجراءات تعديل السطح لتعزيز أو منع التصاق الخلية مع خلية لاحقة ترسب السلبي. تقدم Bioprinting السيطرة المكانية والزمنية على توزيعات خلية 1. وبالإضافة إلى هذه الوظائف، وقد وصفت bioprinting باعتبارها وسيلة واضحة من الناحية الفنية وسريع وفعالة من حيث التكلفة لتوليد السقالات معقدة هندسيا 4. فإنه يستخدم تصميم البرمجيات الكمبيوتر ويسمح إدخال الخلايا في عملية التصنيع (4).

وقد نظم Bioprinting تصنيفها على أساس مبادئ عملها وفقا ليزر مقرها، على أساس النافثة للحبر أو قذف على أساس 4. وقد وصفت قذف bioprinting كما الواعدة لأنها تتيح للتصنيع التركيبات المنظمة من الأحجام ذات الصلة سريريا ضمن إطار زمني واقعي 4-6. يتم تنفيذ ذلك إما عن طريق الضغط الميكانيكي أو الخلفي قذف بمساعدة من تأثير الخلايا هيدروجيل bioink. في الطريقة المعروضة هنا، كان يعمل الضغط مرة أخرى. كما ذكرنا، يتم تسليم الخلايا في bioink cytocompatible. هذا bioink ينبغي أن تدعم إيصال الخلايا دون إنتاج إجهاد القص ضار، وتكون ذات اللزوجة الكافية للاحتفاظ سلامة التتبع المطبوعة، دون أن تنهار أو نشر (المشار إليها باسم "نزف الحبر") 7-10.

ومن المعروف أن تفاعل الخلايا مع سطحها ملتصقة في التأثير على سلوك الخلوية. تضاريس السطح يمكن التحكم في شكل الخلية، والتوجه 11، وحتى في النمط الظاهري. على وجه الخصوص، وقد ثبت تلفيق الأخاديد والقنوات للحثامتدت، مورفولوجيا ممدود على أنواع خلايا متعددة. تم العثور على اعتماد هذا التشكل للتأثير على النمط الظاهري للخلايا متعدد القدرات والمحفزة. على سبيل المثال، عندما الانحياز في الأخاديد، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) تظهر أدلة على التمايز نحو العضلية 12،13 وخلايا العضلات الملساء الوعائية اعتماد النمط الظاهري مقلص خلال الاصطناعية 10،14-17.

الخلية التوفيق بين القنوات أو الأخاديد يمكن أن تتولد على سطح البوليمر عبر عدد من الطرق، على سبيل المثال، عميق الحفر أيون رد الفعل، شعاع الالكترون الطباعة الحجرية، والطباعة بالليزر مباشرة، ليزر الفيمتو ثانية، ضوئيه والبلازما الحفر الجاف 18. هذه الطرق غالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وتتطلب أجهزة معقدة، ويمكن أن يكون مقيدا في شكل نمط إنشاؤها. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها لا مزامنة الزخرفة مع bioprinting وعدم السماح لcellularization فوري. مراقبة حركة coordinately لالآلينظام الاستغناء يمكن اتباع أنماط معقدة لترسب الحلول. نحن هنا لشرح كيف يمكن أن تستغل الحركة التي تسيطر عليها الميكروسكيل إلى خلق قنوات لتوجيه الخلية. ومرفق القلم شحذ أو مشرط لرأس الطباعة في مكان الحقنة قذف، ويمكن أن المعدات ثم احفر سطح البوليمر بتوجيه من البرنامج التآمر. يوفر طريقة براعة في تصميم نمط وينطبق على المواد البوليمرية التي يشيع استخدامها في الهندسة الحيوية مثل البوليسترين، PTFE، وpolycaprolactone. وكخطوة لاحقة لالنقش، وخلايا يمكن bioprinted مباشرة إلى الأخاديد خدش. كان bioink الجيلاتين المستخدمة هنا قادرة على حد سواء الحفاظ على التتبع وتسمح للخلايا المودعة ليشعر ملامح محفورا. وقد أظهرت الخلايا الجذعية الوسيطة bioprinted إلى أخاديد محفورة إلى استطال على طول لهم في خطوط متميزة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول استخدام الخلفي الضغط بمساعدة نظام صرف الآلي (الشكل 1A) باعتباره الحفر السطحية (الشكل 1B) وbioprinter القائم البثق (الشكل 1C) 10.

1. تعديل سطح البوليستيرين

  1. استخدام ورقة 1 مم البوليسترين منذ زراعة الأنسجة لوحات البوليسترين تميل إلى الرضوخ صعودا في الوسط، تخريب الاتساق ارتفاع كل من الحفر والطباعة.
    ملاحظة: كما لم يتم تعديل ورقة من البوليستيرين للالتصاق الخلايا، يتم إجراء العلاج البلازما.
  2. الأكسجين العلاج البلازما.
    1. أولا، حدد ضغط 2 بار على منظم للاسطوانة أكسجين مرتبطة إلى الجهاز البلازما. ثم تبديل آلة البلازما على وإدخال الشروط التالية في لوحة التحكم للجهاز: 150 W، 30 SSCM من الأكسجين، و 10 دقيقة (من أجل السلطة، وتدفق الغاز والوقت على التوالي).
    2. وضع substrat البوليسترينالبريد الى غرفة البلازما، وختم الباب واضغط على زر البداية على لوحة التحكم. نقع الأكسجين البلازما البوليسترين تعامل الركيزة في المصل البقري الجنين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل غسل ثلاث مرات 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).

2. أنماط البرمجة طباعة

  1. استخدام البرنامج لأول حفر السطح مع قلم أو المبضع.
    1. عند استخدام القلم، اضافة الى وجود إبرة النسيج 1.5 مم (من الداخل بعناية كبيرة) في فوهة حقنة صرف (5 أو 10 مل) حتى يصبح مثبتة والمضمون. في حالة استخدام مشرط، واختيار مشرط التعامل جولة بحيث يمكن تثبيتها في آلية المشبك الذراع الطباعة.
      ملاحظة: القلم يحفر أنماط منحني أفضل من شفرة المشرط.
    2. عندما تحاول أولا إلى وضع ترتيب bioprinted، رسم نمط المطلوب على ورقة الرسم البياني مع محاور مرقمة لتوليد تنسيق XY. ثم اناnput إحداثيات محفورا نمط / bioprinted في برنامج جداول البيانات (الشكل 2).
      ملاحظة: "النمط المطلوب" يمكن أن يكون في العديد من الأشكال مثل خطي، S الشكل، أو التعميم. ويتوقف الاختيار على النموذج التجريبي المطلوبة، مثل خطوط خطية متوازية للتمايز اللجان الدائمة لالعضلية كما هو موضح هنا. وتسمح وظيفة مبعثر الرسم البياني التصور للنمط مؤامرة المقترحة.
    3. فتح طباعة / الاستغناء عن البرنامج. حدد "البرنامج> إضافة برنامج" تليها "تحرير> إضافة نقطة" لإعداد البرنامج. تصدير x و y تنسيق القيم التي تم الحصول عليها من جدول البيانات إلى الطباعة / توزيع البرامج باستخدام "نسخ ولصق" وظيفة.
    4. معايرة "ض" ارتفاع الروبوت قبل كل المدى من أجل وضع فوهة القلم / طباعة على السطح.
      1. في المطبوعة / الاستغناء عن البرنامج، حدد الخيار "روبوت"، انقر على "تغيير الوضع و# 34؛ وتمكين خيار "الوضع التعليمي". وبمجرد اختيار، فإن هذه البرمجيات تتيح وظيفة "هرول" للروبوت.
      2. لهرول، أولا تهيئة الروبوت إلى موقعه الافتراضي عن طريق تحديد الأوامر التالية من شريط القوائم. "روبوت> ميكا تهيئة"، ثم حدد "روبوت> هرول". إدخال القيم العددية (مم) في "فتحات X و Y" اللازمة لوضع القلم بالضبط على أصل النموذج.
      3. بعد ذلك، إدخال قيمة عددية (مم) في "فتحة Z" لوضع القلم أو فوهة الطباعة في اتصال مع السطح ولكن لا المرن أو البادئة السطح. يتم تعيين هذه النقطة "Z" قيمة البداية.
        ملاحظة: عمق كل أخدود يمكن أن تختلف بسهولة باستخدام Z-ارتفاع النظام. وقد أثبت الأخاديد من 40، 80، و 170 ميكرون لقطع في سطح 1 مم صحائف البوليسترين سميكة (الشكل 4 والجدول 1).
    5. حدد عتعليمات rint لكل من تنسيق نقطة، أي "بداية الخط الاستغناء" لتحديد النقطة الأولى وبدء الطباعة، "الخط يمر" للدلالة على نقاط وسيطة و "نهاية الخط الاستغناء" للإشارة إلى الروبوت لإنهاء الطابعة قيد التشغيل.
    6. التواصل برنامج لالروبوت عن طريق تحديد الأوامر متابعة من شريط القائمة العلوية: "روبوت> إرسال C & T البيانات".
    7. بدء تشغيل / طباعة الحفر، عن طريق تغيير الروبوت إلى وضع "تشغيل". هل هذا عن طريق اختيار "روبوت> تغيير الوضع> تبديل وضع تشغيل" من شريط القائمة العلوية.
    8. بدء إجراء الطباعة عن طريق الضغط على زر "البدء" الأخضر على وحدة الروبوت موزع.

3. إعداد وطباعة الجيلاتين Bioink التي تحتوي على خلية

  1. حل 2٪ الجيلاتين في الحد الأدنى الضروري المتوسطة ألفا المتوسطة (αMEM) (تستكمل مع FBS 10٪ و 2٪ مضاد حيوي / antimycotجيم) عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإعداد الحلول bioink.
  2. قبل ثقافة البروتين الأحمر نيون معربا عن الخلايا الجذعية الوسيطة (RFP-اللجان الدائمة) إلى 70٪ التقاء في أطباق زراعة الأنسجة 10 سم باستخدام αMEM / 10٪ FBS. الافراج عن خلايا تعلق في تعليق عن طريق إزالة المتوسطة وطلاء مع 1X حل التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. resuspend الكرية خلية في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 1X والاعتماد على كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  4. بعد السماح للbioink ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، وتخلط بلطف في حجم كاف لتعليق طلب تقديم العروض-اللجان الدائمة في bioink لتحقيق تركيز النهائي من 5 × 10 6 خلايا مل -1.
  5. صب bioink تحمل الخلية إلى حقنة الطباعة مع فوهة مختومة. هدئ حقنة تحميلها إلى 4 درجات مئوية وذلك لتحقيق اللزوجة للطباعة.
  6. وضع حقنة تحميلها على المؤتمتةنظام صرف الآلي وإرفاق خطوط الضغط الجوي. إزالة محقنة لور ختم وإرفاق فوهة الطباعة.
  7. بثق bioinks cellularized إلى خطوط رقيقة باستخدام 0.05 ميجا باسكال الضغط مرة أخرى، في 5 ملم / ثانية سرعة الكتابة من حقنة 10 مل عبر 27 إبرة G / فوهة (مدبب أوصى خلال أسطواني) على سطح فيلم البوليسترين، بعد ترسب مبرمجة مسبقا النمط هو موضح في الخطوة 2.1 لوضع bioink cellularized على الأخاديد قبل محفورا.
  8. بعد مرور فترة الحضانة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، إضافة 10 مل وسائط النمو (تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية)، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة (للسماح للخلايا ليشعر ويتفاعل مع الميزات محفورا) قبل عرض باستخدام مجهر مضان مقلوب في 10X التكبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

توضح نتائج ممثل أن احداهما بمساعدة نظام صرف الآلي يمكن أن تستخدم بمثابة bioprinter القائم على قذف لأداء كل من الحفر على سطح والطباعة bioink (الشكل 1). ويمكن استخدامه لتوليد أخاديد محفورة في سطح البوليمر، وبعد ذلك طباعة bioink تحمل الخلية مباشرة إلى ميزات (الشكل 1 B و C).

يتم تحديد كل من الحفر والطباعة من قبل الإحداثيات مبرمجة (الشكل 2) مدخلات الطباعة / توزيع البرمجيات التي تمكن الطباعة الخطية، المنحنية وأنماط الشعاعية كما هو مطلوب لتطبيق (الشكل 3 AC). ضبط المحور Z تسمح للسيطرة على عمق الأخدود المحفور (الشكل 4 والجدول 1).

بعد استبدالالقلم مع رئيس هيدروجيل الطباعة، البرمجة التي نسقت الحفر يمكن استخدامها لتمكين نظام صرف الآلي لتقديم bioink تحمل الخلية مباشرة إلى أخاديد محفورة في أعقاب نفس التصميم (الشكل 3 D و E). كما يمكن أن يلاحظ في الشكل 5 ألف وباء، والخلايا الجذعية المصنفة من قبل bioprinting داخل bioink في نهاية المطاف الرواسب إلى السطح، والعقل واستطال على طول اتجاه الحفر في خطوط منفصلة. الخلايا المصنفة في مستنبت دون bioprinting الانحياز في اتجاه الميزات، إلا أنها تغطي كامل السطح (الشكل 5 C)، مما يثبت أن bioink يحد من الخلايا لتتبع المطبوعة. بدون ملامح محفورا، وخلايا المصنف في وسائل الإعلام ثقافة لا تظهر أي اتجاه أو محاذاة (الشكل 5 د).

شكل 1
فيقوإعادة 1: نظام صرف الآلي الآلي (A) تم تخصيص الجهاز مع إدراج قلم شحذ (المضمون في حقنة) المركزي لرأس الطباعة الذي يحفر حلقات متحدة المركز على شريحة البوليسترين (B). ويمكن بعد ذلك تحويل رأس الطباعة لبثق تحمل خلية الجيلاتين bioink، مع الضغط الخلفي بمساعدة قذف، والودائع على نمط محفورا سابقا (C). تم تعديل هذا الرقم من Bhuthalingam وآخرون. 2015 (10).

الشكل 2
ينسق التآمر س ص في برنامج جداول البيانات والاستيلاء على الشاشة الموضحة هنا يوضح أن س ص تآمر إحداثيات خلق نمط الموجة الجيبية كما هو مبين في الرسم البياني المؤامرة: الرقم 2. وكانت هذه الإحداثيات مدخلات البرنامج بالتآمر باستخدام نسخ / لصقوظيفة.

الشكل (3)
حفرت نمط تعدد إحداثيات المبرمج في البرنامج التآمر قادرة على حفر الخطية (A)، جيبية (ب) ودوائر متحدة المركز (C): الشكل (3). أخاديد محفورة في البوليسترين يمكن طباعتها مباشرة على مع bioink هيدروجيل خلال الخطوة اللاحقة (D) و (E). تم تعديل هذا الرقم من Bhuthalingam وآخرون. 2015 10.

الشكل (4)
الرقم 4: المحفور عمق الأخدود عمق الأخدود المحفور يمكن تنظيمها من قبل عنصر التحكم ض محور النظام صرفها. الصور (A) إلى (C) تظهر جهة نظر العامة و(D) إلى (E) تظهر المقطع العرضي. تم برمجة الروبوت لحفر السطح إلى عمق 40 ((A) و (D))، 90 ((B) و (E)) و 180 ميكرون ((C) و (F)). يتم عرض قربه من عمق مبرمجة وعمق محفورا الفعلي في الجدول 1. وقد تم تعديل هذا الرقم من Bhuthalingam وآخرون. 2015 10.

الرقم 5
الرقم 5: Bioink تسليمها الخلايا الجذعية الوسيطة و-اللجان الدائمة طلب تقديم العروض المطبوعة في bioink على أنماط محفورا يمكن الشعور والميزات كما يتبين من التشكل ممدود والمواءمة مع الأخاديد (A) و (B) مقارنة مع الخلايا المزروعة على. الميزات دون bioink (أي، في مستنبت) (C </ قوي>) وعلى سطح غير منقوشة (D). تم تعديل هذا الرقم من Bhuthalingam وآخرون. 2015 10.

عمق مبرمجة (ميكرون) عمق الأخدود المحفور (ميكرون)
40 35 ± 7
90 81 ± 6
180 175 ± 3

الجدول 1: مقارنة بين المبرمج مقابل عمق الحفر الفعلي على البوليسترين تم تعديل هذا الرقم من Bhuthalingam وآخرون 2015 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في خطوة حاسمة من هذا الإجراء هو التسليم bioprinting الفعلي للخلايا الجذعية بأنها عملية يجب أن تسمح الترسيب الخلية إلى الميزات، طباعة بدون تنتشر bioink / النزيف، وتقديم الخلايا دون القص موت الخلايا التوتر ولا يؤدي التمايز نحو النسب غير المرغوب فيها.

إذا فشلت المحاذاة خلية من المتوقع أن يحدث، ثم اللزوجة bioink ينبغي تقييم لمدى ملاءمتها للطباعة. من المهم أن bioink يسمح للخلايا الرواسب على سطح البوليمر نمط. تركيز البوليمر bioink يمكن تخفيض أو زيادة درجة الحرارة (تصل إلى حد أقصى قدره 37 درجة مئوية)، للحد من اللزوجة وتعزيز الترسيب الخلية. ومع ذلك، قد يسبب هذه التخفيضات في bioink لنشر / تنزف آخر الطباعة. هنا نقترح استخدام 2٪ الجيلاتين (ث / ت) الذائب في برنامج تلفزيوني 1X. إذا ظهر تركيز خلية ما بعد الطباعة خفض، ثم إجهاد القص الناجمة عن الطباعة قد تعرض للخطرالجدوى من الخلايا المطبوعة 7. فحص الخلايا في bioink قبل وبعد الطباعة باستخدام فحص جدوى مثل تفعيل ريسازورين fluoresence 7. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت الخلايا الجذعية bioprinted الاتصال على السطح ولكن لا محاذاة، ثم أنه من الممكن أن إجهاد القص أثناء الطباعة انخفض multipotency من قبل مما ادى الى مسار التمايز غير مرغوب فيها. آخر الطباعة stemness يمكن تقييمها من خلال تحليل مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) باستخدام علامات الخلايا الجذعية مثل CD 29 10،19،20. إذا تبين أن إجهاد القص هو وجود آثار ضارة على خلايا، ثم اللزوجة الطباعة bioink يمكن تخفيض بإضافة أو استبدال البوليمر bioink مع القص رقيق واحد، مثل الجينات، Pluronic F127، حمض الهيالورونيك، الصمغ جيلان، ميتاكريليت الجيلاتين أو أكسيد 19، 21-25 البولي ايثيلين.

وأخيرا، والجوانب الأخرى التي يمكن أن يكون الأمثل تشمل احداهما الطباعة، كثافة الخلية bioink،وفوهة قطرها. احداهما يتطلب الأمثل لاللزوجة من bioink ويمكن تغيير للحصول على أثر منقطع منفصلة. وهناك تركيز خلية عالية قد تزيد من لزوجة bioink ويسد رأس الطباعة. ومع ذلك، فإن هذه العملية قذف لا تسمح للطباعة من كثافة الخلية أعلى نسبيا من الطرق bioprinting أخرى 26،27. ينبغي النظر في اختيار قياس فوهة الطباعة منذ فتحات صغيرة قطرها يمكن أن تنتج أي أثر أدق ولكن سوف تكون عرضة للانسداد. تم العثور على فوهات مدبب إلى وظيفة أفضل منذ نفس معدل التدفق يمكن التوصل إليها فوهة أسطواني ولكن بسعر أقل إجهاد القص وبالتالي تحسين بقاء الخلية 28.

احداهما ساعد طريقة الترسيب، كما يشار إلى bioprinting قذف، وقرار أقل من نهج الطباعة الخلايا الأخرى مثل الحبر النفاث ومنهجية ليزر بمساعدة بسبب الحد الأدنى للطول الخطوة برمجة ونشر وEMERGجي bioink. ومع ذلك، يتم تعديل المعدات احداهما قذف معظم بسهولة لإدراج قلم النقش. طرق أخرى لإنتاج الأخاديد مثل الزخرفة الدقيقة باستخدام ضوئيه تليها PDMS صب لها أكثر بكثير خطوات من الحفر الآلية والطريقة هي أقل تنوعا في تعديل الأنماط الحالية أو إنتاج جديدة 12،15،29-31.

هذا الأسلوب يوفر أداة لفي المختبر دراسة التفاعلات الخلية حيث موقعها، والتوجه، وترتيب واحد أو أكثر من أنواع الخلايا مهمة. ومن المعروف أن العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة، الخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء لمحاذاة على أخاديد سطح 1،10،14،18. أنماط محفورا، المعروضة هنا، يمكن تعديل وطبع بسرعة كبيرة وبسهولة. هذا هو من مصلحة كما الزخرفة السطح مع الأخاديد وقد استخدمت في دراسة التصاق الخلية، مورفولوجيا والهجرة وتنبع تمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، طكما تم تطبيق ر إلى العصبية وهندسة الأنسجة العضلية 18، 32،33. منذ الأخاديد لا تلعب دورا في تمايز الخلايا أو تنظيم النمط الظاهري لعدة أنواع الخلايا، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لخلق الأخاديد، لمساعدة التمايز وإيداع الخلايا في صفوف منفصلة بحيث لا يمكن أن يؤديها الشاشات. حاليا، نحن بصدد تقييم هذه الطريقة لتعزيز ترتيب خلية متباين الخواص من الخلايا لإنتاج ألواح الخلايا cardiomyocyte، كما توجه الخلوي مهم لوظيفة الأنسجة القلبية 12-14،34.

النهج أثبت هنا توظف bioink القابلة للذوبان التي من شأنها أن تبدد في نهاية المطاف. ومع ذلك، إذا كنت بحاجة لتغطية هيدروجيل أكثر دواما، ثم إدراج الغلوتامين الميكروبية يمكن أن يعبر الارتباط والاستقرار الهلاميات المائية البروتين مثل القائم منها الجيلاتين دون آثار سلبية على الخلايا 9، 35. يمكن Bioinks أيضا استخدام البوليمرات methacrylated للشرع الأشعة فوق البنفسجية crosslinkinغرام من خلية تحمل الهلاميات المائية بطريقة cytocompatible 36. ومع ذلك، في تجربتنا، وتبين أن يشابك الغلوتامين الممنوحة لتحسين التفاعل بين هيدروجيل وسطح البوليمر (delaminated بسرعة أقل)، وبيئة أكثر cytocompatible بالمقارنة مع بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) هيدروجيل 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Robotic Dispensing System Janome 2300N
Plasma Machine Femto Science Covance
USB Microscope
Optical Microscope Olympus IX71
Name Company Catalog Number Comments
Software
Spreadsheet Excel Excel
Printing Co-ordinate Software Janome JR C-Points
Imaging Software National Institutes of Health (NIH) ImageJ
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Stylus (Blade) OLFA AK-5
5 ml printing syringe San-ei Tech SH10LL-B
30 G printing needle San-ei Tech SH30-0.25-B
1 mm polystyrene sheets Purchased locally
Fetal bovine serum Invitrogen  10270-098
Phosphate buffered saline Invitrogen
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A Sigma Aldrich 9000-70-8
αMEM Invitrogen 41061-029
Antibiotc antimycotic Sigma Aldrich A5955-100ML
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) Cyagen Biosciences Incorporation RASMX-01201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
  2. Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810, (3), 239-250 (2011).
  3. Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29, (6), 1855-1868 (2009).
  4. Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. Academic Press. 123-152 (2015).
  5. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, (6109), 921-926 (2012).
  6. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, (36), 5011-5028 (2013).
  7. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, (26), 6020-6041 (2012).
  8. Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. Academic Press. 1-17 (2015).
  9. Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17, (1), 16 (2015).
  10. Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
  11. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, (24), 1573-1583 (1997).
  12. Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316, (7), 1159-1168 (2010).
  13. Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7, (10), 1416-1421 (2011).
  14. Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8, (2), 531-539 (2012).
  15. Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33, (28), 6626-6633 (2012).
  16. Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
  17. Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9, (2), e88089 (2014).
  18. Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32, (2), 347-365 (2014).
  19. Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5, (3), 326-333 (2016).
  20. Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A, (1), 48-61 (2013).
  21. Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8, (2), 260-272 (2012).
  22. Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16, (5), 1489-1496 (2015).
  23. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26, (19), 3124-3130 (2014).
  24. Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. Academic Press. 249-270 (2015).
  25. Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. Academic Press. 229-248 (2015).
  26. Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. Springer International Publishing. 33-66 (2015).
  27. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  28. Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27, (6), 1777-1784 (2011).
  29. Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33, (21), 5230-5246 (2012).
  30. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9, (2), 149-157 (2007).
  31. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4, (1), 20130041 (2014).
  32. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, (27), 6941-6951 (2010).
  33. Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33, (2), 504-514 (2012).
  34. Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6, (2), 024109 (2014).
  35. Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10, (2), 912-920 (2014).
  36. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, (2), 024105 (2014).
  37. Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhuthalingam, R., Lim, P. Q., Irvine, S. A., Venkatraman, S. S. Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells. J. Vis. Exp. (117), e54604, doi:10.3791/54604 (2016).More

Bhuthalingam, R., Lim, P. Q., Irvine, S. A., Venkatraman, S. S. Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells. J. Vis. Exp. (117), e54604, doi:10.3791/54604 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter